CN105418622A

CN105418622A - 一种青蒿素衍生物及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN105418622A
Application number: CN201511019713.3A
Authority: CN
Inventors: 郑清四; 彭艳; 张国海; 卢幸; 吴亦明; 杨阳
Original assignee: Guilin Pharmaceutical Co Ltd; Guangxi Normal University
Current assignee: Guilin Pharmaceutical Co Ltd; Guangxi Normal University
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN105418622B

Abstract

本发明公开了一种青蒿素衍生物及其合成方法和应用。所述的青蒿素衍生物为N-(3-N’,N’-二甲胺基-丙基)-10-氮杂脱氧青蒿素，它是以青蒿素为原料，先后与N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷和对甲苯磺酸反应得到。申请人通过考察该衍生物对多种人肿瘤细胞株和人正常细胞株的增殖抑制活性，发现其对人膀胱癌细胞T-24、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人胃癌细胞MGC80-3三种细胞株都表现出显著的增殖抑制活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

Description

一种青蒿素衍生物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种青蒿素衍生物及它的合成方法和应用。

背景技术

青蒿素是一种从传统中药黄花蒿(即青蒿)中得到的半倍萜内酯化合物。早在公元前340年，东晋的葛洪在其撰写的中医方剂《肘后备急方》一书中，首次描述了青蒿的退热功能，李时珍的《本草纲目》则说它能“治疟疾寒热”。我国科学家屠呦呦从古典文献中获得灵感，使用乙醚在不超过60℃下从青蒿中分离出单体，命名为青蒿素。实验发现青蒿素对鼠疟和猴虐的虐原虫具有100％的抑制率。1986年，青蒿素获得一类新药证书。根据世界卫生组织统计数据，自2000年起，在撒哈拉以南的非洲地区，约2.4亿人口受益于青蒿素，其中150万人因青蒿素避免死于疟疾。2015年10月，屠呦呦因发现青蒿素获得了诺贝尔生理学或医学奖。

随着对青蒿素类化合物的研究不断深入，研究人员发现该类化合物除了抗疟疾以外还有抗纤维化、抗血吸虫、抗心律失常等作用。目前尚未发现有N-(3-N’,N’-二甲胺基-丙基)-10-氮杂脱氧青蒿素的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖的青蒿素衍生物即N-(3-N’,N’-二甲胺基-丙基)-10-氮杂脱氧青蒿素，以及它的合成方法和应用。

本发明涉及下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

上述式(I)所示化合物的化学名称为N-(3-N’,N’-二甲胺基-丙基)-10-氮杂脱氧青蒿素，分子量为350.2g/mol。

上述式(I)所示化合物的合成方法是以青蒿素为原料，先后与N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷和对甲苯磺酸反应得到。

更为具体的合成方法为：取青蒿素和N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷置于第一有机溶剂中，在惰性气体保护条件下反应，得到反应物A，反应物A蒸除溶剂，所得残渣溶于第二有机溶剂中，加入对甲苯磺酸反应，得到反应物B，反应物B蒸除溶剂，得到目标物粗品；其中：

所述第二有机溶剂为醇类物质与选自氯仿、二氯甲烷和丙酮中的一种或两种以上的组合，此时，醇类物质在第一有机溶剂中的占比为≥30％；所述的醇类物质为含1～6个碳原子的醇中一种或两种以上的组合；

所述第二有机溶剂二氯甲烷和/或氯仿。

上述合成方法制得的是式(I)化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对其进行纯化以提高式(I)化合物的纯度。通常采用硅胶柱层析来进行纯化，具体是将制得的目标化合物粗品上硅胶柱层析，用由体积比为1：0.5～2的石油醚和二氯甲烷组成的洗脱剂洗脱，洗脱液蒸除溶剂，得到纯化后的目标物。所述组成洗脱剂的石油醚和二氯甲烷的体积比优选为1：1～2。

本发明所述的合成方法中，所述的第一有机溶剂和第二溶剂在使用前最好先用分子筛进行脱水，以更有利于反应的进行。所述第一有机溶剂和第二有机溶剂的用量均可根据需要确定，通常以能溶解参加反应的原料并形成澄清溶液为宜，优选地，第一有机溶剂可以按1mmol的青蒿素加入20～50mL第一有机溶剂来计算，第二有机溶剂可以按1mmol的青蒿素加入20～50mL第二有机溶剂来计算。

本发明所述的合成方法中，所述惰性气体可以是氩气、氦气或氮气等。

本发明所述的合成方法中，所述青蒿素和N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷的反应在低于或等于0℃的条件下进行，反应过程中可以通过TLC跟踪检测反应是否完全。所述青蒿素和N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷的摩尔比通常为1：1～2。

