CN104334182B

CN104334182B - 制造地加瑞克

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Publication number: CN104334182B
Application number: CN201380028448.8A
Authority: CN
Inventors: 格雷戈里·施瓦希; 安德斯·尼尔森; 蒂内·伊丽莎白·戈特沙尔克伯文; 约恩·霍尔贝克·拉斯穆斯; 比吉塔·默恩斯塔姆; 安德斯·齐尔克; 乌尔夫·安比; 延斯·福斯加德
Original assignee: Ferring BV
Current assignee: Ferring BV
Priority date: 2012-06-01
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2017-09-08
Anticipated expiration: 2033-05-31
Also published as: PH12014502682A1; US10172906B2; US20150141337A1; NZ727679A; NZ701978A; CN107569456A; TW201400143A; CN104334182A; HK1209046A1; AU2013269523B2; IL235856B; IL235856A0; CA3228586A1; RU2014146272A; US11510962B2; SG11201407679PA; CA2874927A1; AR123619A2; US10765721B2; EP2854831A2

Abstract

本发明提供生产冻干的地加瑞克(degarelix)产品的方法，所述产品在以20mg/ml的量用注射用水重构后,显示至多15mPas的粘度。本发明还提供冻干的地加瑞克药物物质，其在以20mg/ml的量溶解于水后显示至多3.2mPas的粘度,并且本发明还提供制备该冻干的地加瑞克药物物质的方法。

Description

制造地加瑞克

技术领域

本发明涉及制备地加瑞克(degarelix)的制造方法。

发明背景

前列腺癌是工业化世界中男性发病和死亡的主要原因。地加瑞克,也称为FE200486,是第三代促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂(GnRH阻断剂)，其被开发和批准用于需要雄激素消融治疗的前列腺癌患者(Doehn等人,Drugs 2006,vol.9,No.8,pp.565-571；WO 09846634)。地加瑞克通过直接且竞争性阻滞脑垂体中的GnRH受体而起作用，并且与其他GnRH拮抗剂一样，不会引起经由下丘脑-脑垂体-性腺轴的促黄体激素产生的初始刺激，并且因此不会引起睾酮激增或临床爆发(Van Poppel，Cancer Managementand Research，2010：239-52；Van Poppel等，Urology，2008，71(6)，1001-1006)；James，E.F.等，Drugs，2009，69(14)，1967-1976)。

地加瑞克是一种合成的直链十肽，其含有七个非天然氨基酸，其中五个是D-氨基酸。在该十肽的主链中具有十个手性中心。在该序列的位置5处的氨基酸残基在侧链取代中具有额外的手性中心，产生总共十一个手性中心。其CAS登记号是214766-78-6(游离碱的)，并且其以商标Firmagon^TM可商购获得。该药物物质在化学上被命名为D-丙氨酰胺，N-乙酰基-3-(2-萘基)-D-丙氨酰-4-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-4-[[[(4S)-六氢-2,6-二氧代-4-嘧啶基]羰基]氨基]-L-苯丙氨酰-4-[(氨基羰基)氨基]-D-苯丙氨酰-L-亮氨酰-N6-(1-甲基乙基)-L-赖氨酰-L-脯氨酰-并且由以下化学结构(下文也称为式I)表示：

地加瑞克的结构也可以表示为：

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH₂

其中Ac是乙酰基，2Nal是2-萘基丙氨酸，4Cpa是4-氯苯丙氨酸，3Pal是3-吡啶基丙氨酸，Ser是丝氨酸，4Aph是4-氨基苯丙氨酸，Hor是氢化乳清酸，Cbm是氨基甲酰基，Leu是亮氨酸，Lys(iPr)是N6-异丙基赖氨酸，Pro是脯氨酸而Ala是丙氨酸。

为了描述本发明的目的，地加瑞克中的每个氨基酸将被赋予如下的简化符号：

AA₁是D-2Nal，AA₂是D-4Cpa，AA₃是D-3Pal，AA₄是Ser，AA₅是4Aph(L-Hor)，AA₆是D-Aph(Cbm)，AA₇是Leu，AA₈是Lys(iPr)，AA₉是Pro并且AA₁₀是D-Ala。

