CN104447766A - 一种配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成及抗肿瘤应用 - Google Patents
一种配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成及抗肿瘤应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法及抗肿瘤应用。[Cu2(L12)2]·(H2O)的分子式C68H62Cu2N18O21，分子量为：1594.42。（1）将0.07-0.14克分析纯1-(6-甲基吡啶)-5-羟基-1氢-吡唑-3-甲酸甲酯和0.05-0.15克分析纯三水硝酸铜溶于10-20毫升体积比为1：1的无水乙腈和无水甲醇的混合溶液中；（2）将步骤(1)所制得的溶液转入聚四氟乙烯的反应釜中，在80-90°C下反应60-80小时，降温至室温，过滤，滤液置于室温下自然挥发结晶，18天后得到单晶级[Cu2(L12)2]·(H2O)配合物。[Cu2(L12)2]·(H2O)应用于抗肿瘤。本发明具有工艺简单、成本低廉、化学组分易于控制、重复性好并产量高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法及抗肿瘤应用。
背景技术
近年来出现了原位合成技术,即在一定条件,通过化学反应,在反应体系内原位生成一种或几种新型的化合物，通过原位合成，可以获得其他合成方法难以获得的化合物。吡唑酮衍生物及其配合物具有独特的生物活性，可以用作设计合成具有应用前景的低毒有效的抗菌、抗肿瘤等药物、功能材料的前驱体，具有重要的潜在用途。
发明内容
本发明的目的就是为设计合成吡啶-吡唑杂环衍生物金属配合物，利用溶剂热方法和原位合成技术合成配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)及抗肿瘤应用。
本发明涉及的配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)的分子式为：C68H62Cu2N18O21，分子量为：1594.42，H2L12＝1,8-二-(6-甲基吡啶)-4-[2-(6-甲基吡啶)-5-甲酯基-3-氧-2,3-二氢-1氢-吡唑]-9-氧-1,2,7,8-四氮杂螺[4.4]壬-3,4,6-三甲酸甲酯，晶体结构参数表见表一，键长键角数据见表二；细胞毒性测试数据见表三、表四，具有良好的抗肿瘤活性。
表一：[Cu2(L12)2]·(H2O)的晶体学参数
表二：[Cu2(L12)2]·(H2O)的键长和键角(°)
| Cu2-N12 | 2.032(4) | N13-C46 | 1.345(7) |
| Cu2-N10 | 2.023(5) | N13-C50 | 1.341(8) |
| Cu2-N7 | 1.980(5) | O3-C7 | 1.195(7) |
| Cu2-N9 | 2.030(6) | N4-C12 | 1.320(8) |
| Cu1-N16 | 1.993(5) | N4-C16 | 1.360(8) |
| Cu1-N18 | 2.021(5) | C25-C24 | 1.408(8) |
| Cu1-N3 | 2.012(5) | C25-C26 | 1.404(8) |
| Cu1-N1 | 2.042(6) | C25-C21 | 1.502(9) |
| N8-N7 | 1.386(6) | O6-C22 | 1.185(7) |
| N8-C24 | 1.416(8) | C42-C45 | 1.502(7) |
| N8-C29 | 1.383(8) | C42-C43 | 1.492(7) |
| O17-C56 | 1.346(7) | C60-C61 | 1.494(8) |
| O17-C57 | 1.437(7) | C60-C59 | 1.389(8) |
| O16-C56 | 1.190(8) | N5-N6 | 1.365(7) |
| N12-N11 | 1.392(5) | N5-C12 | 1.386(8) |
| N12-C42 | 1.287(6) | N5-C11 | 1.469(7) |
| O5-C19 | 1.330(7) | C56-C55 | 1.552(8) |
| O5-C20 | 1.448(7) | C55-C52 | 1.517(8) |
| O11-C41 | 1.205(6) | C55-C45 | 1.594(8) |
| O10-C27 | 1.321(8) | C55-C59 | 1.511(8) |
| O10-C28 | 1.453(7) | N6-C18 | 1.280(8) |
| O8-C24 | 1.259(6) | C41-C45 | 1.543(7) |
| N10-C40 | 1.348(6) | C52-C53 | 1.494(9) |
| N10-C36 | 1.353(7) | C40-C39 | 1.374(7) |
| O20-C61 | 1.333(8) | C26-C27 | 1.491(9) |
| O20-C62 | 1.433(6) | C59-C58 | 1.424(8) |
| N16-N17 | 1.391(6) | C46-C47 | 1.368(8) |
| N16-C60 | 1.331(7) | C8-C9 | 1.483(8) |
| O15-C53 | 1.332(8) | C8-C11 | 1.500(7) |
| O15-C54 | 1.465(7) | C36-C37 | 1.352(8) |
| N7-C26 | 1.317(8) | C36-C35 | 1.523(8) |
