CN104756871B - 一种青鸟寿的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青鸟寿的组织培养方法，以青鸟寿肉质叶片作为外植体，清洗后杀菌消毒，然后将外植体切至长约1.5‑2cm，将切口向上斜插到启动培养基中，培养温度25±2℃，光照时间为24h/d，光照度为2000lx，培养7d后青鸟寿外植体叶肉逐渐膨大，此时将外植体转入诱导愈伤培养基培养，20天后外植体形成愈伤组织；转入分化培养基中培养，35天左右愈伤组织逐渐萌动分化出芽点，50天后转入芽增殖培养基增殖成小芽，丛生芽逐渐形成丛生苗，并长出小青鸟寿；利用解剖刀将丛生苗分割，继续增殖培养，70天后入盆。该方法使用多肉植物叶肉组织作为外植体，可以短时间获得大量植物材料，从而使得包括青鸟寿在内的多肉植物得到快速繁殖与推广。

Description

一种青鸟寿的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物组培培养技术领域，特别是涉及一种青鸟寿的组织培养方法。

背景技术

青鸟寿(Haworthia retusa)为百合科十二卷属多肉植物，原产非洲南部。由于叶顶有窗，从上方俯视下去看到的正是由许多三角形合成的一个圆，犹如寿字纹所表现的那样，从此就称之为“寿”。正寿共有九种，为：西山寿，帝王寿，青鸟寿，玉露寿，白银寿，毛蟹寿，赤肌寿，磨面寿，芳亭寿。寿的品种繁多，虽都小巧铃拢，但外型都相当精巧美丽，变化丰富的奇特叶片，生长缓慢，观赏期长，不论是孤赏还是组合盆景都可以保持相对长期的固定观赏，形似花朵一年四季犹如鲜花绽放，素有“不败之花”的美称。是家庭栽培观赏的理想种类，园艺爱好者都竞相收藏。由于许多种类繁殖率低,生长缓慢，原产地不在我国，尤其是出锦的青鸟寿，更是价值连城，观赏价值极高。

以往多肉植物的组织培养外植体多以花梗或花茎为主，多肉植物多是多年生植物，有的次年开花，有的多年后开花，当年开花者较少，有的好几年才开一次花，有的很难见到开花。外植体取材受到时间季节限制。一些高档观赏性多肉植物，较为稀缺，材料较少，植物组培受到材料来源限制，成功率较低。很难快速繁殖，造成生产周期延长。目前尚未有关于青鸟寿组织培养快繁体系研究的报道。

发明内容

发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种青鸟寿的组织培养方法，利用青鸟寿叶肉作为外植体材料进行组织培养，在短时间获得大量植物材料，从而使得包括青鸟寿在内的多肉植物得到快速繁殖与推广。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种青鸟寿的组织培养方法，包括如下步骤：

以青鸟寿肉质叶片作为外植体，充分清洗后备用；

2)将清洗后的青鸟寿外植体杀菌消毒，然后用手术刀将较大的外植体以45°斜口切至长约1.5-2cm，再将切分后的外植体切口向上斜插到启动培养基中，培养温度25±2℃，光照时间为24h/d，光照度为2000lx，培养7d以上；启动培养基配方为MS+琼脂7g/L+蔗糖30g/L；

3)7d后青鸟寿外植体叶肉逐渐膨大，此时将外植体转入诱导愈伤培养基培养，20天后外植体形成黄绿色的疏松的小球状的愈伤组织；诱导愈伤培养基配方为MS+NAA0.1～0.4mg/L+6-BA1.0～2.5mg/L+KT 0.01～0.03mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L；培养条件为：25+2℃，每天光照8～12h/d，光照强度为2000～4000lx，以20～30天为周期更换培养基；

