CN104684577A

CN104684577A - 免疫原性wt-1肽及其使用方法

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Publication number: CN104684577A
Application number: CN201380014022.7A
Authority: CN
Inventors: R·J·奥赖利; E·道布罗维纳; A·塞尔瓦库马尔
Original assignee: Commemorate This Long Kaitelin Cancer Center
Current assignee: Commemorate This Long Kaitelin Cancer Center
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2033-01-14
Also published as: EP2802347B1; EP3520810A2; AU2018201210A1; EP3520810A3; JP6995645B2; CN104684577B; US10100087B2; AU2013207669A1; US20170334951A1; JP2015512866A; AU2018201210B2; HK1204261A1; EP2802347A4; AU2013207669C1; EP2802347A2; AU2013207669B9; CN108676069A; JP2018104438A; WO2013106834A3; JP6282598B2

Abstract

本发明提供肽、免疫原性组合物和疫苗，以及治疗表达WT-1的癌症、降低表达WT-1的癌症的发病率和诱导针对表达WT-1的癌症的免疫应答的方法，包括来源于WT-1蛋白的肽。

Description

免疫原性WT-1肽及其使用方法

政府支持

本工作得到国立卫生研究院基金CA23766，CA59350和CA08748的支持。美国政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明提供肽，包括所述肽的组合物和疫苗，以及治疗表达WT-1的癌症、降低表达WT-1的癌症的发病率和诱导针对表达WT-1的癌症的免疫应答的方法，包括施用所述肽、组合物或疫苗。

发明背景

维尔姆斯瘤(WT)，在新生儿中以1/10000频率发生的小儿肾母细胞瘤，数年来已成为大量临床和基础研究的内容。该肿瘤是胚胎来源的；其通常在5岁之前的儿童中检测到，可以在单侧或双侧发生。当发育中肾的致密后肾间充质细胞不能正确分化时，WT出现。维尔姆斯瘤1(WT-1)肿瘤抑制基因在WT病因学中的参与显示遗传变异可以对发育和肿瘤发生均产生影响。

维尔姆斯瘤蛋白I(WT-1)是在正常个体发育期间在诸如胎儿肾、睾丸和卵巢中表达的锌指转录因子。在成人中，WT-1限于造血干细胞、肌上皮祖细胞、肾足细胞以及睾丸和卵巢中的一些细胞中的低水平表达。最近证实了WT-1在数种白血病类型中过表达，表明WT-1将成为各种癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。

发明概述

本发明提供肽、组合物和免疫原性组合物诸如包括免疫原性肽的疫苗，以及治疗表达WT-1的癌症、降低表达WT-1的癌症的发病率，和诱导针对表达WT-1的癌症的免疫应答的方法，包括施用免疫原性肽。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的WT-1肽，其具有由序列SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191和193中任一项组成的氨基酸(AA)序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的HLA I类结合WT-1肽，其具有由序列SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，190，191和193中任一项组成的氨基酸(AA)序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的HLA II类结合WT-1肽，其具有由序列SEQ ID NO:149，156，173，174和180中任一项组成的氨基酸(AA)序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的WT-1肽，其具有由序列SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191和193任一项组成的氨基酸(AA)序列，或上述任一项的片段。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的HLAI类结合WT-1肽，其具有由序列SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，190，191和193中任一项组成的氨基酸(AA)序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的HLA II类结合WT-1肽，其具有由序列SEQ ID NO:149，156，173，174和180中任一项组成的氨基酸(AA)序列。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包括(a)抗原呈递细胞和(b)选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191和193的肽的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供一种包括(a)抗原呈递细胞和(b)HLA I类结合肽的组合物，所述HLA I类结合肽选自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183。在另一个实施方案中，本发明提供一种包括(a)抗原呈递细胞和(b)HLA II类结合肽的组合物，所述HLA II类结合肽选自SEQ ID NO:149，156，173，174和180。

在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中的一或多种肽。在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括选自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183的一或多种HLA I类结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括选自SEQ ID NO:149，156，173，174和180的一或多种HLA II类结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括选自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183的一或多种HLA I类结合肽，和选自SEQ ID NO:149，156，173，174和180的一或多种HLA II类结合肽。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有表达WT-1的癌症的对象的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1肽或疫苗，从而治疗患有表达WT-1的癌症的对象。

在另一个实施方案中，本发明提供一种在对象中降低表达WT-1的癌症的发病率或其复发的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1肽或疫苗，从而在对象中降低表达WT-1的癌症的发病率或其复发。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导WT-1蛋白特异性CTL的形成和增殖的方法，所述方法包括将淋巴细胞群与本发明的肽或组合物接触，从而诱导WT-1蛋白特异性CTL的形成和增殖。该方法可以在体外、离体或体内进行。当在体外或离体进行时，这些CTL继而可以被输注入患者以达到治疗效果。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导(a)WT-1蛋白特异性CD8⁺淋巴细胞；或(b)对WT-1蛋白特异的CD4⁺淋巴细胞、或其组合的形成和增殖的方法，所述方法包括将淋巴细胞群与本发明的肽或组合物接触，从而诱导(a)WT-1蛋白特异性CD8⁺淋巴细胞；或(b)对WT-1蛋白特异的CD4⁺淋巴细胞、或其组合的形成和增殖。该方法可以在体外、离体或体内进行。当在体外或离体进行时，这些CTL继而可以被输注入患者以达到治疗效果。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导对象的抗癌免疫应答的方法，所述方法包括将对象与免疫原性组合物接触的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；(b)WT蛋白的片段；(c)编码WT-1蛋白的核苷酸分子；或(d)编码WT-1蛋白片段的核苷酸分子，从而诱导对象的抗间皮瘤免疫应答。在一个实施方案中，WT-1蛋白的片段由来自SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193的肽组成或包括来自SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193的肽。在另一个实施方案中，所述片段由以下肽组成或包括以下肽，所述肽来自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183，或SEQ ID NO:149，156，173，174和180。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；(b)WT蛋白的片段；(c)编码WT-1蛋白的核苷酸分子；或(d)编码WT-1蛋白片段的核苷酸分子，从而治疗患有间皮瘤的对象。在一个实施方案中，WT-1蛋白的片段是来自SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191或193的肽。在另一个实施方案中，所述片段由以下肽组成或包括以下肽，所述肽来自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183，或SEQ ID NO:156，173，174和180。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的癌症发病率或其复发的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；(b)WT蛋白的片段；(c)编码WT-1蛋白的核苷酸分子；或(d)编码WT-1蛋白片段的核苷酸分子，从而降低对象的间皮瘤发病率或其复发。在一个实施方案中，WT-1蛋白的片段是来自SEQ IDNO：1-160，162-185，190，191或193的肽。在另一个实施方案中，所述片段由以下肽组成或包括以下肽，所述肽来自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183，或SEQ IDNO:149，156，173，174和180。

在另一个实施方案中，癌症是表达WT-1的癌症。在一个实施方案中，表达WT-1的癌症是急性髓性白血病(AML)。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症与脊髓发育不良综合征(MDS)有关。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是MDS。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是维尔姆斯氏瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是白血病。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是血液癌症。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是淋巴瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是促结缔组织增生的小圆细胞瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是间皮瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是恶性间皮瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是胃癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是结肠癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是生殖细胞瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是卵巢癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是子宫癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是甲状腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肝细胞癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是甲状腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肝癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肾癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是卡波西氏肉瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肉瘤。在另一个实施方案，表达WT-1的癌症是任意其他癌或肉瘤。

在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是实体瘤。在另一个实施方案中，实体瘤与表达WT-1的癌症有关。在另一个实施方案中，实体瘤与脊髓发育不良综合征(MDS)有关。在另一个实施方案中，实体瘤与非小细胞肺癌(NSCLC)有关。在另一个实施方案中，实体瘤与肺癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与乳腺癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与结肠直肠癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与前列腺癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与卵巢癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与肾癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与胰腺癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与脑癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与胃肠癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与皮肤癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与黑色素瘤有关。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包括本发明分离的肽以及至少1种其他WT-1肽的组合物。在一些实施方案中，提供包括至少2种不同的本发明分离的肽的组合物。在一些实施方案中，提供包括至少3种或至少4种不同的本发明分离的肽的组合物。每种可能性代表本发明单独的实施方案。在一些实施方案中，本发明的组合物是疫苗。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有表达WT-1的癌症的对象的方法，所述方法包括给对象施用本发明的肽或组合物，从而治疗患有表达WT-1的癌症的对象。

在另一个实施方案中，本发明提供一种在对象中降低表达WT-1的癌症的发病率或其复发的方法，所述方法包括给对象施用本发明的肽或组合物，从而在对象中降低表达WT-1的癌症的发病率或其复发。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导WT-1蛋白特异性CTL的形成和增殖的方法，所述方法包括将淋巴细胞群与本发明的肽或组合物接触，从而诱导WT-1蛋白特异性CTL的形成和增殖。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导(a)WT-1蛋白特异性CD8⁺淋巴细胞；或(b)对WT-1蛋白特异的CD4⁺淋巴细胞、或其组合的形成和增殖的方法，所述方法包括将淋巴细胞群与本发明的肽或组合物接触，从而诱导(a)WT-1蛋白特异性CD8⁺淋巴细胞；或(b)对WT-1蛋白特异的CD4⁺淋巴细胞、或其组合的形成和增殖。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种具有至少一个氨基酸变化的本发明肽，所述氨基酸变化增加所述肽结合HLA分子的亲和力。

本申请要求2012年1月13日提交的系列号为61/586,177和2012年5月15日提交的系列号为61/647,207的美国临时申请的优先权；这两者均以全文引入本文作为参考。

附图简述

为使本发明的上述特征、优点和目的以及其他将明显，可以被实现以及可以更详细地被了解，简要概括了本发明的更具体的描述。上述细节可以参考其某些实施方案，其在附图中显示。这些附图构成说明书的一部分。但是应当注意，附图显示本发明优选的实施方案，因此不应被认为限制它们的范围。

图1A-D显示通过用加载WT-1来源的十五肽总库的自体APC刺激，从正常供体(n＝56)的PBMC产生的CTL的WT-1特异性应答；

图2A-E描述用于产生跨越WT-1蛋白全序列的重叠十五肽的总库和表位定位的策略；

图3A-D显示在与加载于自体CAM上的重叠15-聚体的WT-1总库共培养40天后，WT-1 CTL中针对来源于WT-1蛋白的相同免疫优势肽(immunodominant peptide)序列的组合HLA I类和II类限制性WT-1特异性T细胞应答；

图4A-F显示WT-1的图式；和

图5描述在8个正常A0201+供体中使用加载于A0201-AAPC上的混合A0201表位的结果。

发明详述

本发明提供免疫原性肽，和包括免疫原性肽的组合物和疫苗，以及治疗表达WT-1的癌症、降低表达WT-1的癌症的发病率和诱导针对表达WT-1的癌症的免疫应答的方法，包括施用一或多种免疫原性肽。

本发明提供WT-1肽，以及治疗表达WT-1的癌症、降低表达WT-1的癌症的发病率和诱导针对表达WT-1的癌症的免疫应答的方法，包括免疫原性肽。

在另一个实施方案中，作为本发明肽来源的WT-1分子具有以下序列：

1 SRQRPHPGAL RNPTACPLPH FPPSLPPTHS PTHPPRAGTAAQAPGPRRLL

51 AAILDFLLLQ DPASTCVPEP ASQHTLRSGP GCLQQPEQQGVRDPGGIWAK

101 LGAAEASAER LQGRRSRGAS GSEPQQMGSD VRDLNALLPAVPSLGGGGGC

151 ALPVSGAAQW APVLDFAPPG ASAYGSLGGP APPPAPPPPPPPPPHSFIKQ

201 EPSWGGAEPH EEQCLSAFTV HFSGQFTGTA GACRYGPFGPPPPSQASSGQ

251 ARMFPNAPYL PSCLESQPAI RNQGYSTVTF DGTPSYGHTPSHHAAQFPNH

301 SFKHEDPMGQ QGSLGEQQYS VPPPVYGCHT PTDSCTGSQALLLRTPYSSD

351 NLYQMTSQLE CMTWNQMNLG ATLKGVAAGS SSSVKWTEGQSNHSTGYESD

401 NHTTPILCGA QYRIHTHGVF RGIQDVRRVP GVAPTLVRSASETSEKRPFM

451 CAYPGCNKRY FKLSHLQMHS RKHTGEKPYQ CDFKDCERRFSRSDQLKRHQ

501 RRHTGVKPFQ CKTCQRKFSR SDHLKTHTRT HTGKTSEKPFSCRWPSCQKK

551 FARSDELVRH HNMHQRNMTK LQLAL(SEQ ID NO:194)

WT-1蛋白的上述序列是由Gessler等人(37)公开的那些，其包括575个氨基酸，并包括在WT-116的(外显子5+，KTS+)同种型中缺失的N端前126个氨基酸。

在另一个实施方案中，WT-1序列是：

MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPP

PPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQA

RMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGS

LGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLK

GVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTL

VRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLK

RHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVR HHNMHQRNMTKLQLAL(GenBank登录号AY245105；SEQ ID NO:195)。

在另一个实施方案中，WT-1分子具有序列：

AAEASAERLQGRRSRGASGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAP

VLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQF

TGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHT

PSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDN

LYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRV

PGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRF

SRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPFSCRWPSCQKKFARS DELVRHHNMHQRNMTKLQLAL(GenBank登录号NM_000378；SEQ ID NO:196)。

在另一个实施方案中，WT-1分子具有序列：

MQDPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAERLQGRRSRGA

SGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGP

APPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQ

ASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDP

MGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQM

NLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRV

PGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRF

SRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPFSCRWPSCQKKFARS DELVRHHNMHQRNMTKLQLAL(GenBank登录号NP_077742；SEQ ID NO:197)。

在另一个实施方案中，WT-1蛋白具有GenBank登录号NM_024426所示的序列。在其他实施方案中，WT-1蛋白具有或包括下列序列条目之一所示的一条序列:NM_024425，NM_024424，NM_000378，S95530，D13624，D12496，D 12497，或X77549。在另一个实施方案中，WT-1蛋白具有本领域已知的任意其他WT-1序列。本发明提供肽、组合物和免疫原性组合物诸如包括免疫原性肽的疫苗，以及治疗表达WT-1的癌症、降低表达WT-1的癌症的发病率和诱导针对表达WT-1的癌症的免疫应答的方法，包括施用免疫原性肽。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的WT-1肽，其具有由序列SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191和193中任一项组成的氨基酸(AA)序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的HLA I类结合WT-1肽，其具有由序列SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183中任一项组成的氨基酸(AA)序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的HLA II类结合WT-1肽，其具有由序列SEQID NO:149，156，173，174和180中任一项组成的氨基酸(AA)序列。在另一个实施方案中，HLA I类肽由SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151组成或包括SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151，以及HLA II类肽由SEQ ID NO：149组成或包括SEQ ID NO：149。

在一个实施方案中，本发明提供一种分离的WT-1肽或其片段，所述分离的WT-1肽具有包括序列SEQ ID NO:1-53或43-XXX中任一项的氨基酸(AA)序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的HLA I类结合WT-1肽，其具有包括序列SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183中任一项的氨基酸(AA)序列。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的HLA II类结合WT-1肽，其具有包括序列SEQ ID NO:149，156，173，174和180中任一项的氨基酸(AA)序列。在另一个实施方案中，HLA I类肽由SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151组成或包括SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151，以及HLA II类肽由SEQ ID NO：149组成或包括SEQ ID NO：149。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包括(a)抗原呈递细胞和(b)选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191和193的肽的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供一种包括(a)抗原呈递细胞和(b)HLA I类结合肽的组合物，所述HLA I类结合肽选自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183。在另一个实施方案中，本发明提供一种包括(a)抗原呈递细胞和(b)HLA II类结合肽的组合物，所述HLA II类结合肽选自SEQ ID NO:149，156，173，174和180。在另一个实施方案中，HLA I类肽由SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151组成或包括SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151，以及HLA II类肽由SEQ ID NO：149组成或包括SEQ IDNO：149。

在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中的一或多种肽。在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括选自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183的一或多种HLA I类结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括选自SEQ ID NO:149，156，173，174和180的一或多种HLA II类结合肽。在另一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括选自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183的一或多种HLA I类结合肽，和选自SEQ ID NO:149，156，173，174和180的一或多种HLA II类结合肽。在另一个实施方案中，HLA I类肽由SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151组成或包括SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151，以及HLA II类肽由SEQ ID NO：149组成或包括SEQ ID NO：149。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；(b)WT蛋白的片段；(c)编码WT-1蛋白的核苷酸分子；或(d)编码WT-1蛋白片段的核苷酸分子，从而治疗患有间皮瘤的对象。在一个实施方案中，WT-1蛋白的片段是来自SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193的肽。在另一个实施方案中，所述片段由以下肽组成或包括以下肽，所述肽来自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183，或SEQ ID NO:149，156，173，174和180。在另一个实施方案中，HLA I类肽由SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151组成或包括SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151，以及HLA II类肽由SEQ ID NO：149组成或包括SEQ ID NO：149。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的癌症发病率或其复发的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；(b)WT蛋白的片段；(c)编码WT-1蛋白的核苷酸分子；或(d)编码WT-1蛋白片段的核苷酸分子，从而降低对象的间皮瘤发病率或其复发。在一个实施方案中，WT-1蛋白的片段是来自SEQ IDNO：1-160，162-185，190，191或193的肽。在另一个实施方案中，所述片段由以下肽组成或包括以下肽，所述肽来自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183，或SEQ IDNO:149，156，173，174和180。在另一个实施方案中，HLA I类肽由SEQID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151组成或包括SEQID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151，HLA II类肽由SEQ ID NO：149组成或包括SEQ ID NO：149。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导对象的抗癌免疫应答的方法，所述方法包括将对象与免疫原性组合物接触的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；(b)WT蛋白的片段；(c)编码WT-1蛋白的核苷酸分子；或(d)编码WT-1蛋白片段的核苷酸分子，从而诱导对象的抗间皮瘤免疫应答。在一个实施方案中，WT-1蛋白的片段是来自SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191或193的肽。在另一个实施方案中，所述片段由以下肽组成或包括以下肽，所述肽来自SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183，或SEQ ID NO:149，156，173，174和180。在另一个实施方案中，HLA I类肽由SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151组成或包括SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151，HLA II类肽由SEQ IDNO：149组成或包括SEQ ID NO：149。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；(b)WT蛋白的片段；(c)编码WT-1蛋白的核苷酸分子；或(d)编码WT-1蛋白片段的核苷酸分子，从而治疗患有间皮瘤的对象。在一个实施方案中，WT-1蛋白的片段是来自SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191或193的肽。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的癌症发病率或其复发的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；(b)WT蛋白的片段；(c)编码WT-1蛋白的核苷酸分子；或(d)编码WT-1蛋白片段的核苷酸分子，从而降低对象的间皮瘤发病率或其复发。在一个实施方案中，WT-1蛋白的片段是来自SEQ IDNO：1-160，162-185，190，191或193的肽。

在另一个实施方案中，癌症是表达WT-1的癌症。在一个实施方案中，表达WT-1的癌症是急性髓性白血病(AML)。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症与脊髓发育不良综合征(MDS)有关。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是MDS。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是维尔姆斯氏瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是白血病。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是血液癌症。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是淋巴瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是促结缔组织增生的小圆细胞瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是间皮瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是恶性间皮瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是胃癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是结肠癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是生殖细胞瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是卵巢癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是子宫癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是甲状腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肝细胞癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是甲状腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肝癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肾癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是卡波西氏肉瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肉瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是任意其他癌症或肉瘤。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导(a)WT-1蛋白特异性CD8⁺淋巴细胞；或(b)对WT-1蛋白特异的CD4⁺淋巴细胞，或其组合的形成和增殖的方法，所述方法包括将淋巴细胞群与本发明的肽或组合物接触，从而诱导(a)WT-1蛋白特异性CD8⁺淋巴细胞；或(b)对WT-1蛋白特异的CD4⁺淋巴细胞，或其组合的形成和增殖。

在本发明方法和组合物的另一个实施方案中，“肽”是指通过肽键连接的亚单位氨基酸的化合物。在另一个实施方案中，肽包括氨基酸类似物。在另一个实施方案中，肽包括模拟肽。将在下文列举可以包括在本发明方法和组合物的肽中的不同氨基酸类似物和模拟肽。在另一个实施方案中，亚单位通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚单位通过另一类型的键(例如酯键，醚键，等等)连接。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