本发明所述的合成方法中，所述残渣和对甲苯磺酸的反应可以在加热或不加热条件下进行，反应过程中可以通过TLC跟踪检测反应是否完全。当反应在室温条件下进行时，反应至完全大约需要24～48h的时间。当反应在加热条件下进行时，通常是在不超过第二有机溶剂的回流温度下进行。所述对甲苯磺酸的加入量可以是过量的，其加入量通常为青蒿素物质的量的1～3倍。

为了去除反应物B中未参加反应的对甲苯磺酸，可以将反应物B依次用碱性物质和水进行萃取后再进行后续操作。所述的碱性物质为碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、氨水或三乙胺。所述的碳酸氢钠水溶液可以质量浓度为1％至饱和浓度的碳酸氢钠水溶液，所述的碳酸钠水溶液可以质量浓度为1％至5％的碳酸钠水溶液。当碱性物质的选择为碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液或氨水时，萃取直至水相的pH≥7，收集的有机相再用水萃取，再收集有机相并用无水硫酸钠干燥后用于下一步操作。当碱性物质的选择为三乙胺时，向反应物B中加入三乙胺直至混合物的pH≥7，然后再向其中加水萃取，再收集有机相并用无水硫酸钠干燥后用于下一步操作。

本发明还包括上述式(I)所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还包括以上述式(I)所述化合物为活性成分制备的抗肿瘤药物。

与现有技术相比，本发明提供了一种结构新颖的青蒿素衍生物及其合成方法和应用。申请人通过考察该衍生物对多种人肿瘤细胞株和人正常细胞株的增殖抑制活性，发现其对人膀胱癌细胞T-24、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人胃癌细胞MGC80-3三种细胞株都表现出显著的增殖抑制活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的产物的高分辨质谱谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：

1)取410mg(1.44mmol)青蒿素、30ml甲醇置于100ml的圆底烧瓶中，在冰浴下搅拌5分钟，加入423mg(2.88mmol)N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷,在氮气保护下，0℃反应24小时，反应结束后蒸干溶剂，收集残渣；

2)将上一步收集的残渣溶于30ml二氯甲烷中，再加入550mg(2.88mmol)对甲苯磺酸，在室温下反应，用TLC跟踪反应，待反应结束(约40小时)后蒸除溶剂，用5w/w％碳酸氢钠溶液萃取三次，再用水萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后蒸干溶剂，得到油状物；

3)将上一步获得油状物上硅胶柱层析纯化(洗脱溶剂为石油醚：二氯甲烷＝1：1，体积比)，得到白色固体产物(95mg,产率18.8％)。

对所得白色固体产物进行鉴定：

(1)核磁共振氢谱和碳谱，具体波谱表征数据如下：

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ5.34(t,J＝4.6Hz,1H),2.24–2.19(m,1H),2.01(dd,J＝12.4,6.7Hz,2H),1.72–1.52(m,5H),1.38–1.18(m,22H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H).

¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ130.07,77.36,37.83,36.09,32.05,29.92,29.85,29.80,29.76,29.75,29.70,29.67,29.62,29.47,29.38,27.36,25.68,22.83,14.27.

(2)高分辨质谱：ESI-MSm/z:351.2[M+H]⁺，谱图如图1所示。

因此，可确定上述白色固体产物为N-(3-N’,N’-二甲胺基-丙基)-10-氮杂脱氧青蒿素，其化学结构式如下：

实施例2

1)取410mg(1.44mmol)青蒿素、15ml乙醇和15ml二氯甲烷置于100ml的圆底烧瓶中，在冰浴下搅拌5分钟，加入211mg(1.44mmol)N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷,在氮气保护下，0℃反应24小时，反应结束后蒸干溶剂，收集残渣；

2)将上一步收集的残渣溶于20ml二氯甲烷，加入275mg(1.44mmol)对甲苯磺酸，在室温下反应，用TLC跟踪反应，待反应结束(约40小时)后用5w/w％碳酸钠溶液萃取三次，再用水萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后蒸干溶剂，得到油状物；

3)将上一步获得油状物上硅胶柱层析纯化(洗脱溶剂为石油醚：二氯甲烷＝1：2，体积比)，得到目标产物(60mg,产率11.9％)。

实施例3

1)取410mg(1.44mmol)青蒿素、5ml正丁醇、5ml己醇和15ml氯仿置于100ml的圆底烧瓶中，在冰浴下搅拌5分钟，加入634mg(4.32mmol)N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷,在氮气保护下，0℃反应18小时，反应结束后蒸干溶剂，收集残渣；

2)将上一步收集的残渣溶于40ml氯仿，加入825mg(4.32mmol)对甲苯磺酸，在室温下反应，用TLC跟踪反应，待反应结束(约30小时)后用氨水萃取三次，再用水萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后蒸干溶剂，得到油状物；

3)将上一步获得油状物上硅胶柱层析纯化(洗脱溶剂为石油醚：二氯甲烷＝1：0.5，体积比)，得到目标产物(120mg,产率23.7％)。

实施例4

1)取410mg(1.44mmol)青蒿素、20ml正戊醇、10ml二氯甲烷、5ml氯仿和10ml丙酮置于100ml的圆底烧瓶中，在冰浴下搅拌5分钟，加入211mg(1.44mmol)N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷,在氮气保护下，0℃反应24小时，，反应结束后蒸干溶剂，收集残渣；