4)将愈伤组织转入分化培养基中培养，35天左愈伤组织逐渐变转成淡绿色，在淡绿色愈伤上萌动分化出芽点，50天后转入芽增殖培养基中增殖成小芽，丛生芽逐渐形成丛生苗，并长出小青鸟寿；分化培养基配方为：MS+NAA0.1～0.2mg/L+6-BA 0.1～0.5mg/L+KT0.01～0.02mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L；芽增殖培养基为MS+NAA0.05～0.1mg/L+6-BA0.05～0.5mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L；培养条件为：25+2℃，每天光照8～12h/d，光照强度为2000～4000lx，以20～30天为周期更换培养基；

5)壮苗和移栽：将已生根瓶苗或未生根的瓶苗转移到人工气侯室中进行炼苗，控制相对湿度为85％～95％，温度为25℃～30℃，10天后洗净移栽到育苗钵中，进行移栽管理即可。

步骤1)中，利用棉线将选取的青鸟寿外植株叶片剥离成单个叶片，先用洗衣粉清洗青鸟寿叶片，清洗完后倒去洗涤液，然后将经过洗衣粉清洗的叶片在自来水下冲洗30分钟后，将叶片放于4℃过夜，次日将叶片置于流水下冲洗2小时。

步骤2)中，将清洗后的青鸟寿外植体，放置在超净工作台的烧杯中用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡后在用无菌水冲洗2-3次，然后迅速将青鸟寿培养部位倒入浓度为0.1％升汞液中浸泡8-10min，将升汞消毒后的外植体用无菌水洗涤3-4次，每次3-5min，确保外植体表面的升汞被洗净为止。

步骤2)中，将切分后的外植体切口向上斜插到启动培养基中，每瓶培养基中接1个外植体，防止污染。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点包括：本发明的青鸟寿的组织培养方法，使用多肉植物叶肉组织作为外植体，克服了多肉植物受到时间季节限制，取材短缺的局限性，可以短时间获得大量植物材料，从而使得包括青鸟寿在内的多肉植物得到快速繁殖与推广。本发明可以使名贵青鸟寿品系在较短时间内快速繁殖，采用以上方案后，以青鸟寿的叶肉为外植体，可以在原取材花茎所需时间大大缩短，只要有一株名贵品种青鸟寿母本，不论生长状态季节时间，可以在12个月左右形成6万株以上小苗，解决了名贵品种在短期时间内快速繁殖的问题，从而形成当年提供青鸟寿母本，次年即可规模化将新品种推向市场。

附图说明

图1是青鸟寿母本的照片图；

图2是外植体切割面愈伤组织诱导结果图；

图3是初代培养诱导愈伤培养20d的生长情况结果图；

图4是初代培养诱导愈伤培养30d的生长情况结果图；

图5是继代培养愈伤增殖后分化出芽点结果图；

图6是继代愈伤分化成芽结果图；

图7是初代培养愈伤分化成小苗结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来说明本发明。

实施例1

一种青鸟寿的组织培养方法，包括如下步骤：

1)取材：使用青鸟寿母本(如图1所示)的肉质叶片作为外植体，利用棉线将选取的青鸟寿外植株叶片剥离成单个叶片，先用含有60％直链烷基苯磺酸钠洗涤剂清洗青鸟寿叶片，清洗完后倒去洗涤液，然后将经过洗衣粉清洗的叶片在自来水下冲洗30分钟后，将叶片放于4℃过夜，次日将叶片置于流水下冲洗2小时。

2)材料灭菌：将通过上述清洗的青鸟寿外植体，放置在超净工作台的烧杯中用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡后在用无菌水冲洗2-3次，接下来迅速将青鸟寿培养部位倒入浓度为0.1％升汞液中浸泡8-10min，将升汞消毒后的外植体用无菌水洗涤3-4次，每次3-5min，确保外植体表面的升汞被洗净为止。然后将外植体放置在已灭菌的吸水纸上，用手术刀将较大的外植体以45°斜口切至长约1.5-2cm，再将切分后的外植体切口向上斜插到启动培养基MS+琼脂7g/L+蔗糖30g/L中，每瓶培养基中接2-3个外植体，放到人工培养室中培养。培养温度约为(25±2)℃，光照时间为24h/d，光照度为2000lx。