本发明未改变的肽(如上下文所述)在本文中被统称为“WT-1肽”。下文中针对“WT-1肽”列举的每一实施方案适用于本发明未改变的WT-1肽和HLA I类和II类变态(heteroclitic)肽。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合HLA I类分子或II类分子。在另一个实施方案中，所述肽与I类和II类分子均结合。在另一个实施方案中，HLA II类分子是HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，HLA II类分子是HLA-DRA分子。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA-DQA1分子。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA-DQB1分子。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA-DPA1分子。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA-DPB1分子。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA-DMA分子。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA-DMB分子。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA-DOA分子。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA-DOB分子。在另一个实施方案，HLA分子是本领域已知的任意其他HLA II类分子。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-A分子，其结合模体(motif)包含于或包括本发明的肽。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-B分子。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-C分子。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-A0201分子。在另一个实施方案，分子是HLA A1。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA A2。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA A2.1。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA A3。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA A3.2。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA A11。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA A24。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA B7。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA B27。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA B8。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明方法和组合物的HLA I类分子-结合WT-1肽与HLA I类分子的超家族结合。在另一个实施方案中，所述超家族是A2超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是A3超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是A24超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是B7超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是B27超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是B44超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是C1超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是C4超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是本领域已知的任意其他超家族。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，HLA分子是A0101，A0201，A0203，A2402，A6901，B0702，A3101，B3501，B3503，B3508，B3802，B3801，B3901，B4001，B4402，B4701，B5701，C0401，C1701，DRB₁0101，DRB₁0402，DRB₁0402，DRB₁0401或DRB₁1104分子。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182和183，以及SEQ ID NO:149，156，173，174和180的肽，与表1或2中针对每种肽描述的HLA I类或II类分子结合。在另一个实施方案中，HLA I类肽由SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151组成或包括SEQ ID NO：142，143，144，145，146，147，148，150或151，HLA II类肽由SEQ ID NO：149组成或包括SEQ ID NO：149，并且与表1或表2中针对每种肽的相应一或多种HLA分子结合。在一个实施方案中，某些肽可以结合一种以上的HLA等位基因。

在另一个实施方案中，提供本发明肽的修饰。在一个实施方案中，所述修饰包括至少一个变态氨基酸变化，也称为突变或突变的，或锚定残基突变(见下文)。相对于肽的未突变对应物，本发明修饰肽的HLA I类分子结合模体显示对HLA I类分子的亲和力增加。在另一个实施方案中，点突变增加分离的突变WT-1肽对HLA I类分子的亲和力。在另一个实施方案中，亲和力增加是相对于分离的未突变WT-1肽的亲和力(针对相同HLA I类分子)，所述分离的突变WT-1肽来自所述分离的未突变WT-1肽。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，将本发明方法和组合物的WT-1肽设计为显示针对HLA分子的亲和力。在另一个实施方案中，亲和力是如本文描述的高亲和力。

HLA分子，在另一个实施方案中已知作为主要组织相容性复合体(MHC)分子，与肽结合并将它们呈递给免疫细胞。因此，在另一个实施方案中，肽的免疫原性是由其针对HLA分子的亲和力部分决定的。HLA I类分子与CD8分子相互作用，所述CD8分子通常存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上。HLA II类分子与CD4分子相互作用，所述CD4分子通常存在于辅助T淋巴细胞上。

在另一个实施方案中，本发明的肽是免疫原性的。在另一个实施方案中，“免疫原性”是指刺激、引发或参与免疫应答的能力。在另一个实施方案中，引发的免疫应答是细胞介导的免疫应答。在另一个实施方案中，免疫应答是细胞介导应答和体液应答的组合。

在另一个实施方案中，与MHC分子-肽复合物结合的T细胞被活化和诱导以增殖并裂解表达包括所述肽的蛋白的细胞。通常最初T细胞被“专业的”抗原呈递细胞(“APC”；例如树突状细胞，单核细胞，和巨噬细胞)活化，所述抗原呈递细胞呈递共刺激分子，它们促使T细胞活化而不是无反应或凋亡。在另一个实施方案中，如本文所述，应答是变态的，这样的话CTL裂解肿瘤细胞，所述肿瘤细胞表达与本发明肽具有AA序列同源性的蛋白或与最初刺激T细胞的肽不同的肽。

在另一个实施方案中，本发明的肽与T细胞接触诱导其分化为效应和/或记忆T细胞。效应或记忆T细胞与相同肽的后续接触，或，在另一个实施方案中，与本发明相关肽的接触，导致更快和更强烈的免疫应答。在另一个实施方案中，通过测量暴露于肽的T细胞群体的增殖程度来测量这种应答。在另一个实施方案中，通过下文列举的任意方法来测量这种应答。

在另一个实施方案中，本发明方法和组合物的肽以高亲和力与HLA II类分子结合。在其他实施方案中，HLA II类分子是本文列举的任意HLA II类分子。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明方法和组合物的肽的衍生物以高亲和力与HLA I类分子结合。在其他实施方案中，MHC I类分子是本文列举的任意MHC I类分子。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明方法和组合物的肽以显著亲和力与HLAII类分子结合，而来源于原始肽的肽以显著亲和力与HLA I类分子结合。

在另一个实施方案中，“亲和力”是指将标准肽与指定MHC分子的结合抑制50％所需的肽浓度。在另一个实施方案中，“高亲和力”是指如下亲和力，其使得标准肽结合的50％抑制需要约500纳摩(nM)或更低浓度的肽。在另一个实施方案中，需要约400nM或更低浓度的肽。在另一个实施方案中，结合亲和力是300nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是200nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是150nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是100nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是80nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是60nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是40nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是30nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是20nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是15nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是10nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是8nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是6nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是4nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是3nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是2nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是1.5nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是1nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是0.8nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是0.6nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是0.5nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是0.4nM。在另一个实施方案中，结合亲和力是0.3nM。在另一个实施方案中，结合亲和力低于0.3nM。

在另一个实施方案中，“亲和力”是指与MHC分子的结合强度的测量。在另一个实施方案中，使用本领域已知的测量竞争性结合亲和力的方法来测量亲和力。在另一个实施方案中，使用本领域已知的测量相对结合亲和力的方法来测量亲和力。在另一个实施方案中，所述方法是竞争性结合测定法。在另一个实施方案中，所述方法是放射免疫测定法或RIA。在另一个实施方案中，所述方法是BiaCore分析。在另一个实施方案中，所述方法是本领域已知的任意其他方法。在另一个实施方案中，所述方法产生相对于已知亲和力的参考肽的IC50的IC50。

每种类型的亲和力和测量亲和力的方法代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，“高亲和力”是指0.5-500nM的IC50。在另一个实施方案中，IC50是1-300nM。在另一个实施方案中，IC50是1.5-200nM。在另一个实施方案中，IC50是2-100nM。在另一个实施方案中，IC50是3-100nM。在另一个实施方案中，IC50是4-100nM。在另一个实施方案中，IC50是6-100nM。在另一个实施方案中，IC50是10-100nM。在另一个实施方案中，IC50是30-100nM。在另一个实施方案中，IC50是3-80nM。在另一个实施方案中，IC50是4-60nM。在另一个实施方案中，IC50是5-50nM。在另一个实施方案中，IC50是6-50nM。在另一个实施方案中，IC50是8-50nM。在另一个实施方案中，IC50是10-50nM。在另一个实施方案中，IC50是20-50nM。在另一个实施方案中，IC50是6-40nM。在另一个实施方案中，IC50是8-30nM。在另一个实施方案中，IC50是10-25nM。在另一个实施方案中，IC50是15-25nM。每种亲和力及亲和力范围代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明方法和组合物的肽结合HLA分子的超家族。HLA分子的超家族具有非常类似或相同的结合模体。在另一个实施方案中，所述超家族是HLA I类超家族。在另一个实施方案中，所述超家族是HLA II类超家族。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，术语“HLA结合肽”，“HLA I类分子结合肽”和“HLA II类分子结合肽”是指以可检测的亲和力结合HLA分子的肽。在另一个实施方案中，该术语是指以高亲和力结合HLA分子的肽。在另一个实施方案中，该术语是指以足以活化T细胞前体的亲和力结合HLA分子的肽。在另一个实施方案中，该术语是指以足以介导T细胞识别的亲和力结合HLA分子的肽。在其他实施方案中，HLA分子是本文列举的任意HLA分子。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，“变态”是指产生识别原始肽的免疫应答的肽，所述原始肽是变态肽的来源(例如不包含锚定残基突变的肽)。在另一个实施方案中，“原始肽”是指本发明的肽。在另一个实施方案中，“变态”是指产生识别原始肽的免疫应答的肽，所述原始肽是变态肽的来源，其中通过变态肽的免疫产生的免疫应答大于通过原始肽的免疫产生的免疫应答。在另一个实施方案中，“变态”免疫应答是识别原始肽的免疫应答，所述原始肽是改善肽的来源(例如不包含锚定残基突变的肽)。在另一个实施方案中，“变态”免疫应答是指识别原始肽的免疫应答，所述原始肽是变态肽的来源，其中通过变态肽的免疫产生的免疫应答程度大于通过原始肽的免疫产生的免疫应答。在另一个实施方案中，通过变态肽的免疫产生的免疫应答程度大于实质上相当于响应原始肽免疫的免疫应答。在另一个实施方案中，通过变态肽的免疫产生的免疫应答程度大于比响应原始肽免疫低的免疫应答。在另一个实施方案中，本发明的变态肽是HLA I类变态肽。用于鉴定HLA I类和II类残基以及通过突变残基提高HLA结合的方法是本领域公知的，如下所述。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的变态肽诱导相对于作为变态肽来源的WT-1肽(“天然肽”)增加至少2倍的免疫应答。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加3倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加5倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加7倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加10倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加15倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加20倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加30倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加50倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加100倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加150倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加200倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加300倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加500倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加1000倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加超过1000倍。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种来源于本发明分离的WT-1肽的HLA II类变态肽。在另一个实施方案中，衍生过程包括引入增强肽与HLAII类分子结合的突变。在另一个实施方案中，衍生过程由引入增强肽与HLAI类分子结合的突变组成。在另一个实施方案中，突变位于HLA II类锚定残基上。在另一个实施方案中，如本文举例说明的，按照与HLA I类变态肽的鉴定和检验类似的方式鉴定和检验本发明的变态II类肽。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，通过HLA II类模体锚定残基的突变，可以在本发明的肽中产生或改进HLA II类结合位点。在另一个实施方案中，修饰的锚定残基位于P1位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P2位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P6位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P9位置。在另一个实施方案中，锚定残基选自P1，P2，P6，和P9位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P3位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P4位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P5位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P6位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P8位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P10位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P11位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P12位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P13位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于本领域已知的HLA II类分子的任意其他锚定残基处。在另一个实施方案中，除了P1，P2，P6和P9之外的残基作为次级锚定残基(secondary anchor residue)；因此，将它们突变可以改进HLA II类结合。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，通过引入产生锚定模体的突变来产生变态肽。在另一个实施方案中，“锚定模体”或“锚定残基”是指在HLA结合序列的特定位置的1个或1组优选的残基。

HLA结合序列是HLA II类结合序列。在另一个实施方案中，HLA结合序列是HLA I类结合序列。在另一个实施方案中，对应于锚定模体的位置是在结合HLA分子中起重要作用的那些位置。在另一个实施方案中，锚定残基是初级锚定模体(primary anchor motif)。在另一个实施方案中，锚定残基是次级锚定模体。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

用于预测MHC II类表位的方法是本领域公知的。在另一个实施方案中，利用TEPITOPE(Meister GE,Roberts CG等人,Vaccine 199513:581-91)预测MHC II类表位。在另一个实施方案中。利用EpiMatrix(De Groot AS,Jesdale BM等人,AIDS Res Hum Retroviruses 199713:529-31)预测MHC II类表位。在另一个实施方案中，利用Predict Method(Yu K,Petrovsky N等人,Mol Med.20028:137-48)预测MHC II类表位。在另一个实施方案中，利用SYFPEITHI表位预测算法(实施例)预测MHC II类表位。在另一个实施方案中，利用Rankpep预测MHC II类表位。在另一个实施方案中，利用本领域已知的任意其他方法预测MHC II类表位。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，就HLA II类结合肽(例如HLA-DR-结合肽)而言，修饰的锚定残基位于P1位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P2位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P6位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于P9位置。在其他实施方案中，锚定残基是P3，P4，P5，P6，P8，P10，P11，P12或P13位置。在另一个实施方案中，锚定残基是本领域已知的HLA II类分子的任意其他锚定残基。在另一个实施方案中，除了P1，P2，P6和P9之外的残基作为次级锚定残基；因此，将它们突变可以改进HLA II类结合。在另一个实施方案中，将上述残基的任意组合进行突变。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合2种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合3种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合4种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合5种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合6种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合超过6种不同的HLA II类分子。

在另一个实施方案中，被本发明WT-1肽结合的HLA II类分子由指定HLA II类基因座的两个或更多个不同的等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA II类分子由基因座的3个不同等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA II类分子由基因座的4个不同等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA II类分子由基因座的5个不同等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA II类分子由基因座的6个不同等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA II类分子由基因座的超过6个不同等位基因编码。

在另一个实施方案中，被WT-1肽结合的HLA II类分子由2个不同基因座的HLA II类基因编码。在另一个实施方案中，结合的HLA分子由2个或更多个不同基因座的HLA II类基因编码。在另一个实施方案中，结合的HLA分子由3个不同基因座的HLA II类基因编码。在另一个实施方案中，结合的HLA分子由3个或更多个不同基因座的HLA II类基因编码。在另一个实施方案中，结合的HLA分子由4个不同基因座的HLA II类基因编码。在另一个实施方案中，结合的HLA分子由4个或更多个不同基因座的HLA II类基因编码。在另一个实施方案中，结合的HLA分子由超过4个不同基因座的HLA II类基因编码。在其他实施方案中，基因座选自HLA-DRB基因座。在另一个实施方案中，HLA II类结合肽是HLA-DRA结合肽。在另一个实施方案中，所述肽是HLA-DQAl结合肽。在另一个实施方案中，所述肽是HLA-DQB1结合肽。在另一个实施方案中，所述肽是HLA-DPA1结合肽。在另一个实施方案中，所述肽是HLA-DPB1结合肽。在另一个实施方案中，所述肽是HLA-DMA结合肽。在另一个实施方案中，所述肽是HLA-DMB结合肽。在另一个实施方案中，所述肽是HLA-DOA结合肽。在另一个实施方案中，所述肽是HLA-DOB结合肽。在另一个实施方案中，所述肽结合本领域已知的任意其他HLA II类分子。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合2种不同的HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，所述肽结合3种不同的HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，所述肽结合4种不同的HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，所述肽结合5种不同的HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，所述肽结合6种不同的HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，所述肽结合超过6种不同的HLA-DRB分子。

在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合由2个不同HLA-DRB等位基因编码的HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，HLA-DRB分子由3个不同的HLA-DRB等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA-DRB分子由4个不同的HLA-DRB等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA-DRB分子由5个不同的HLA-DRB等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA-DRB分子由6个不同的HLA-DRB等位基因编码。在另一个实施方案中，HLA-DRB分子由超过6个不同的HLA-DRB等位基因编码。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的WT-1肽结合由2个不同HLA-DRB等位基因编码的HLA-DRB分子，所述HLA-DRB等位基因选自DRB 101，DRB 301，DRB 401，DRB 701，DRB 1101，和DRB 1501。在另一个实施方案中，WT-1肽结合由3个不同HLA-DRB等位基因编码的HLA-DRB分子，所述HLA-DRB等位基因选自DRB 101，DRB 301，DRB 401，DRB 701，DRB 1101，和DRB 1501。在另一个实施方案中，WT-1肽结合由4个不同HLA-DRB等位基因编码的HLA-DRB分子，所述HLA-DRB等位基因选自DRB 101，DRB 301，DRB 401，DRB 701，DRB 1101，和DRB 1501。在另一个实施方案中，WT-1肽结合由5个不同HLA-DRB等位基因编码的HLA-DRB分子，所述HLA-DRB等位基因选自DRB 101，DRB 301，DRB401，DRB 701，DRB 1101，DRB 1101和DRB 1501。在另一个实施方案中，WT-1肽结合由由下列HLA-DRB等位基因的每一种编码的HLA-DRB分子：DRB 101，DRB 301，DRB 401，DRB 701，DRB 1101，和DRB 1501。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包括本发明2种不同WT-1肽的组合物。在另一个实施方案中，所述2种不同的WT-1肽都未被改变。在另一个实施方案中，所述WT-1肽的1种是未改变的，而另一种是变态的。在另一个实施方案中，所述两种WT-1肽均是变态的。

在另一个实施方案中，组合物包括本发明3种不同的WT-1肽。在另一个实施方案中，组合物包括本发明4种不同的WT-1肽。在另一个实施方案中，组合物包括本发明5种不同的WT-1肽。在另一个实施方案中，组合物包括超过5种本发明不同的分离WT-1肽。

在另一个实施方案中，所述组合物中的2种WT-1肽是未改变的。在另一个实施方案中，所述组合物中的2种WT-1肽是变态的。在另一个实施方案中，所述组合物中的2种WT-1肽是未改变的，并且2种是变态的。在另一个实施方案中，所述组合物中超过2种WT-1肽是未改变的。在另一个实施方案中，所述组合物中超过2种WT-1肽是变态的。在另一个实施方案中，所述组合物中超过2种WT-1肽是未改变的，并且超过2种是变态的。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明组合物中1种额外的WT-1肽具有选自如下所示的序列：SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193。在另一个实施方案中，本发明组合物中2种额外的WT-1肽具有选自如下所示的序列：SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193。在另一个实施方案中，本发明组合物中3种额外的WT-1肽具有选自如下所示的序列：SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193。

在另一个实施方案中，使用本领域已知的任意其他免疫原性WT-1肽作为额外的WT-1肽。在另一个实施方案中，使用本领域已知的免疫原性WT-1肽的任意组合。其他WT肽的非限制性来源包括WO2005053618，WO2007047764和WO2007120673。

每种额外的WT-1肽，及其每种组合，代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的组合物包含2种HLA II类变态肽，其均来源于本发明相同的分离WT-1肽。在另一个实施方案中，所述2种HLAII类变态肽包含在不同HLA II类分子锚定残基上的突变。在另一个实施方案中，所述2种HLA II类变态肽包含在相同锚定残基上的不同突变。在另一个实施方案中，所述2种HLA II类变态肽来源于本发明不同的分离WT-1肽。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的2种WT-1肽，或对应于本发明2种HLA II类变态肽的WT-1肽，彼此重叠。在另一个实施方案中，所述肽之间的重叠是至少7个氨基酸(AA)。在另一个实施方案中，重叠是至少8AA。在另一个实施方案中，重叠是至少9AA。在另一个实施方案中，重叠是7AA。在另一个实施方案中，重叠是8AA。在另一个实施方案中，重叠是9AA。在另一个实施方案中，重叠是10AA。在另一个实施方案中，重叠是11AA。在另一个实施方案中，重叠是12AA。在另一个实施方案中，重叠是13AA。在另一个实施方案中，重叠是14AA。在另一个实施方案中，重叠是15AA。在另一个实施方案中，重叠是16AA。在另一个实施方案中，重叠超过16AA。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明组合物的肽结合2种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述肽结合3种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述肽结合4种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述肽结合5种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述肽结合超过5种不同的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述组合物的肽结合相同的HLA II类分子。

在另一个实施方案中，本发明组合物的每种WT-1肽结合一组HLA II类分子。在另一个实施方案中，每种WT-1肽结合不同组的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述组合物的WT-1肽结合相同组的HLA II类分子。在另一个实施方案中，2种WT-1肽结合不同但重叠组的HLA II类分子。在另一个实施方案中，2种或更多种的WT-1肽结合相同组的HLA II类分子，而另一WT-1肽结合不同的组。在另一个实施方案中，2种或更多种的WT-1肽结合一种重叠组的HLA II类分子，而另一WT-1肽结合不同的组。

