CN104605308A - 适用于微藻保健稀态发酵酱油曲制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，属于食品发酵、酿造领域。本发明是一种含高活力蛋白酶、蛋白酶与淀粉酶酶比例协调的酱油曲制备方法，赋予酱油曲产生高活力碱性蛋白酶、氨肽酶的蛋白酶系、协调的淀粉酶酶系、纤维素酶系，可制备高品质的微藻保健稀态发酵酱油。本发明克服一般酱油曲酶系不协调，造成蛋白酶解（糖化）效率较低的技术问题。本发明以脱脂大豆和焙炒小麦、微藻、麸皮为原料，以米曲霉和黑曲霉作为制曲菌种，采用低温制曲方法，包括：制曲原料预处理、固态蒸煮、制曲和酱油曲的配制等过程。本发明生产的复合曲酶系，在制曲及酱油生产过程既可使微藻蛋白质、多糖物质适当降解，又可促进微藻物质的增浓除腥。
Description
技术领域
本发明涉及适用于微藻保健稀态酱油曲制备方法。本发明特别涉及适用于微藻保健稀态发酵酱油曲，赋予该种酱油曲产生高活力蛋白酶和氨肽酶以及协调的淀粉酶、纤维素酶酶系，可制备高品质的微藻保健稀态发酵酱油，属于食品发酵、酿造领域。
背景技术
本发明与微藻保健稀态发酵酱油曲制备方法有关，更具体地说是关于高品质的微藻保健稀态发酵酱油曲生产技术以及制备方法。
酱油曲是以脱脂大豆、小麦（或者大豆、面粉）作为制曲的原料，经原料预处理、种曲扩大培养和酱油曲制备阶段，得到含有一定的蛋白酶、淀粉酶等酶系和酶活力、使酱油曲中的蛋白质和淀粉在酶的作用下达到适度的溶解以及形成一定的酱油“色、香、味、体”前体性物质，是酱油生产过程的一种重要的中间制品。
适合生产酱油大豆，豆料，一年生草本，茎直立或半蔓生，种子呈球形至近球形。以东北大豆质量最优，平均千粒重约为165克。脱脂大豆中脂肪含量极低，水分也少，蛋白质含量却很高，因而适宜于作为酱油原料。本发明选择脱脂大豆作为酱油曲制备的原料；所选适合酱油制造的脱脂大豆，颗粒呈片状，蛋白质含量43-51%，脂肪含量0.5-1.5%。
小麦属于禾本科、小麦属，一年生或二年生草本作物。它是世界上分布最广、栽培面积最大的主要粮食作物之一。小麦粒色可分为红皮或白皮小麦。以质粒硬软而言可分为硬质、软质和中间质小麦。作为酿造酱油的辅料，以利用淀粉为主，应选用红皮及软质小麦。本发明选择小麦作为酱油曲制备的辅助原料；所选适合酱油制造的小麦含10-14%的蛋白质，其中麸胶蛋白质和谷蛋白质较丰富。麸胶蛋白质中的氨基酸最多，是产生酱油鲜味的一种主要成分。
麸皮质地疏松、体轻、表面积大，除一般成分外，还含多种维生素，钙、铁等无机盐，营养成分适于促进米曲霉的生长和产酶，既可增强其所分泌的酶的活力，又有利于原料利用率的提高。选择麸皮作为制酱油种曲的原料。所选适合酱油制造的麸皮质地疏松、表面积大，含有15-20%淀粉、半纤维素含量20-24%，含有丰富的钙、铁等无机盐和微量元素、维生素等营养成分。
米曲霉（Aspergillus oryzae）属于曲霉属的一种。米曲霉菌丝有隔膜、无色、多分枝，营养菌丝、气生菌丝。米曲霉的孢子吸水，在营养物上萌发、生长，形成菌丝。并长出分支，许多菌丝缠在一起称菌丝体。初生菌丝呈白色，再生出分生孢子梗，形成顶囊，顶囊上长小梗生长分生孢子，呈黄绿色。该发酵菌株较适宜于低温生长，培养最适温度为32℃。曲霉菌的生长需要适当的水分，菌丝生长期需要较高的水分，要求湿度保持在98-100%。米曲霉生长最适pH是6.0－6.5左右。米曲霉是好氧微生物，在繁殖阶段应通入较多的新鲜空气。米曲霉具有强的蛋白质分解和淀粉质液化能力，酶系较纯，不产生黄曲霉毒素。米曲霉变种是国内酱油曲制备的主要菌种。
黑曲霉(Aspergillus niger)属于曲霉属一种。它在自然分布广泛。黑曲霉的菌丝初为白色，继而产生鲜黄色，厚绒状。在麸皮培养基上生长迅速，初生孢子为嫩黄色，2－3天后全部变成黑色孢子。黑曲霉菌丛呈黑褐色，顶囊呈大球形，小梗分枝，形成串生孢子链，孢子球形。该发酵菌株较适宜于低温生长，培养最适温度为32℃。最适pH4.5-5.0。黑曲霉在生长中分解有机质生成多种有机酸，其抑止细菌能力强于米曲霉。黑曲霉具有强的糖化酶活力及果胶酶、纤维素酶，并具有较强的酸性蛋白酶活力，而且酶系较广。黑曲霉变种是国内糖化曲制备的主要菌种。适用于酱油曲制备的米曲霉、黑曲霉菌种的生理特性和产酶特性如表1所示。
表1. 适用于酱油曲制备的米曲霉、黑曲霉菌种的生理特性和产酶特性
利用微藻保健酱油曲制备的微藻酱油富含多种营养成分，而且具有浓郁的海鲜风味。这种微藻保健酱油具有调味、保健双重功效。这种具有保健功能的微藻包括：螺旋藻、雨生红球藻、小球藻等。这些微藻含有许多有益人体健康的生物活性物质，如：微藻蛋白质、微藻多糖、不饱和脂肪酸、α-胡萝卜素等微藻特征性成分，从而使这些微藻及其制品具有提高机体免疫力，降血脂、降血压等多种生理功效。这些保健微藻是一种多细胞丝状微藻，或者单细胞微藻，如螺旋藻、雨生红球藻、小球藻等。