| N9-C29 | 1.350(8) | C19-C18 | 1.477(9) |
| N9-C33 | 1.342(10) | C39-C38 | 1.387(7) |
| N18-C63 | 1.346(8) | C29-C30 | 1.379(8) |
| N18-C67 | 1.345(7) | C38-C37 | 1.368(8) |
| O18-C58 | 1.239(7) | C12-C13 | 1.389(8) |
| O19-C61 | 1.196(7) | C5-C6 | 1.389(9) |
| N11-C41 | 1.378(6) | C5-C4 | 1.398(10) |
| N11-C40 | 1.416(6) | C63-C64 | 1.383(8) |
| O7-C22 | 1.316(8) | C16-C17 | 1.489(9) |
| O7-C23 | 1.430(8) | C16-C15 | 1.383(9) |
| O9-C27 | 1.190(8) | C11-C21 | 1.598(8) |
| N15-N14 | 1.368(6) | C11-C7 | 1.562(9) |
| N15-C52 | 1.267(8) | C21-C18 | 1.529(8) |
| N14-C45 | 1.459(7) | C21-C22 | 1.553(8) |
| N14-C46 | 1.398(7) | C66-C67 | 1.383(9) |
| O13-C43 | 1.297(7) | C66-C65 | 1.379(10) |
| O13-C44 | 1.452(6) | C30-C31 | 1.381(11) |
| N3-N2 | 1.383(6) | C67-C68 | 1.500(10) |
| N3-C8 | 1.296(7) | C50-C49 | 1.364(10) |
| O2-C9 | 1.333(6) | C50-C51 | 1.517(9) |
| O2-C10 | 1.461(7) | C47-C48 | 1.365(10) |
| O12-C43 | 1.189(7) | C49-C48 | 1.385(9) |
| O4-C19 | 1.198(8) | C64-C65 | 1.364(9) |
| N2-C6 | 1.410(8) | C2-C1 | 1.516(9) |
| N2-C7 | 1.406(7) | C2-C3 | 1.354(10) |
| O14-C53 | 1.194(9) | C15-C14 | 1.395(10) |
| N1-C6 | 1.332(7) | C13-C14 | 1.386(10) |
| N1-C2 | 1.370(8) | C3-C4 | 1.363(10) |
| N17-C58 | 1.429(8) | C31-C32 | 1.380(11) |
| N17-C63 | 1.399(7) | C34-C33 | 1.508(11) |
| O1-C9 | 1.167(7) | C32-C33 | 1.379(10) |
| N10-Cu2-N12 | 80.25(17) | O20-C61-C60 | 110.9(6) |
| N10-Cu2-N9 | 136.8(2) | O19-C61-O20 | 124.4(6) |
| N7-Cu2-N12 | 123.9(2) | O19-C61-C60 | 124.7(6) |
| N7-Cu2-N10 | 121.7(2) | N7-C26-C25 | 113.9(6) |
| N7-Cu2-N9 | 81.0(2) | N7-C26-C27 | 118.3(6) |
| N9-Cu2-N12 | 119.5(2) | C25-C26-C27 | 127.7(7) |
| N16-Cu1-N18 | 81.3(2) | C60-C59-C55 | 131.3(5) |
| N16-Cu1-N3 | 128.0(2) | C60-C59-C58 | 106.8(6) |
| N16-Cu1-N1 | 117.5(2) | C58-C59-C55 | 121.9(6) |
| N18-Cu1-N1 | 130.8(2) | O10-C27-C26 | 111.1(7) |
| N3-Cu1-N18 | 126.5(2) | O9-C27-O10 | 125.6(7) |
| N3-Cu1-N1 | 79.4(2) | O9-C27-C26 | 123.2(7) |
| N7-N8-C24 | 112.0(5) | N13-C46-N14 | 112.7(6) |
| C29-N8-N7 | 117.9(5) | N13-C46-C47 | 123.7(6) |
| C29-N8-C24 | 130.2(5) | C47-C46-N14 | 123.5(6) |
| C56-O17-C57 | 116.2(6) | N3-C8-C9 | 117.2(5) |
| N11-N12-Cu2 | 111.7(3) | N3-C8-C11 | 113.0(6) |
| C42-N12-Cu2 | 139.8(4) | C9-C8-C11 | 129.7(6) |
| C42-N12-N11 | 108.1(4) | N10-C36-C35 | 115.5(6) |
| C19-O5-C20 | 112.4(6) | C37-C36-N10 | 121.7(5) |
| C27-O10-C28 | 117.5(6) | C37-C36-C35 | 122.8(6) |
| C40-N10-Cu2 | 115.4(4) | O5-C19-C18 | 112.0(6) |
| C40-N10-C36 | 116.8(5) | O4-C19-O5 | 126.0(7) |