在另一个实施方案中，本发明组合物的2种或更多种WT-1肽各结合超过1种HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，所述组合物的肽结合的4种或更多种HLA-DRB分子彼此不同。在另一个实施方案中，HLA-DRB分子由不同的HLA-DRB等位基因编码。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明组合物的WT-1肽结合的2种或更多种HLA II类分子是HLA-DRB分子。在另一个实施方案中，结合的3种或更多种HLA II类分子是HLA-DRB分子。在其他实施方案中，结合的HLA II类分子可以是本文列举的任意HLA II类分子。在另一个实施方案中，结合的HLA II类分子由指定基因座的2个或更多个不同HLA II类等位基因编码。在另一个实施方案中，结合的HLA II类分子由2个或更多个不同基因座的HLA II类基因编码。

每种上述组合物代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，“HLA II类分子组”是指由特定基因座的不同等位基因编码的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述术语是指具有特定结合特异性的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述术语是指具有特定肽共有序列的HLA II类分子。在另一个实施方案中，所述术语是指HLAII类分子的超家族。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种组合物，其包括未改变的本发明HLA II类分子-结合WT-1肽，和第二HLA I类分子-结合WT-1肽。在另一个实施方案中，所述组合物包括除了HLA I类分子-结合WT-1肽以外的超过1种本发明HLA II类分子-结合WT-1肽。在另一个实施方案中，所述组合物包括除了HLA II类分子-结合WT-1肽以外的超过1种本发明HLA I类分子-结合WT-1肽。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，HLA I类分子-结合WT-1肽的AA序列包括选自SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191或193的序列。在另一个实施方案中，HLA I类分子-结合WT-1肽的AA序列选自SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191或193所示的序列。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，HLA I类分子-结合WT-1肽是HLA I类变态肽。在另一个实施方案中，如本文进一步所述，HLA I类分子-结合WT-1肽包含其HLA I类分子锚定残基的突变。如本文提供的，对WT-1来源的肽在HLA锚定残基上进行修饰，以产生具有对HLA-A0201和HLA-A0301增加的预测结合的变态肽。具有增加的预测结合的肽还显示增强的结合HLA I类分子的能力和增加的免疫原性。

在另一个实施方案中，增强MHC结合的突变位于HLA I类变态肽位置1的残基上。在另一个实施方案中，所述残基被变为酪氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为甘氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为苏氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为苯丙氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为本领域已知的任意其他残基。在另一个实施方案中，位置1的取代(例如变为酪氨酸)稳定位置2锚定残基的结合。

在另一个实施方案中，突变位于HLA I类变态肽的位置2。在另一个实施方案中，所述残基被变为亮氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为缬氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为异亮氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为甲硫氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为本领域已知的任意其他残基。

在另一个实施方案中，突变位于HLA I类变态肽的位置6。在另一个实施方案中，所述残基被变为缬氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为半胱氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为谷氨酰胺。在另一个实施方案中，所述残基被变为组氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为本领域已知的任意其他残基。

在另一个实施方案中，突变位于HLA I类变态肽的位置9。在另一个实施方案中，所述突变改变其C端位置的残基。在另一个实施方案中，所述残基被变为缬氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为苏氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为异亮氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为亮氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为丙氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为半胱氨酸。在另一个实施方案中，所述残基被变为本领域已知的任意其他残基。

在另一个实施方案中，点突变位于初级锚定残基。在另一个实施方案中，HLA I类初级锚定残基是位置2和9。在另一个实施方案中，点突变位于次级锚定残基。在另一个实施方案中，HLA I类次级锚定残基是位置1和8。在另一个实施方案中，HLA I类次级锚定残基是位置1，3，6，7和8。在另一个实施方案中，所述点突变位于选自位置4，5和8的位置。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，点突变位于选自HLA I类结合模体的位置1，2，8和9的位置的1个或更多个残基。在另一个实施方案中，点突变位于选自HLA I类结合模体的位置1，3，6和9的位置的1个或更多个残基。在另一个实施方案中，点突变位于选自HLA I类结合模体的位置1，2，6和9的位置的1个或更多个残基。在另一个实施方案中，点突变位于选自HLA I类结合模体的位置1，6和9的位置的1个或更多个残基。在另一个实施方案中，点突变位于选自位置1，2和9的位置的1个或更多个残基。在另一个实施方案中，点突变位于选自位置1，3和9的位置的1个或更多个残基。在另一个实施方案中，点突变位于选自位置2和9的位置的1个或更多个残基。在另一个实施方案中，点突变位于选自位置6和9的位置的1个或更多个残基。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

每种上述锚定残基和取代代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，HLA I类分子-结合WT肽的长度为9AA。在另一个实施方案中，肽的长度为10AA。如本文提供的，9-10AA的天然和变态肽显示与HLA I类分子的实质结合，以及引发细胞因子分泌和CTL的细胞溶解的能力。

在另一个实施方案中，被HLA I类分子-结合WT-1肽结合的HLA I类分子是HLA-A分子。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-A2分子。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-A3分子。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-Al 1分子。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-B8分子。在另一个实施方案中，HLA I类分子是HLA-0201分子。在另一个实施方案，HLA I类分子与本领域已知的任意其他HLA I类分子结合。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明方法和组合物的WT-1肽具有8-30个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，肽的长度为9-11AA。在另一个实施方案中，肽的长度大小范围是7-25AA，或在另一个实施方案中，或在另一个实施方案中，8-11，或在另一个实施方案中，8-15，或在另一个实施方案中，9-20，或在另一个实施方案中，9-18，或在另一个实施方案中，9-15，或在另一个实施方案中，8-12，或在另一个实施方案中，9-11AA。在另一个实施方案中，肽长度为8AA，或在另一个实施方案中，9AA或在另一个实施方案中，10AA或在另一个实施方案中，12AA或在另一个实施方案中，长度为25AA，或在另一个实施方案中，它们之间的任意长度。在另一个实施方案中，肽具有更长的长度，例如50，或100，或更多。在这种实施方案中，细胞将肽加工为7-25AA的长度。在这种实施方案中，细胞将肽加工为9-11AA的长度。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，肽的长度为15-23AA。在另一个实施方案中，长度为15-24AA。在另一个实施方案中，长度为15-25AA。在另一个实施方案中，长度为15-26AA。在另一个实施方案中，长度为15-27AA。在另一个实施方案中，长度为15-28AA。在另一个实施方案中，长度为14-30AA。在另一个实施方案中，长度为14-29AA。在另一个实施方案中，长度为14-28AA。在另一个实施方案中，长度为14-26AA。在另一个实施方案中，长度为14-24AA。在另一个实施方案中，长度为14-22AA。在另一个实施方案中，长度为14-20AA。在另一个实施方案中，长度为16-30AA。在另一个实施方案中，长度为16-28AA。在另一个实施方案中，长度为16-26AA。在另一个实施方案中，长度为16-24AA。在另一个实施方案中，长度为16-22AA。在另一个实施方案中，长度为18-30AA。在另一个实施方案中，长度为18-28AA。在另一个实施方案中，长度为18-26AA。在另一个实施方案中，长度为18-24AA。在另一个实施方案中，长度为18-22AA。在另一个实施方案中，长度为18-20AA。在另一个实施方案中，长度为20-30AA。在另一个实施方案中，长度为20-28AA。在另一个实施方案中，长度为20-26AA。在另一个实施方案中，长度为20-24AA。在另一个实施方案中，长度为22-30AA。在另一个实施方案中，长度为22-28AA。在另一个实施方案中，长度为22-26AA。在另一个实施方案中，长度为24-30AA。在另一个实施方案中，长度为24-28AA。在另一个实施方案中，长度为24-26AA。

每种上述肽、肽长度和肽类型代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，利用本领域公知的原理，对本发明的肽进行微小修饰(minor modification)，但不降低它们对HLA分子的亲和力或改变它们的TCR特异性。在另一个实施方案中，就HLA I类结合肽而言，“微小修饰”涉及例如包括一个氨基酸在内的插入、缺失或取代，或2-9个残基之外的包括1-3个氨基酸在内的缺失或添加。尽管本文描述的计算机算法可用于预测肽的MHC I类结合能力，但它们只有60-80％的预测准确性；因此，在最终确定MHC I类结合亲和力之前，对肽应进行经验鉴定。因此，本发明的肽不限于通过显示强MHC I类结合亲和力的算法预测得到的肽。可以进行的修饰类型在下文列出。每种修饰代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，通过将锚定残基突变为MHC I类优选的锚定残基(在其他实施方案中，其可以是本文列举的任意锚定残基)，对本发明实施例列举的肽进行进一步修饰。在另一个实施方案中，通过将锚定残基突变为针对该位置的不同MHC I类优选残基，对包含MHC I类优选锚定残基的本发明肽进行进一步修饰。在其他实施方案中，不同的优选残基可以是本文列举的任意优选残基。

在另一个实施方案中，被进一步修饰的锚定残基位于位置1。在另一个实施方案中，锚定残基位于位置2。在另一个实施方案中，锚定残基位于位置3。在另一个实施方案中，锚定残基位于位置4。在另一个实施方案中，锚定残基位于位置5。在另一个实施方案中，锚定残基位于位置6。在另一个实施方案中，锚定残基位于位置7。在另一个实施方案中，锚定残基位于位置8。在另一个实施方案中，锚定残基位于位置9。就HLA I类结合肽而言，除了2和9以外的残基可以作为次级锚定残基；因此，将它们突变可以改善MHC I类结合。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明方法和组合物的肽是实施例所列举肽的长度变体。在另一个实施方案中，所述长度变体比实施例的肽短1个氨基酸(AA)。在另一个实施方案中，所述长度变体比实施例的肽短2AA。在另一个实施方案中，所述长度变体比实施例的肽短超过2AA。在另一个实施方案中，更短的肽是在N末端截短。在另一个实施方案中，更短的肽是在C末端截短。在另一个实施方案中，截短的肽是在N末端和C末端均截短。在另一个实施方案中，将肽截短但不改变对HLA分子的亲和力，这是本领域公知的。

每种上述截短肽代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，长度变体比本发明实施例列举的肽更长。在另一个实施方案中，更长的肽是根据周围的WT-1序列在N末端延伸。在另一个实施方案中，将肽在N末端延伸但不改变对HLA分子的亲和力，这是本领域公知的。这类肽因此是实施例所列举肽的等同物。在另一个实施方案中，N端延伸肽延伸一个残基。在另一个实施方案中，N端延伸肽延伸两个残基。在另一个实施方案中，N端延伸肽延伸三个残基。在另一个实施方案中，N端延伸肽延伸超过三个残基。

在另一个实施方案中，更长的肽是根据周围的WT-1序列在C末端延伸。在另一个实施方案中，将肽在C末端延伸但不改变对HLA分子的亲和力，这是本领域公知的。这类肽因此是本发明实施例所列举肽的等同物。在另一个实施方案中，C端延伸肽延伸一个残基。在另一个实施方案中，C端延伸肽延伸两个残基。在另一个实施方案中，C端延伸肽延伸三个残基。在另一个实施方案中，C端延伸肽延伸超过三个残基。

在另一个实施方案中，延伸肽是根据周围的WT-1序列在N末端和C末端均延伸。

每种上述延伸肽代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的截短肽保留第二残基和C端残基上的HLA锚定残基(例如HLA I类锚定残基)，比本发明实施例列举的肽具有更小数目的插入残基数(例如5)。在另一个实施方案中，将肽进行这种突变但不改变对HLA分子的亲和力。

在另一个实施方案中，通过去除上述序列之一的一个插入残基，设计出这类截短肽。在另一个实施方案中，保留第二和第八残基上的HLA锚定残基。在另一个实施方案中，保留第一和第八残基上的HLA锚定残基。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的延伸肽保留第二残基和C端残基上的HLA锚定残基(例如HLA I类锚定残基)，比本发明实施例列举的肽具有更大数目的插入残基数(例如7或8)。在另一个实施方案中，通过在上述序列之一的两个插入残基之间添加一个或更多个残基，设计出这类延伸肽。本领域公知的是，可以在HLA结合肽的插入序列之间去除或添加残基，而不改变对HLA的亲和力。这类肽因此是本发明实施例所列举肽的等同物。在另一个实施方案中，保留第二和第九残基上的HLA锚定残基。在另一个实施方案中，保留第一和第八残基上的HLA锚定残基。在另一个实施方案中，保留被6个插入残基分离的两个残基上的HLA锚定残基。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，“片段”是指长度为11或更多AA的肽。在另一个实施方案中，本发明的肽片段长16或更多AA。在另一个实施方案中，片段长12或更多AA。在另一个实施方案中，片段是13或更多AA。在另一个实施方案中，片段是14或更多AA。在另一个实施方案中，片段是15或更多AA。在另一个实施方案中，片段是17或更多AA。在另一个实施方案中，片段是18或更多AA。在另一个实施方案中，片段是19或更多AA。在另一个实施方案中，片段是22或更多AA。在另一个实施方案中，片段是8-12AA。在另一个实施方案中，片段是约8-12AA。在另一个实施方案中，片段是16-19AA。在另一个实施方案中，片段是约16-19AA。在另一个实施方案中，片段是10-25AA。在另一个实施方案中，片段是约10-25AA。在另一个实施方案中，片段具有任意其他长度。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，“WT-1蛋白的片段”是指本文所述“片段”的任意定义。每种定义代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的肽与实施例列举的肽同源。在另一个实施方案中，当涉及任意蛋白或肽时，术语“同源性”、“同源”等等是指在序列比对和引入空位(必要时)以实现最大百分比同源性后(并且不将任意保守取代作为序列同一性的一部分)，候选序列中与相应天然多肽的残基相同的氨基酸残基百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。

在另一个实施方案中，当涉及任意核酸序列时，术语“同源性”类似地表示候选序列中与相应天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸百分比。

在另一个实施方案中，通过本领域详细描述的方法，通过用于序列比对的计算机算法来确定同源性。在其他实施方案中，核酸序列同源性的计算机算法分析包括使用任意数目的可用软件包，诸如，例如，BLAST，DOMAIN，BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)，GENPEPT和TREMBL包。

在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193的序列的同一性大于70％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193的序列的同一性大于72％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于75％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193的序列的同一性大于78％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于80％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于82％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193的序列的同一性大于83％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于85％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于87％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193的序列的同一性大于88％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于90％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于92％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193的序列的同一性大于93％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于95％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO:1-160，162-185，190，191或193的序列的同一性大于96％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于97％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于98％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性大于99％。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO：1-160，162-185，190，191和193中之一的同一性为100％。每种可能性代表本发明单独的实施方案。在另一个实施方案中，通过候选序列杂交的检测来确定同源性，该方法在本领域有详尽描述(参见，例如，"Nucleic AcidHybridization"Hames,B.D.,和Higgins S.J.,Eds.(1985)；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；和Ausubel等人,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y)在另一个实施方案中，在中等到严格条件下，针对编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补序列实施杂交方法。杂交条件是，例如，在如下溶液中42℃温育过夜，所述溶液包括：10-20％甲酰胺，5X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5X Denhardt's溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA。

在实施例中所列举肽的每种上述同源物和变体代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包括本发明肽的组合物。在另一个实施方案中，组合物还包括药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，组合物还包括佐剂。在另一个实施方案中，组合物包括2种或更多种本发明的肽。在另一个实施方案中，组合物还包括下文所述的任意添加剂、化合物或赋形剂。在另一个实施方案中，佐剂是KLH、QS21、弗氏完全或不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、BCG或明矾。在其他实施方案中，载体是本文列举的任意载体。在其他实施方案中，佐剂是本文列举的任意佐剂。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供包括本发明肽的疫苗。在另一个实施方案中，本发明提供包括抗原呈递细胞(APC)和本发明肽的疫苗。在另一个实施方案中，疫苗还包括载体。在另一个实施方案中，疫苗还包括佐剂。在另一个实施方案中，疫苗还包括APC。在另一个实施方案中，疫苗还包括抗原、载体和/或APC中超过1种的组合。在另一个实施方案中，疫苗是基于细胞的组合物。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，术语“疫苗”是指以下材料或组合物，当将其引入对象时，提供该对象针对特定疾病、病症或症状的预防性或治疗性应答。在另一个实施方案中，本发明包括基于肽的疫苗，其中所述肽包括本文所列的任意实施方案，包括免疫调节化合物诸如细胞因子、佐剂，等等。

在另一个实施方案中，本发明方法和组合物的疫苗还包括佐剂。在另一个实施方案中，佐剂是Montanide。在另一个实施方案中，佐剂是Montanide ISA 51。Montanide ISA 51包含天然可代谢的油和精炼乳化剂。在另一个实施方案中，佐剂是GM-CSF。在另一个实施方案中，重组GM-CSF是在酵母(啤酒酵母)载体中表达的人蛋白。GM-CSF促进造血祖细胞、APC以及树突状细胞和T细胞的克隆扩增和分化。

在另一个实施方案中，佐剂是细胞因子。在另一个实施方案中，佐剂是生长因子。在另一个实施方案中，佐剂是细胞群。在另一个实施方案中，佐剂是QS21。在另一个实施方案中，佐剂是弗氏不完全佐剂。在另一个实施方案中，佐剂是磷酸铝。在另一个实施方案中，佐剂是氢氧化铝。在另一个实施方案中，佐剂是BCG。在另一个实施方案中，佐剂是明矾。

在另一个实施方案中，佐剂是白介素。在另一个实施方案中，佐剂是趋化因子。在另一个实施方案中，佐剂是本领域已知的任意其他类型的佐剂。在另一个实施方案中，WT-1疫苗包括两种上述佐剂。在另一个实施方案中，WT-1疫苗包括超过两种上述佐剂。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在其他实施方案中，本发明的疫苗或组合物可以包括本发明WT-1肽及其组合的任意实施方案。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

应理解本文描述的有关本发明肽、疫苗和组合物的任意实施方案均可在本发明的任意方法中使用。肽、疫苗或组合物与方法的每种组合代表其实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有表达WT-1的癌症的对象的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1疫苗，从而治疗患有表达WT-1的癌症的对象。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有MDS的对象的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1疫苗，从而治疗患有MDS的对象。

在另一个实施方案中，本发明提供一种抑制或终止对象的表达WT-1的癌症的进展的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1疫苗，从而抑制或终止表达WT-1的癌症的进展。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的表达WT-1的癌症的发病率的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1疫苗，从而降低对象的表达WT-1的癌症的发病率。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的AML的发病率的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1疫苗，从而降低AML的发病率。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的表达WT-1的癌症的复发率的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1疫苗，从而降低对象的表达WT-1的癌症的复发率。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的AML的复发率的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1疫苗，从而降低对象的AML的复发率。

在另一个实施方案中，本发明提供一种打破对象对表达WT-1的癌症的T细胞耐受性的方法，所述方法包括给对象施用本发明的WT-1疫苗，从而打破对表达WT-1的癌症的T细胞耐受性。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有表达WT-1的癌症的对象的方法，包括(a)通过本发明的方法在供体中诱导人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的形成和增殖，所述CTL识别癌症的恶性细胞；和(b)将人CTL输注入对象，从而治疗患有癌症的对象。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有表达WT-1的癌症的对象的方法，包括(a)通过本发明的方法离体诱导人CTL的形成和增殖，所述CTL识别癌症的恶性细胞，其中人免疫细胞获自供体；和(b)将人CTL输注入对象，从而治疗患有癌症的对象。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导(a)WT-1蛋白特异性CD8⁺淋巴细胞；或(b)对WT-1蛋白特异的CD4⁺淋巴细胞，或其组合的形成和增殖的方法，所述方法包括将淋巴细胞群与本发明的肽或组合物接触，从而诱导(a)WT-1蛋白特异性CD8⁺淋巴细胞；或(b)对WT-1蛋白特异的CD4⁺淋巴细胞，或其组合的形成和增殖。该方法可以在体外、离体或体内进行。当在体外或离体进行时，这些CTL继而可以被输注入患者以达到治疗效果。

