IT201600077085A1 - Kit portatile per analisi immunoenzimatiche automatizzate - Google Patents
Kit portatile per analisi immunoenzimatiche automatizzateInfo
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Description
Titolo: "Kit portatile per analisi immunoenzimatiche automatizzate"
Descrizione
Forma oggetto della presente invenzione un kit per lo svolgimento di analisi immunoenzimatiche miniaturizzate che comprende almeno un circuito microfluidico (2) supportato su una card, definita LOC, ed uno strumento per l'analisi di detto LOC, laddove detto circuito microfluidico (2) è suddiviso in almeno 6 regioni funzionali che consistono in: a) Regione di interfaccia con lo strumento; b) Regione di immagazzinamento reagenti; c) Regione di inserimento del campione da analizzare; d) Regione di reazione; e) Regione di misura; f) Regione di scarico; dove dette regioni sono in comunicazione fluidica tra loro mediante canali di collegamento (9).
Stato dell'arte
I saggi immunoenzimatici sono ampiamente utilizzati in ricerca, nella pratica clinica, nel controllo di qualità. La loro flessibilità di impiego e la conseguente ampia penetrazione hanno stimolato lo sviluppo di metodiche la cui esecuzione fosse rapida, quanto più possibile operatore-indipendente, affidabile e svolta con l'ausilio di strumentazioni accessibili, poco costose e poco ingombranti.
A titolo di esempio, US 8,765,062, US 20140271361, US 7,419,821 descrivono analizzatori di campioni in grado di leggere analiti precedentemente caricati su di una cartuccia. La presente invenzione ha lo scopo di fornire un'alternativa alle soluzioni oggi disponibili che offra vantaggi di utilizzo, performance ed economicità .
Descrizione dell'invenzione
Forma oggetto della presente invenzione un kit per lo svolgimento di analisi immunoenzimatiche miniaturizzate e automatizzate per Point of Care (POC). Detto kit comprende una card, che è una struttura microfluidica, definita LOC (Lab-On-Chip) e uno strumento, preferibilmente portatile, per la gestione automatica dei reagenti e per la lettura automatica dei risultati analitici di detto LOC. E' altresì parte integrante della presente invenzione un metodo per lo svolgimento ottimale di detto processo di analisi. In detta LOC i reagenti sono precaricati in appositi microserbatoi e, attraverso canali, raggiungono regioni funzionali presenti sulla stessa struttura, come descritto nei paragrafi che seguono.
Grazie al kit e al metodo della presente invenzione, le analisi immunoenzimatiche vengono eseguite in modo automatizzato, tramite uno strumento portatile idoneo che gestisce la microfluidica dei reagenti ed esegue la misura finale. Detta LOC viene inserito a tenuta pneumatica in detto strumento di gestione e misura, grazie ad un collettore mani f old e, dopo opportuna movimentazione automatica dei fluidi, il risultato dell'analisi viene letto in automatico.
Descrizione delle figure
Figura 1: forma di realizzazione esemplificativa della struttura microfluidica secondo la presente invenzione, con 4 linee di reazione.
Figura 2: forma del micro-serbatoio di misura (7) della struttura microfluidica secondo la presente invenzione. Figura 3: rappresentazione schematica della rastrematura dei canali che permette l'allineamento dei fluidi nella struttura microfluidica secondo la presente invenzione. Figura 4: curva standard per aflatossina B1 ottenuta con il metodo della presente invenzione (linea continua) e su piastre ELISA standard (linea tratteggiata).
Figura 5: rappresentazione schematica dello strumento di gestione microfluidica e lettura del LOC secondo la presente invenzione.
Figura 6: rappresentazione schematica del primo elemento del LOC, in una forma di realizzazione alternativa.
Figura 7: rappresentazione schematica del secondo elemento del LOC, in una forma di realizzazione alternativa.