因此,地加瑞克可以表示为Ac-AA₁-AA₁₀-NH₂。

之前使用如在WO 98/46634和Jiang等人,J.Med.Chem.2001,44,453-467中报道的Boc-固相肽合成(SPPS)方法制备地加瑞克。

WO2010/12835和WO2011/066386描述了使用Fmoc策略制备地加瑞克。WO2012/055905和WO2012/055903描述了地加瑞克的液相合成。

发明概述

地加瑞克的物理化学表征显示该十肽具有自聚集的能力,并且最终形成凝胶水溶液。自聚集使该化合物在皮下或肌肉内注射时在原位形成贮存制剂(depot)。显示该地加瑞克贮存制剂根据剂量提供活性物质持续释放数月。目前,第一次注射以120mg(40mg/ml)的剂量施用所述药物,并且以80mg(20mg/ml)的剂量用于持续释放超过一个月。

本发明人出人意料地发现重构的药品的粘度、和由此产生的持续释放性质和生物利用度可以通过加工粗肽(例如通过Fmoc策略,液相合成或其它途径获得)为药物物质而被控制。与药物物质相关的粘度出人意料地与和药品相关的粘度关联,即使在进一步重构和冻干之后。药品的粘度必须被控制在至多(up to)15mPas的范围内,优选在2至12mPas的范围内,以获得所需的贮存制剂形成和由此产生的持续释放。本发明提供允许制造显示该粘度的药品的方法，所述粘度是在用重构液以20mg地加瑞克/ml重构液的浓度重构后所确定的。

在第一个方面,本发明因此提供控制地加瑞克产品的粘度不大于15mPas,优选在2至12mPas范围内的方法，所述粘度是在用注射用水以20mg地加瑞克游离碱/ml的量重构后所确定的，所述方法包括以下步骤：

1.提供冻干的地加瑞克药物物质，所述地加瑞克药物物质显示至多3.2mPas的粘度，所述粘度是在以20mg地加瑞克游离碱/ml的量溶解于含甘露醇(2.5％w/V)的水后所确定的

2.将冻干的地加瑞克药物物质溶解于含甘露醇的水以提供含水的地加瑞克-甘露醇混合物；

3.冻干所述含水的地加瑞克-甘露醇混合物以提供所述地加瑞克药品。

在第二个方面,本发明提供生产显示至多15mPas,优选在2至12mPas范围内的粘度的冻干的地加瑞克产品的方法,所述粘度是在用注射用水以20mg地加瑞克游离碱/ml的量重构后所确定的，所述方法包括以下步骤：

2.将冻干的地加瑞克药物物质溶解于含甘露醇的水以提供含水的地加瑞克-甘露醇混合物；和

在第三个方面,本发明提供生产包含冻干的地加瑞克药品和用于重构的液体(重构液)的地加瑞克药品的方法，所述地加瑞克药品在用所述液体以20mg地加瑞克游离碱/ml的量重构后显示至多15mPas,优选在2至12mPas范围内的粘度,所述方法包括以下步骤：

1.将冻干的地加瑞克药物物质溶解于含甘露醇的水溶液以提供地加瑞克-甘露醇混合物；

2.冻干所述地加瑞克-甘露醇混合物以提供所述地加瑞克药品,

其中在冻干之前将降粘度剂(viscosity-reducing agent)添加至地加瑞克-甘露醇混合物。

本发明还提供冻干的地加瑞克药物物质，所述地加瑞克药物物质在以20mg地加瑞克游离碱/ml的量溶解于含有2.5重量％甘露醇的水后显示至多3.2mPas的粘度,和提供该冻干的地加瑞克药物物质的方法。

此外,本发明提供包含冻干的地加瑞克药品和重构液的地加瑞克药品，所述地加瑞克药品在用所述重构液以20mg地加瑞克游离碱/ml的量重构后,显示至多15mPas,优选在2至12mPas范围内的粘度,并且以0.001至5mg/ml的量含有降粘度剂。