酱油曲制备工艺可分为稀态发酵酱油曲、固态发酵酱油曲和特种酱油曲制备工艺。稀态发酵酱油曲、固态发酵酱油曲制备工艺如表2所示。
表2. 稀态发酵酱油曲和固态发酵酱油曲制备工艺
特种酱油曲能赋予这种曲特殊功效，影响酱油的色、香、味及其稳定性，以适合不同类型酱油制备和风味的需求。
稀态发酵酱油曲制备的工艺过程是以脱脂大豆、焙炒小麦粉作为制曲的原料，包括：原料预处理、种曲扩大培养和酱油曲制备阶段。原料预处理分为脱脂大豆润料、炒小麦、配料、蒸煮阶段。脱脂大豆润料主要可促进蛋白质适度变性，使淀粉易于糊化，并供给曲霉菌生长的水分。炒小麦主要使小麦的淀粉达到α-化，易被酶分解，增加风味物质前体性物质。原料蒸煮主要使原料中蛋白质达到适度变性、淀粉充分糊化，使消化率达到80%以上。用于蒸煮的设备主要为旋转式蒸煮锅，多采用高压间歇固态蒸煮法；或者采用连续蒸煮法，利用连续蒸煮装置，其原料润料、蒸料和冷却都是处于封闭状态下连续进行蒸煮的操作，可实现高压短时间蒸煮，消化率达到85-90%。原料蒸煮后要达到：原料中蛋白质达到适度变性、淀粉充分糊化，使消化率达到85%以上，原料含水量达到46-51%左右。
用于种曲制备的设备为调温调湿箱和种曲制备装置等。种曲扩大培养过程：试管（种曲）培养→三角瓶（种曲）培养→种曲培养。采用低温固态培养方法，通过调节制曲温度、湿度以及通风量，控制制曲进程，制得种曲。种曲要求孢子数60亿个/g(干基)以上。
用于制曲的设备主要为通风制曲箱和旋转式圆盘制曲系统等，多采用低温通风制曲方法，通过调节制曲料层温度、湿度以及通风量，控制制曲进程，制得成品的酱油曲。稀态发酵酱油曲为碱性蛋白酶活力2000（U/g干基），氨肽酶大于1000 U/g干基，糖化酶活力大于50 U/g干基。水分含量26-30%，手感曲料疏松柔软，具有弹性。曲层内部菌丝丰满粗壮，并密生嫩黄色孢子，无夹心。具有正常的曲香。
发明内容
本发明的目的，提供一种含高活力蛋白酶、蛋白酶与淀粉酶酶系比例协调的酱油曲制备方法，赋予酱油曲产生高活力碱性蛋白酶、氨肽酶、协调的淀粉酶酶系、纤维素酶系，可制备高品质的微藻保健稀态发酵酱油。本发明生产得到的复合曲酶系，在制曲及酱油生产过程既可使微藻蛋白质、多糖、细胞壁物质适当降解，产生较多生物活性物质，又可促进微藻物质的增浓除腥，制备高品质的微藻保健稀态发酵酱油。微藻保健稀态发酵酱油曲制备工艺如表3所示。
本发明的解决方案是采用一种微藻保健稀态发酵酱油曲制备方法。选择脱脂大豆、焙炒小麦和微藻藻粉作为制曲原料，经原料预处理，加水进行润料处理，并加入适量的微藻藻粉萃取液，经高温高压蒸煮；以蒸煮冷却物料为培养基质，以米曲霉为培养菌株，采用低温通风制曲方法，通过调节制曲温度、湿度、通风量，控制制曲进程，制备出微藻保健稀态发酵酱油曲。采用特异性蛋白酶以及淀粉酶等活力测定方法，观测制曲过程蛋白酶、淀粉酶等的变化动态。根据制曲过程蛋白酶、淀粉酶变化，通过调节制曲过程的温度、湿度和通风量等，对制曲进程进行调节和控制。
表3. 微藻保健稀态发酵酱油曲制备工艺
本发明的技术方案是：一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，以脱脂大豆和焙炒小麦、微藻、麸皮为原料，选择米曲霉和黑曲霉作为制曲菌种，包括制曲原料预处理、固态蒸煮、制曲和成品酱油曲的配制过程，具体包括以下步骤：
（1） 选择耐盐、适合于酱油曲生产的米曲霉、黑曲霉作为制曲菌株；
（2） 选择含有较强保健功效的成分的微藻作为保健功能成分的来源；
（3） 选择脱脂大豆、焙炒小麦、麸皮作为制酱油曲的原料：所选适合酱油制造的脱脂大豆颗粒呈片状，蛋白质含量43-51%，脂肪含量0.5-1.5%；小麦含10-14%的蛋白质，其中麸胶蛋白质和谷蛋白质较丰富；小麦经焙炒，焙炒小麦经粉碎，颗粒大小为2-3毫米，粉末量不超过20%；所选麸皮含有15-20%的淀粉、半纤维素含量为20-24%；
（4） 原料预处理：对脱脂大豆进行干蒸，温度为100-110℃，然后加水进行润料，使含水量达到46-51%，润料过程中均匀加入原料质量1-5%的微藻藻粉萃取液；
（5） 固态蒸煮：将步骤（4）得到润料的脱脂大豆进行蒸煮，在蒸煮罐中经高温高压蒸煮，使原料中蛋白质达到适度变性、淀粉充分糊化，使消化率达到85%以上，然后与焙炒小麦进行混合，脱脂大豆与焙炒小麦两者比例为1：1－1：（3/7）；