Descrizione dettagliata dell'invenzione:
Il kit oggetto della presente invenzione comprende un LOC (1) e uno strumento (20) per l'analisi dello stesso LOC. In un'ulteriore aspetto, si rivendicano qui indipendentemente detto LOC (1) e detto strumento (20). Detto LOC (1), che è un dispositivo monouso, raffigurato in una forma di realizzazione esemplificativa nella figura 1, e, in una ulteriore forma di realizzazione, nelle figure 6 e 7, comprende almeno un circuito microfluidico (2) suddiviso in almeno 6 regioni funzionali, rispettivamente:
a) Regione di interfaccia con lo strumento: fori (3), (13) che mettono in comunicazione il circuito microfluidico presente su detto LOC con lo strumento di gestione e analisi. Preferibilmente, a detti fori sono associate strutture assorbenti in modo tale da prevenire la fuoriuscita di liquidi e prevenire contaminazioni e/o una pellicola protettiva per chiudere i fori stessi quando il LOC non è utilizzato, permettendo di fornire un LOC precaricato evitando l'evaporazione dei liquidi;
b) Regione di immagazzinamento reagenti: uno o più micro-serbatoi reagenti (4) atti a contenere i reagenti necessari per lo svolgimento dell'analisi, a titolo di esempio selezionati nel gruppo che comprende anticorpi, anticorpi coniugati, coniugati enzimatici, reagenti cromogeni, reagenti fluorescenti, reagenti chemiluminescenti, soluzioni di lavaggio, soluzioni tampone e acidi, opportunamente precaricati e pronti all'uso, opzionalmente liofilizzati;
c) Regione di inserimento del campione da analizzare:
uno o più micro-serbatoi campione (5) che ricevono il campione liquido da analizzare. Il campione è un fluido di interesse analitico, quale, a titolo di esempio, vino, latte, acqua o un qualsiasi liquido fisiologico selezionato ad esempio tra urina, saliva, sangue, plasma, siero oppure è il risultato di un processo estrattivo preventivamente effettuato, ad esempio un estrazione da cereali, carne, tessuti, frutta secca;
d) Regione di reazione: una o più camere di reazione (6) che contengono sonde immobilizzate, ad esempio mediante adsorbimento fisico o legame covalente sulla superficie. In una forma di realizzazione preferita, detta camera di reazione (6) è rivestita, ad esempio con metalli o film di molecole ricche di legami ossidrilici o aminici;
e) Regione di misura: almeno un micro-serbatoio di misura (7) per accogliere il liquido da misurare; f) Regione di scarico: almeno una struttura di scarico (8) che riceve i reagenti di scarto dopo il loro utilizzo nelle diverse operazioni analitiche.
Preferibilmente, a detta regione di scarico è associato un tampone assorbente che impedisce la fuoriuscita dei reagenti di scarto proteggendo altresì lo strumento da problemi di contaminazione.
Dette regioni sono in comunicazione fluidica tra loro mediante canali di collegamento (9).
In una forma di realizzazione, raffigurata in figura 1, detto LOC è costituito da un unico elemento che comprende le regioni sopradescritte,
In una forma di realizzazione alternativa, raffigurata nelle figure 6 e 7, detto LOC comprende un primo elemento (30) ed un secondo elemento (31), laddove detti primo e secondo elemento sono descritti nel dettaglio in seguito e la sovrapposizione di detti due elementi porta al LOC (1) con le regioni sopradescritte.
Detto LOC comprende le regioni da a) ad f) descritte, laddove la geometria rappresentata nelle figure 1, 6 e 7 è da ritenersi puramente esemplificativa e non esaustiva. Pertanto, sono da considerarsi parte della presente invenzione anche forme di realizzazione la cui geometria non rifletta quella esemplificata nelle figure. Ad esempio, i LOC raffigurati sono a 4 vie, forme di realizzazione ad 1, 2, 3, 5, 6 o più vie sono possibili e rientrano nell'ambito della presente invenzione. Anche la disposizione nel LOC delle diverse regioni è aperta a modifiche che non ne compromettono la funzionalità .
In un'ulteriore forma di realizzazione, sono altresì presenti in detto LOC strutture quali, a titolo di esempio non esaustivo, sigilli frangibili, guarnizioni frangibili, valvole in gomma a becco d'anatra, o valvole in gomma flessibili, che separano detti micro-serbatoi reagenti (4) da detti canali di collegamento (9). Laddove detto LOC è inserito in detto strumento (20), dette strutture si aprono creando opportune pressionidepressioni tramite attivazione di valvola/e e/o pompa/e a bordo di detto strumento (20).
Nella forma di realizzazione schematizzata nelle figure 6 e 7, detto LOC è costituito da due elementi sovrapponibili che vengono uniti al momento dell'analisi, un primo elemento (30) ed un secondo elemento (31). In tale forma di realizzazione la card contiene, in detto primo elemento (30), almeno una delle regioni funzionali: micro-serbatoi reagenti (4), microserbatoi campione (5), camere di reazione (6), almeno un micro-serbatoio di misura (7), almeno una struttura di scarico (8). Detti micro-serbatoi e camere presenti in detto primo elemento (30) comprendono, alle estremità, fori (33) chiusi con un film protettivo (34). Detto secondo elemento (31) alloggia i canali di collegamento (9) e la regione di interfaccia con lo strumento, ovvero i fori (3) e (13), e le regioni funzionali che eventualmente non sono presenti nel primo elemento (30). Detto secondo elemento (31) ha delle protuberanze (35), ad esempio aculee o aghiformi. Dette protuberanze (35), quando detto primo elemento viene sovrapposto a detto secondo elemento, si trovano in corrispondenza di detti fori (33) su detto primo elemento. Dette protuberanze (35) forano detta pellicola protettiva (34), mettendo in comunicazione tra loro dette regioni (4, 5, 6, 7, 8) su detto primo elemento (30) attraverso detti canali di comunicazione (9) su detto secondo elemento (31). In questa forma di realizzazione, detto circuito microfluidico (2) lo si ottiene quindi dalla sovrapposizione di detto primo elemento (30) e detto secondo elemento (31). Il vantaggio di questa soluzione consiste nel tenere isolate le diverse regioni eliminando rischi residuali di contaminazione reciproca durante la conservazione della card stessa.