用于离体免疫治疗的方法是本领域公知的，描述于，例如，美国专利申请系列2006/0057130，2005/0221481，2005/0214268，2003/0175272，2002/0127718，和美国专利5,229,115，这些引入本文作为参考。其他方法是本领域公知的，描述于例如，Davis ID等人(Blood dendritic cells generatedwith Flt3 ligand and CD40 ligand prime CD8+ T cells efficiently in cancerpatients.J Immunother.2006年9月-10月；29(5):499-511)和Mitchell MS等人(The cytotoxic T cell response to peptide analogs of the HLA-A*0201-restrictedMUC1 signal sequence epitope,Ml.2.Cancer Immunol Immunother.2006年7月28日)。每种方法代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导对表达WT-1的癌症的细胞特异的CTL的形成和增殖的方法，所述方法包括将淋巴细胞群体与本发明的疫苗接触。在另一个实施方案中，所述疫苗是与本发明的肽结合的APC。在另一个实施方案中，所述疫苗是与本发明的肽混合物结合的APC。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种在对象中产生变态免疫应答的方法，其中所述变态免疫应答是针对表达WT-1的癌症，所述方法包括给对象施用本发明的疫苗，从而产生变态免疫应答。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导对象的抗间皮瘤免疫应答的方法，所述方法包括将对象与免疫原性组合物接触的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；或(b)WT蛋白的片段，从而诱导对象的抗间皮瘤免疫应答。在另一个实施方案中，间皮瘤是恶性间皮瘤。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种诱导对象的抗间皮瘤免疫应答的方法，所述方法包括将对象与免疫原性组合物接触的步骤，所述免疫原性组合物包括编码(a)WT-1蛋白；或(b)WT-1蛋白的片段的核苷酸分子，从而诱导对象的抗间皮瘤免疫应答。在另一个实施方案中，间皮瘤是恶性间皮瘤。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有间皮瘤的对象的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；或(b)WT蛋白的片段，从而治疗患有间皮瘤的对象。在另一个实施方案中，间皮瘤是恶性间皮瘤。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有间皮瘤的对象的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括编码(a)WT-1蛋白；或(b)WT-1蛋白的片段的核苷酸分子，从而治疗患有间皮瘤的对象。在另一个实施方案中，间皮瘤是恶性间皮瘤。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的间皮瘤发病率或其复发的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括(a)WT-1蛋白；或(b)WT蛋白的片段，从而降低对象的间皮瘤发病率或其复发。在另一个实施方案中，间皮瘤是恶性间皮瘤。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低对象的间皮瘤发病率或其复发的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括编码(a)WT-1蛋白；或(b)WT-1蛋白的片段的核苷酸分子，从而降低对象的间皮瘤发病率或其复发。在另一个实施方案中，间皮瘤是恶性间皮瘤。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，用本发明方法引发的免疫应答的靶细胞在HLA分子上呈递本发明的WT-1肽，或相应WT-1片段。在另一个实施方案中，HLA分子是HLA I类分子。在其他实施方案中，HLA分子是本领域已知的任意HLA I类同种型或HLA I类分子。在另一个实施方案中，针对WT-1肽或片段的免疫应答是变态免疫应答。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是急性髓性白血病(AML)。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症与脊髓发育不良综合征(MDS)有关。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是MDS。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是维尔姆斯氏瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是白血病。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是血液癌症。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是淋巴瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是促结缔组织增生的小圆细胞瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是间皮瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是恶性间皮瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是胃癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是结肠癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是生殖细胞瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是卵巢癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是子宫癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是甲状腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肝细胞癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是甲状腺癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肝癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肾癌。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是卡波西氏肉瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是肉瘤。在另一个实施方案中，表达WT-1的癌症是任意其他癌症或肉瘤。

在另一个实施方案中，通过本发明方法治疗的癌症或肿瘤被怀疑表达WT-1。在另一个实施方案中，还没有通过检测真正的肿瘤样本来验证WT-1表达。在另一个实施方案中，在许多情况下所述癌症或肿瘤是已知表达WT-1的类型。在另一个实施方案中，在大多数情况下所述类型表达WT-1。

每种类型的表达WT-1的癌症或肿瘤，以及被怀疑表达WT-1的癌症或肿瘤，代表本发明单独的实施方案。

本文列举的有关本发明肽、疫苗和组合物的任意实施方案均可在本发明的任意方法中使用，并且每个都代表其实施方案。

在另一个实施方案中，在本发明的方法中使用本发明的多种肽来刺激免疫应答。

本领域技术人员将能够理解本文公开的方法将能够设计其他WT-1来源的肽。所述方法还能够设计与其他HLA分子结合的肽。所述方法还能够设计组合本发明的WT-1来源肽的疫苗。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的疫苗具有以下优点：活化或引发包含各种不同的HLA II类分子等位基因的WT-1特异性CD4⁺T细胞。在另一个实施方案中，所述疫苗具有以下优点：在相当比例的群体中(例如在不同的实施方案中，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或大于95％)活化或引发WT-1特异性的CD4⁺T细胞。在另一个实施方案中，所述疫苗在相当比例的特定种群中(例如美洲白种人)活化或引发WT-1特异性的CD4⁺T细胞。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的方法提供免疫应答的改善，所述免疫应答已经在对象中建立。在另一个实施方案中，本发明的方法包括施用肽、组合物或疫苗2次或更多次。在另一个实施方案中，所述肽在其组成、浓度或其组合方面不同。在另一个实施方案中，所述肽在对象中启动针对感兴趣的抗原的免疫应答，所述对象还没有启动针对所述抗原的免疫应答。在另一个实施方案中，响应APC或癌细胞上肽的呈递而诱导CTL增殖。在其他实施方案中，免疫应答的调节涉及免疫系统的体液和细胞介导的臂(arm)中的任一或两个，其分别伴有Th2和Th1 T辅助细胞的存在，或在另一个实施方案中，分别涉及每一个臂。

在其他实施方案中，影响肿瘤生长的方法导致(1)肿瘤细胞分裂的直接抑制，或(2)免疫细胞介导的肿瘤细胞裂解，或以上两者，这导致肿瘤细胞净扩增的抑制。

本领域普通技术人员基于大量公知方法，可以容易的测定由这两种机制任一种产生的肿瘤生长抑制。在另一个实施方案中，通过测量一段时间内的实际肿瘤大小，可以测定肿瘤抑制。在另一个实施方案中，利用本领域技术人员公知的方法，通过估计(一段时间内的)肿瘤大小可以测定肿瘤抑制。更具体来说，可以使用各种放射成象方法(例如，单光子和正电子发射计算机断层检查；一般参见"Nuclear Medicine in Clinical Oncology,"Winkler,C.(ed.)Springer-Verlag,New York,1986)来估算肿瘤大小。这种方法还可以利用各种显影剂，包括例如，常规显影剂(例如，镓-67柠檬酸盐)，以及用于代谢产物成像、受体成像或免疫学成像(例如，放射性标记的单克隆抗体特异性肿瘤标记物)的专用试剂。此外，还可以使用非放射性方法诸如超声(参见，"Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors",Kossoff and Fukuda,(eds.),Igaku-Shoin,New York,1984)来估算肿瘤大小。

除了上文讨论的用于测定肿瘤抑制的体内方法之外，还可以使用各种体外方法以便预测体内肿瘤抑制。代表性的实例包括通过以下方式测定的淋巴细胞介导的抗肿瘤溶胞活性，例如通过⁵¹Cr释放测定法(实施例)，肿瘤依赖性淋巴细胞增殖(Ioannides,等人,J.Immunol.146(5):1700-1707,1991)，肿瘤特异性抗体的体外产生(Herlyn,等人,J.Immunol.Meth.73:157-167,1984)，细胞(例如，CTL，辅助T细胞)或体液(例如，抗体)介导的体外细胞生长抑制(Gazit,等人,Cancer Immunol Immunother 35:135-144,1992)，以及，用于测定细胞前体频率的任意这些测定法(Vose,Int.J.Cancer 30:135-142(1982)，等等。

在另一个实施方案中，抑制肿瘤生长的方法表示，与不接触或不暴露于本发明肽的生长相比，减弱的生长状态。肿瘤细胞生长可以通过本领域已知的任意方法进行评价，包括但不限于，测量肿瘤大小，使用³H-胸苷掺入测定法来确定肿瘤细胞是否增殖，或对肿瘤细胞计数。在其他实施方案中，“抑制”肿瘤细胞生长表示减缓、延迟或停止肿瘤生长，或导致肿瘤消退。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，测量WT-1表达。在另一个实施方案中，测量WT-1转录物表达。在另一个实施方案中，测量肿瘤的WT-1蛋白水平。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

用于测定免疫应答的存在和大小的方法是本领域公知的。在另一个实施方案中，淋巴细胞增殖测定法，其中放射性物质(例如³H-胸苷)的T细胞摄取作为细胞增殖的函数被测定。在其他实施方案中，通过测量以下的增加来检测T细胞增殖：白介素-2(IL-2)产生，Ca²⁺流出，或染料摄入，诸如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-联苯-四唑。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，通过本领域已知的方法(包括细胞增殖、细胞因子产生等等的检测)来测定CTL刺激。通过对T细胞接触配体-脉冲刺激的(ligand-pulsed)靶标时分泌的细胞因子类型和数量的分析可以作为功能活性的测量。可以通过ELISA或ELISPOT测定法来测量细胞因子以确定细胞因子产生的速率和总量(Fujihashi K.等人(1993)J.Immunol.Meth.160:181；Tanguay S.and Killion J.J.(1994)Lymphokine Cytokine Res.13:259)。

在另一个实施方案中，通过⁵¹Cr-释放裂解测定法来测定CTL活性。将抗原特异性T细胞对肽脉冲刺激的⁵¹Cr标记的靶标的裂解与用对照肽脉冲刺激的靶细胞进行比较。在另一个实施方案中，用本发明的肽刺激T细胞，并测定MHC背景下表达天然肽的靶细胞的裂解。在另一个实施方案中，使用固定时间点(例如，4小时)的裂解以及全部靶标裂解的动力学，以鉴定配体表现(Ware C.F.等人(1983)J Immunol 131:1312)。

用于测定肽对HLA分子亲和力的方法是本领域公知的。在另一个实施方案中，通过TAP稳定测定法来测定亲和力。

在另一个实施方案中，通过竞争性放射免疫测定法来测定亲和力。在另一个实施方案中，使用下列方案：用含1％牛血清白蛋白(BSA；FisherChemicals,Fairlawn,NJ)的PBS将靶细胞洗涤两次。将细胞按10⁷/ml在冰上重悬，并在存在3mg/ml beta₂微球蛋白的条件下使用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液在0℃将天然细胞表面结合肽剥离2分钟。在存在3mg/ml beta2微球蛋白和30mg/ml脱氧核糖核酸酶的条件下，将沉淀按照5×10⁶细胞/ml重悬于PBS/1％BSA，并在存在或缺失HLA特异性肽的条件下将200ml等分试样在20℃温育10分钟，然后与¹²⁵I标记的肽在20℃温育30分钟。在用PBS/2％BSA洗涤两次和用PBS洗涤1次后测定总的结合¹²⁵I。通过将递增浓度的测试肽与已知的结合肽进行比较，测定相对亲和力。

在另一个实施方案中，对肽与活细胞(例如SKLY-16细胞)表面HLA的结合进行特异性分析以证实结合是针对合适的HLA分子的，并表征其限制性。在另一个实施方案中，这包括与过量的未标记肽(已知结合相同或不同的HLA分子)的竞争以及靶细胞(其表达相同或不同的HLA型)的使用。在另一个实施方案中，在活的新鲜或0.25％多聚甲醛固定的人PBMC、白血病细胞系和特定HLA型的EBV转化T细胞系中进行这种测定。肽(其被发现结合特定细胞上的MHC分子)的相对亲和力通过如上所述的竞争测定法来测定，所述竞争测定法针对具有对相关HLA分子(例如，酪氨酸酶或HBV肽序列)高亲和力的¹²⁵I标记的肽。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的HLA II类结合肽比结合HLA II类分子的最小长度要长，在另一个实施方案中所述最小长度是约12AA。在另一个实施方案中，增加HLA II类结合肽的长度能够结合超过一个HLA II类分子。在另一个实施方案中，增加长度能够结合其结合模体未知的HLA II类分子。在另一个实施方案中，增加长度能够结合HLA I类分子。在另一个的实施方案中，HLA I类分子的结合模体是已知的。在另一个的实施方案中，HLA I类分子的结合模体是未知的。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，在本发明方法和组合物中使用的肽包括非典型氨基酸诸如∶1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Kazmierski等人(1991)J.AmChem.Soc.113:2275-2283)；(2S,3S)-甲基-苯丙氨酸，(2S,3R)-甲基-苯丙氨酸，(2R,3S)-甲基-苯丙氨酸和(2R,3R)-甲基-苯丙氨酸(Kazmierski and Hruby(1991)Tetrahedron Lett.32(41):5769-5772)；2-氨基四氢化萘-2-羧酸(Landis(1989)Ph.D.Thesis,University of Arizona)；羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸酯(Miyake等人(1984)J.Takeda Res.Labs.43:53-76)，组氨酸异喹啉羧酸(Zechel等人(1991)Int.J.Pep.Protein Res.38(2):131-138)；和HIC(组氨酸环脲),(Dharanipragada等人(1993)Int.J.Pep.Protein Res.42(l):68-77)和((1992)Acta.Crst.,Crystal Struc.Comm.48(IV):1239-124)。

在另一个实施方案中，本发明的肽包括氨基酸类似物或模拟肽，其在其他实施方案中诱导或有利于特定的二级结构。在其他实施方案中，这类肽包括下列：LL-Acp(LL-3-氨基-2-propenidone-6-羧酸)，β-转角诱导二肽类似物(Kemp等人(1985)J.Org.Chem.50:5834-5838)；β-片层诱导类似物(Kemp等人(1988)Tetrahedron Lett.29:5081-5082)；β-转角诱导类似物(Kemp等人(1988)Tetrahedron Left.29:5057-5060)；α-螺旋诱导类似物(Kemp等人(1988)Tetrahedron Left.29:4935-4938)；γ-转角诱导类似物(Kemp等人(1989)J.Org.Chem.54:109:115)；下列参考文献提供的类似物：Nagai和Sato(1985)Tetrahedron Left.26:647-650；和DiMaio等人(1989)J.Chem.Soc.Perkin Trans,p.1687；Gly-Ala转角类似物(Kahn等人(1989)Tetrahedron Lett.30:2317)；酰胺键电子等排体(Jones等人(1988)Tetrahedron Left.29(31):3853-3856)；tretrazol(Zabrocki等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110:5875-5880)；DTC(Samanen等人(1990)Int.J.ProteinPep.Res.35:501:509)；以及以下教导的类似物：Olson等人(1990)J.Am.Chem.Sci.112:323-333和Garvey等人(1990)J.Org.Chem.55(3):936-940。β转角和β凸起的构象限制性模拟物，以及包含它们的肽，描述于1995年8月8日授权给Kahn的美国专利5,440,013。

在其他实施方案中，如下文所述，将本发明的肽与一种不同的其他分子缀合，其可以通过共价或非共价连接(复合的)，在另一个实施方案中，其性质根据具体目的而改变。在另一个实施方案中，肽被共价或非共价复合到大分子载体(例如免疫原性载体)，包括但不限于，天然和合成的多聚体、蛋白、多糖、多肽(氨基酸)、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮和脂。在另一个实施方案中，将本发明的肽与基质连接。在另一个实施方案中，将肽与脂肪酸缀合以导入脂质体(美国专利5,837,249)。在另一个实施方案中，将本发明的肽与固相支持物共价或非共价复合，各种固相支持物是本领域已知的。在另一个实施方案中，肽与载体、基质、脂肪酸或固相支持物的连接用于增加引发的免疫应答。

在其他实施方案中，载体是甲状腺球蛋白、白蛋白(例如人血清白蛋白)、破伤风类毒素、聚氨基酸诸如聚(赖氨酸∶谷氨酸)、流感蛋白、乙肝病毒核心蛋白、钥孔虫戚血兰素、白蛋白，或另一种载体蛋白或载体肽、乙肝病毒重组疫苗或APC。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，术语“氨基酸”(AA)是指天然的或，在另一个实施方案中，非天然或合成的AA，并且在其他实施方案中，可以包括，甘氨酸、D-或L-旋光异构体、AA类似物、模拟肽，或其组合。

在另一个实施方案中，术语“癌症”、“赘生物(neoplasm)”、“赘生的(neoplastic)”或“肿瘤(tumor)”可以互换使用，是指经历恶性转化(使它们对于宿主生物体来说是病理性的)的细胞。通过非常成熟的技术(尤其是组织学检查)可以轻易的区分原发癌细胞(即，从邻近恶性转化部位获得的细胞)和非癌细胞。如本文使用的癌细胞的定义不仅包括原发癌细胞，而且包括来源于癌细胞祖先的任意细胞。这包括转移的癌细胞，以及来源于癌细胞的体外培养物和细胞系。在另一个实施方案中，肿瘤可基于肿瘤块来检测；例如，通过诸如CAT扫描、磁共振成像(MRI)、X光、超声或触诊这类方法，和在另一个实施方案中，通过生化或免疫学发现来鉴定，后者在其他实施方案中也被用于鉴定癌细胞。

用于合成肽的方法是本领域公知的。在另一个实施方案中，本发明的肽利用合适的固态合成方法来合成(参见例如，Steward and Young,SolidPhase Peptide Synthesis,Freemantle,San Francisco,Calif.(1968)；Merrifield(1967)Recent Progress in Hormone Res 23:451)。在其他实施方案中，使用本文描述的测定法来检测这些肽的活性。

在另一个实施方案中，通过标准方法纯化本发明的肽，所述标准方法包括层析(例如，离子交换、亲和力和大小分级柱层析法)、离心、差异溶解度，或通过用于蛋白纯化的任意其他标准技术。在另一个实施方案中，使用免疫亲和层析，通过将其结合到包括抗体(其针对该肽或本发明的相关肽而产生，并粘附到固定的支持物上)的亲和柱来分离表位。

在另一个实施方案中，亲和标签诸如6-His(Invitrogen)、麦芽糖结合域(New England Biolabs)、流感包膜序列(Kolodziej等人(1991)Meth.Enzymol.194:508-509)、谷胱甘肽-S-转移酶或其他亲和标签连接到本发明的肽以便于经通过合适的亲和柱而纯化。在其他实施方案中，还可以使用诸如蛋白水解、核磁共振和X射线晶体分析法的技术，对分离的肽进行物理表征。

在另一个实施方案中，利用已知的技术通过体外翻译产生本发明的肽，这对本领域技术人员将是显而易见的。在另一个实施方案中，肽在翻译期间或翻译后进行差别修饰，例如，通过磷酸化、糖基化、交联、酰化、蛋白水解切割、连接到抗体分子、膜分子或其他配体(Ferguson等人(1988)Ann.Rev.Biochem.57:285-320)。

在另一个实施方案中，本发明的肽还包括可检测的标记，其在另一个实施方案中是荧光的，或在另一个实施方案中是发光的，或在另一个实施方案中是放射性的，或在另一个实施方案中是电子致密。在其他实施方案中，可检测的标记包括，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、DS-Red(红色荧光蛋白)、分泌的碱性磷酸酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、³²P、¹²⁵I、³H和¹⁴C、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰和伞形酮、荧光素或大量本领域技术人员已知的其他这类标记。使用的具体标记物将取决于使用的免疫测定类型。

在另一个实施方案中，本发明的肽与基质连接，所述基质在另一个实施方案中用作载体。在另一个实施方案中，肽与基质的连接用于增加引发的免疫应答。

在另一个实施方案中，使用常规交联剂诸如碳二亚胺，按照本文所述将本发明的肽与其他分子连接。碳二亚胺的实例是1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺(CMC)，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和1-乙基-3-(4-氮翁-44-二甲基戊基)碳二亚胺。

在其他实施方案中，交联剂包括溴化氰、戊二醛和琥珀酸酐。通常，可以使用大量同型双功能试剂中的任一种，包括同型双功能醛、同型双功能环氧化物、同型双功能亚氨酸酯、同型双功能N-羟基琥珀酰亚胺酯酯、同型双功能马来酰亚胺、同型双功能卤代烷、同型双功能吡啶二硫物、同型双功能芳基卤、同型双功能酰肼、同型双功能重氮衍生物和同型双功能光反应化合物。在其他实施方案中，还可以预见的是异型双功能化合物，例如，具有胺反应基和硫氢反应基的化合物，具有胺反应基和光反应基的化合物，以及具有羰基反应基和硫氢反应基的化合物。