| C36-N10-Cu2 | 126.6(4) | O4-C19-C18 | 122.0(7) |
| C61-O20-C62 | 116.7(6) | C40-C39-C38 | 117.1(5) |
| N17-N16-Cu1 | 111.3(4) | O15-C53-C52 | 111.1(7) |
| C60-N16-Cu1 | 143.5(4) | O14-C53-O15 | 126.3(6) |
| C60-N16-N17 | 104.3(5) | O14-C53-C52 | 122.4(7) |
| C53-O15-C54 | 114.6(6) | N9-C29-N8 | 115.1(6) |
| N8-N7-Cu2 | 112.1(4) | N9-C29-C30 | 122.8(7) |
| C26-N7-Cu2 | 143.4(4) | C30-C29-N8 | 122.1(7) |
| C26-N7-N8 | 104.2(5) | O18-C58-N17 | 123.6(6) |
| C29-N9-Cu2 | 113.0(5) | O18-C58-C59 | 133.3(6) |
| C33-N9-Cu2 | 127.2(5) | C59-C58-N17 | 103.1(6) |
| C33-N9-C29 | 119.0(6) | O13-C43-C42 | 113.5(6) |
| C63-N18-Cu1 | 114.5(4) | O12-C43-O13 | 125.1(6) |
| C63-N18-C67 | 117.3(6) | O12-C43-C42 | 121.4(6) |
| C67-N18-Cu1 | 128.1(5) | C37-C38-C39 | 118.8(6) |
| N12-N11-C40 | 117.6(4) | N4-C12-N5 | 114.2(6) |
| C41-N11-N12 | 112.6(4) | N4-C12-C13 | 124.0(7) |
| C41-N11-C40 | 129.2(5) | N5-C12-C13 | 121.8(7) |
| C22-O7-C23 | 117.4(6) | C6-C5-C4 | 117.1(7) |
| C52-N15-N14 | 108.3(5) | N18-C63-N17 | 114.3(5) |
| N15-N14-C45 | 114.2(5) | N18-C63-C64 | 124.1(6) |
| N15-N14-C46 | 119.5(5) | C64-C63-N17 | 121.6(6) |
| C46-N14-C45 | 124.5(4) | N1-C6-N2 | 114.7(6) |
| C43-O13-C44 | 116.1(5) | N1-C6-C5 | 124.1(7) |
| N2-N3-Cu1 | 111.6(4) | C5-C6-N2 | 121.2(7) |
| C8-N3-Cu1 | 138.5(4) | N4-C16-C17 | 118.3(6) |
| C8-N3-N2 | 109.6(5) | N4-C16-C15 | 120.5(7) |
| C9-O2-C10 | 115.7(5) | C15-C16-C17 | 121.1(8) |
| N3-N2-C6 | 116.8(5) | C36-C37-C38 | 121.1(6) |
| N3-N2-C7 | 112.4(5) | O2-C9-C8 | 107.5(6) |
| C7-N2-C6 | 127.4(6) | O1-C9-O2 | 126.5(6) |
| C6-N1-Cu1 | 113.9(5) | O1-C9-C8 | 125.9(6) |
| C6-N1-C2 | 117.3(7) | N5-C11-C8 | 114.5(5) |
| C2-N1-Cu1 | 128.1(5) | N5-C11-C21 | 100.6(4) |
| N16-N17-C58 | 112.1(5) | N5-C11-C7 | 111.1(6) |
| N16-N17-C63 | 118.4(5) | C8-C11-C21 | 113.6(5) |
| C63-N17-C58 | 129.5(5) | C8-C11-C7 | 100.5(5) |
| C50-N13-C46 | 117.7(6) | C7-C11-C21 | 117.3(5) |
| C12-N4-C16 | 119.6(6) | C25-C21-C11 | 113.2(4) |
| C24-C25-C21 | 123.9(5) | C25-C21-C18 | 114.3(6) |
| C26-C25-C24 | 105.6(6) | C25-C21-C22 | 111.4(5) |
| C26-C25-C21 | 130.5(6) | C18-C21-C11 | 99.2(5) |
| N12-C42-C45 | 114.1(5) | C18-C21-C22 | 106.4(5) |
| N12-C42-C43 | 120.2(5) | C22-C21-C11 | 111.6(6) |
| C43-C42-C45 | 125.2(5) | N6-C18-C19 | 123.4(6) |
| N16-C60-C61 | 117.7(6) | N6-C18-C21 | 114.3(6) |
| N16-C60-C59 | 113.7(5) | C19-C18-C21 | 121.1(6) |
| C59-C60-C61 | 128.6(6) | N2-C7-C11 | 104.5(5) |
| N6-N5-C12 | 121.6(6) | O3-C7-N2 | 126.2(6) |
| N6-N5-C11 | 113.2(5) | O3-C7-C11 | 129.3(6) |