In una forma preferita di realizzazione, detto LOC (1) a due elementi è raffigurato nelle figure 6 e 7, e detto primo elemento (30) comprende micro-serbatoi reagenti (4), micro-serbatoi campione (5), camere di reazione (6), micro-serbatoi di misura (7), struttura di scarico (8). Detto secondo elemento (31) alloggia i canali di collegamento (9) e la regione di interfaccia con lo strumento, ovvero i fori (3) e (13).
Detto almeno un micro-serbatoio di misura (7) è trasparente e con dimensione dipendente dal tipo di fascio luminoso e dall'area sensibile per la detection, dovendo rientrare completamente all'interno di entrambi. Una regione di misura sottodimensionata rispetto al fascio luminoso non permetterebbe infatti una lettura corretta del segnale.
In una forma preferita di realizzazione, detto almeno un micro-serbatoio di misura (7) si immette tramite detto canale di collegamento (9) in detta struttura di scarico (8) in un punto diametralmente opposto rispetto al punto dove è posizionato detto foro (13) in uscita da detta struttura di scarico (8).
Preferibilmente, detti canali di collegamento (9) sono a sezione quadrata. Ancor più preferibilmente, il lato di detti quadrati ha dimensioni pari o inferiori a 1 mm, ancor più preferibilmente detto lato misura circa 0,5 mm. Grazie a queste dimensioni ridotte, si minimizza la formazione di menischi all'interno del canale di collegamento stesso, minimizzando così i rischi di residui di fluido all'interno del canale di collegamento (9). Opzionalmente, detti canali di collegamento (9) sono realizzati così da avere una superficie idrofobica per annullare il rischio di residui superficiali o menischi di liquido.
Preferibilmente, dette camere di reazione (6) hanno una forma allungata, ovvero una forma tale da massimizzare il rapporto superficie/volume. Detta massimizzazione favorisce il contatto delle molecole contenute nel liquido all'interno della camera di reazione con la superficie della camera stessa. Siccome su detta superficie sono immobilizzate dette sonde, si favorisce così lo svolgimento della reazione.
In una forma ancor più preferita, uno o più dei microserbatoi reagenti (4) è collegato con un ulteriore micro-serbatoio tramite un canale di miscelazione.
Detto LOC è fabbricata in qualunque materiale polimerico in grado di adsorbire le sonde con o senza opportune modifiche (funzionalizzazioni) superficiali. Il materiale deve essere trasparente nell'intervallo di lunghezza d'onda della misura scelta, ad esempio luce monocromatica a 450 o 620nm.
Preferibilmente, detto LOC (1) è precaricato, ovvero in detta una o più camere di reazione (6), sono preventivamente immobilizzate sonde specifiche per l'analisi di interesse. Su ciascun LOC sono presenti una o più linee di reazione così da poter eseguire anche più analisi differenti contemporaneamente o, laddove richiesta particolare accuratezza, ottenere una curva di taratura, laddove vengano inserite soluzioni standard di riferimento in una o più di dette linee di reazione.
Laddove il campione derivi da un processo di preparativa, come ad esempio da un processo estrattivo a pressione, detto processo verrà eseguito da un dispositivo accessorio a parte. In un'ulteriore forma di realizzazione è presente un meccanismo di dosaggio del campione direttamente sul LOC. Tale meccanismo può funzionare partendo da una quantità ignota o da una goccia del campione da analizzare, la quale viene aspirata nel LOC dallo strumento automatico fino ad un preciso punto del canale microfluidico così da poterne quantificare il volume, come ad esempio 10 o 20 microlitri. In alternativa tale dosaggio può avvenire su card tramite capillarità.
Una ulteriore peculiarità che distingue detto LOC da altre soluzioni presenti nello stato dell'arte è data dalla conformazione di detto almeno un serbatoio di misura (7). In figura 2 è raffigurata la forma di detto almeno un serbatoio di misura (7) nella LOC. Detto almeno un serbatoio di misura (7) ha una forma più o meno allungata, dove le due estremità terminano con un restringimento sfociante nei canali di entrata e di uscita. Gli autori della presente invenzione hanno dimostrato che, grazie a detta conformazione, si ottengono una serie di vantaggi: i) si evita la formazione di bolle di aria, bolle che costituiscono un importante limite delle soluzioni di microfluidica dello stato dell'arte; ii) l'assenza di angoli pronunciati permette uno scorrimento ottimale dei reagenti; iii) l'assenza di angoli pronunciati, evitando zone di ristagno, facilita il lavaggio delle superfici.
La soluzione della presente invenzione prevede inoltre che i canali di collegamento (9) presentino delle rastremature (10), come raffigurato in figura 3. Detta rastrematura (10) permette, nel momento in cui si necessita un mescolamento uniforme di due reagenti, di ottenere un riallineamento dei reagenti stessi poiché la tensione superficiale del menisco del fronte di un liquido in arrivo blocca parzialmente lo scorrimento dello stesso permettendo al secondo liquido, se in ritardo, di riallinearsi. Inoltre, dette rastremature permettono un corretto scorrimento del fluido, all'altezza dell'incrocio, nella direzione desiderata a valle grazie alla tensione superficiale che si crea ed impedisce al liquido di fluire nel canale indesiderato. Detto LOC può avere da una a 4 linee di reazione contemporaneamente presenti e nel caso di LOC con meno di 4 linee si utilizzano adattatori sullo strumento che garantiscono l'allineamento ottico e l'allineamento con i fori del collettore che sono collegati alle valvole e pompe da utilizzare presenti sullo strumento di lettura, permettendo così l'utilizzo di un unico strumento di lettura per LOC che comprendono da una a 4 linee di reazione. La gestione del LOC attuata da una molteplicità di valvole, permettendo un controllo fine e puntuale del circuito, conferisce al kit della presente invenzione una flessibilità non riscontrata in altri sistemi descritti nello stato dell'arte.