在其他实施方案中，同型双功能交联剂分别包括双功能N-羟基琥珀酰亚胺酯二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，二琥珀酰亚胺辛二酸酯，和二琥珀酰亚胺酒石酸酯；双功能亚氨酯己二亚氨二甲酯，庚二酰亚氨二甲酯，和辛二亚氨酸二甲酯；双功能硫氢反应性交联剂1,4-双-[3'-(2'-二硫吡啶)丙酰胺基]丁烷，二马来酰亚胺基己烷，和双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷；双功能芳基卤1,5-二氟-2,4-二硝基苯和4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯砜；双功能光反应试剂诸如双-[b-(4-叠氮基水杨基氨基)乙基]二硫醚；双功能醛甲醛，丙二醛，丁二醛，戊二醛，和己二醛；双功能环氧化物诸如1,4-丁二醇二环氧甘油醚；双功能酰肼已二酸二酰肼，卡巴肼，和琥珀酸二酰肼；双功能重氮o-联甲苯胺，重氮化和双偶氮联苯胺；双功能卤代烷N,N'-亚乙基-双(碘乙酰胺)，N,N'-六亚甲基-双(碘乙酰胺)，N,N'-十一亚甲基-双(碘乙酰胺)，以及苄卤和halomustards，诸如a,a'-二碘-p-二甲苯磺酸和三(2-氯乙烷)胺。

在其他实施方案中，如本文描述的用于将肽连接到其他分子的异型双功能交联剂包括，但不限于，SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)，MBS(m-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，SIAB(N-琥珀酰亚胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯)，SMPB(琥珀酰亚胺-4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯)，GMBS(N-(.gamma.-马来酰亚胺基丁酸)琥珀酰亚胺酯)，MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼)，M2C2H(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-酰肼)，SMPT(琥珀酰亚胺基氧化羰基-a-甲基-a-(2-二硫吡啶)甲苯)，和SPDP(N-琥珀酰亚胺3-(2-二硫吡啶)丙酸酯)。

在另一个实施方案中，将本发明的肽配制为通过离子、吸附或生物特异性相互作用的单体非共价连接。在另一个实施方案中，通过低离子强度环境(诸如在去离子水中)下盐桥的形成，实现肽与带正电或带负电的分子的复合。在另一个实施方案中，使用带电的多聚体诸如聚-(L-谷氨酸)或聚-(L-赖氨酸)(其分别包含许多的负电荷和正电荷)可以产生大的复合物。在另一个实施方案中，将肽吸附到表面诸如微粒胶乳珠子或其他疏水多聚体，形成非共价结合的肽-超级抗原复合物，在其他实施方案中有效模拟交联的或化学聚合的蛋白。在另一个实施方案中，通过使用其他分子间的生物特异性相互作用，将肽非共价连接。例如，生物素对蛋白诸如亲和素或链霉亲和素或它们衍生物的强亲和力可用于形成肽复合物。根据这个方面，和在另一个实施方案中，使用常见的生物素化试剂诸如D-生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-生物素)(其与可用的胺基反应)，可以将肽修饰为具有生物素基团。

在另一个实施方案中，将本发明的肽与载体连接。在另一个实施方式中，载体是KLH。在其他实施方案中，载体是本领域已知的任意其他载体，包括，例如，甲状腺球蛋白、白蛋白诸如人血清白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸诸如聚(赖氨酸:谷氨酸)、流感、乙肝病毒核心蛋白、乙肝病毒重组疫苗等等。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，将本发明的肽与脂(诸如P3 CSS)缀合。在另一个实施方案中，将本发明的肽与珠子缀合。

在另一个实施方案中，本发明的组合物还包括免疫调节化合物。在其他实施方案中，免疫调节化合物是细胞因子、趋化因子，或增强免疫系统辅助或粘附分子的表达的补体组分，它们的受体，或其组合。在一些实施方案中，免疫调节化合物包括白介素，例如白介素1到15，干扰素α、β或γ，肿瘤坏死因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，趋化因子诸如中性粒细胞活化蛋白(NAP)，巨噬细胞化学引诱物和活化因子(MCAF)，RANTES，巨噬细胞炎性肽MIP-Ia和MIP-Ib，补体组分，或其组合。在其他实施方案中，免疫调节化合物刺激或增强以下物质的表达：OX40，OX40L(gp34)，淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)，CD40，CD40L，B7.1，B7.2，TRAP，ICAM-1、2或3，细胞因子受体，或其组合。

在另一个实施方案中，免疫调节化合物诱导或增强参与免疫应答的共刺激分子的表达，在一些实施方案中，所述共刺激分子包括CD40或其配体、CD28、CTLA-4或B7分子。在另一个实施方案中，免疫调节化合物诱导或增强以下物质的表达：热稳定抗原(HSA)(Liu Y.等人(1992)J.Exp.Med.175:437-445)、硫酸软骨素修饰的MHC恒定链(Ii-CS)(Naujokas M.F.等人(1993)Cell 74:257-268)或胞内粘附分子1(ICAM-I)(Van R.H.(1992)Cell71:1065-1068)，在另一个实施方案中，这通过与它们在T细胞上的同源配体相互作用促进共刺激。

在另一个实施方案中，组合物包含溶剂，所述溶剂包括水、分散介质、细胞培养基、等渗剂等等。在另一个实施方案中，溶剂是pH为大约7.0的水性等渗缓冲液。在另一个实施方案中，组合物包括稀释剂诸如水、磷酸缓冲盐溶液或生理盐水。在另一个实施方案中，组合物包括溶剂，其是非水的，诸如丙基乙烯乙二醇、聚乙二醇和植物油。

在另一个实施方案中，将组合物配制为通过本领域技术人员已知的众多技术之一进行施用。例如，本发明提供药物组合物的以下施用方式：肠胃外、静脉内、皮下、皮内、粘膜内、局部地、口服或通过吸入。

在另一个实施方案中，包括本发明肽的疫苗还包括细胞群，在另一个实施方案中，其包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞、干细胞或其组合，在另一个实施方案中其相对于彼此是自体的(autologous)、同基因的(syngeneic)或异基因的(allogeneic)。在另一个实施方案中，细胞群包括本发明的肽。在另一个实施方案中，细胞群摄取所述肽。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的细胞群获自体内来源，诸如，例如，外周血、白细胞分离(leukopheresis)血液制品、分离(apheresis)血液制品、外周淋巴结、肠相关淋巴组织、脾、胸腺、脐带血、肠系膜淋巴结、肝、免疫病变部位例如滑液、胰、脑脊液、肿瘤样本、肉芽肿组织，或其中可以获得这类细胞的任意其他来源。在另一个实施方案中，细胞群获自人类来源，在其他实施方案中，其来自人类胎儿、新生儿、儿童或成人来源。在另一个实施方案中，本发明的细胞群获自动物来源，诸如，例如，猪的或猿的，或任意其他感兴趣的动物。在另一个实施方案中，本发明的细胞群获自对象，所述对象是正常的，或在另一个实施方案中，是患病的，或在另一个实施方案中，易患感兴趣的疾病。

在另一个实施方案中，通过基于亲和力的分离方法来分离本发明的细胞群。在其他实施方案中，用于亲和分离的技术包括磁性分离、使用抗体包被的磁珠、亲和层析、与单克隆抗体连接或与单克隆抗体联用的细胞毒剂，例如补体和细胞毒素，以及利用粘附到固体基质(诸如板)的抗体进行“淘选”，或任意其他便利的技术。在其他实施方案中，分离技术包括使用荧光活化细胞分检器，其可以具有不同程度的复杂度，诸如多彩色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道，等等。在其他实施方案中，可以使用能够分离本发明细胞群的任意技术，这被认为是本发明的一部分。

在另一个实施方案中，树突状细胞来自在各种淋巴和非淋巴组织中发现的形态类似细胞类型的各种群体，并如此鉴定(Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9:271-296)。在另一个实施方案中，用于本发明的树突状细胞分离自骨髓，或在另一个实施方案中，来源于骨髓祖细胞，或，在另一个实施方案中，分离自/来源于外周血，或在另一个实施方案中，来源于细胞系，或是细胞系。

在另一个实施方案中，本文描述的细胞群分离自哺乳动物(诸如鼠、猿或人)的白细胞组分(参见，例如，WO 96/23060)。在另一个实施方案中，白细胞组分可以从哺乳动物的外周血分离。

用于分离树突状细胞的方法是本领域公知的。在另一个实施方案中，DC通过包括下列步骤的方法进行分离：(a)通过本领域已知的方法诸如白细胞分离法，提供从哺乳动物来源获得的白细胞组分；(b)通过逆流离心洗脱，将步骤(a)的白细胞组分分离为4个或更多个亚组分；(c)通过将细胞与钙离子载体、GM-CSF和IL-13或GM-CSF和IL-4接触，将来自步骤(b)的一个或更多个组分中的单核细胞刺激转化为树突状细胞；(d)鉴定来自步骤(c)的树突状细胞富集组分；和(e)收集步骤(d)的富集组分，优选的在大约4℃。

在另一个实施方案中，树突状细胞富集组分通过荧光激活细胞分类术进行鉴定，其鉴定下列标记物中的至少一种：HLA-DR、HLA-DQ或B7.2，并且鉴定下列标记物的同时缺失：CD3、CD14、CD16、56、57和CD 19、20。

在另一个实施方案中，细胞群包括淋巴细胞，在另一个实施方案中，其是T细胞，或在另一个实施方案中，是B细胞。在其他实施方案中，T细胞被表征为NK细胞、辅助T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、TBL、天然T细胞，或其组合。应理解作为原代或细胞系、克隆等等的T细胞被认为是本发明的一部分。在另一个实施方案中，T细胞是CTL，或CTL系，CTL克隆，或从肿瘤、炎性或其他浸润液分离的CTLs。

在另一个实施方案中，造血干细胞或早期祖细胞包括用于本发明的细胞群。在另一个实施方案中，所述群是通过白细胞分离法分离或衍生的。在另一个实施方案中，在细胞因子施用之后，从骨髓、外周血(PB)或新生脐带血进行白细胞分离。在另一个实施方案中，干细胞或祖细胞的特征在于已知为CD34⁺的表面抗原标记物的表面表达，和表面谱系抗原标记物的表达排除，Lin^-。

在另一个实施方案中，连同骨髓细胞，给对象施用本发明的肽、组合物或疫苗。在另一个实施方案中，与骨髓细胞一起施用的实施方案在之前对象的放射之后进行，作为疗程的一部分，以便遏制、抑制或治疗对象的癌症。

在另一个实施方案中，短语“接触细胞”或“接触群”是指暴露的方法，其在其他实施方案中可以是直接或间接的。在另一个实施方案中，这种接触包括通过本领域公知的任意方式直接注射细胞，诸如显微注射。在另一个实施方案中，还可以预见，提供给细胞是间接的，诸如通过在细胞周围的培养基中提供，或通过本领域公知的任意途径并如本文所述给对象施用。

在另一个实施方案中，本发明方法的CTL产生在体内实现，并受到向对象引入抗原呈递细胞(体外与本发明的肽接触)的影响(参见例如Paglia等人(1996)J.Exp.Med.183:317-322)。

在另一个实施方案中，将本发明方法和组合物的肽递送给APC。在另一个实施方案中，将肽刺激的APC给对象施用以引发免疫应答，或治疗或抑制肿瘤的生长或复发。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，以编码肽的cDNA形式将肽递送给APC。在另一个实施方案中，术语“抗原呈递细胞(APC)”是指树突状细胞(DC)、单核细胞/巨噬细胞、B淋巴细胞或表达必需MHC/共刺激分子的其他细胞类型，它们有效的允许呈递肽的T细胞识别。在另一个实施方案中，APC是癌细胞。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，CTL与2种或更多种APC群接触。在另一个实施方案中，2种或更多种APC群呈递不同的肽。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，使用在APC(例如DC)的胞浆中引起抗原表达的技术将肽递送到APC。用于在APC上表达抗原的方法是本领域公知的。在另一个实施方案中，技术包括(1)将编码本发明肽的裸DNA导入APC，(2)用表达本发明肽的重组载体感染APC，和(3)使用脂质体将本发明的肽导入APC的胞浆。(参见Boczkowski D.等人(1996)J.Exp.Med.184:465-472；Rouse等人(1994)J.Virol.68:5685-5689；and Nair等人(1992)J.Exp.Med.175:609-612)。

在另一个实施方案中，如本文所举例的，使用培养的APC诸如来源于人细胞系174xCEM.T2(称为T2)的那些，其在它的抗原加工途径中包含突变，这限制了内源肽与细胞表面MHC I类分子的结合(Zweerink等人(1993)J.Immunol.150:1763-1771)。

在另一个实施方案中，如本文所述，将对象暴露于肽或包括本发明肽(其不同于表达的天然蛋白)的组合物/细胞群，其中随后形成宿主免疫与天然蛋白/抗原的交叉反应。

在另一个实施方案中，在本发明任意方法或实施方案中涉及的对象是人。在其他实施方案中，对象是哺乳动物，其可以是小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、马、牛、绵羊、山羊、猪、猫、狗、猴或猿。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明的肽、疫苗和组合物刺激导致肿瘤细胞裂解的免疫应答。

在另一个实施方案中，使用本文描述的任意方法来引发CTL，其是体外引发的。在另一个实施方案中，CTL是离体引发的。在另一个实施方案中，CTL是体外引发的。在另一个实施方案中，将获得的CTL给对象施用，从而治疗与肽、包括肽的表达产物或其同系物相关的病症。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在另一个实施方案中，所述方法要求使用例如一或多种核酸递送技术导入编码本发明肽的遗传序列。在另一个实施方案中，本发明的核酸包括DNA、RNA以及DNA和RNA的混合物，单独的或与非核酸组分联用。在另一个实施方案中，所述方法包括给对象施用包括核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列编码本发明的肽(Tindle,R.W.等人Virology(1994)200:54)。在另一个实施方案中，所述方法包括给对象施用裸DNA，所述裸DNA编码本发明的肽或在另一个实施方案中编码本发明的两种或更多种肽(Nabel,等人PNAS-USA(1990)90:11307)。在另一个实施方案中，使用多表位、基于类似物的癌症疫苗(Fikes等人,Design of multi-epitope,analogue-basedcancer vaccines.Expert Opin Biol Ther.2003 Sep；3(6):985-93)。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

核酸可以通过本领域已知的任意方法给对象施用，包括肠胃外或静脉内施用，或在另一个实施方案中，通过基因枪。在另一个实施方案中，核酸在组合物中施用，其在其他实施方案中对应于本文所列的任意实施方案。

用于本发明方法的载体可以包括有利于或允许本发明肽表达的任意载体。在一些实施方案中，载体包括减毒病毒，诸如牛痘或鸡痘，诸如描述于，美国专利4,722,848，引入本文作为参考。在另一个实施方案中，载体是BCG(结核活菌苗)，诸如描述于Stover等人(Nature 351:456-460(1991))。可用于本发明肽的治疗性施用或免疫的多种其他载体，例如伤寒沙门氏菌载体等等，根据此处的描述对本领域技术人员来说将是显而易见的。

在另一个实施方案中，如本文所述，所述载体还编码免疫调节化合物。在另一个实施方案中，在给对象施用编码本发明肽的载体的同时、之前或之后，给所述对象施用编码免疫调节化合物的另外的载体。

在另一个实施方案中，将本发明的肽、组合物和疫苗给对象施用，或在本发明的方法中使用，与其他抗癌化合物和化疗剂联用，包括单克隆抗体，其针对其他的(alternate)癌症抗原或在另一个实施方案中由AA序列组成的表位，所述AA序列对应于或部分对应于作为本发明肽来源的序列。

本发明预期剂量范围的各种实施方案。在另一个实施方案中，剂量是20μg每种肽每天。在另一个实施方案中，剂量是10μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是30μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是40μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是60μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是80μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是100μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是150μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是200μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是300μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是400μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是600μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是800μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是1000μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是1500μg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是2000μg/肽/天。

在另一个实施方案中，剂量是10μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是30μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是40μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是60μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是80μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是100μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是150μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是200μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是300μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是400μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是600μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是800μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是1000μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是1500μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是2000μg/肽/剂量。

在另一个实施方案中，剂量是10-20μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是20-30μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是20-40μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是30-60μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是40-80μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是50-100μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是50-150μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是100-200μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是200-300μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是300-400μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是400-600μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是500-800μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是800-1000μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是1000-1500μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是1500-2000μg/肽/剂量。

在另一个实施方案中，每剂量或每天的肽总量是上述量之一。在另一个实施方案中，每剂量的总肽剂量是上述量之一。

每种上述剂量代表本发明不同的实施方案。

本发明预期剂量范围的各种实施方案。在另一个实施方案中，剂量是20mg每种肽每天。在另一个实施方案中，剂量是10mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是30mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是40mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是60mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是80mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是100mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是150mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是200mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是300mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是400mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是600mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是800mg/肽/天。在另一个实施方案中，剂量是1000mg/肽/天。

在另一个实施方案中，剂量是10mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是30mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是40mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是60mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是80mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是100mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是150mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是200mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是300mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是400mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是600mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是800mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是1000mg/肽/剂量。

在另一个实施方案中，剂量是10-20mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是20-30mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是20-40mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是30-60mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是40-80mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是50-100mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是50-150mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是100-200mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是200-300mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是300-400mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是400-600mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是500-800mg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量是800-1000mg/肽/剂量。

每种上述剂量代表本发明不同的实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包括本发明的肽、组合物或疫苗的试剂盒。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包括标签或包装说明书。在另一个实施方案中，通过利用延迟型超敏反应测试，使用试剂盒来检测WT-1特异性CD4应答。在另一个实施方案中，所述试剂盒用于本文列举的任意其他方法。在另一个实施方案中，所述试剂盒用于本领域已知的任意其他方法。每种可能性代表本发明单独的实施方案。

在恶性细胞独有或差异表达的那些抗原中，WT-1被认为是最有希望的之一(47)。但是，先前鉴定和报道的免疫原性WT-1肽抗原的数目是非常有限的，并主要限于HLA等位基因A0201、A2402和DRB10401呈递的一组肽中。由下文所述的实施例可以看出，使用加载于自体APC的跨越WT-1氨基酸序列的重叠15-聚体肽库进行致敏，从41/56(78％)的正常供体的血液中产生WT-1肽特异性IFNγ⁺CD4⁺和CD8T细胞，从而鉴定引发这些应答的表位和它们的呈递HLA等位基因。在描述的42种WT-1肽抗原中，迄今为止只有一种被鉴定过。鉴定的新免疫原性肽包括I类HLA等位基因呈递的36种肽和II类HLA等位基因呈递的5种肽。在I类HLA等位基因呈递的肽中，鉴定出10个九聚体表位，其可以由2-4个不同的HLA等位基因呈递。在4种十五肽中还鉴定出共诱导可区分的CD4⁺IFNγ⁺和CD8⁺IFNγ⁺T细胞的重叠11-聚体和九聚体序列。可以轻易的确定在遗传两种呈递HLA等位基因或I类和II类呈递HLA等位基因(在这些情况下重叠序列包含于相同的15-聚体)的个体中被超过一种等位基因呈递的表位是否可以引发增强的WT-1特异性应答及其程度；但是，在WT-1疫苗中包括这种肽可以将它们的适用范围显著变宽，尤其在未遗传HLA-A0201或A2402的患者中。

如实施例所示，由I类HLA等位基因呈递的那些肽引发IFNγ⁺CD8⁺T细胞，其在50/51(99％)和48/51(94％)的被测培养物中(表1，2)分别能够裂解加载肽的自体APC以及具有T细胞的限制性HLA等位基因的异基因APC。更重要地，在能够检测到的36个HLA限制性WT-1肽特异性T细胞系中，对29种表位(包括II类等位基因呈递的2/4表位和I类等位基因呈递的27/32表位)特异的T细胞系还能够裂解具有T细胞的限制性HLA等位基因的WT-1⁺白血病原始细胞。HLA限制性WT-1表位特异性T细胞不能裂解来自相同白血病患者的异基因PHA原始细胞(表3A)，以及与用单独的自体EBVBLCL致敏的相同T细胞的等分试样相比，用加载WT-1肽的自体EBVBLCL致敏的T细胞的不同杀白血病细胞活性(表3B)，表明杀白血病活性是WT-1肽特异性的，而非污染的同种反应性T细胞的结果。因此，这些数据显示，在适合于WT-1表位特异性T细胞识别和细胞溶解的浓度，29/36的所鉴定WT-1免疫原性肽(80％)能够被加工并被WT-1⁺白血病细胞呈递。