（6） 酱油曲的制备：将步骤（5）得到的蒸煮后的物料置于种曲制备装置中，按0.3-0.5%接种量分别接入米曲霉种曲或者黑曲霉种曲，曲料厚度20-40厘米。采用低温培养方法进行酱油曲制备。在孢子萌发期，在第0-8小时，28-30℃，采用静止培养，适当增加湿度；在菌丝生长期，在第8-12小时，30-32℃，采用间歇通风培养，采用小风量、循环风方法，控制曲料层水分和培养温度；在菌丝生长结块时，进行翻曲；在菌丝繁殖期，在第12-18小时，32-34℃，采用连续通风培养，采用大风量、直接通风方法，控制曲料层水分和培养温度；在菌丝生长结块时，进行翻曲；在孢子形成期，在第18-36小时，26-28℃，采用连续通风；可适当增加湿度方法，促进孢子形成；在干燥期，在第36-40小时，38-45℃，采用连续大风量干空气，逐渐降低曲料层含水量；并使曲料含水量降低至30%以下，即可出曲；
（7） 成品酱油曲的配制：将经步骤（6）得到的米曲霉成品曲和黑曲霉成品曲，按4：1-4：1.5比例混合构成复合曲；米曲霉所产成品曲中碱性蛋白酶活力＞中性蛋白酶活力＞酸性蛋白酶活力；碱性蛋白酶大于2000 U/g干基；氨肽酶大于1000 U/g干基；糖化酶活力大于50 U/g干基；黑曲霉所产成品曲中酸性蛋白酶大于2000 U/g干基；糖化酶活力较高，其酶活力大于70 U/g干基；纤维素酶活力较高，其酶活力（CMC酶活力）大于2000 U/g干基。
在上述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法中，所述的微藻为微藻菌体、微藻干粉中的一种。
在上述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法中，所述的微藻为螺旋藻、雨生红球藻、小球藻中的一种或多种。
在上述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法中，所述的微藻藻粉萃取液的制备方法为微藻采用均质法进行破壁增溶，以氯化钙溶液为提取溶液，浓度为10mmol/L，循环次数为3次时，得到的微藻有效物质溶出率为70%以上。
在上述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法中，所述的微藻藻粉萃取液的制备方法为微藻采用直接破壁，以氯化钙溶液为提取溶液，浓度为10mmol/L，循环次数为3次时，得到的微藻有效物质溶出率为70%以上。
在上述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法中，所述种曲制备过程包括三角瓶种曲培养和种曲扩大培养：
（1）三角瓶种曲培养：以原料配比麸皮：脱脂大豆比例为4：1-4：1.5混合后装入三角瓶中，加入原料量100%的水进行润料，121℃、0.1Mpa灭菌30min，冷却后接入活化过的米曲霉或黑曲霉，置于30℃恒温箱培养，至瓶中充满孢子，种曲孢子数为60亿个/g 干基以上；
（2）种曲扩大培养：将脱脂大豆在100－110℃干蒸后加水进行润料，使含水量达到46-51%，然后与麸皮1：1－1：1.5以混合均匀后进行固态高温高压蒸煮；将蒸煮后的物料置于种曲制备装置中，按0.3-0.5%接种量接入步骤（1）所得的三角瓶种曲，曲料厚度2-10厘米左右，在孢子萌发的前期，在28-30℃，干湿球温度相差1℃；在第16小时左右，曲料面层稍有发白并结块，进行第一次翻曲；翻曲后，维持室温28-30℃，干湿球温度相差1-2℃，此阶段菌丝大量生长，注意调节室温和湿度的变化，不要使品温超过35℃；在曲料层颜色开始变深，应适当增加湿度方法，促进孢子形成；在曲料层已全部呈淡黄色时，品温逐渐下降到30-32℃；在第65-70小时孢子大量形成，并呈黄绿色，即制成种曲；在干燥期38-45℃，采用连续大风量干空气，降低曲料层含水量。并使曲料含水量降低至15%以下，即可出种曲；种曲孢子数达到60亿个/g(干基)以上；种曲制备过程通过调节空气温度、湿度以及湿空气量，控制制曲进程；
（3）利用酶活力、菌体生长以及孢子数来控制制曲进程。
在上述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法中，在制曲步骤，采用特异性蛋白酶、淀粉酶活力测定方法，观测制曲过程蛋白酶、淀粉酶的变化动态。