Nella forma di realizzazione esemplificata in figura 1, detto LOC comprende 4 linee di reazione indipendenti tra loro. Questa caratteristica permette, in ciascuna di dette regioni, di immobilizzare una sonda diversa così da permettere in parallelo lo svolgimento di 4 saggi indipendenti. Inoltre, è possibile ottenere una curva di taratura, utilizzando tre delle quattro linee di reazione per la taratura ed una per il campione.
In una forma preferita, detto LOC è precaricato con soluzioni standard del target Aflatossina B1 (o MI), soluzioni di lavaggio, coniugati enzimatici che consistono in aflatossina specifica coniugata a horseradish peroxidase , soluzioni cromogene TMB, soluzione di stop.
In un'ulteriore forma preferita, detto LOC è precaricato con soluzioni standard del target lisozima, soluzioni di lavaggio, anticorpi specifici secondari coniugati a horseradish peroxidase , soluzioni cromogene TMB, soluzione di stop.
Forma ulteriore aspetto della presente invenzione detto strumento per la gestione microfluidica e l'analisi di detto LOC.
Detto strumento (20) comprende un alloggiamento (21) per detto LOC, un sistema che attiva la comunicazione microfluidica tra le regioni funzionali che sono su detto LOC, un sistema di lettura dei dati, ove le funzioni di detto strumento sono gestite, almeno parzialmente, in maniera automatizzata.
Preferibilmente, detto strumento comprende:
a) Un alloggiamento (21) per detto LOC, ove detto alloggiamento comprende, in corrispondenza dei fori (3), (13) presenti su detto LOC, una serie di guarnizioni (22) che mettono in collegamento a tenuta pneumatica detti fori (3), (13), per esempio attraverso strutture aghiformi o non, con canali (23) presenti nell'alloggiamento stesso, ove detti canali sono indipendenti tra loro e contenuti nella porzione sottostante la zona di alloggiamento di detto LOC;
b) Un sistema di gestione della comunicazione microfluidica che comprende almeno una valvola (24), ad esempio un'elettrovalvola e almeno una pompa (25) collegate in entrata e/o in uscita a detti canali (23);
c) Un sistema di lettura dei dati (26) che è un sistema ottico;
d) hardware e software (27) per il controllo della fluidica, gestione, analisi delle letture e comunicazione dati, indipendentemente in locale e/o in remoto;
e) opzionalmente, un sistema elettronico di stabilizzazione della temperatura di detto alloggiamento (21), ad esempio a 25°C;
f) opzionalmente, sensori ottici per il controllo di posizione dei liquidi;
g) opzionalmente, sensori di segnalazione di avvenuto inserimento del LOC;
h) opzionalmente, un dispositivo di lettura ottica per l'identificazione del LOC inserito.
Detti software per il controllo della fluidica, tramite la gestione di dette valvole e pompe, di acquisizione e analisi dei dati, e/o di controllo della posizione dei liquidi lungo detti percorsi microfluidici e/o di gestione dei dati ottenuti da detti sensori, sono installati su di un hardware (27) contenuto nello strumento stesso, oppure uno o più di detti software sono esterni allo strumento, installati su un PC o altro dispositivo o, alternativamente, su un cloud al quale detto strumento è connesso, a titolo di esempio mediante internet attraverso connessione wi-fi o connessione tramite sim card.
In una forma di realizzazione, detto strumento comprende detti hardware e software e si interfaccia con l'utente tramite un display.
In una forma alternativa, detti software e/o hardware sono in remoto e detto strumento comprende un mezzo di connessione a detti software e/o hardware. Questa forma di realizzazione è particolarmente vantaggiosa, poiché mette a disposizione uno strumento agile, economico, e di facile utilizzo. Ad esempio, lo stesso operatore addetto alla raccolta del campione può disporre in loco di detto kit, caricare su detto LOC il campione e inserire detto LOC nell'apposito alloggiamento in detto strumento. Il software procederà con l'analisi, la lettura e l'interpretazione dei dati comunicando e salvando gli stessi, ove necessario, in remoto.
In una forma di realizzazione ulteriore, detto strumento integra entrambe le funzionalità, comprendendo hardware e software ed anche mezzi di connessione a software e hardware in remoto.