在图4中，显示WT-1蛋白。图4C显示所有先前报道的由HLA I类和II类等位基因呈递的抗原性表位的位置；图4D描述该报道鉴定的免疫原性肽的位置。可以看出，先前报道的由I类呈递的11个表位和由II类HLA等位基因呈递的10个表位主要聚簇于外显子1、7和10编码的序列，而用WT-1肽库致敏的正常T细胞识别的表位主要聚簇于前5个外显子编码的序列。因此，26个新表位被归入源于剪接变体的4种WT-1主要同种型中的每一种，其包括或不包括外显子5的17氨基酸序列(氨基酸250-266)以及锌指3和4之间的3氨基酸序列(400-410KTS)。尽管表位是广泛分布的，在外显子1的RNA识别域和接近外显子5的剪接17aa片段的活化域(aa 181-250)(图4F)检测到表位簇。后一区域还包含被多个供体最常识别的那些表位(图4E)。有趣地是，9个新鉴定的表位定位到N端的126个氨基酸的序列(由Gessler等人(37)最初描述的WT-1基因的片段编码)(即WT-1的(Exon 5+，KTS+)同种型的外显子1的着丝粒)，并包括WT-1的长同种型(从位于外显子1.50的AUG起始子上游的CUG密码子开始)。令人惊讶的，在该序列中鉴定的每一表位都引发IFNγ⁺T细胞，其对共表达WT-1和T细胞的限制性HLA等位基因的白血病原始细胞是溶胞性的。

在特定肿瘤差异表达的数种“自身”蛋白诸如WT-1、NY-ESO-1、HER2/neu、MAGE等等中，只有WT-1和MART-1显示在正常供体中引发应答(31,32,51-54)。与此相反，在一定比例的患有过表达这些蛋白的肿瘤的患者中，已经记录了对这些蛋白中每种特异的T细胞(55)。具体来说，已经在患有白血病、骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌及其他实体瘤的患者中检测到对WT-1的RMF和CMT肽特异的T细胞(31,32,56-61)。已经记载了当前研究中在50-60％的卵巢癌患者中鉴定到对数种WT-1表位的应答。考虑到在蛋白诸如NY-ESO-1和HER2/neu(其在载有肿瘤的宿主中引发应答)中较高数目的有效免疫原性表位(62)，我们鉴定出的免疫原性WT-1肽的数目的不同之处不足以解释正常供体中WT-1应答的差异化存在。此外，Pospori等人(63)已经证明，表达转导的TCR(对HLA-A0201呈递的WT-1肽特异)的HSC在HLA-A0201转基因小鼠的胸腺中没有被去除，并产生功能性记忆T细胞。但是，尽管这种缺乏“自体”耐受性的基础是不清楚的，Rezvani等人的研究(31)和本文的数据(图1A)表明，健康供体的血液中WT-1特异性T细胞的频率较低。在某种程度上，这反映了正常个体中WT-1表达的低水平和有限组织分布(18-20)。最近，Rezvani等人(64)还证明了在重复接种WT-1肽的患者中对WT-1的T细胞应答下降，表明这些应答受高度调控。Lehe等人(65)最近还显示，在高浓度IL-2存在的条件下，用DRB10402呈递的WT-1肽对T细胞的致敏优选的刺激CD25⁺FOX P3⁺GITR⁺CD127-调节性T细胞的产生，其能够抑制CD8⁺WT-1特异性T细胞应答。

在本文使用的培养条件下，加载WT-1肽库的自体DC和EBVBLCL优选的在41/56的正常供体(73％)中诱导CD8⁺和CD4⁺IFNγ⁺WT-1肽特异性T细胞的产生。尽管每个供体只识别1-3个WT-1表位，对这些表位的80％特异的T细胞能够识别具有T细胞呈递HLA等位基因的WT-1⁺白血病细胞的事实表明，异常表达的WT-1的更新和加工较高，允许这些白血病细胞表达的限制性HLA等位基因同时呈递数种不同的WT-1表位。这些表位的鉴定有利于用于继承性细胞疗法的有效杀肿瘤的WT-1特异性T细胞的体外产生，以及用于刺激T细胞应答(用于消灭体内表达WT-1的克隆源性肿瘤细胞)的更广泛适用范围疫苗的产生。

在一个实施方案中，来自WT-1蛋白序列(其位于外显子1的上游，即在SEQ ID NO:194的前126个氨基酸内)的肽迄今为止未被识别为免疫原性表位的位点，因此未被认为是可用于本文目的的肽。

实施例1

HLA-A0201和-A0301通过来源于WT-1的合成肽类似物结合

材料和试验方法。肽由Genemed Synthesis Inc,CA使用芴甲氧羰酰化学法和固相合成法合成，并用高压液相层析(HPLC)纯化。通过HPLC分析评价肽的质量，并利用基质辅助的激光解吸质谱来测量预期分子量。肽是无菌的，并且纯度>90％。将肽溶于DMSO，并用PBS(pH 7.4)或盐溶液稀释以获得5毫克每毫升(mg/ml)的浓度，保存于-80℃。对于体外实验，使用无关对照肽HLA A24共有序列(consensus)。

肽序列分析。使用2个数据库进行肽序列分析。第一个数据库是Bioinformatics & Molecular Analysis Section(National Institutes of Health,Washington,DC)(Parker KC等人,Scheme for ranking potential HLA-A2binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains.J Immunol 152:163-175,1994)的软件，其基于来自HLA I类分子的预测半衰期解离系数排列9-聚体或10-聚体肽。第二个数据库，SYFPEITHI预测软件，描述于Rammensee HG等人(SYFPEITHI:database for MHC ligands andpeptide motifs.Immunogenetics 50:213-219,1999)。用于体外实验的无关对照肽是：对于II类是RAS(TEYKLVVVGAPGVGKSALTIQ；SEQ ID NO:49)或CML b2a2(VHSIPLTINKEEALQRPVASDFE；SEQ ID NO:50)，对于I类是HIV pol(ILKEPVHGV；SEQ ID NO:51)或CML F(YLKALQRPY；SEQ ID NO:52)。

细胞系。在添加5％FCS、青霉素、链霉素、2mM谷氨酰胺和2-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中，在37℃包含5％CO₂的湿润空气中培养细胞系。T2是人细胞系，不含TAP1和TAP2，因此不会呈递来源于细胞溶质蛋白的肽。Raji细胞是显示高水平TAP表达的人伯基特淋巴瘤细胞。

研究的人间皮瘤细胞系包括∶肉瘤样的(VAMT,H2373,H28)、上皮状的(H2452)和两相性的(JMN,MSTO和H-Meso1A)。细胞系获自下列来源：H-Meso1A:NCI,Bethesda,MD；JMN和VAMT:Dr.Sirotnak,Memorial SloanKettering Cancer Center(MSKCC)；H-2452和H2373:Dr.Pass,KarmanosCancer Institute,Wayne State University,Detroit,MI；H28和MSTO:美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)。细胞系在供应商推荐的培养基中维持，并在含5％CO₂的湿润培养箱中孵育。

间皮瘤细胞系Meso 11、Meso 34、Meso 37、Meso 47和Meso 56获自Dr.M Gregoire(Institute of Biology,Nantes,France)，并在RPMI 1640(LifeTechnologies)+10％胎牛血清(FCS)、1％青霉素-链霉素和1％L-谷氨酰胺中培养。所有细胞都由MSKCC的细胞免疫学系进行HLA分型。黑色素瘤细胞系Mewo(WT-1^-A201⁺)获自ATCC。SKRC-52肾细胞癌获自LudwigInstitute的L.Old。白血病细胞系在RPMI 1640+10％FCS、1％青霉素-链霉素、2mM谷氨酰胺和2-巯基乙醇，37℃/5％CO₂的条件下培养。LAMA81、BV173和697都是WT-1⁺和A0201⁺的Ph⁺白血病细胞，由Dr.HJ Stauss(University College London)提供。SKLY-16是人B细胞淋巴瘤(WT-1^-，A0201⁺)；K562、RwLeu4和HL60都是WT-1⁺白血病细胞，获自ATCC。

用于HLA A0201分子的肽结合和稳定的T2测定法。T2细胞(TAP^-，HLA-A0201⁺)按照1×10⁶细胞/ml的浓度，在添加5μg/ml人β_2m(Sigma,StLouis,MO)的不含FCS的RPMI培养基中于27℃孵育过夜，所述RPMI培养基不含(阴性对照)或存在各种终浓度(50,10,1和0.1微克(μg)/ml)的阳性参照酪氨酸酶肽或测试肽。与5μg/ml布雷菲尔德菌素A(Sigma)孵育4小时后，将T2细胞在4℃用饱和浓度的抗HLA-A2.1(BB7.2)mAb标记30分钟，然后洗涤两次。然后将细胞与饱和浓度的缀合FITC的山羊IgG F(ab')2抗小鼠Ig(Caltag,San Francisco,CA)在4℃孵育30分钟，洗涤两次，在PBS/1％多聚甲醛中固定，并使用FACS细胞荧光计(BectonDickinson,Immunocytometry Systems,San Jose,CA)进行分析。

观察到的针对每种肽浓度的荧光平均强度(MIF)(在除以不含肽的MIF之后)被用作肽结合的指示，并表示为“荧光指数”。类似地进行稳定测定法。在时间为0时进行肽结合的初始评估之后，细胞用RPMI完全培养基洗涤以去除游离肽，并在0.5μg/ml布雷菲尔德菌素-A连续存在的条件下孵育2，4，6或8小时。

如上所述通过免疫荧光估算稳定的肽-HLA-A2.1复合物的数目。复合物的半衰期是时间为0时的MIF值降低50％所需时间的估值。

WT-1肽。由Gessler等人(37)公开的WT-1蛋白序列(其包括575个氨基酸并包括在WT-116的(外显子5+,KTS+)同种型中N端缺失的前126个氨基酸)被用于设计肽序列(SEQ ID NO:1；图2A)。跨越该序列的141个十五肽(每个与下一个重叠11aa)由Invitrogen(Baltimore,MD)按照已验证序列的说明进行合成，95％纯度，无菌且不含内毒素。将这141个15-聚体等量混合以形成总肽库，其中每种肽的浓度为0.35mcg/ml。该库用于T细胞致敏。为了鉴定引发应答的肽，建立包含12个十五肽(4.17mcg/ml/肽)的子库，以形成其中每种肽只被包含入两个重叠子库的定位矩阵(图2B)。

WT-1特异性T细胞的产生：根据Memorial Sloan-Kettering CancerCenter(New York,NY)伦理委员会批准的方案，从56个知情同意的正常供体获得外周血。通过标准技术按照高分辨率将所有供体分型为HLA-A，B，C，DR和DQ

使用细胞因子活化的单核细胞(CAM)作为抗原呈递细胞(APC)，并如先前所述(32)产生。简单来说，通过粘附到塑料上分离外周血单核细胞，并在包含1％自体血清的RPMI 1640中培养。在第0，2，4天，添加GM-CSF(Berlex,Montville,NJ)和白介素-4(IL-4)(R&D Systems,Minneapolis,MN)到终浓度分别为2000U/ml和1000U/ml。在第5天，这些细胞再用TNFα(10ng/ml)、白介素-6(IL-6)(1000IU/ml)、IL1((400IU/ml)、PGE2(25mM-3)(R&DSystems,Minneapolis,MN)以及相同剂量的GM-CSF和IL-4进行处理。经FACS分析确定，培养第7天收集的CAM表达CD83、CD80、CD86以及HLA I类和II类等位基因。

如实验中所述，EBV-BLCL也被用作加载WT-1肽和对照APC或作为靶标。如先前所述，它们通过用EBV株B95.8(38,39)感染外周血单个核细胞(PBMC)产生。在存在无环鸟苷的条件下，在含10％胎牛血清(Gemini)的RPMI 1640(Gemini)中培养EBV转化的BLCL(EBV-BLCL)。

WT-1特异性T细胞的致敏和增殖。为了产生WT-1特异性CTL，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBMC。按照先前的描述(32)，单核细胞通过粘附到塑料上去除，而NK细胞吸附到免疫磁性CD56预包被微珠(Miltenyi Biotech Inc,MA)。按照20:1的应答物：刺激剂比例，用自体CAM或EBV-BLCL(已经在不含血清的培养基中用WT-1十五肽的总库预加载3小时并辐射到3000cGy)刺激富集T细胞的组分。T细胞在添加5％AB人血清(YH5,Gemini)的Yssel's培养基中培养，用加载自体WT-1总库的CAM或EBV-BLCL每周再刺激，并且每2-3天按照10-50U/ml添加白介素-2(IL-2)(Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA)。

细胞靶标-白血病细胞∶如先前所述(32,38)，使用鼠抗人WT-1单克隆抗体(Neomarkers,Fremont,CA)，通过胞内FACS染色表征24种原代白血病细胞和1种白血病细胞系的WT-1表达。WT-1⁺白血病细胞包括来自11个原代AML、3个原代ALL和1个B细胞前体ALL细胞系的母细胞。使用10个WT-1白血病细胞作为对照，并包括3个B细胞前体ALL和7个AML。

通过标准技术在高分辨率下将所有EBV BLCL和白血病细胞分型为HLA A，B，C，DR和DQ等位基因。

T细胞应答的评价。

WT-1特异性T细胞的IFNγ产生。如先前所述(38,40)，响应第二次刺激(利用加载于自体PBMC的WT-1总库、WT-1子库或单个WT-1 15-聚体或9-聚体WT-1肽)产生IFNγ的T细胞的比例和表型(CD4和CD8)通过包含胞内IFNγ的T细胞的FACS分析进行测量。

免疫原性表位的定位。将用WT-1总库刺激35-42天的T细胞的等分试样洗涤，用加载WT-1十五肽每种子库之一的自体PBMC再刺激过夜。如先前所述(41)，通过对包含胞内IFNγ的T细胞进行FACS分析，将针对每种子库的T细胞应答定量。然后使用定位网格(图2B)鉴定被引发T细胞应答的2种子库独享的特异性WT-1 15-聚体。这些15-聚体以及15-聚体内的9-聚体或11-聚体序列作为二次单肽刺激剂进行分析，以确认它们的免疫原性并确定在引发应答的15-聚体内的免疫原性表位。

细胞毒活性。在标准的Cr51释放测定法中测量致敏T细胞针对以下的WT-1特异性和HLA限制性细胞毒活性：一组HLA匹配和不匹配的CAM靶标(未修饰的或加载总库的)，如先前所描述(32)鉴定的引发T细胞应答的WT-1的15-聚体，或9-聚体或11-聚体表位。此外，通过测量致敏T细胞针对一组异基因CAM(预先加载肽，如先前描述每种具有在应答性WT-1特异性T细胞上表达的单个HLA等位基因(41))的细胞毒性，鉴定出呈递每种免疫原性表位的限制性HLA等位基因。如先前所述(32)，在所述细胞毒性测定Cr51测定法中还评价了WT-1表位特异性CTL针对WT-1^-和WT-1⁺白血病细胞系或表达限制性HLA等位基因的原代白血病细胞的细胞毒活性。

鉴定的免疫优势WT-1来源表位的免疫原性。为了估算鉴定的WT-1肽表位在不同个体中的免疫原性，将从正常供体组的PBMC分离的富集T细胞(表达一系列占优势的HLA等位基因(即HLA-A0201，A0301，A2402，B0702)之一，其先前被鉴定为新鉴定的WT-1表位的呈递者)在体外用人工抗原呈递细胞(AAPC)致敏(42)，所述AAPC表达该HLA等位基因并加载预先鉴定的WT-1表位或无关肽。AAPC组包括表达下列单个HLA等位基因之一的AAPC：HLA A0201，A0101，A0301，A2402，B0702或B0801，其如先前所述产生(42)。将T细胞与加载肽的AAPC在存在IL2的条件下共培养35天后，CTL用加载致敏肽或无关肽的自体PBMC进行第二次刺激过夜，检测它们的IFNγ应答。如果响应二次刺激(利用加载刺激性WT-1来源肽的自体PBMC)的产生IFNγ的T细胞比例超过与PBMC单独孵育的IFNγT细胞的背景比例两倍或更多，则应答被记为阳性的。

实施例2

正常供体对WT-1十五肽的总库的应答。

最初测量WT-1特异性IFNγ⁺T细胞在41个正常供体的PBMC中的频率。这些频率范围在0.01％到1.82％之间，只在10/41的个体中超过在用自体PBMC单独刺激的T细胞中检测到的IFNγ⁺T细胞背景(图1A)。对来自56个正常供体的T细胞进行体外致敏(利用加载WT-1十五肽的总库的自体CAM)35-42天导致在41/56的病例(73％)中IFNγ⁺T细胞的显著扩增(图1A)。从38/56的供体产生的T细胞还显示针对自体PHA原始细胞(加载WT-1总库)的细胞毒活性(图1B)，包括来自38/41的供体的T细胞，其对利用WT-1肽库的二次刺激发生应答而产生IFNγ。

将先前报道的预测结合HLA-A0201等位基因的WT-1表位之一，_126-134RMFPNAPYL(SEQ ID NO:21；RMF)(43)，与WT-1十五肽的总库比较当加载于自体CAM时在HLA-A0201⁺正常供体(n＝14)中刺激WT-1反应性T细胞的能力。在9/14的供体中检测到最初用RMF肽致敏的IFNγ⁺T细胞的频率增加，其中7个还对利用肽库的二次刺激产生应答(图1C)。与此相反，最初用WT-1肽库致敏的12/14的CTL系在用WT-1肽库二次刺激后产生高频率的IFNγ⁺T细胞，包括还对RMF产生应答的6个CTL系。对用总库致敏的T细胞识别的WT-1表位(参见下文)定位，在12/14的供体中鉴定出RMF以外的表位。对那些表位的应答大小要比对RMF肽的高得多(图1C)。只有4/14的最初用RMF致敏的CTL系显示针对加载RMF的自体PHA原始细胞的细胞毒活性；其中3个还能够裂解加载WT-1库的自体PHA原始细胞(图1D)。与此相反，10/14的用WT-1肽库致敏的CTL对加载WT-1总库的PHA原始细胞显示细胞毒性，包括裂解加载RMF肽的原始细胞的3/14(图1D)。因此，在高比例的HLA A0201⁺供体中，利用WT-1总库刺激T细胞比用单个HLA A0201结合RMF肽刺激更稳定地引发WT-1特异性T细胞应答。

图1的详细说明。通过用加载WT-1来源的十五肽总库的自体APC刺激，从正常供体(n＝56)的PBMC产生的CTL的WT-1特异性应答：A.IFNγ在以下细胞中的产生：单独的PBMC(作为背景)，与十五肽(跨越WT-1蛋白全序列)总库共孵育过夜的PBMC(PBMC+WT-1库)以及预先产生的与加载WT-1肽的PBMC共孵育过夜的WT-1特异性T细胞；B.用针对WT-1^-(自体PHA刺激的原始细胞)和WT-1⁺(自体PHA刺激的原始细胞，加载WT-1十五肽的总库)靶标的WT-1总库，按照50:1的效应物：刺激剂比例进行刺激，体外产生的WT-1特异性CTL的细胞毒活性；C.在用未修饰的或加载下列之一的自体PBMC进行二次过夜刺激后：RMF肽、通过在WT-1总库致敏的CTL中进行表位定位法鉴定的WT-1优势表位(dominantepitope)、WT-1141个十五肽的总库，不同应答细胞群(外周血来源的PBMC，在体外用加载于自体CAM的RMF肽致敏的预先产生的CTL，和用WT-115-聚体的总库致敏的预先产生的CTL)中通过FACS染色测量的IFNγ应答；D.体外产生，通过用加载RMF 9-聚体或WT-1 15-聚体总库的自体CAM进行致敏的WT特异性T细胞的细胞毒活性。评价针对自体WT-1阴性靶标(PHA活化的原始细胞)以及加载RMF肽、WT-1 15-聚体总库或相同T细胞系鉴定的优势WT-1表位的相同靶标的T细胞的细胞毒性。