| C12-N5-C11 | 122.5(5) | C65-C66-C67 | 119.0(7) |
| O17-C56-C55 | 109.1(6) | C29-C30-C31 | 117.2(7) |
| O16-C56-O17 | 123.9(6) | N18-C67-C66 | 121.9(7) |
| O16-C56-C55 | 127.1(6) | N18-C67-C68 | 116.0(7) |
| C56-C55-C45 | 111.1(5) | C66-C67-C68 | 122.1(7) |
| C52-C55-C56 | 106.9(4) | N13-C50-C49 | 122.4(7) |
| C52-C55-C45 | 99.5(5) | N13-C50-C51 | 114.6(7) |
| C59-C55-C56 | 111.0(6) | C49-C50-C51 | 122.8(7) |
| C59-C55-C52 | 113.3(5) | C48-C47-C46 | 117.3(6) |
| C59-C55-C45 | 114.3(4) | C50-C49-C48 | 118.3(8) |
| C18-N6-N5 | 109.2(6) | O7-C22-C21 | 109.7(6) |
| O11-C41-N11 | 126.4(5) | O6-C22-O7 | 124.7(7) |
| O11-C41-C45 | 127.7(5) | O6-C22-C21 | 125.5(6) |
| N11-C41-C45 | 105.9(4) | C47-C48-C49 | 120.6(8) |
| N15-C52-C55 | 115.8(5) | C65-C64-C63 | 117.3(7) |
| N15-C52-C53 | 122.6(6) | N1-C2-C1 | 113.8(7) |
| C53-C52-C55 | 120.5(6) | C3-C2-N1 | 121.3(7) |
| N10-C40-N11 | 114.1(5) | C3-C2-C1 | 124.9(8) |
| N10-C40-C39 | 124.4(5) | C16-C15-C14 | 118.8(8) |
| C39-C40-N11 | 121.5(5) | C14-C13-C12 | 116.3(7) |
| N14-C45-C42 | 113.2(5) | C13-C14-C15 | 120.7(7) |
| N14-C45-C55 | 101.1(4) | C64-C65-C66 | 120.4(7) |
| N14-C45-C41 | 112.4(5) | C2-C3-C4 | 121.4(8) |
| C42-C45-C55 | 113.3(5) | C3-C4-C5 | 118.7(8) |
| C42-C45-C41 | 99.4(4) | C32-C31-C30 | 120.8(8) |
| C41-C45-C55 | 118.2(5) | C33-C32-C31 | 118.7(9) |
| O8-C24-N8 | 122.6(6) | N9-C33-C34 | 116.1(7) |
| O8-C24-C25 | 133.3(6) | N9-C33-C32 | 121.5(8) |
| C25-C24-N8 | 104.2(5) | C32-C33-C34 | 122.3(9) |
所述[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法具体步骤为：
(1)将0.07-0.14克分析纯1-(6-甲基吡啶)-5-羟基-1氢-吡唑-3-甲酸甲酯和0.05-0.15克分析纯三水硝酸铜溶于10-20毫升体积比为1：1的无水乙腈和无水甲醇的混合溶液中；
(2)将步骤(1)所制得的溶液转入聚四氟乙烯的反应釜中，在80-90℃下反应60-80小时，降温至室温，过滤，滤液置于室温下自然挥发结晶，18天后得到单晶级[Cu2(L12)2]·(H2O)配合物，其晶体学参数见表一，键长键角数据见表二。
[Cu2(L12)2]·(H2O)对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验步骤：
(1)细胞株与细胞培养：
本实验选用人肝癌细胞株(BEL-7404)，人肝癌细胞(HepG2)，人膀胱癌细胞(T-24)，人宫颈癌细胞(Hela)，正常人肝细胞株(HL-7702)等5种细胞株。所有细胞株均培养在含10wt％小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2孵箱中培养。
(2)待测化合物的配制：
所用的[Cu2(L12)2]·(H2O)的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配制成20μmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的终浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长的抑制程度。
(3)细胞生长抑制实验(MTT法)：
1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/ml的细胞悬液，以每孔190μl接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
2)5％CO2，37℃孵育24小时，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；
3)5％CO2，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；