在上述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法中，所选用微藻保健稀态发酵酱油曲酶系及酶活力按以下方法进行：（1）酱油制曲实质上是米曲霉在好气条件下生长繁殖产酶过程。在以脱脂大豆、焙炒小麦作为培养基质，米曲霉在制曲过程生长繁殖，蛋白质诱导分泌蛋白酶，淀粉诱导分泌淀粉酶。在适宜酱油曲的培养基质和培养条件下，通过制曲过程，可产生适合微藻保健酱油曲制造的蛋白酶活力高（碱性蛋白酶活力高以及氨肽酶强）、淀粉酶活力较高、酶系适当（碱性蛋白酶活力＞中性蛋白酶活力＞酸性蛋白酶活力；糖化酶活力较高），所产酶具有较强耐盐特性；（2）酱油辅助用曲--黑曲霉成品曲，实质上是黑曲霉在好气条件下生长繁殖产酶过程。以脱脂大豆、焙炒小麦粉作为培养基质，黑曲霉在制曲过程生长繁殖，蛋白质诱导分泌蛋白酶；淀粉诱导分泌淀粉酶；纤维素诱导分泌纤维素酶。在适宜酱油曲的培养基质和培养条件下，通过制曲过程，可产生适合微藻保健酱油曲制造的蛋白酶活力高（酸性蛋白酶活力高）、淀粉酶活力高、纤维素酶活力高，酶系适当（酸性蛋白酶活力高；糖化酶活力高；纤维素酶活力高）。所产酶具有较强耐盐特性；（3）分别经酱油制曲得到的米曲霉成品曲以及黑曲霉成品曲，按4：1-4：1.5比例混合构成复合曲。这种复合曲是一种适合微藻保健酱油曲。这一复合曲的酶系构成及酶活力特征为：蛋白酶活力高、淀粉酶活力高、纤维素酶活力高，酶系适当（蛋白酶活力活力高；糖化酶活力高；纤维素酶活力高）。这一复合曲在制曲及酱油生产过程既可使用于微藻蛋白质、多糖、细胞壁物质的适当降解，产生较多生物活性物质，又可促进微藻物质增浓、除腥以及脱色作用；（4）选择米曲霉所产成品曲中蛋白酶具有碱性蛋白酶活力高以及氨肽酶强，而且其中碱性蛋白酶活力＞中性蛋白酶活力＞酸性蛋白酶活力；碱性蛋白酶大于2000 U/g干基；氨肽酶大于1000 U/g干基；糖化酶活力大于50 U/g干基。（5）选择黑曲霉所产成品曲中酸性蛋白酶具有高的酶活力，其中酸性蛋白酶大于2000 U/g干基；糖化酶活力较高，其酶活力大于70 U/g干基；纤维素酶活力较高，其酶活力（CMC酶活力）大于2000 U/g干基。
本发明的有益效果为利用微藻保健酱油曲制备的微藻酱油富含多种营养成分，且经米曲霉成品曲和黑曲霉成品曲混合配制的复合曲所产酶系将微藻营养成分酶解为较小分子，更有利于人体吸收和营养，在具有浓郁的海鲜风味的同时而没有腥味。这种微藻保健酱油具有调味、保健双重功效，具有提高机体免疫力，降血脂、降血压等多种生理功效。
本发明的创新点：
1. 本发明根据脱脂大豆、焙炒小麦、微藻干粉以及原料配比、培养基质蛋白质、淀粉含量及配比进行选择。选择脱脂大豆、焙炒小麦、麸皮作为制酱油曲的原料。脱脂大豆与焙炒小麦两者比例：1：1－1：（3/7）。所选适合酱油制造的脱脂大豆颗粒呈片状，蛋白质含量43-51%，脂肪含量0.5-1.5%。小麦含10-14%的蛋白质，其中麸胶蛋白质和谷蛋白质较丰富。常规的制曲原料——大豆、麸皮、小麦是以依据大豆蛋白含量、原料配比进行选择。
2. 本发明适当提高原料蒸煮效果，使原料中蛋白质适度变性、淀粉充分糊化，使消化率达到85%以上，为制曲和产酶打下基础。制曲原料采用偏酸性(pH5.5-6.5)、适当硬度的深井水及水温，进行润料，使含水量达到46-51%；通过固态高温高压蒸煮，使消化率达到85%以上。而一般酱油曲的消化率为80%左右。
3. 本发明在制曲初期接入适量的高活力的耐盐的米曲霉孢子，控制曲料层培养温度、湿度以及通风量，控制制曲进程，制得酱油曲。采用低温制曲方法，制曲温度控制在26-32℃，有利于制曲和蛋白酶、淀粉酶系以及酶活的提高。由米曲霉所产成品曲中蛋白酶具有碱性蛋白酶活力高以及氨肽酶强，而且其中碱性蛋白酶活力＞中性蛋白酶活力＞酸性蛋白酶活力；碱性蛋白酶大于2000 U/g干基；氨肽酶大于1000 U/g干基；糖化酶活力大于50 U/g干基。
4．本发明分别将经酱油制曲得到的米曲霉成品曲以及黑曲霉成品曲，按一定比例混合构成复合曲。这种复合曲是一种适合微藻保健酱油曲。这一复合曲的酶系构成及酶活力特征为：蛋白酶活力高、淀粉酶活力高、纤维素酶活力高，酶系适当。这一复合曲在制曲及酱油生产过程既可使微藻蛋白质、多糖、细胞壁物质的适当降解，产生较多生物活性物质，又可促进微藻物质增浓、除腥以及脱色。
5. 本发明制备微藻藻粉萃取液，在原料润料时均匀加入适量的藻藻粉萃取液，由于米曲霉或者黑曲霉所分泌的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等是诱导酶，通过制曲过程，既可有效促进曲中各种蛋白酶、淀粉酶系分泌以及酶活力的提高，又可促进微藻物质溶解、除腥以及脱色。
6. 本发明采用特异性蛋白酶、淀粉酶活力，特别是碱性蛋白酶和氨肽酶、糖化酶、纤维素酶活力测定方法，分别测定不同蛋白酶、淀粉酶以及纤维素酶活力，绘制出制曲过程蛋白酶、淀粉酶以及纤维素酶变化动态。根据制曲过程蛋白酶、淀粉酶以及纤维素酶变化动态，通过调节制曲过程的温度、湿度和曲料层的含水量等，对制曲进程进行调节和控制。
表4是一般酱油曲与利用本专利技术生产的酱油曲的比较。
表4. 一般酱油曲与利用本专利技术生产的酱油曲的比较