Detti fori (3), (13) su detto LOC consentono il collegamento di detto circuito microfluidico con detto strumento per la gestione microfluidica e lettura di detto LOC. Detti fori (3), (13) mediante guarnizioni, entrano in contatto con i canali (23) contenuti in detto strumento che mettono in comunicazione gli stessi con 1'almeno una valvola e 1'almeno una pompa a bordo dello strumento, dove detto collegamento è un collegamento a tenuta pneumatica che rende possibile l'utilizzo di dette valvole e/o pompe per la movimentazione dei liquidi contenuti in detto LOC, tipicamente per aspirazione o per spinta.
In una forma di realizzazione, detta almeno una pompa (25) è posizionata a valle di detto LOC ed è collegata in uscita a detti canali (23). Preferibilmente, detta almeno una pompa (25) posizionata a valle di detto LOC è in collegamento con il foro (13) posizionato a valle di detta regione di scarico (8) e detta pompa (25) è una pompa di aspirazione.
In questa forma di realizzazione, all'accensione di detta pompa (25), si genera un'aspirazione al foro (13) a valle di detto LOC (1). Aprendo uno o più di detti fori (3), ciascuno controllato in maniera indipendente da dette valvole (24), si stabilisce se e da quale micro-serbatoio debba fluire il contenuto verso il micro-serbatoio o camera posto a valle della stessa. A titolo esemplificativo, dopo aver azionato detta pompa (25), aprendo la valvola (24) posta in corrispondenza del foro (3) che è a monte di detto micro-serbatoio campione (5), l'aria in ingresso attraverso detto foro (3) aperto da detta valvola (24) fa sì che, per azione della pompa (25), il fluido contenuto in detto microserbatoio campione (5) si immetta in detto canale di collegamento (9) per raggiungere detta camera di reazione (3).
In un'ulteriore forma di realizzazione, detta almeno una pompa (25), che è una pompa in spinta, è posizionata a monte di detto LOC ed è collegata in entrata a detti canali (23) mentre detta almeno una valvola (24) è a valle di detto LOC in collegamento con il foro (13) posizionato a valle di detta regione di scarico (8). Alternativamente, detto sistema comprende almeno una pompa (25) e almeno una valvola (24) a valle e almeno una pompa (25) e almeno una valvola a monte di detta LOC.
Dette valvole (24), gestite da detto software, in una forma di realizzazione preferita controllano l'apertura e la chiusura dei fori (3) e/o (13) su detto LOC.
In una forma di realizzazione, ciascuno di detti canali (23) è controllato singolarmente da una valvola (24), laddove ad ogni foro (3) è così connessa una valvola (24). In una forma di realizzazione alternativa, ciascuno di detti canali (23) è controllato singolarmente da una pompa (25) alla quale ciascuno di detti fori (3) è connesso. In questa forma di realizzazione, detta pompa (25) è una pompa a spinta. In un'ulteriore forma di realizzazione ciascuno di detti canali (23) è controllato singolarmente da una pompa (25) o una valvola (24) alla quale ciascuno di detti fori (3) è connesso.
In una forma preferita di realizzazione, detto sistema comprende una pompa (25) che è posizionata a valle rispetto a detta LOC, preferibilmente connessa tramite uno di detti canali (23) ad una delle guarnizioni (22) alla quale si connette il foro (13) su detto LOC. In questa forma di realizzazione, schematizzata in figura 5, detta pompa (25) è una pompa di aspirazione e la sua attivazione permette il movimento dei fluidi in detto LOC, ove la selezione del circuito fluidico da attivare è possibile grazie l'apertura di almeno una valvola (24), laddove ogni foro (3) è controllato da una valvola (24) attraverso detto canale (23).
In un'ulteriore forma di realizzazione, il sistema comprende altresì una pompa (25) a monte di detto LOC. Detta pompa (25) a monte di detto LOC, lavorando in spinta, rende possibile un movimento dei fluidi all'interno del LOC, ad esempio è possibile, attivando detta pompa (25) a monte, spostare per spinta un campione all'interno del LOC. Oppure, utilizzando alternativamente detta pompa di aspirazione a valle e detta pompa di aspirazione a monte del LOC, si opera un movimento di salita e discesa del fluido nel circuito che porta ad una miscelazione del fluido stesso.
Detto sistema ottico è costituito da: almeno una sorgente luminosa monocromatica, led o alogena, emettente alla lunghezza d'onda di assorbimento del reagente cromogeno, tipicamente a 450 nm o 620 nm e stabilizzata, oppure emettenti alla lunghezza d'onda di emissione dei fluorofori utilizzati per l'analisi e di almeno un detector o fotodiodo, o altro sistema di misura, sensibile alle lunghezze d'onda suddette. Il fascio luminoso è posizionato perpendicolarmente rispetto al detector e mantenuto a distanza costante, tale da rimanere centrato all'interno dell'area della regione di misura del LOC e centrato al tempo stesso sul detector.
Grazie al LOC della presente invenzione, l'intervento manuale dell'operatore è limitato al caricamento del campione da analizzare, riducendo così al minimo la variabilità operatore-dipendente, oltre che il rischio di errore. Detti LOC vengono messi a disposizione vuoti o, più preferibilmente, precaricati. L'operatore dispone di una serie di LOC precaricati analisi/specifiche così da poter scegliere il LOC idoneo per la specifica analisi da effettuare.