4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4小时；
5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。
7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验室组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。
计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算各受试化合物对多种人肿瘤细胞株及人正常肝细胞株的IC50值。其细胞毒性测试数据见表三、表四所示。
表三：[Cu2(L12)2]·(H2O)对不同细胞株的抑制率(与顺铂做对比)
| BEL-7404 | HepG2 | T-24 | Hela | HL-7702 | |
| [Cu2(L12)2]·(H2O) | 12.90±1.58 | 43.24±2.63 | 50.29±1.75 | 51.63±1.06 | 25.38±0.96 |
| 顺铂 | 55.15±1.18 | 60.63±0.99 | 47.58±2.65 | No data | 73.58±2.30 |
表四：[Cu2(L12)2]·(H2O)对不同细胞株的IC50值(与顺铂做对比)(IC50，μM)
| BEL-7404 | HepG2 | T-24 | Hela | HL-7702 | |
| [Cu2(L12)2]·(H2O) | >100 | 22.36±1.08 | 21.88±1.49 | 17.33±1.08 | 196.45±3.08 |
| 顺铂 | 12.41±0.38 | 9.48±0.35 | 28.07±1.88 | No data | 5.63±0.32 |
本发明具有工艺简单、成本低廉、化学组分易于控制、重复性好并产量高等优点。
附图说明
图1为本发明[Cu2(L12)2]·(H2O)的实施图。
图2为本发明[Cu2(L12)2]·(H2O)的结构图。
图中：C-碳原子，N-氮原子，O-氧原子，Cu-铜原子，数字表示原子排序的序号。
具体实施方式
实施例1：
配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法，其特征在于[Cu2(L12)2]·(H2O)的分子式为：C68H62Cu2N18O21，分子量为：1594.42，H2L12＝1,8-二-(6-甲基吡啶)-4-[2-(6-甲基吡啶)-5-甲酯基-3-氧-2,3-二氢-1氢-吡唑]-9-氧-1,2,7,8-四氮杂螺[4.4]壬-3,4,6-三甲酸甲酯，晶体结构参数表见表一，键长键角数据见表二；细胞毒性测试数据见表三、表四，具有良好的抗肿瘤活性。
[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法具体步骤为：
所述抗癌药物[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法具体步骤为：
(1)将0.07克分析纯1-(6-甲基吡啶)-5-羟基-1氢-吡唑-3-甲酸甲酯和0.06克分析纯三水硝酸铜溶于15毫升体积比为1：1的无水乙腈和无水甲醇的混合溶液中。
(2)将步骤(1)所制得的溶液转入聚四氟乙烯的反应釜中，在80℃下反应72小时，降温至室温，过滤，滤液置于室温下自然挥发结晶，18天后得到单晶级[Cu2(L12)2]·(H2O)配合物，其晶体学参数见表一，键长键角数据见表二。
[Cu2(L12)2]·(H2O)对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：
(1)细胞株与细胞培养：
本实验选用人肝癌细胞株(BEL-7404)，人肝癌细胞(HepG2)，人膀胱癌细胞(T-24)，人宫颈癌细胞(Hela)，正常人肝细胞株(HL-7702)等5种细胞株。所有细胞株均培养在含10wt％小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2孵箱中培养。
(2)待测化合物的配制：
所用的[Cu2(L12)2]·(H2O)的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配制成20μmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的终浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长的抑制程度。
(3)细胞生长抑制实验(MTT法)：
1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/ml的细胞悬液，以每孔190μl接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
2)5％CO2，37℃孵育24小时，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；
3)5％CO2，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；
4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4小时；
5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。
7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验室组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。