从表4可看出，在一般（传统）酱油曲中，蛋白酶酶系不协调，酶活力较低，即在这种酱油曲中蛋白酶酶系的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和氨肽酶活力较低，而且四种酶比例不协调，因而造成利用这种酱油曲制备的酱油糖化醪中氨基酸态含量低；曲中淀粉酶系中的糖化酶活力较低，造成利用这种酱油曲制备的酱油糖化醪中还原糖含量低，酵母发酵能力较弱；曲中纤维素酶活力较低，纤维素酶与其它酶协同作用较弱，进而造成原料中植物纤维物质较难降解，使得酱油糖化醪中相关物质含量较低。与前者相对比，在利用本专利技术生产的酱油曲中，蛋白酶酶系丰富，酶活力较高，即在这种曲中酶系的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和氨肽酶活力较高，而且四种酶比例协调，因而利用本专利技术生产的酱油曲制备的酱油糖化醪中氨基酸态含量较高；曲中淀粉酶系中的糖化酶活力较高，使得糖化醪中还原糖含量高，酵母发酵能力较强；曲中纤维素酶活力高，纤维素酶与其它酶协同作用强，进而造成植物纤维物质降解较彻底，使得酱油糖化醪中相关物质含量较高。
具体实施方式
下面再用几个实例进一步说明本发明，当然本发明不局限于这几个实例。本发明所述的酱油曲制备方法适用于实验室人工气候箱(调温调湿箱)、小型种曲培养箱以及工业生产的通风制曲装置进行制曲过程。
实施例1
本发明的第一个实施例为工业规模的、在种子培养箱和通风制曲装置中、进行的适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备过程。
（1）本实例的原材料为脱脂大豆、焙炒小麦、微藻干粉和麸皮。适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的原材料及其要求如表5所示。
表5. 原材料及其要求
（2）原料预处理：
制曲原料的预处理包括：原料处理、配料、润料及蒸煮过程，这一原料预处理过程是在烟台欣和味达美食品有限公司酱油厂完成。其制曲原料的预处理分别为：
脱脂大豆的颗粒呈片状，一般不经过粉碎；小麦经焙炒，焙炒小麦经粉碎，颗粒大小为2-3毫米，粉末量不超过20%。脱脂大豆与焙炒小麦两者比例为1：1。脱脂大豆先经干蒸110℃后加水，进行润料，使含水量达到50%；然后与辅料混合均匀后再行蒸煮。蒸煮好的脱脂大豆与焙炒小麦进行配料。通过控制偏酸性(pH6.0-6.5)、适当硬度的水以及水温，使之达到要求的含水量。配料后物料，在蒸煮罐中，经高温高压蒸煮，使原料中蛋白质达到适度变性、淀粉充分糊化，使消化率达到86%。
微藻藻粉萃取液制备：微藻藻粉采用均质法进行破壁增溶，以氯化钙溶液为提取溶液，浓度为10mmol/L，循环次数为3次。在原料润料时，加入原料3%的微藻藻粉萃取液。
（3）种曲制备：
三角瓶种曲培养：以原料配比麸皮：脱脂大豆比例为4：1混合后装入三角瓶中，加入原料量100%的水进行润料，121℃、0.1Mpa灭菌30min，冷却后接入活化过的米曲霉或黑曲霉，置于30℃恒温箱培养，至瓶中充满孢子，种曲孢子数为60亿个/g 干基以上。
种曲制备：以脱脂大豆、麸皮为培养基质，其配比为1：1。经蒸煮的熟料，在种曲培养装置中，按0.4%接种量接入三角瓶种曲，曲料厚度5厘米左右，采用低温培养方法进行种曲制备。在孢子萌发期，在28-30℃，干湿球温度相差1℃；在第16小时左右，曲料面层稍有发白并结块，进行第一次翻曲；翻曲后，维持室温28-30℃，干湿球温度相差1-2℃，此阶段菌丝大量生长，注意调节室温和湿度的变化，使品温不要超过35℃；在曲料层颜色开始变深时，应适当增加湿度，促进孢子形成；在曲料层已全部呈淡黄色时，品温逐渐下降到30-32℃；在第65-70小时孢子大量形成，并呈黄绿色，即制成种曲。在干燥期38-45℃，采用连续大风量干空气通风，降低曲料层含水量。并使曲料含水量降低至15%以下，即可出种曲。种曲数孢子数60亿个/g(干基)以上。
种曲制备过程通过调节空气温度、湿度以及湿空气量，控制制曲进程。
（4）酱油曲制备：
经蒸煮的熟料，在固态通风制曲装置中，曲料厚度30厘米左右，采用低温培养方法进行酱油曲制备。在孢子萌发期，在第0-8小时，28-30℃，采用静止培养；在菌丝生长期，在第8-12小时，30-32℃，采用间歇通风培养，采用小风量、循环风方法，控制曲料层水分和培养温度；在菌丝生长结块时，进行翻曲。在菌丝繁殖期，在第12-18小时，32-34℃，采用连续通风培养，采用大风量、直接通风方法，控制曲料层水分和培养温度。在菌丝生长结块时，进行翻曲。在孢子形成期，在第18-36小时，26-28℃，采用连续通风；可适当增加湿度方法，促进孢子形成。在干燥期，在第36-40小时，38-45℃，采用连续大风量干空气通风，逐渐降低曲料层含水量。并使曲料含水量降低至30%以下，即可出曲。
制曲过程通过调节空气温度、湿度以及湿空气量，控制制曲进程。当蛋白酶活力达到最高时即可出曲。