2)将上一步收集的残渣溶于20ml氯仿和10ml二氯甲烷，加入275mg(1.44mmol)对甲苯磺酸，在室温下反应，用TLC跟踪反应，待反应结束(约48小时)后加入291mg三乙胺(2.88mmol)，再用水萃取三次，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后蒸干溶剂，得到油状物；

3)将上一步获得油状物上硅胶柱层析纯化(洗脱溶剂为石油醚：二氯甲烷＝1：1，体积比)，得到目标产物(75mg,产率14.8％)。

为了充分说明本发明所述的N-(3-N’,N’-二甲胺基-丙基)-10-氮杂脱氧青蒿素在制药中的用途，申请人对其进行了体外抗肿瘤活性实验。

一、N-(3-N’,N’-二甲胺基-丙基)-10-氮杂脱氧青蒿素对5种细胞株的增殖抑制活性实验：

1、细胞株与细胞培养

本实验选用人膀胱癌细胞T-24、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞MGC80-3、人正常肝细胞HL-7702共5种细胞株。

所有肿瘤细胞株均培养在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO₂孵箱中培养；人正常细胞株则培养在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养液内。

2、待测化合物的配制

所用的N-(3-N’,N’-二甲胺基-丙基)-10-氮杂脱氧青蒿素为本发明实施例1所得产物，由柱层析提纯所得，纯度≥95％,将其DMSO储液(浓度为0.001mol/L)通过RMPI1640培养基依次稀释成五个浓度梯度，

分别为40、20、10、5、2.5μmol/L，其中助溶剂DMSO终浓度≤1％。首先测试20μmol/L的目标产物对于肿瘤细胞增殖的抑制率，视为初筛结果；再分别测试不同梯度浓度下目标产物对各种肿瘤细胞的增殖抑制程度，用以拟合计算半数抑制浓度，即IC₅₀值。

3、细胞生长抑制实验(MTT法)

(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔190μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

(2)5％CO₂，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；

(3)5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；

(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mLPBS，即0.5％MTT)，继续培养4h；

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μLDMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；

(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。

(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

利用公式：

计算化合物对肿瘤细胞生长的抑制率。其测试结果如以下表1所示。

表1：化合物在20μmol/L时对不同肿瘤细胞株的生长抑制率(％)

对于在初筛浓度下抑制率超过50％的细胞株，进一步通过SPSS软件对五个浓度梯度的抑制率数据进行拟合，求出产物对不同肿瘤株的半数抑制浓度(IC₅₀值，单位μmol/L)，青蒿素衍生物对于不同细胞株的IC₅₀值如表2所示。

表2：化合物对各细胞株的IC₅₀值(μM)

从体外抗肿瘤活性测试结果来看，该青蒿素衍生物对人膀胱癌细胞T-24、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人胃癌细胞MGC80-3三种细胞株都表现出显著的增殖抑制活性，其中对于MGC80-3细胞活性最高。

综上所述，本发明所涉及的化合物总体表现出了相当的体外抗肿瘤活性，并对于不同细胞株有一定的选择性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

Claims

1.下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

2.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：取青蒿素和N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷置于第一有机溶剂中，在惰性气体保护条件下反应，得到反应物A，反应物A蒸除溶剂，所得残渣溶于第二有机溶剂中，加入对甲苯磺酸反应，得到反应物B，反应物B蒸除溶剂，得到目标物粗品；其中：

所述第二有机溶剂二氯甲烷和/或氯仿。

3.根据权利要求2所述化合物的合成方法，其特征在于：还包括纯化步骤：具体是将制得的目标物粗品上硅胶柱层析，用由体积比为1：0.5～2的石油醚和二氯甲烷组成的洗脱剂洗脱，洗脱液蒸除溶剂，得到纯化后的目标物。

4.根据权利要求2或3所述化合物的合成方法，其特征在于：所述青蒿素和N，N-二甲基-1,3-二氨基丙烷的反应在低于或等于0℃的条件下进行。

5.根据权利要求2或3所述化合物的合成方法，其特征在于：所述残渣和对甲苯磺酸的反应在加热或不加热条件下进行。

6.根据权利要求2或3所述化合物的合成方法，其特征在于：所述残渣和对甲苯磺酸的反应在不超过第二有机溶剂的回流温度下进行。

7.根据权利要求2或3所述化合物的合成方法，其特征在于：反应物B依次用碱性物质和水进行萃取后再进行后续操作。

8.根据权利要求7所述化合物的合成方法，其特征在于：所述的碱性物质为碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、氨水或三乙胺。

9.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.以权利要求1所述化合物为活性成分制备的抗肿瘤药物。