实施例3

WT-1反应性T细胞识别的WT-1蛋白免疫原性表位的鉴定。

用肽库致敏产生的WT-1 CTL是表位特异性和HLA限制性的。通过定量IFNγ⁺T细胞对形成的WT-1 15-聚体子库的定位网格的应答来鉴定T细胞(在体外用重叠的WT-1十五肽的总库致敏)识别的表位(图2A)，这样的话任意单个15-聚体只被两个交叉子库共享(图2B)。如图2C的典型实施例所示，数量显著增加的IFNγ⁺T细胞响应具有十五肽#_75的子库#3和#19而选择性产生。然后用相邻的15-聚体(每个与肽#75重叠11aa)刺激T细胞。可以看出，IFNγ⁺T细胞响应肽#75选择性产生(图2D)。新鉴定的免疫原性WT-1表位是_174-182HSFKHEDPM。随后，评价这些T细胞针对一组异基因CAM(未修饰的或加载所述肽，每种具有被测CTL表达的一个HLA等位基因)的细胞毒活性。如图2E所示，T细胞选择性裂解加载肽的自体靶标和表达HLA-B3501等位基因的靶标，但是不裂解具有由T细胞供体遗传的其他HLA等位基因的加载肽的靶标。这些T细胞还裂解共表达HLA-B3501等位基因的WT-1⁺BALL细胞。

图2的详细说明。用于产生跨越WT-1蛋白全序列的重叠十五肽的总库和表位定位的策略：A.显示由575个氨基酸组成的WT-1蛋白的序列和11氨基酸重叠的十五肽的原则。跨越完整蛋白总共需要141个十五肽。使用由Gessler等人(37)公开的575个氨基酸的序列。该序列包括N端的额外126个氨基酸。为了符合WT-1序列(使用最长的、最频繁描述的WT-1 D同种型)内的氨基酸序列编号，我们将前126个氨基酸用负值编号，使用正值给最长D同种型描述的后449个氨基酸编号；B.定位网格由24个子库组成，每个包含最多12个WT-1来源的十五肽。每种肽独有地包含在两个交叉子库内；例如肽75被子库3和19独享；C.WT-1致敏的CTL响应二次(secondary)过夜刺激(利用加载于自体PBMC的WT-1十五肽子库)导致的IFNγ产生。对于均包含一个共同十五肽#75的子库#3和#19都观察到优势应答；D.根据在该图2C中确定的分析，WT-1 CTL响应二次过夜刺激(利用包含于子库内的单个十五肽)引发最高的应答导致的IFNγ产生，证实了优势免疫原性序列包含于十五肽#75内；E.响应肽#75的WT-1特异性T细胞的HLA限制性，通过Cr51释放测定法针对一组异基因CAM或PHA原始细胞鉴定，其符合WT-1 CTL供体表达的单个HLA等位基因。这些沿着图的X轴显示。用于所述测定法的CAM或PHA原始细胞是未修饰的(灰色柱)或加载WT-1优势表位(黑色柱)。WT-1 CTL的WT-1特异性细胞毒活性受到B3501 HLA等位基因的限制。

对引发T细胞应答的WT-1肽定位鉴定出由不同的I类和II类HLA等位基因呈递的多种免疫原性表位。使用相同方法定位，并最终鉴定了引发T细胞(来自其他40个应答正常供体)应答的WT-1表位。在这些供体中，8(19％)个只对一种WT-1肽应答，而18(43％)个对两种肽应答，16(39％)个对三种肽应答。在引发针对超过一种WT-1肽的应答的培养中，对子库的IFNγ⁺T细胞应答模式是足够独特的，以便允许有效免疫原性肽的初步分离。然后单独鉴定每种候选肽以确定诱导T细胞应答的特定肽。

鉴定的WT-1免疫原性肽和它们的呈递HLA等位基因列于表1。在引发T细胞应答的42种WT-1肽中，41种是新鉴定的；这些WT-1肽中只有一种，由HLA-A0201呈递的_126-134RMFPNAPYL九聚体，先前已被描述并证明当被所述等位基因呈递时是免疫原性的(43)。肽91，_235-249CMTWNQMNLGATLKG包含在本研究中引发受HLA DRB1 0402限制的CD4⁺T细胞应答的表位，还包含已知由HLA A0201和HLA A2402呈递的_235-243CMT九聚体(29)。对于由I类HLA等位基因呈递的26种肽，在最初研究的供体中鉴定出单个呈递HLA等位基因。但是，当检查不同供体中对这些肽的T细胞应答的HLA限制性时，发现当由2或3个不同的I类HLA等位基因呈递时，这些肽中的10种可以引发T细胞应答。一种序列，_238-246WNQMNLGAT肽，当由4种不同HLA I类等位基因中的任一种在不同供体中呈递时，引发强IFNγ⁺CD8⁺T细胞应答。

表1。使用跨越WT-1蛋白全序列的重叠十五肽库，通过用于T细胞应答的IFNγ产生测定法鉴定的WT-1来源免疫原性表位。阴影行表示可以由超过一个HLA等位基因呈递的肽。粗体肽序列代表实施例5中的那些被测肽，结果显示于表3。

*-通过计算机算法或文献的描述先前预测的表位

**-T细胞的细胞毒针对加载自体WT-1肽的APCs，但不针对白血病细胞

***-不能因为缺乏遗传一种等位基因而不遗传其他的靶标，将HLA限制性指定为一种或其他等位基因

使用这种表位定位策略，鉴定出5种新的11-聚体肽，其刺激受HLA II类等位基因限制的CD4⁺T细胞应答。响应这些表位中每一种产生的CD4⁺T细胞表达高水平的IFNγ⁺T细胞。对所述5个肽表位中的3个响应的CD4⁺T细胞应答还显示针对加载肽的PHA原始细胞以及未修饰的WT-1⁺白血病原始细胞(选择性的具有限制性II类HLA等位基因)的特异性细胞毒活性。

在所测56个供体的4个中，用WT-1 15-聚体的完整库致敏的T细胞表位定位鉴定出引发CD4⁺和CD8⁺T细胞应答的特定15-聚体(15-聚体肽#20，41，91，112)。对引发这些应答的序列的精细定位鉴定出刺激HLA II类限制性CD4⁺T细胞应答的4个11-聚体，其在它们的序列内还包含引发HLA I类限制性CD8⁺T细胞应答的9-聚体。这些双重刺激肽之一的典型实施例显示于图3。在这种情况下，发现肽41引发CD4⁺和CD8⁺IFNγ⁺T细胞应答(图3A)。对引发CD4⁺IFNγ⁺T细胞应答的肽41内的11-聚体的精细定位(图3A)表明，_38-48LDFAPPGASAY肽作为免疫原性最强的序列诱导CD4⁺和CD8⁺IFNγ⁺T细胞应答。令人惊讶的，肽41致敏的T细胞裂解用9aa序列(_38-46LDFAPPGAS)或11aa序列(_38-48LDFAPPGASAY)致敏的PHA原始细胞，但不裂解加载_36-46PVLDFAPPGAS或_37-47VLDFAPPGASA 11-聚体的PHA原始细胞。对培养中T细胞HLA限制性的后续检查(图3D)显示，只有当加载LDF 11-聚体时，II类HLA限制性T细胞对具有等位基因DRB10402和DQB1 0302的靶标是选择性细胞毒的，而受HLA A0201限制的T细胞能够裂解加载11-聚体或9-聚体LDF肽的靶标。在这种情况下，无法确定DRB1 0402或DQB1 0302是否是限制性II类HLA等位基因，因为在表达一种而无其他的组中没有可用细胞。

图3的详细说明。在用加载于自体CAM上的WT-1重叠15-聚体的总库致敏的WT-1 CTL中，HLA I类和II类限制性WT-1特异性T细胞对来源于WT-1蛋白的相同免疫优势肽15-聚体产生应答。A.由CD8⁺和CD4⁺WT-1特异性T细胞(响应利用相同优势WT-1来源的15-聚体#41的二次过夜刺激)产生IFNg；B.在二次过夜刺激(利用加载一组9-聚体的自体PBMC，所述9-聚体对肽#41(LDF-LDFAAPGAS)是独特的，或包含于相邻的重叠15-聚体#40(PVL-PVLDFAPPG，VLD-VLDFAPPGA)和#42(DFA-DFAPPGASA)之内)后通过IFNg产生鉴定十五肽#41内的氨基酸的免疫原性序列。只有唯独在15-聚体#41内呈递的9-聚体，LDF，引发IFNg应答；C.观察到WT-1 CTL针对9-聚体和11-聚体组(包含于肽#_41内，并加载于自体PHA刺激的原始细胞)的肽特异性细胞毒活性针对11-聚体LDF和包含于11-聚体LDF内的9-聚体LDF，如按照25:1 E:T比例的标准Cr51释放测定法所确定；D.WT-1 CTL的细胞毒活性的HLA限制性：受HLA-A0201限制的T细胞裂解加载11-聚体或9-聚体的靶标，而受HLADRB10402限制的那些只裂解加载11-聚体的靶标。

实施例4

产生的针对新鉴定WT-1表位的T细胞显示针对WT-1⁺白血病细胞的细胞毒活性。

一旦确定了WT-1肽特异性以及应答WT-1肽库的IFNγ⁺T细胞的HLA限制性，检测它们的细胞毒活性，所述细胞毒活性针对未修饰的和加载肽的自体PHA原始细胞和针对一系列加载所鉴定肽的异基因PHA原始细胞以及表达WT-1蛋白的原代急性白血病原始细胞，其共表达WT-1特异性T细胞的限制性HLA等位基因。对于后一测试，使用不表达限制性等位基因的WT-1⁺白血病细胞和具有限制性等位基因的WT-1^-细胞作为对照。结果概述于表1和2。

从表1可见，在用加载所鉴定肽的自体APC二次刺激后，在产生IFNγ⁺CD8⁺T细胞的51种培养物中，50种还显示针对加载靶标肽的自体PHA原始细胞的显著特异性细胞毒活性。在这些培养物中，48种还裂解加载异基因肽的PHA原始细胞或具有应答性T细胞的限制性HLA等位基因的DC。对3/5鉴定的II类HLA等位基因呈递的11-聚体肽应答的CD4⁺IFNγ⁺T细胞还裂解加载肽的自体和具有HLA的异基因II类+靶标。

在针对加载肽的靶标显示表位特异性细胞毒活性的T细胞培养物中，36种检测出针对共表达T细胞的限制性HLA等位基因的WT-1⁺白血病细胞的细胞毒活性。在这36种培养物中，27种显示针对WT-1⁺白血病细胞的HLA限制性细胞毒活性(表2)。对HLA A0201呈递的5种肽(_6-15RDL，_46-54SAY，_58-66PAP，_225-233NLY和_436-445NMH)特异的T细胞不能够裂解HLA-A0201⁺WT-1⁺白血病细胞。但是，对于_46-54SAY肽特异的HLA B4001限制性T细胞可以裂解共表达该HLA等位基因的WT-1⁺白血病细胞。类似地，裂解加载NMH肽的靶标的NMH肽特异性HLA限制性T细胞系(共表达HLA A0201，B4001或A2402)只能裂解表达HLA B4001等位基因的WT-1⁺白血病细胞。

表2。使用跨越WT-1蛋白全序列的重叠十五肽库，通过用于T细胞应答的IFNγ产生测定法鉴定的WT-1来源的免疫原性表位。粗体序列表示如实施例5描述的被测肽，结果提供于表3。

*-先前报道的表位；

**-针对加载WT-1肽的自体APC但不针对白血病细胞的T细胞细胞毒。

为了确定观察到的WT-1肽特异性T细胞针对异基因WT-1⁺白血病细胞(具有T细胞限制性等位基因)的细胞毒活性不是反映T细胞系中异应答性(alloresponsive)T细胞的存在，我们检测了这些针对从相同白血病患者培养的WT-1⁺白血病细胞和WT-1^-PHA原始细胞的HLA限制性WT-1肽特异性T细胞系中的13种的细胞毒活性。如表3a所示，WT-1特异性T细胞裂解来自相同患者的WT-1⁺白血病细胞但不裂解PHA原始细胞。

表3a。对WT-1来源的免疫原性表位(使用跨越WT-1蛋白全序列的重叠十五肽库，通过用于T细胞应答的IFNγ产生测定法鉴定)特异的T细胞的细胞毒活性，并针对WT-1阳性原代白血病细胞和相同来源的PHA原始细胞的T细胞的细胞毒活性进行检测。

P<0.001

*-通过计算机算法或文献的描述先前预测的表位

**-白血病细胞样品由永生化白血病细胞系或获自WT-1⁺白血病患者的原代白血病细胞提供

***-PHA原始细胞从PBMC产生，所述PBMC来源于与WT-1⁺原代白血病细胞来源相同的患者

不是本研究中提供白血病原始细胞的每个患者均能提供PHA原始细胞。尽管如此，这些结果提供了以下证据，WT-1特异性T细胞的细胞毒性不是归因于污染的异反应性。第二个(内容更丰富的)，但较间接的证据由来源于35个供体(已经在体外用加载的WT-1肽库或未修饰的自体EBVBLCL同时致敏)的T细胞针对这些原代白血病细胞的应答的配对比较提供。如表3b所示，在25/35的病例中，用加载WT-1肽库的EBVBLCL致敏的T细胞裂解具有T细胞的限制性HLA等位基因的WT-1⁺白血病细胞。与此相反，用单独的自体EBVBLCL致敏的T细胞始终不能裂解相同的WT-1⁺白血病细胞靶标。

表3b.来自正常供体的指定表位特异性和HLA限制性T细胞(用自体EBV BLCL或加载WT-1肽库的EBV BLCL致敏)针对具有T细胞的限制性HLA等位基因的原代WT-1+白血病细胞的杀白血病细胞(leukemocidal)活性。

p<0.001

*-通过计算机算法或文献的描述先前预测的表位

实施例5

新鉴定WT-1表位的免疫原性。

为了确定在单个供体中通过定位应答鉴定的肽在高比例的个体(载有相同呈递HLA等位基因)中也是免疫原性的，测定这些表位是否可以在6-12个个体(表达所述HLA等位基因)的组中引发适当的限制性T细胞应答。为了这个目的，来自每个供体的T细胞用载于一组人工抗原呈递细胞(AAPC)(42)(每种均表达单个HLA等位基因，具体来说是A0201，A0301，A2402或B0702)上的鉴定的表位进行致敏。如表4所示，在鉴定的9个肽(由HLA-A0201呈递)中，所有都能够在一定比例的HLA-A0201⁺个体中刺激WT-1特异性IFNγ⁺T细胞应答。先前报道的_126-134RMFPNAPYL肽(由HLA-A0201等位基因呈递)在5/12(42％)的测试HLA-A0201⁺正常供体中引发应答。作为比较，其他8个测试肽中的5个在50-75％的相同HLA-A0201⁺供体中引发WT-1肽特异性应答。由HLA-B0702等位基因呈递的两种WT-1表位还分别在50％和63％的测试个体中引发WT-1特异性T细胞应答(表4)。所有测试肽在至少2个额外供体(载有它们的呈递HLA等位基因)中引发特异性应答。

表4。对鉴定的WT-1肽(加载于表达单个HLA等位基因的AAPC上)产生应答的正常供体比例。

实施例6

将对肽(通过对混合WT-1 15-聚体的定位应答鉴定得到)的应答与对先前报道的WT-1肽(由结合算法预测有免疫原性的)的应答进行比较。

针对单独的WT-1肽比较由正常供体T细胞产生的初次应答，所述WT-1肽由针对其他WT-1肽的应答的定位策略鉴定得到，所述其他WT-1肽包含侧翼序列，使用先前描述的结合算法(44,45)经预测对呈递HLA等位基因具有更高的结合指数。如上文表4所示，8/12定位的表位的预测结合指数只是稍微低于研究最多的WT-1肽，RMF(由HLA A0201呈递)。但是，它们的解离时间显著更低。尽管如此，在高比例的正常供体中引发了针对这些肽中每一种的T细胞应答。

在5个例子中，定位的肽特异性(即_(-99)-(-91)THS，(-22)-(-19)KLG，_22-31GGC，_126-134RMF和_{(-125)-(-117)}RQR)与对呈递HLA等位基因具有最高亲和力的肽(在刺激性15-聚体内通过结合算法预测)相同。在定位的序列和预测具有最高结合指数的序列不同的那些例子中，对单独的定位的肽响应的供体比例等于或大于对预测具有更高亲和力的相邻表位响应产生的比例。例如，在检测的8/12(67％)HLA A0201供体中产生针对_38-46LDF肽的IFNγ⁺T细胞应答，而没有供体对预测和先前报道(46)的表位_37-45VLDFAPPGA产生应答。类似地，在HLA A2402⁺供体中，4/6的供体(60％)对_239-248NQMNLGATL产生应答，而只有1/6的供体对先前报道的由所述等位基因呈递(29)的_235-243CMTWNQMNL肽产生应答。

为了直接比较由HLA A0201呈递的肽(由矩阵定位鉴定，含有具有更高预测结合指数的侧翼肽)，将按相等浓度混合的肽加载于HLA A0201⁺AAPC，并用于致敏来自8个HLA A0201⁺正常供体的T细胞。致敏35天后，然后洗涤T细胞，并用辐射过的自体PBMC(加载各种单独肽)的等分试样二次刺激24小时。然后通过FACS定量应答性IFNγ⁺T细胞。如图5所示，结果证明尽管22-31GGC肽具有最低的结合指数和最短的预测解离时间，但它在7/8的供体中诱导强IFNγ⁺T细胞应答。此外，尽管3/8的供体对_6-15RDL、_10-18ALL和_7-15DLN肽产生应答，但通过应答定位鉴定的_6-15RDL肽引发更多数目的IFNγ⁺T细胞。将_(-75)-(-67)AILDFLLLQ和侧翼_(-78)-(-70)LLAAILDFL序列进行比较，AIL肽在更高比例的供体中(6/8对3/8供体)引发更强的应答。类似地，将定位的_38-46LDFAPPGAS肽与先前报道的_37-45VLDFAPPGA肽(46)进行比较，LDF肽在5/8的供体中诱导强应答，而VLD肽只在这些供体的2个中诱导低应答。

图5的详细说明。针对9-聚体肽(通过体外应答的表位定位鉴定)和相同15-聚体或相邻重叠15-聚体肽内的肽(预测具有更高结合亲和力和免疫原性)的等摩尔混合物的IFNγ⁺T细胞应答。A.对跨越氨基酸+2到+31的九聚体(包括_6-15RDL和_22-31GGC肽，在表位定位研究中HLA A0201⁺供体对其产生应答)的混合物的应答。B.对体外定位的_(-75)-(-67)AILDFLLLQ表位和具有更高预测结合亲和力的侧翼肽_(-78)-(-70)LLAAILDFL的应答。C.对体外定位的_38-46LDFAPPGAS表位和预测具有更高结合亲和力的重叠_37-45VLDFAPPGA的应答。

图5显示WT-1蛋白的定位。图5C限定所有先前报道的由HLA I类和II类等位基因呈递的抗原性表位的定位；图5D描述本报告鉴定的免疫原性肽的位置。可以看出，先前报道的由I类呈递的11个表位和由II类HLA等位基因呈递的10个表位主要聚簇于外显子1、7和10编码的序列中，而用WT-1肽库致敏的正常T细胞识别的表位主要聚簇于前5个外显子编码的序列中。因此，26个新表位被归入源于剪接变体的4种WT-1主要同种型中的每一种，其包括或不包括外显子5的17氨基酸序列(氨基酸250-266)或锌指3和4之间的3氨基酸序列(_400-410KTS)。由于表位是广泛分布的，在外显子1的RNA识别域和接近外显子5的剪接17aa片段的活化域(aa181-250)(图5F)中检测到表位簇。后一区域还包含被多个供体最常识别的那些表位(图5E)。9个新鉴定的表位定位到由WT-1基因片段编码的N端的126个氨基酸序列，所述WT-1基因最初由Gessler等人(37)描述，其是WT-1(Exon 5+，KTS+)同种型的外显子1的着丝粒点，并包括起始于外显子1的AUG起始子的CUG密码子上游的WT-1长同种型。令人惊讶的，该序列中鉴定的每种表位引发IFNγ⁺T细胞，其对共表达WT-1和T细胞的限制性HLA等位基因的白血病原始细胞是溶胞性的。