通过以上制曲工艺，可制备适合于微藻保健稀态发酵酱油曲的米曲霉所产成品曲和黑曲霉所产成品曲的酶系及酶活力如表6所示。
（5）适合于微藻保健稀态发酵酱油成品曲的配制：
分别经酱油制曲得到的米曲霉成品曲以及黑曲霉成品曲，按4：1比例混合构成复合曲。这种复合曲是一种适合微藻保健酱油曲。这一复合曲的酶系构成及酶活力特征为：蛋白酶活力高、淀粉酶活力高、纤维素酶活力高，酶系适当（蛋白酶活力活力高；糖化酶活力高；纤维素酶活力高）。这一复合曲在制曲及酱油生产过程既可使用于微藻特征性物质得到适当降解，产生较多生物活性物质，又可促进微藻物质增浓以及除腥作用。
表6. 米曲霉所产成品曲和黑曲霉所产成品曲的酶系及酶活力
※空白：传统制曲条件；
※ 对照：专利制曲条件；
实施例2
本发明的第二个实施例为采用自动控制小型种曲培养装置，模拟工厂生产制曲工艺，进行适合于微藻保健稀态发酵酱油曲中试规模的制曲过程。
采用自动控制小型种曲培养装置模拟工厂生产制曲工艺进行中试。中试一次可处理6个10公斤样品。
（1）本实例的试验材料为脱脂大豆、焙炒小麦、微藻干粉和麸皮。适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的原材料及其要求如表7所示。脱脂大豆与焙炒小麦两者比例：1：3/7。
微藻藻粉萃取液制备：微藻藻粉采用均质法进行破壁增溶，以氯化钙溶液为提取溶液，浓度为10mmol/L，循环次数为3次。在原料润料时，加入原料3%的微藻藻粉萃取液。
经蒸煮工艺处理后，使原料中蛋白质达到适度变性、淀粉充分糊化，使消化率达到86.5%。就可进入酱油曲的制备过程。
（2）种曲制备：
三角瓶种曲培养：以原料配比麸皮：脱脂大豆比例为4：1.25混合后装入三角瓶中，加入原料量100%的水进行润料，121℃、0.1Mpa灭菌30min，冷却后接入活化过的米曲霉或黑曲霉，置于30℃恒温箱培养，至瓶中充满孢子，种曲孢子数为60亿个/g 干基以上。
种曲制备：以脱脂大豆、麸皮为培养基质，其配比1：1.25。经蒸煮的熟料，在气候培养箱的曲盒中，按0.4%接种量接入三角瓶种曲，曲料厚度2厘米左右，采用低温培养方法进行种曲制备。其种曲制备工艺与工厂种曲制备工艺一致。成品种曲孢子数60亿个/g(干基)以上。
种曲制备过程通过调节空气温度、湿度以及湿空气量，控制制曲进程。
表7. 原材料及其要求
（3）酱油曲制备：
制酱油曲工艺与工厂制酱油曲工艺一致：原料预处理→种曲→酱油曲制备→成品曲配制。
经蒸煮的熟料，在种曲培养装置中，曲料厚度4厘米左右，采用低温培养方法进行酱油曲制备。在干燥期，在第36-40小时，38-45℃，采用连续大风量干空气，逐渐降低曲料层含水量。并使曲料含水量降低至30%以下，即可出曲。
制曲过程通过调节空气温度、湿度以及湿空气量，控制制曲进程。当蛋白酶活力达到最高时即可出曲。
通过以上制曲工艺，可制备适合于微藻保健稀态发酵酱油曲的米曲霉所产成品曲和黑曲霉所产成品曲的酶系及酶活力如表8所示。
表8. 米曲霉所产成品曲和黑曲霉所产成品曲的酶系及酶活力
（4）适合于微藻保健稀态发酵酱油成品曲的配制：
分别经酱油制曲得到的米曲霉成品曲以及黑曲霉成品曲，按4：1.5比例混合构成复合曲。这种复合曲是一种适合微藻保健酱油曲。这一复合曲的酶系构成及酶活力特征为：蛋白酶活力高、淀粉酶活力高、纤维素酶活力高，酶系适当。这一复合曲在制曲及酱油生产过程既可使微藻特征性物质得到适当降解，产生较多生物活性物质，又可促进微藻物质增浓以及除腥。
实施例3
本发明的第三个实施例为在实验室内采用高压蒸汽锅灭菌、人工气候箱(调温调湿箱)制曲、鼓风干燥箱干燥，模拟工厂生产制曲工艺进行适合于微藻保健稀态发酵酱油成品曲小型规模的制曲过程。
在实验室条件下模拟工厂制曲工艺，一次可处理6个500g样品。
采用气候培养箱(调温调湿箱)模拟工厂生产制曲工艺进行中试。中试一次可处理6个500克样品。
（1）本实例的试验材料为脱脂大豆、焙炒小麦、微藻干粉和麸皮。适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的原材料及其要求如表9所示。脱脂大豆与焙炒小麦两者比例：1：1。
微藻藻粉萃取液制备：把微藻藻粉直接破壁，然后再以氯化钙溶液为提取溶液，浓度为10mmol/L，循环次数为3次。在原料润料时，加入原料4%的微藻藻粉萃取液。
表9. 原材料及其要求
经蒸煮工艺处理后，使原料中蛋白质达到适度变性、淀粉充分糊化，使消化率达到86.1%。就可进入酱油曲的制备过程。
（2）种曲制备：