附图说明

图1显示药物物质粘度和药品粘度之间的关系。

图2和3显示在第3天(图2)和第28天(图3)地加瑞克剂量给药悬浮液(20mg/ml)的动态粘度和地加瑞克血浆浓度(大鼠)之间的关系。

发明详述

根据第一和第二方面二者的生产冻干的地加瑞克产品的方法以将更详细描述的地加瑞克药物物质开始。

地加瑞克药物物质

可以通过在WO98/46634,WO2010/12835和WO2011/066386中所公开的固相肽合成,或通过在WO2012/055905或WO2012/055903中公开的液相肽合成制备十肽地加瑞克。该肽合成提供粗品地加瑞克，将所述粗品地加瑞克进一步纯化并随后冻干以提供冻干的产品，所述冻干的产品由地加瑞克,乙酸,残余量的水,和由于生产工艺产生的少量杂质(如果有的话)组成。该产品在本发明中被称为地加瑞克药物物质或只是药物物质。所述地加瑞克药物物质优选由地加瑞克,4.5至10重量％乙酸(w/w),和至多10重量％水(w/w)组成。

药物物质的制造可以被分为两个步骤：提供溶液中的纯化的地加瑞克的第一步骤 (A)，和提供所述地加瑞克药物物质的第二步骤(B)。

步骤(A)：纯化

步骤(A)包括在一个以上步骤,优选两个步骤中纯化粗品地加瑞克,任选地接着柱浓缩和/或盐交换步骤。

首先将如通过LPPS或SPPS所获得的粗品地加瑞克进行纯化。纯化优选通过将由SPPS或LPPS获得的肽溶液应用于具有反相材料的柱进行，所述柱优选用缓冲液预平衡。该第一纯化步骤优选提供通过HPLC所确定的至少95％的纯度。

在一个优选的实施方案中,重复反相柱层析以获得具有通过HPLC所确定的至少97.5％的纯度的产品。

在一个特别优选的实施方案中,将具有至少95％,优选至少97.5％纯度的纯化的地加瑞克溶液进行进一步柱层析步骤以预浓缩所述地加瑞克溶液和/或用于盐交换(特别是如果乙酸用于最后纯化步骤中洗脱液的pH调整)。

该预浓缩和/或盐交换步骤还优选在反相柱上进行：将纯化的地加瑞克溶液用水稀释(优选1.5至2.5倍)并应用于所述柱,用缓冲液预平衡。优选首先用乙醇(低浓度,一般低于20％)和乙酸铵水溶液清洗柱并且随后用乙醇(低浓度,一般低于20％)/乙酸/水清洗。随后将柱例如用乙醇(高浓度,一般20至60％)/乙酸/水洗脱以获得比纯化步骤之后的溶液更加浓缩的地加瑞克溶液。该过程不限于乙醇作为洗脱液中的有机改性剂(modifier)。其他溶剂比如乙腈也可以被使用。

步骤(A)提供纯化的地加瑞克溶液。

步骤(B)

为了获得所述地加瑞克药物物质的对纯化的地加瑞克溶液的随后处理可以以不同方式进行。在下文中,说明了四种优选的方式(步骤(B1),(B2),(B3),和(B4))。

步骤(B1)：浓缩–解聚–冻干

首先将纯化的地加瑞克溶液进行浓缩步骤，其中通过蒸发将乙醇或另一种有机改性剂比如乙腈去除。该步骤优选用rotavap蒸发器进行。蒸发过程中优选的最大温度是40℃。产生的高度浓缩的,粘性地加瑞克产品(通常为凝胶形式的聚集的产品)随后用乙酸(解聚步骤)处理,优选过滤,和冻干。

解聚步骤对于控制药物物质的粘度是重要的。因此,所述解聚步骤优选以一个以上,最优选全部以下条件进行：

·最终乙酸浓度：6-40％,优选15–35％(v/v)

·温度0至35℃,优选2至30℃,最优选5至15℃

·地加瑞克浓度(游离碱)5–35g/l,优选10–20g/l

·时间1–15小时

在这些限制内，可以通过简单实验发现工艺参数的合适组合。

所述冻干步骤优选以1.2至2.4cm的冰厚度和1至17小时的二次干燥时间进行。所述二次干燥温度通常约20℃(15至25℃)。

在一个优选的实施方案中,步骤(B1)因此提供冻干的药物物质，所述冻干的药物物质显示少于3.2mPas,优选介于1.15和2mPas之间的粘度(在以20mg地加瑞克游离碱溶于1ml水(含2.5％(w/V)甘露醇)的量溶解后所确定的)。测量粘度的方法在实验部分描述。满足此粘度需求的药物物质进一步被称为药物物质(1),然而不满足此粘度需求的药物物质进一步被称为药物物质(2)。药物物质(2)在以20mg的量溶于1ml水后具有优选的3.2至15mPas的粘度。药物物质(2)在显著高于3.2mPas的条件下可以甚至是凝胶样的,虽然其粘度不能被准确测量。