3)愈伤组织的诱导和增殖：7天后青鸟寿外植体叶肉逐渐膨大(如图2所示，此时将外植体转入诱导愈伤培养基培养MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L+KT 0.02mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，20天后水晶掌外植体形成黄绿色的疏松的小球状的愈伤组织(如图3)，25天后愈伤组织状态良好。将愈伤组织剥出1cm左右放入愈伤组织增殖培养基中MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L+KT0.01mg/L琼脂7g/L+蔗糖30g/L增殖(如图4)。

4)不定芽的分化和增殖：将步骤3)转入分化培养基中MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L+KT 0.01mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，35天左右愈伤组织逐渐变转成淡绿色，在淡绿色愈伤上萌动分化出芽点(如图5)，50天后转入芽增殖培养基增殖成小芽(如图6)，丛生芽逐渐形成丛生苗，并长出小青鸟寿。

5)壮苗和移栽：将已生根瓶苗或未生根的瓶苗转移到人工气侯室中进行炼苗，控制相对湿度为85％～95％，温度为25℃～30℃，10天后洗净移栽到直径5厘米的育苗钵中，进行移栽管理即可。

实施例2

升汞的消毒时间对外植体的染菌情况有较大影响，消毒时间短会造成灭菌不彻底，染菌情况严重；消毒时间过长则会造成灭菌过度，引起外植体的褐化而死亡。因此，使用最适消毒时间，才能为后期的愈伤组织诱导提供无菌外植体。实验进行三批，每批接种数量相同，取三批次实验结果的平均数，得到表1。由表1可知，浓度为0.1％的升汞最佳消毒时间为5min。3min的灭菌结果不甚理想，染菌情况比较严重，染菌率达到了100％，外植体最终也因染菌而死亡；4.5min的消毒时间能达到一定程度的灭菌效果，但不如5min的灭菌效果好；而6min的灭菌时间虽能达到较好的灭菌效果，但会造成大部分外植体灭菌过度而使其失去生长活性，从而不利于外植体后期的愈伤组织诱导。而5min的灭菌时间既能达到很大程度的灭菌效果，又能使外植体体积膨大，保持生长活性。所以针对本次的实验材料，经综合比较后，升汞消毒时间达到5min是最佳选择。

表1升汞对外植体不同灭菌时间的结果

实施例3

同一种生长激素使用的浓度不同，所产生的效果也不同，浓度过高或过低都可能引起愈伤组织的不诱导行为或造成诱导时间过长的状况。

将MS培养基中的无菌外植体转移到MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1～0.4mg/L，pH5.8-6.0的培养基中。实验进行三批，每批接种数量相同，取三批次实验的平均数，得到表2。由表2可知，0.1mg/L、0.4mg/L的NAA未能成功诱导愈伤组织，0.2mg/L、0.3mg/L的NAA浓度诱导率都能达到50％，但很明显0.2mg/L的NAA是最有利于愈伤组织诱导的激素浓度，因其能在最短的时间内长出愈伤组织。

表2不同浓度的NAA诱导青鸟寿愈伤组织的结果

愈伤组织较易长在外植体的切口部分或伤口部分，一般在23d后可见其切口部分有淡绿色小球粒状愈伤组织；30d后愈伤组织膨胀，其表面晶莹透亮，由许多个小球粒状愈伤簇拥而成。

将MS培养基中的无菌外植体转接到MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0～2.5mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.8-6.0的培养基中。实验进行三批，每批接种数量相同，取三批次实验结果的平均数，得到表3。由表3可知，2.5mg/L的6-BA对愈伤组织的诱导是不利的，都未能长出愈伤组织；2.0mg/L的6-BA虽能诱导出愈伤组织，但诱导时间过长，且数量较少；浓度在1.5mg/L的6-BA对诱导青鸟寿愈伤组织的效果是最佳的，也是能在最快的时间内诱导出愈伤组织的激素浓度。