以麸皮、脱脂大豆为培养基质，其配比4;1.5。经润料的培养基质放入带棉塞的1000mL三角瓶中，经高温高压（0.1MPa下灭菌30分钟）。在气候培养箱的带棉塞的1000mL三角瓶中，按0.3%接种量接入试管种曲，采用低温培养方法进行种曲制备。30℃培养72小时以上，待大量孢子生成。采用38-45℃干燥空气，降低曲料层含水量。并使曲料含水量降低至15%以下，即可出种曲。种曲数孢子数60亿个/g(干基)以上。
种曲制备过程通过调节空气温度、湿度以及湿空气量，控制制曲进程。
（3）酱油曲制备：
制酱油曲工艺与工厂制酱油曲工艺一致：原料预处理→三角瓶种曲→曲盒酱油曲制备→成品曲配制。
经蒸煮的熟料，在气候培养箱的曲盒中，曲料厚度2厘米左右，采用低温培养方法进行酱油曲制备。在干燥期，在第36小时，38-45℃，采用连续大风量干空气通风，逐渐降低曲料层含水量。并使曲料含水量降低至30%以下，即可出曲。
制曲过程通过调节空气温度、湿度以及湿空气量，控制制曲进程。当蛋白酶活力达到最高时即可出曲。
通过以上制曲工艺，可制备适合于微藻保健稀态发酵酱油曲的米曲霉所产成品曲和黑曲霉所产成品曲的酶系及酶活力如表10所示。
表10. 米曲霉所产成品曲和黑曲霉所产成品曲的酶系及酶活力
（4）适合于微藻保健稀态发酵酱油成品曲的配制：
分别经酱油制曲得到的米曲霉成品曲以及黑曲霉成品曲，按4：1.25比例混合构成复合曲。这种复合曲是一种适合微藻保健酱油曲。这一复合曲的酶系构成及酶活力特征为：蛋白酶活力高、淀粉酶活力高、纤维素酶活力高，酶系适当。这一复合曲在制曲及酱油生产过程既可使微藻特征性物质得到适当降解，产生较多生物活性物质，又可促进微藻物质增浓、除腥和脱色。
Claims (8)
1.一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，其特征在于：以脱脂大豆和焙炒小麦、微藻、麸皮为原料，选择米曲霉和黑曲霉作为制曲菌种，包括制曲原料预处理、固态蒸煮、种曲制备、制曲和成品酱油曲的配制过程，具体包括以下步骤：
（1）选择耐盐、适合于酱油曲生产的米曲霉、黑曲霉作为制曲菌株；
（2）选择含有较强保健功效的成分的微藻作为保健功能成分的来源；
（3）选择脱脂大豆、焙炒小麦、麸皮作为制酱油曲的原料：所选适合酱油制造的脱脂大豆颗粒呈片状，蛋白质含量43-51%，脂肪含量0.5-1.5%；小麦含10-14%的蛋白质，其中麸胶蛋白质和谷蛋白质较丰富；小麦经焙炒，焙炒麦子经粉碎，颗粒大小为2-3毫米，粉末量不超过20%；所选麸皮含有15-20%的淀粉、半纤维素含量为20-24%；
（4）原料预处理：对脱脂大豆进行干蒸，温度为100-110℃，然后加水进行润料，使含水量达到46-51%，润料过程中均匀加入原料质量1-5%的微藻藻粉萃取液；
（5）固态蒸煮：将步骤（4）得到润料的脱脂大豆进行蒸煮，在蒸煮罐中经高温高压蒸煮，使原料中蛋白质达到适度变性、淀粉充分糊化，使消化率达到85%以上，然后与焙炒小麦进行混合，脱脂大豆与焙炒小麦两者比例为1：1－1：（3/7）；
（6）酱油曲的制备：将步骤（5）得到的蒸煮后的物料置于种曲制备装置中，按0.3-0.5%接种量分别接入米曲霉种曲或者黑曲霉种曲，曲料厚度20-40厘米，采用低温培养方法进行酱油曲制备，在孢子萌发期，在第0-8小时，28-30℃，采用静止培养，适当增加湿度；在菌丝生长期，在第8-12小时，30-32℃，采用间歇通风培养，采用小风量、循环风方法，控制曲料层水分和培养温度；在菌丝生长结块时，进行翻曲；在菌丝繁殖期，在第12-18小时，32-34℃，采用连续通风培养，采用大风量、直接通风方法，控制曲料层水分和培养温度；在菌丝生长结块时，进行翻曲；在孢子形成期，在第18-36小时，26-28℃，采用连续通风；可适当增加湿度方法，促进孢子形成；在干燥期，在第36-40小时，38-45℃，采用连续大风量干空气，逐渐降低曲料层含水量；并使曲料含水量降低至30%以下，即可出曲；
（7） 成品酱油曲的配制：将经步骤（6）得到的米曲霉成品曲和黑曲霉成品曲，按4：1-4：1.5比例混合构成复合曲；米曲霉所产成品曲中碱性蛋白酶活力＞中性蛋白酶活力＞酸性蛋白酶活力；碱性蛋白酶大于2000 U/g干基；氨肽酶大于1000 U/g干基；糖化酶活力大于50 U/g干基；黑曲霉所产成品曲中酸性蛋白酶大于2000 U/g干基；糖化酶活力较高，其酶活力大于70 U/g干基；纤维素酶活力较高，其酶活力（CMC酶活力）大于2000 U/g干基。
2.根据权利要求1所述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，其特征在于：所述的微藻为微藻菌体、微藻干粉中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，其特征在于：所述的微藻为螺旋藻、雨生红球藻、小球藻中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，其特征在于：所述的微藻藻粉萃取液的制备方法为微藻采用均质法进行破壁增溶，以氯化钙溶液为提取溶液，浓度为10mmol/L，循环次数为3次时，得到的微藻有效物质溶出率为70%以上。