Il kit secondo la presente invenzione è adatto allo svolgimento di più protocolli ELISA, quali ELISA Competitivo, Non competitivo, Diretto, Indiretto.
Detto kit è progettato per essere utilizzato anche da personale non qualificato in quanto il metodo di esecuzione contempla esclusivamente le semplici operazioni qui elencate, non necessariamente nell'ordine indicato:
a) Inserimento del LOC nello strumento di gestione della microfluidica e lettura, dove detto strumento è controllato da un software, in locale o in remoto;
b) Caricamento del campione nel LOC (1), in detto micro-serbatoio campione (5), ad esempio mediante pipetta, oppure per capillarità o aspirazione in modalità assistita dallo strumento;
c) Avviamento del protocollo di analisi desiderato via software, grazie al riconoscimento automatico della card da parte dello strumento con il sistema di lettura codice, laddove presente, ovvero tramite comando manuale;
d) Spostamento automatizzato del campione e dei reagenti, preferibilmente mediato da una pompa di aspirazione collegata a detto foro (13), in una o più camere di reazione (6), dove, opzionalmente, detti campione e reagenti entrano in contatto con una o più sonde di interesse ivi immobilizzate generando alla fine del protocollo il segnale cromogeno oggetto di misurazione;
e) Gestione automatizzata delle fasi di reazioni intervallate da fasi di lavaggio successive allo spostamento di detti campione e reagenti nella regione di scarico (8);
f) Immissione opzionale di una soluzione detta di STOP, mescolamento e spostamento della stessa, laddove presente, insieme a detto substrato cromogeno nella regione di misura, laddove detto spostamento è ottenuto tramite aspirazione, preferibilmente mediata da una pompa di aspirazione collegata a detto foro (13);
g) Misura di assorbanza/emissione del segnale cromogeno via software tramite lo strumento di gestione microfluidica e misura;
h) Elaborazione dei dati misurati per mezzo del software ed esibizione dei risultati.
Detto passaggio h) di elaborazione ed esibizione dei risultati avviene in locale, laddove detto strumento è predisposto per questa funzionalità, oppure in remoto, attraverso un hardware al quale detto strumento è collegato oppure tramite internet e un sistema cloud grazie alla connessione garantita, ad esempio, dalla sim card precedentemente inserita nello strumento. Detti risultati possono venire salvati su qualsiasi memoria, in locale o in remoto.
Risultati quantitativi possono essere ottenuti grazie all'esecuzione di una curva di taratura sul LOC contemporaneamente all'analisi del campione o precaricando detta curva di taratura via software.
Per ciascun target da analizzare è applicato uno specifico protocollo. A seconda che si debba eseguire un'analisi immunoenzimatica diretta o indiretta nella camera di reazione si trovano, precedentemente immobilizzate sulla superficie, le sonde, anticorpi specifici o antigeni specifici, opportunamente stabilizzate con operazioni di blocking e overcoating. Prima di procedere all'analisi, gli analiti vengono introdotti in appositi ingressi nel LOC. Ciascun protocollo di analisi prevede la movimentazione dei reagenti dalle regioni d'immagazzinamento fino alla regione di reazione e poi fino a quella di scarico lungo i canali della microfluidica. Nella regione di reazione i reagenti sostano per tempi stabiliti. Dopo ogni reazione, soluzioni di lavaggio vengono fatte transitare per eliminare ogni residuo delle regioni di reazione e fermare le reazioni stesse. Ultimo passaggio nella regione di reazione consiste nell'introduzione della soluzione cromogena, ad esempio TMB, che viene lasciata interagire per tempi fissati e quindi, spostata in regione di misura. Durante questo trasferimento il cromogeno sviluppato può essere miscelato con una soluzione di stop, ad esempio acido, per spegnere la reazione. Se si procede con lo spegnimento con la soluzione di stop è fondamentale ottenere un perfetto mescolamento del cromogeno con essa. Per garantire un perfetto allineamento dei fluidi nei due rami della fluidica convergenti si sono realizzate delle rastremature come descritte nella descrizione della card. Il colore del cromogeno, se miscelato con la soluzione di stop, vira. La risultante finale viene fatta fluire nella regione di misura e quindi la centralina fa procedere la misura di assorbanza.
A titolo esempio, il kit e il metodo secondo la presente invenzione trovano applicazione nel settore agroalimentare, ad esempio per la misura di aflatossine in latte e cereali, di antibiotici nel latte, di allergeni. Ulteriori applicazioni sono possibili in diagnostica, sia nell'uomo che in animali.
ESEMPI:
Analisi di campioni di cereali
In campioni di cereali, con un protocollo immunoenzimatico competitivo, si sono misurate le concentrazioni di aflatossina B1 nell'intervallo tra 0,01 e 1,2 ng/ml.
Analisi di campioni di vino
In campioni di vino, con un protocollo di analisi immunoenzimatica non competitiva, è stata analizzata la concentrazione di lisozima in concentrazioni nell'intervallo tra 1,5 e 12 ng/ml.