表3不同浓度的6-BA诱导青鸟寿愈伤组织的结果

由表2和表3可以看出，外植体在不同的激素浓度组合下长出愈伤组织的时间不同，可以初步得出外植体在不同浓度激素诱导过程中，愈伤组织的分化能力也不一样。NAA浓度在0.2mg/L、6-BA浓度在1.5mg/L时，愈伤组织的分化时间是最短的，分化能力也是最强的，其结果并不是随浓度升高或降低呈现有规律的变化。且NAA浓度在0.2mg/L、6-BA浓度在1.5mg/L的组合浓度下，愈伤分化的速度比较快。

将MS培养基中的无菌外植体转接到MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L+KT0.01～0.02mg/L，pH5.8-6.0的培养基中。实验进行三批，每批接种数量相同，取三批次实验结果的平均数，得到表4。由表4可知，0.15mg/L的KT对愈伤组织的诱导愈伤组织的效果是最佳的，得到青鸟寿愈伤组织诱导培养基MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L+KT 0.15mg/L。

表4不同浓度的KT诱导青鸟寿愈伤组织的结果

Claims (4)

1.一种青鸟寿的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以青鸟寿肉质叶片作为外植体，充分清洗后备用；

2)将清洗后的青鸟寿外植体杀菌消毒，然后用手术刀将较大的外植体以45°斜口切至长1.5-2cm，再将切分后的外植体切口向上斜插到启动培养基中，培养温度25±2℃，光照时间为24h/d，光照度为2000lx，培养7d以上；启动培养基配方为MS+琼脂7g/L+蔗糖30g/L；

3)7d后青鸟寿外植体叶肉逐渐膨大，此时将外植体转入诱导愈伤培养基培养，20天后外植体形成黄绿色的疏松的小球状的愈伤组织；诱导愈伤培养基配方为MS+NAA0.1～0.4mg/L+6-BA1.0～2.5mg/L+KT 0.01～0.03mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L；培养条件为：25+2℃，每天光照8～12h/d，光照强度为2000～4000lx，以20～30天为周期更换培养基；

4)将愈伤组织转入分化培养基中培养，35天愈伤组织逐渐变转成淡绿色，在淡绿色愈伤上萌动分化出芽点，50天后转入芽增殖培养基中增殖成小芽，丛生芽逐渐形成丛生苗，并长出小青鸟寿；分化培养基配方为：MS+NAA0.1～0.2mg/L+6-BA 0.1～0.5mg/L+KT 0.01～0.02mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L；芽增殖培养基为MS+NAA0.05～0.1mg/L+6-BA0.05～0.5mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L；培养条件为：25+2℃，每天光照8～12h/d，光照强度为2000～4000lx，以20～30天为周期更换培养基；

5)壮苗和移栽：将已生根瓶苗或未生根的瓶苗转移到人工气侯室中进行炼苗，控制相对湿度为85％～95％，温度为25℃～30℃，10天后洗净移栽到育苗钵中，进行移栽管理即可。

2.根据权利要求1所述的青鸟寿的组织培养方法，其特征在于：步骤1)中，利用棉线将选取的青鸟寿外植株叶片剥离成单个叶片，先用洗衣粉清洗青鸟寿叶片，清洗完后倒去洗涤液，然后将经过洗衣粉清洗的叶片在自来水下冲洗30分钟后，将叶片放于4℃过夜，次日将叶片置于流水下冲洗2小时。

3.根据权利要求1所述的青鸟寿的组织培养方法，其特征在于：步骤2)中，将清洗后的青鸟寿外植体，放置在超净工作台的烧杯中用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡后再用无菌水冲洗2-3次，然后迅速将青鸟寿培养部位倒入浓度为0.1％升汞液中浸泡8-10min，将升汞消毒后的外植体用无菌水洗涤3-4次，每次3-5min，确保外植体表面的升汞被洗净为止。

4.根据权利要求1所述的青鸟寿的组织培养方法，其特征在于：步骤2)中，将切分后的外植体切口向上斜插到启动培养基中，每瓶培养基中接2-3个外植体。