在这方面,要注意“在以20mg的量溶于1ml水后”仅是指用于测量粘度的条件并且不意为所述药物物质以20mg/ml的溶液存在。最优选,所述药物物质以冻干形式存在。

所述药物物质,尤其是药物物质(1),优选进一步特征为4.5至10.0％(w/w)的乙酸含量和/或10％或更小(w/w)的含水量。另外,所述药物物质,尤其是药物物质(1),优选显示0.10AU或更小的光密度(在20mg地加瑞克游离碱/ml溶于2.5％甘露醇(水溶液)的浓度下)。测量光密度的方法在实验部分中描述。

因此,本发明提供生产所述地加瑞克药物物质(1)的方法,所述方法包括以下步骤：

a.纯化通过液相或固相肽合成所获得的地加瑞克以获得具有至少95％纯度的地加瑞克溶液；

b.蒸发溶剂以浓缩所述地加瑞克溶液以获得聚集的地加瑞克；

c.将聚集的地加瑞克用乙酸解聚；和

d.冻干解聚的地加瑞克以提供所述地加瑞克药物物质。

本发明进一步提供调整地加瑞克粘度的方法,所述方法使得在冻干和用水重构后,2.5％w/V甘露醇中的20mg/ml地加瑞克溶液的粘度不大于15mPas,所述方法包括：

用乙酸处理聚集的地加瑞克；和

冻干地加瑞克和乙酸的混合物。

在某些实施方案中,乙酸添加和冻干的条件如上文描述的。在特定实施方案中,冻干后的乙酸含量为4.5至10.0％(w/w)。

步骤(B2)：柱浓缩–冻干

将步骤A(优选一或二步骤纯化方法(例如无预浓缩/盐交换)之后)中获得的地加瑞克溶液加样于色谱柱,进行离子交换并且将柱用稀释的乙酸(约1％)冲洗(清洗)。使用AcOH浓度为20至50重量％,优选23至37重量％,优选23至27重量％,优选27至37重量％,优选33至37重量％,优选35重量％的乙酸水溶液将地加瑞克从柱上洗脱,并且随后任选地稀释为适当的AcOH浓度,过滤。然后,将地加瑞克的AcOH/水溶液冻干。柱中的固定相可以是不同类型。所述固定相可能含有功能基团如烃(脂肪族的和芳香族的)、醇、腈，具有适当酸/碱性质的基团和离子交换基团，但不限于此类型的基团。该工艺提供所述药物物质,优选药物物质(1)。

因此,本发明还提供生产地加瑞克药物物质的方法,所述方法包括以下步骤：

b.将地加瑞克溶液加样于色谱柱；

c.用乙酸从柱上洗脱地加瑞克以提供洗脱的地加瑞克；

d.冻干所述洗脱的地加瑞克以提供所述地加瑞克药物物质。

步骤(B3)：通过冻干-在AcOH/水中重构-冻干分离

将步骤A之后获得的纯化的地加瑞克溶液通过冻干分离；将产生的冻干产品以介于10和20g/L之间的浓度溶解在2％乙酸溶液中,并再次冻干以产生地加瑞克药物物质(1)。

步骤(B4)：喷雾干燥

将溶液中的纯化的地加瑞克(步骤A之后获得的,或步骤B1除了冻干,或B2中除了冻干所描述的，含有AcOH的EtOH/水或含有AcOH的ACN/水)通过喷雾干燥分离以产生地加瑞克药物物质(1)。

在一个优选的实施方案中,将步骤A中所获得的纯化的地加瑞克溶液直接进行喷雾干燥过程。将进行喷雾干燥的所述地加瑞克水溶液的AcOH浓度调整至6至40％(v/v),优选15至35％(v/v)。

描述了药物物质的制造之后,我们现在将描述地加瑞克药品的制造。所述冻干的地加瑞克药品包含地加瑞克药物物质和甘露醇,即其包含(并且优选由以下各项组成)地加瑞克,乙酸,甘露醇,残余量的水,和由于生产工艺产生的少量杂质(如果有的话)。