A questo scopo, sono state messe a disposizione LOC precaricate con soluzioni standard del target, soluzioni di lavaggio, anticorpi specifici secondari coniugati a horseradish peroxidase HRP (per protocolli ELISA non competitivi) o antigeni specifici coniugati a horseradish peroxidase HRP (per protocolli ELISA competitivi), soluzioni cromogene TMB, soluzione di stop.
Analisi di campioni di latte
In campioni di latte è stata misurata 1'aflatossina B1 fino a concentrazioni dell'ordine di 10 pg/ml.
A titolo di esempio, si descrive qui di seguito il metodo per l'analisi di aflatossina Bl, dove detto metodo comprende:
a) Messa a disposizione di una LOC a 4 vie ed inserimento della stessa nello strumento;
b) Caricamento del campione da analizzare;
c) Avviamento del protocollo da parte dello strumento;
d) Sequenziale mescolamento delle soluzioni a concentrazione nota di aflatossina Bl (per la curva di taratura), e del campione da analizzare, con soluzioni di coniugato enzimatico (composto da aflatossina Bl chimicamente coniugata all'enzima HRP) all'interno del LOC e sequenziale spostamento di tali soluzioni nelle camere di reazione (6) tramite accensione e spegnimento di detta almeno una pompa (25) e detta almeno una valvola (24); e) Incubazione per circa 15 minuti, e successivo spostamento delle dette soluzioni verso la regione di scarico;
f) Sequenziale spostamento delle soluzioni di lavaggio nella camera di reazione e successivo spostamento delle stesse verso la regione di scarico;
g) Sequenziale spostamento dei reagenti TMB nelle 4 camere di reazione dove sostano per circa 5 minuti; h) Sequenziale spostamento delle soluzioni di STOP all'altezza delle rastremature del circuito contemporaneamente allo spostamento sequenziale dei reagenti TMB colorati in modo tale da poterli allineare per un corretto mescolamento;
i) Spostamento sequenziale di ciascun reagente TMB, sviluppato, contemporaneamente alla sua soluzione di STOP nella regione di misura, operazione mediante la quale le due soluzioni subiscono un mescolamento e quindi lo spegnimento della reazione chimica di sviluppo del TMB;
j) Sequenziale misura di assorbanza delle soluzioni e spostamento nella regione di scarico.
La figura 4, linea continua, mostra la curva standard ottenuta utilizzando 4 diverse concentrazioni note di aflatossina B1 con il metodo della presente invenzione. La linea tratteggiata sulla stessa figura 4 mostra i dati ottenuti eseguendo un esperimento di confronto su piastre ELISA tradizionali sulle stesse soluzioni (confronto tra le tecniche). A conferma della validità del sistema che qui si propone, i risultati ottenuti sono sovrapponibili.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Un kit per lo svolgimento di analisi immunoenzimatiche miniaturizzate che comprende almeno un LOC (1) e uno strumento (20) per l'analisi di detto LOC, laddove detto LOC comprende almeno sei regioni funzionali che consistono in: a) Regione di interfaccia con lo strumento; b) Regione di immagazzinamento reagenti; c) Regione di inserimento del campione da analizzare; d) Regione di reazione; e) Regione di misura; f) Regione di scarico; dove dette regioni sono in comunicazione fluidica tra loro mediante canali di collegamento (9) e detto strumento (20) comprende un alloggiamento (21) per detto LOC, un sistema che attiva la comunicazione microfluidica tra dette regioni funzionali che sono su detta LOC e un sistema di lettura dei dati.
- 2. Una struttura microf luidica (LOC) per lo svolgimento di analisi immunoenzimatiche miniaturizzate che comprende almeno un circuito microfluidico (2) suddiviso in almeno 6 regioni funzionali, rispettivamente: a)Regione di interfaccia con lo strumento: fori (3), (13) che mettono in comunicazione il circuito microfluidico (2) presente su detto LOC con uno strumento di gestione e analisi; b)Regione di immagazzinamento reagenti: uno o più micro-serbatoi reagenti (4) atti a contenere i reagenti necessari per lo svolgimento dell'analisi, a titolo di esempio selezionati nel gruppo che comprende anticorpi, anticorpi coniugati, coniugati enzimatici, reagenti cromogeni, reagenti fluorescenti, reagenti chemiluminescenti, soluzioni di lavaggio, soluzioni tampone e acidi, opzionalmente liofilizzati; c)Regione di inserimento del campione da analizzare: uno o più micro-serbatoi campione (5) che ricevono il campione liquido da analizzare; d)Regione di reazione: una o più camere di reazione (6) che contengono sonde immobilizzate; e)Regione di misura: almeno un micro-serbatoio di misura (7) per accogliere il liquido da misurare; f)Regione di scarico: almeno una struttura di scarico (8) che riceve i reagenti di scarto dopo il loro utilizzo; dove dette regioni sono in comunicazione fluidica tra loro mediante canali di collegamento (9).
- 3. Il LOC secondo la rivendicazione 2, dove detto LOC è composto da un primo elemento (30) e un secondo elemento (31) sovrapponibili tra loro, dove detto primo elemento (30) comprende almeno una di dette regioni funzionali nelle quali i micro-serbatoi e le camere comprendono alle estremità fori (33) chiusi con un film protettivo (34) e detto secondo elemento (31) alloggia i canali di collegamento (9) e la regione di interfaccia con lo strumento, ovvero i fori (3) e (13) e le regioni funzionali che eventualmente non sono presenti nel primo elemento (30), dove detto secondo elemento (31) ha protuberanze (35) atte a forare detta pellicola protettiva (34).