实施例7

卵巢癌中肽的抑制作用

在两项研究中鉴定本文所述肽在治疗卵巢癌中的应用。在第一项研究中，在将卵巢癌细胞注射入NOD/SCID小鼠之前，通过将不同剂量的T细胞与SKOV3-A2卵巢癌细胞预孵育，评估对不同WT-1肽特异的T细胞对卵巢肿瘤移植的抑制作用。使用如上所述的方法制备对下列免疫优势表位特异的T细胞培养物：A0201限制性WT-1肽LKTHTTRTHT(SEQ ID NO:182)特异性T细胞；A0301限制性WT-1肽RQRPHPGAL(SEQ ID NO:142)特异性T细胞，和A0201限制性WT-1肽FPPSLPPT(SEQ ID NO:145)T细胞。测试的T细胞与肿瘤细胞的比例是50:1、10:1、5:1和对照(无T细胞)。在肿瘤注射后，通过生物发光成像检测肿瘤荷重。对于每种剂量的所有3种T细胞系，与对照相比都观察到随时间的肿瘤荷重的显著降低。此外，通过将肿瘤细胞与WT-1肽特异性T细胞预孵育，小鼠存活时间被延长。在对照组中，所有小鼠都在肿瘤注射后70天死亡。观察到存活随着T细胞:肿瘤细胞剂量是剂量响应性增加的，对于50:1的剂量所有T细胞系，以及10:1的LKTHTTRTHT特定细胞系，在第96天仍有一些动物存活。

在第二项实验中，给载有预先建立的卵巢癌SKOV3-A2异种移植物的NOD/SCID小鼠静脉内施用WT-1肽特异性T细胞。评估的T细胞系是∶A0201限制性WT-1肽LKTHTTRTHT(SEQ ID NO:182)特异性T细胞和A0301限制性WT-1肽RQRPHPGAL(SEQ ID NO:142)特异性T细胞。通过生物发光、评估的人CD3⁺细胞的肿瘤浸入和记录的存活情况监测肿瘤荷重。在两种情况下，与对照相比给予的WT-1特异性T细胞降低肿瘤荷重，增加人CD3⁺细胞的肿瘤浸入并提高存活。

实施例8

白血病患者T细胞对表位的识别

在从正常相关或无关供体的异基因骨髓移植后复发的患者的过继性疗法中，使用移植供体来源的T细胞(用如上所述WT-1来源的十五肽的完整库致敏)进行I期临床试验。HLA限制性等位基因和相应的免疫优势WT-1表位如下所示：A0201，SEQ ID NO:147；A0203，SEQ ID NOs:176和183；B3503和C0401，SEQ ID NOs:161和169；A6901，SEQ ID NO:177；A0201，SEQ ID NO:182；B4701和DRB10102，SEQ ID NOs:148和149；A3101，SEQ ID NO:145；B4402，SEQ ID NOs:158和166；B3503，SEQ ID NOs:146和162；DRB11104，SEQ ID NO:149。注意到引发所用WT-1特异性T细胞的数种免疫优势表位针对基因N端区域(外显子1上游)的表位，即SEQ IDNOs:145，147，148和149。供体中的两个对PGCLQQPEQQG，SEQ ID NO:149产生应答，并且这两名接受治疗的患者在过继性转移后具有WT-1⁺白血病细胞的暂时清除。

实施例9

十五肽

合成下列十五肽。H2N代表肽的N端，-COOH代表C端。

表5.十五肽的序列

SEQ ID NO:1.H2N-SRQRP HPGAL RNPTA-COOH

SEQ ID NO:2.H2N-PHPGA LRNPT ACPLP-COOH

SEQ ID NO:3.H2N-ALRNP TACPL PHFPP-COOH

SEQ ID NO:4.H2N-PTACP LPHFP PSLPP-COOH

SEQ ID NO:5.H2N-PLPHF PPSLP PTHSP-COOH

SEQ ID NO:6.H2N-FPPSL PPTHS PTHPP-COOH

SEQ ID NO:7.H2N-LPPTH SPTHP PRAGT-COOH

SEQ ID NO:8.H2N-HSPTH PPRAG TAAQA-COOH

SEQ ID NO:9.H2N-HPPRA GTAAQ APGPR-COOH

SEQ ID NO:10.H2N-AGTAA QAPGP RRLLA-COOH

SEQ ID NO:11.H2N-AQAPG PRRLL AAILD-COOH

SEQ ID NO:12.H2N-GPRRL LAAIL DFLLL-COOH

SEQ ID NO:13.H2N-LLAAI LDFLL LQDPA-COOH

SEQ ID NO:14.H2N-ILDFL LLQDP ASTCV-COOH

SEQ ID NO:15.H2N-LLLQD PASTC VPEPA-COOH

SEQ ID NO:16.H2N-DPAST CVPEP ASQHT-COOH

SEQ ID NO:17.H2N-TCVPE PASQH TLRSG-COOH

SEQ ID NO:18.H2N-EPASQ HTLRS GPGCL-COOH

SEQ ID NO:19.H2N-QHTLR SGPGC LQQPE-COOH

SEQ ID NO:20.H2N-RSGPG CLQQP EQQGV-COOH

SEQ ID NO:21.H2N-GCLQQ PEQQG VRDPG-COOH

SEQ ID NO:22.H2N-QPEQQ GVRDP GGIWA-COOH

SEQ ID NO:23.H2N-QGVRD PGGIW AKLGA-COOH

SEQ ID NO:24.H2N-DPGGI WAKLG AAEAS-COOH

SEQ ID NO:25.H2N-IWAKL GAAEA SAERL-COOH

SEQ ID NO:26.H2N-LGAAE ASAER LQGRR-COOH

SEQ ID NO:27.H2N-EASAE RLQGR RSRGA-COOH

SEQ ID NO:28.H2N-ERLQG RRSRG ASGSE-COOH

SEQ ID NO:29.H2N-GRRSR GASGS EPQQM-COOH

SEQ ID NO:30.H2N-RGASG SEPQQ MGSDV-COOH

SEQ ID NO:31.H2N-GSEPQ QMGSD VRDLN-COOH

SEQ ID NO:32.H2N-QQMGS DVRDL NALLP-COOH

SEQ ID NO:33.H2N-SDVRD LNALL PAVPS-COOH

SEQ ID NO:34.H2N-DLNAL LPAVP SLGGG-COOH

SEQ ID NO:35.H2N-LLPAV PSLGG GGGCA-COOH

SEQ ID NO:36.H2N-VPSLG GGGGC ALPVS-COOH

SEQ ID NO:37.H2N-GGGGG CALPV SGAAQ-COOH

SEQ ID NO:38.H2N-GCALP VSGAA QWAPV-COOH

SEQ ID NO:39.H2N-PVSGA AQWAP VLDFA-COOH

SEQ ID NO:40.H2N-AAQWA PVLDF APPGA-COOH

SEQ ID NO:41.H2N-APVLD FAPPG ASAYG-COOH

SEQ ID NO:42.H2N-DFAPP GASAY GSLGG-COOH

SEQ ID NO:43.H2N-PGASA YGSLG GPAPP-COOH

SEQ ID NO:44.H2N-AYGSL GGPAP PPAPP-COOH

SEQ ID NO:45.H2N-LGGPA PPPAP PPPPP-COOH

SEQ ID NO:46.H2N-APPPA PPPPP PPPPH-COOH

SEQ ID NO:47.H2N-APPPP PPPPP HSFIK-COOH

SEQ ID NO:48.H2N-PPPPP PHSFI KQEPS-COOH

SEQ ID NO:49.H2N-PPHSF IKQEP SWGGA-COOH

SEQ ID NO:50.H2N-FIKQE PSWGG AEPHE-COOH

SEQ ID NO:51.H2N-EPSWG GAEPH EEQCL-COOH

SEQ ID NO:52.H2N-GGAEP HEEQC LSAFT-COOH

SEQ ID NO:53.H2N-PHEEQ CLSAF TVHFS-COOH

SEQ ID NO:54.H2N-QCLSA FTVHF SGQFT-COOH

SEQ ID NO:55.H2N-AFTVH FSGQF TGTAG-COOH

SEQ ID NO:56.H2N-HFSGQ FTGTA GACRY-COOH

SEQ ID NO:57.H2N-QFTGT AGACR YGPFG-COOH

SEQ ID NO:58.H2N-TAGAC RYGPF GPPPP-COOH

SEQ ID NO:59.H2N-CRYGP FGPPP PSQAS-COOH

SEQ ID NO:60.H2N-PFGPP PPSQA SSGQA-COOH

SEQ ID NO:61.H2N-PPPSQ ASSGQ ARMFP-COOH

SEQ ID NO:62.H2N-QASSG QARMF PNAPY-COOH

SEQ ID NO:63.H2N-GQARM FPNAP YLPSC-COOH

SEQ ID NO:64.H2N-MFPNA PYLPS CLESQ-COOH

SEQ ID NO:65.H2N-APYLP SCLES QPAIR-COOH

SEQ ID NO:66.H2N-PSCLE SQPAI RNQGY-COOH

SEQ ID NO:67.H2N-ESQPA IRNQG YSTVT-COOH

SEQ ID NO:68.H2N-AIRNQ GYSTV TFDGT-COOH

SEQ ID NO:69.H2N-QGYST VTFDG TPSYG-COOH

SEQ ID NO:70.H2N-TVTFD GTPSY GHTPS-COOH

SEQ ID NO:71.H2N-DGTPS YGHTP SHHAA-COOH

SEQ ID NO:72.H2N-SYGHT PSHHA AQFPN-COOH

SEQ ID NO:73.H2N-TPSHH AAQFP NHSFK-COOH

SEQ ID NO:74.H2N-HAAQF PNHSF KHEDP-COOH

SEQ ID NO:75.H2N-FPNHS FKHED PMGQQ-COOH

SEQ ID NO:76.H2N-SFKHE DPMGQ QGSLG-COOH

SEQ ID NO:77.H2N-EDPMG QQGSL GEQQY-COOH

SEQ ID NO:78.H2N-GQQGS LGEQQ YSVPP-COOH

SEQ ID NO:79.H2N-SLGEQ QYSVP PPVYG-COOH

SEQ ID NO:80.H2N-QQYSV PPPVY GCHTP-COOH

SEQ ID NO:81.H2N-VPPPV YGCHT PTDSC-COOH

SEQ ID NO:82.H2N-VYGCH TPTDS CTGSQ-COOH

SEQ ID NO:83.H2N-HTPTD SCTGS QALLL-COOH

SEQ ID NO:84.H2N-DSCTG SQALL LRTPY-COOH

SEQ ID NO:85.H2N-GSQAL LLRTP YSSDN-COOH

SEQ ID NO:86.H2N-LLLRT PYSSD NLYQM–COOH

SEQ ID NO:87.H2N-TPYSS DNLYQ MTSQL-COOH

SEQ ID NO:88.H2N-SDNLY QMTSQ LECMT–COOH

SEQ ID NO:89.H2N-YQMTS QLECM TWNQM-COOH

SEQ ID NO:90.H2N-SQLEC MTWNQ MNLGA-COOH

SEQ ID NO:91.H2N-CMTWN QMNLG ATLKG-COOH

SEQ ID NO:92.H2N-NQMNL GATLK GVAAG-COOH

SEQ ID NO:93.H2N-LGATL KGVAA GSSSS–COOH

SEQ ID NO:94.H2N-LKGVA AGSSS SVKWT-COOH

SEQ ID NO:95.H2N-AAGSS SSVKW TEGQS–COOH

SEQ ID NO:96.H2N-SSSVK WTEGQ SNHST-COOH

SEQ ID NO:97.H2N-KWTEG QSNHS TGYES-COOH

SEQ ID NO:98.H2N-GQSNH STGYE SDNHT-COOH

SEQ ID NO:99.H2N-HSTGY ESDNH TTPIL-COOH

SEQ ID NO:100.H2N-YESDN HTTPI LCGAQ-COOH

SEQ ID NO:101.H2N-NHTTP ILCGA QYRIH-COOH

SEQ ID NO:102.H2N-PILCG AQYRI HTHGV-COOH

SEQ ID NO:103.H2N-GAQYR IHTHG VFRGI-COOH

SEQ ID NO:104.H2N-RIHTH GVFRG IQDVR-COOH

SEQ ID NO:105.H2N-HGVFR GIQDV RRVPG-COOH

SEQ ID NO:106.H2N-RGIQD VRRVP GVAPT-COOH

SEQ ID NO:107.H2N-DVRRV PGVAP TLVRS-COOH

SEQ ID NO:108.H2N-VPGVA PTLVR SASET-COOH

SEQ ID NO:109.H2N-APTLV RSASE TSEKR-COOH

SEQ ID NO:110.H2N-VRSAS ETSEK RPFMC-COOH

SEQ ID NO:111.H2N-SETSE KRPFM CAYPG-COOH

SEQ ID NO:112.H2N-EKRPF MCAYP GCNKR-COOH

SEQ ID NO:113.H2N-FMCAY PGCNK RYFKL-COOH

SEQ ID NO:114.H2N-YPGCN KRYFK LSHLQ-COOH

SEQ ID NO:115.H2N-NKRYF KLSHL QMHSR-COOH

SEQ ID NO:116.H2N-FKLSH LQMHS RKHTG-COOH

SEQ ID NO:117.H2N-HLQMH SRKHT GEKPY-COOH

SEQ ID NO:118.H2N-HSRKH TGEKP YQCDF-COOH

SEQ ID NO:119.H2N-HTGEK PYQCD FKDCE-COOH

SEQ ID NO:120.H2N-KPYQC DFKDC ERRFS-COOH

SEQ ID NO:121.H2N-CDFKD CERRF SRSDQ-COOH

SEQ ID NO:122.H2N-DCERR FSRSD QLKRH-COOH

SEQ ID NO:123H2N-RFSRS DQLKR HQRRH-COOH

SEQ ID NO:124.H2N-SDQLK RHQRR HTGVK-COOH

SEQ ID NO:125.H2N-KRHQR RHTGV KPFQC-COOH

SEQ ID NO:126.H2N-RRHTG VKPFQ CKTCQ-COOH

SEQ ID NO:127.H2N-GVKPF QCKTC QRKFS-COOH

SEQ ID NO:128.H2N-FQCKT CQRKF SRSDH-COOH

SEQ ID NO:129.H2N-TCQRK FSRSD HLKTH-COOH

SEQ ID NO:130.H2N-KFSRS DHLKT HTRTH-COOH

SEQ ID NO:131.H2N-SDHLK THTRT HTGKT-COOH

SEQ ID NO:132.H2N-KTHTR THTGK TSEKP-COOH

SEQ ID NO:133.H2N-RTHTG KTSEK PFSCR-COOH

SEQ ID NO:134.H2N-GKTSE KPFSC RWPSC-COOH

SEQ ID NO:135.H2N-EKPFS CRWPS CQKKF-COOH

SEQ ID NO:136.H2N-SCRWP SCQKK FARSD-COOH

SEQ ID NO:137.H2N-PSCQK KFARS DELVR-COOH

SEQ ID NO:138.H2N-KKFAR SDELV RHHNM-COOH

SEQ ID NO:139.H2N-RSDEL VRHHN MHQRN-COOH

SEQ ID NO:140.H2N-LVRHH NMHQR NMTKL-COOH

SEQ ID NO:141.H2N-HNMHQ RNMTK LQLAL-COOH

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Claims

1.一种分离的WT-1肽，其由选自以下的氨基酸序列组成：AILDFLLLQ(SEQ ID NO:147)，RQRPHPGAL(SEQ ID NO:142)，GALRNPTAC(SEQ IDNO:143)，THSPTHPPR(SEQ ID NO:146)，ASGSEPQQM(SEQ ID NO:151)，WNQMNLGATLK(SEQ ID NO:173)，PGCLQQPEQQG(SEQ ID NO:149)和LDFAPPGASAY(SEQ ID NO:156)。

2.一种分离的WT-1肽，其由选自以下的氨基酸序列组成：PLPHFPPSL(SEQ ID NO:144)，HFPPSLPPT(SEQ ID NO:145)，PGCLQQPEQ(SEQ IDNO:148),KLGAAEASA(SEQ ID NO:150)，LLAAILDFL(SEQ ID NO:184)，CLQQPEQQGV(SEQ ID NO:185)和ALRNPTACPL(SEQ ID NO:191)。

3.一种分离的WT-1肽，其由选自以下的氨基酸序列组成：RDLNALLPAV(SEQ ID NO:152)，GGCALPVSGA(SEQ ID NO:153)，GAAQWAPVL(SEQ ID NO:154)，LDFAPPGAS(SEQ ID NO:155)，SAYGSLGGP(SEQ ID NO:157)，PAPPPPPPP(SEQ ID NO:158)，ACRYGPFGP(SEQ ID NO:159)，SGQARMFPN(SEQ ID NO:160)，PSCLESQPA(SEQ ID NO:162)，NQGYSTVTF(SEQ ID NO:163)，HHAAQFPNH(SEQ ID NO:164)，HSFKHEDPM(SEQ ID NO:165)，CHTPTDSCT(SEQ ID NO:166)，CTGSQALLL(SEQ ID NO:167)，TDSCTGSQA(SEQ ID NO:168)，RTPYSSDNL(SEQ ID NO:169)，NLYQMTSQLE(SEQ ID NO:170)，WNQMNLGAT(SEQ ID NO:171)，WNQMNLGATLK(SEQ ID NO:173)，CMTWNQMNLGATLKG(SEQ IDNO:174)，NLGATLKGV(SEQ ID NO:175)，LGATLKGVAA(SEQ ID NO:176)，TLGVAAGS(SEQ ID NO:177)，GYESDNHTT(SEQ ID NO:178)，FMCAYPGCNK(SEQ ID NO:179)，KRPFMCAYPGC(SEQ ID NO:180)，RKFSRSDHL(SEQ ID NO:181)，LKTHTTRTHT(SEQ ID NO:182)，NMHQRNHTKL(SEQ ID NO:183)，QARMFPNAPY(SEQ ID NO:190)，ALRNPTACPL(SEQ ID NO:191)和APVLDFAPPGASAYG(SEQ ID NO:193)。

4.一种分离的WT-1肽，其由选自SEQ ID NO:1-141的氨基酸序列组成。

5.一种分离的WT-1肽，其由包括选自SEQ ID NO：142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、184和185的氨基酸序列的8-30个氨基酸组成。

6.一种分离的WT-1肽，其由包括选自SEQ ID NO：1-141的氨基酸序列的16-30个氨基酸组成。

7.权利要求1-6中任一项的分离的WT-1肽，其中所述分离的WT-1肽结合HLA I类分子、HLA II类分子、或其组合。

8.一种药物组合物，其包括权利要求1-6中任一项的肽和药学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。

9.一种疫苗，其包括(a)一或多种权利要求1-6的分离的WT-1肽和(b)佐剂或载体。

10.权利要求9的疫苗，其中所述佐剂是QS21，弗氏不完全佐剂，磷酸铝，氢氧化铝，BCG，明矾，生长因子，细胞因子，趋化因子，白介素，Montanide或GM-CSF。

11.一种治疗患有表达WT-1的癌症的对象或降低表达WT-1的癌症的发病率或其复发的方法，所述方法包括给所述对象施用权利要求9的疫苗，从而治疗患有表达WT-1的癌症的对象，降低对象中表达WT-1的癌症的发病率或其复发。

12.权利要求11的方法，其中所述表达WT-1的癌症是白血病，促结缔组织增生的小圆细胞瘤，胃癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，生殖细胞瘤，卵巢癌，子宫癌，甲状腺癌，肝癌，肾癌，卡波西氏肉瘤，肉瘤，肝细胞癌，维尔姆斯氏瘤，急性髓性白血病(AML)，脊髓发育不良综合征(MDS)，或非小细胞肺癌(NSCLC)。

13.一种用于诱导对表达WT-1的癌症的细胞特异的CTL的形成和增殖的方法，所述方法包括给所述对象施用权利要求9的疫苗，从而诱导对表达WT-1的癌症的细胞特异的CTL的形成和增殖。

14.权利要求13的方法，其中所述表达WT-1的癌症是白血病，促结缔组织增生的小圆细胞瘤，胃癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，生殖细胞瘤，卵巢癌，子宫癌，甲状腺癌，肝癌，肾癌，卡波西氏肉瘤，肉瘤，肝细胞癌，维尔姆斯氏瘤，急性髓性白血病(AML)，脊髓发育不良综合征(MDS)，或非小细胞肺癌(NSCLC)。

15.一种组合物，其包括(a)抗原呈递细胞和(b)权利要求1-6中任一项的肽。

16.权利要求11-14中任一项的方法，其中所述癌症是间皮瘤。