计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算各受试化合物对多种人肿瘤细胞株及人正常肝细胞株的IC50值。其细胞毒性测试数据见表三、表四所示。
实施例2：
配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法，其特征在于[Cu2(L12)2]·(H2O)的分子式为：C68H62Cu2N18O21，分子量为：1594.42，H2L12＝1,8-二-(6-甲基吡啶)-4-[2-(6-甲基吡啶)-5-甲酯基-3-氧-2,3-二氢-1氢-吡唑]-9-氧-1,2,7,8-四氮杂螺[4.4]壬-3,4,6-三甲酸甲酯，晶体结构参数表见表一，键长键角数据见表二；细胞毒性测试数据见表三、表四，具有良好的抗肿瘤活性。
[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法具体步骤为：
(1)将0.137克分析纯1-(6-甲基吡啶)-5-羟基-1氢-吡唑-3-甲酸甲酯和0.12克分析纯三水硝酸铜溶于20毫升体积比为1：1的无水乙腈和无水甲醇的混合溶液中。
(2)将步骤(1)所制得的溶液转入聚四氟乙烯的反应釜中，在90℃下反应60小时，降温至室温，过滤，滤液置于室温下自然挥发结晶，18天后得到单晶级[Cu2(L12)2]·(H2O)配合物，其晶体学参数见表一，键长键角数据见表二。
[Cu2(L12)2]·(H2O)对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：
(1)细胞株与细胞培养：
本实验选用人肝癌细胞株(BEL-7404)，人肝癌细胞(HepG2)，人膀胱癌细胞(T-24)，人宫颈癌细胞(Hela)，正常人肝细胞株(HL-7702)等5种细胞株。所有细胞株均培养在含10wt％小牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2孵箱中培养。
(2)待测化合物的配制：
所用的[Cu2(L12)2]·(H2O)的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配制成20μmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的终浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长的抑制程度。
(3)细胞生长抑制实验(MTT法)：
1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培 养液配制成浓度为5000个/ml的细胞悬液，以每孔190μl接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
2)5％CO2，37℃孵育24小时，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；
3)5％CO2，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；
4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4小时；
5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。
7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验室组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。
计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算各受试化合物对多种人肿瘤细胞株及人正常肝细胞株的IC50值，其细胞毒性测试数据见表三、表四所示。
Claims (2)
1.一种配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)，其特征在于[Cu2(L12)2]·(H2O)的分子式为：C68H62Cu2N18O21，分子量为：1594.42，H2L12＝1,8-二-(6-甲基吡啶)-4-[2-(6-甲基吡啶)-5-甲酯基-3-氧-2,3-二氢-1氢-吡唑]-9-氧-1,2,7,8-四氮杂螺[4.4]壬-3,4,6-三甲酸甲酯，晶体结构参数表见表一，键长键角数据见表二；具有良好的抗肿瘤活性；
所述抗癌药物[Cu2(L12)2]·(H2O)的原位合成方法具体步骤为：
(1)将0.07-0.14克分析纯1-(6-甲基吡啶)-5-羟基-1氢-吡唑-3-甲酸甲酯和0.05-0.15克分析纯三水硝酸铜溶于10-20毫升体积比为1：1的无水乙腈和无水甲醇的混合溶液中；
(2)将步骤(1)所制得的溶液转入聚四氟乙烯的反应釜中，在80-90℃下反应60-80小时，降温至室温，过滤，滤液置于室温下自然挥发结晶，18天后得到单晶级[Cu2(L12)2]·(H2O)配合物，其晶体学参数见表一，键长键角数据见表二；
表一：[Cu2(L12)2]·(H2O)的晶体学参数
表二：[Cu2(L12)2]·(H2O)的键长和键角(°)
。
2.根据权利要求1所述的配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)的应用，其特征在于配合物[Cu2(L12)2]·(H2O)应用于抗肿瘤。
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