- 4. Il LOC secondo la rivendicazione 2 o 3, ove detto almeno un micro-serbatoio di misura (7) è trasparente ed ha una dimensione tale per cui il fascio luminoso utilizzato per la lettura lo attraversa interamente.
- 5. Il LOC secondo una delle rivendicazioni da 2 a 4, dove detto micro-serbatoio di reazione (7) ha una forma più o meno allungata, dove le due estremità terminano con un restringimento sfociante nei canali di entrata e di uscita e/o in detti fori (33).
- 6. Il LOC secondo una delle rivendicazioni da 2 a 5, dove detti canali di collegamento (9) presentano almeno una rastrematura (10).
- 7. Il LOC secondo una delle rivendicazioni da 2 a 6, precaricato con soluzioni standard del target Aflatossina B1 (o Mi), soluzioni di lavaggio, coniugati enzimatici che consistono in aflatossina specifica coniugata a horseradish peroxidase , soluzioni cromogene TMB, soluzione di stop.
- 8. Il LOC secondo una delle rivendicazioni da 2 a 7, caratterizzata dal fatto che detto almeno un microserbatoio di misura (7) si immette tramite detto canale di collegamento (9) in detta struttura di scarico (8) in un punto diametralmente opposto rispetto al punto dove è posizionato detto foro (13) in uscita da detta struttura di scarico (8) e detti canali di collegamento (9) sono a sezione quadrata e il lato di detto quadrato misura circa 0,5 mm e dette camere di reazione (6) hanno una forma allungata.
- 9. Uno strumento (20) per la gestione microfluidica e l'analisi del LOC di cui alle rivendicazioni da 2 a 8, dove detto strumento comprende: a)Un alloggiamento (21) per detto LOC, ove detto alloggiamento comprende, in corrispondenza dei fori (3), (13) presenti su detto LOC, una serie di guarnizioni (22) che mettono in collegamento a tenuta pneumatica detti fori (3), (13) con canali (23), ove detti canali sono indipendenti tra loro e contenuti nella porzione sottostante la zona di alloggiamento di detto LOC; b)Un sistema di gestione della comunicazione microfluidica che comprende almeno una valvola (24), ad esempio un'elettrovalvola, e almeno una pompa (25) collegate almeno una in entrata e almeno una in uscita a detti canali (23); c) Un sistema di lettura dei dati che è un sistema ottico (26); hardware e software (27) per il controllo della fluidica, gestione, analisi delle letture e comunicazione dati, indipendentemente in locale e/o in remoto e, opzionalmente, mezzi di collegamento di detto strumento con detti hardware e software in remoto.
- 10.Lo strumento secondo la rivendicazione 9, dove detta pompa (25) è una pompa di aspirazione collegata a valle di detto LOC e collegata in uscita a detti canali (23), tramite detto foro (13) posizionato a valle di detta regione di scarico (8) e ciascuno di detti canali (23) che si aprono su fori (3) a monte di detti micro-serbatoi su detto LOC è controllato singolarmente da una valvola (24), ad esempio elettrovalvola.
- 11.Lo strumento secondo una delle rivendicazioni 9 o 10 che comprende altresì sensori ottici per il controllo di posizione dei liquidi e/o sensori di segnalazione di avvenuto inserimento del LOC e/o dispositivo di lettura ottica per l'identificazione del LOC inserito e/o sistema di stabilizzazione della temperatura dell'alloggiamento (21).
- 12. Il kit secondo la rivendicazione 1 dove detto LOC (1) è secondo una delle rivendicazioni da 2 a 8 e detto strumento (20) è secondo una delle rivendicazioni da 9 a 11.
- 13.Un metodo per lo svolgimento di analisi immunoenzimatiche miniaturizzare ed automatizzate che comprende i seguenti passaggi, non necessariamente nell'ordine indicato: a)Mettere a disposizione un kit secondo la rivendicazione 1 o 12; b) Inserimento di detto LOC (1) nella zona di alloggiamento (21) su detto strumento (20); c)Caricamento del campione nel LOC (1), in detto micro-serbatoio campione (5); d)Avviamento del protocollo di analisi desiderato; e)Spostamento automatizzato del campione e dei reagenti in una o più camere di reazione (6); f)Gestione automatizzata delle fasi di reazioni intervallate da fasi di lavaggio successive allo spostamento di detti campione e reagenti nella regione di scarico (8); g)Movimentazione di una opzionale soluzione detta di STOP, mescolamento e spostamento della stessa, laddove presente, insieme a detto substrato cromogeno nella regione di misura; h)Misura di assorbanza/emissione del segnale cromogeno/chemiluminescente via software tramite lo strumento di gestione microfluidica e misura; i)Elaborazione dei dati misurati per mezzo del software, visualizzazione e, opzionalmente, salvataggio dei risultati.
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