5.根据权利要求1所述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，其特征在于：所述的微藻藻粉萃取液的制备方法为微藻采用直接破壁，以氯化钙溶液为提取溶液，浓度为10mmol/L，循环次数为3次时，得到的微藻有效物质溶出率为70%以上。
6.根据权利要求1所述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，其特征在于：所述种曲制备过程包括三角瓶种曲培养和种曲扩大培养及制备过程：
（1）三角瓶种曲培养：以原料配比麸皮：脱脂大豆比例为4：1-4：1.5混合后装入三角
瓶中，加入原料量100%的水进行润料，121℃、0.1Mpa灭菌30min，冷却后接入活化过的米曲霉或黑曲霉，置于30℃恒温箱培养，至瓶中充满孢子，种曲孢子数为60亿个/g 干基以上；
（2）种曲扩大培养：将脱脂大豆在100－110℃干蒸后加水进行润料，使含水量达到46-51%，然后与麸皮以1：1－1：1.5的比例混合均匀后进行固态高温高压蒸煮；将蒸煮后的物料置于种曲制备装置中，按0.3-0.5%接种量接入步骤（1）所得的三角瓶种曲，曲料厚度2-10厘米左右，在孢子萌发的前期，在28-30℃，干湿球温度相差1℃；在第16小时左右，曲料面层稍有发白并结块，进行第一次翻曲；翻曲后，维持室温28-30℃，干湿球温度相差1-2℃，此阶段菌丝大量生长，注意调节室温和湿度的变化，不要使品温超过35℃；在曲料层颜色开始变深，应适当增加湿度方法，促进孢子形成；在曲料层已全部呈淡黄色时，品温逐渐下降到30-32℃；在第65-70小时孢子大量形成，并呈黄绿色，即制成种曲；在干燥期38-45℃，采用连续大风量干空气通风，降低曲料层含水量并使曲料含水量降低至15%以下，即可出种曲；种曲孢子数达到60亿个/g(干基)以上；种曲制备过程通过调节空气温度、湿度以及湿空气量，控制制曲进程；
（3）利用酶活力、菌体生长以及孢子数来控制制曲进程。
7.根据权利要求1所述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲的制备方法，其特征在于：在制曲步骤，采用特异性蛋白酶、淀粉酶活力测定方法，观测制曲过程蛋白酶、淀粉酶的变化动态。
8.按照权利要求1所述的一种适用于微藻保健稀态发酵酱油曲制备方法，其特征在于：
（1）酱油制曲实质上是米曲霉在好气条件下生长繁殖产酶过程，在以脱脂大豆、焙炒小麦作为培养基质，米曲霉在制曲过程生长繁殖，蛋白质诱导分泌蛋白酶，淀粉诱导分泌淀粉酶，在适宜酱油曲的培养基质和培养条件下，通过制曲过程，可产生适合微藻保健酱油曲制造的蛋白酶活力高（碱性蛋白酶活力高以及氨肽酶强）、淀粉酶活力较高、酶系适当（碱性蛋白酶活力＞中性蛋白酶活力＞酸性蛋白酶活力；糖化酶活力较高），所产酶具有较强耐盐特性；
（2）酱油辅助用曲——黑曲霉成品曲，实质上是黑曲霉在好气条件下生长繁殖产酶过程，以脱脂大豆、焙炒小麦作为培养基质，黑曲霉在制曲过程生长繁殖，蛋白质诱导分泌蛋白酶；淀粉诱导分泌淀粉酶；纤维素诱导分泌纤维素酶，在适宜酱油曲的培养基质和培养条件下，通过制曲过程，可产生适合微藻保健酱油曲制造的蛋白酶活力高（酸性蛋白酶活力高）、淀粉酶活力高、纤维素酶活力高，酶系适当（酸性蛋白酶活力高；糖化酶活力高；纤维素酶活力高），所产酶具有较强耐盐特性；
（3）分别经酱油制曲得到的米曲霉成品曲以及黑曲霉成品曲，按4：1-4：1.5比例混合构成复合曲，这种复合曲是一种适合微藻保健酱油曲，这一复合曲的酶系构成及酶活力特征为：蛋白酶活力高、淀粉酶活力高、纤维素酶活力高，酶系适当（蛋白酶活力活力高；糖化酶活力高；纤维素酶活力高），这一复合曲在制曲及酱油生产过程既可使用于微藻蛋白质、多糖、细胞壁物质的适当降解，产生较多生物活性物质，又可促进微藻物质增浓、除腥以及脱色作用；
（4）选择米曲霉所产成品曲中蛋白酶具有碱性蛋白酶活力高以及氨肽酶强，而且其中碱性蛋白酶活力＞中性蛋白酶活力＞酸性蛋白酶活力；碱性蛋白酶大于2000 U/g干基；氨肽酶大于1000 U/g干基；糖化酶活力大于50 U/g干基；
（5）选择黑曲霉所产成品曲中酸性蛋白酶具有高的酶活力，其中酸性蛋白酶大于2000 U/g干基；糖化酶活力较高，其酶活力大于70 U/g干基；纤维素酶活力较高，其酶活力（CMC酶活力）大于2000 U/g干基。
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