地加瑞克药品的生产工艺A

生产工艺A是上文提到的本发明的第一方面,即一种生产地加瑞克药品的方法，所述药品在以20mg地加瑞克游离碱/ml的量用注射用水重构后,显示至多15mPas、优选在2至12mPas范围内的粘度,所述方法包括以下步骤：

a.提供冻干的地加瑞克药物物质,优选地加瑞克药物物质(1)；

b.将冻干的地加瑞克药物物质溶解于含甘露醇的水以提供含水的地加瑞克-甘露醇混合物；

c.冻干所述含水的地加瑞克-甘露醇混合物以提供所述地加瑞克药品。

在本发明中,“在以20mg/ml的量用注射用水重构后”是指测量粘度的条件并且不意为所述药品以20mg/ml的溶液存在。最优选的,所述药品以冻干形式存在,任选地与重构液组合存在。优选的每瓶中的量在60至300mg的范围内(比如120mg,80mg,和240mg)。备选地,其可以被提供为具有优选的在2至100mg/ml,优选10至70mg/ml范围内的浓度(比如40mg/ml,20mg/ml,和60mg/ml)的重构的药品。

步骤b也可以被称为混合步骤。在一个优选的实施方案中,在混合之后，在冷冻干燥之前进行过滤和装瓶，从而整个优选的生产工艺A包括以下步骤：

·混合以提供未过滤的原料药品

·过滤(无菌)

·装瓶

·冷冻干燥/冻干

混合以提供原料药品

将药物物质进行混合步骤,所述混合步骤一般如下进行：

为了生产未过滤的原料药品,将药物物质和甘露醇各自以每1000g批量10–60g的量溶解于水(纯水；一般Milli-Q水)。典型的量为20至50g药物物质(如通过HPLC确定的地加瑞克游离碱含量和10至50g甘露醇/1000g。实际量依赖于药品中地加瑞克的终浓度和重构液的体积(优选这样添加甘露醇，以致于在重构之后获得具有300mOsm+/-30mOsm的渗透压的等渗溶液)。

为了生产,将水(通常大约总水量的80％)添加至混合容器。添加甘露醇并通过搅拌溶解。随后将药物物质添加至搅拌的甘露醇溶液并且通过添加剩余的水使配制的原料药(批次)达到最终重量。该混合以以致避免显著粘度增加的方式进行。原料药产物的粘度因此优选在混合步骤过程中仍然低于5mPas,优选低于3.2mPas(过滤后在以20mg溶于1ml2.5％(w/V)甘露醇水溶液的量溶解后所确定的粘度)。这可以通过在高搅拌速度下将肽润湿相对短的时期(至多30分钟)和随后在降低的搅拌速度下将肽溶解以避免发泡和聚集(一般达30至90分钟)而实现。温度通常保持在6–15℃的范围内。搅拌器优选为在无涡旋的情况下提供紊流混合的搅拌器。

过滤

随后优选通过用氮对配制的原料药加压将原料药品例如由串联放置的两个消毒级的滤器无菌过滤。

填装

将无菌小瓶用过滤的原料药品填装并在无菌条件下用瓶塞半塞住(冷冻干燥位置)。

冷冻干燥

所述冷冻干燥器优选为在使用前蒸汽消毒的。将小瓶放置在冷冻干燥器架上。随后的冷冻干燥工艺优选包括冷冻、主要干燥(升华)和二级干燥步骤。优选的条件如下：

所述冷冻干燥工艺优选包括三个主要步骤,或甚至由三个主要步骤组成,即冷冻,主要干燥(升华)和二级干燥。

·冷冻

将小瓶加载于冷藏架上，所述冷藏架维持在2至10℃,比如5℃。

将架从例如5℃冷却至-30至-40℃,比如-35℃。将架子温度维持在例如-35℃最少两小时以确保在主要干燥开始前整个批次完全冷冻。

·主要干燥(升华)

通过降低室压力(优选降至0.100mBar或更低)并增加架子温度(优选至10至20℃,比如+17℃)进行主要干燥。

主要干燥时间进行至少15小时。

·二级干燥

主要干燥过程完成后,降低室压(优选至0.01mBar或更低)并增加架子温度(优选至20至30℃,比如25℃)。二级干燥典型地在7小时内完成。

随后将冻干的药品贴标签和包装并与适当量的重构液组合。

根据药物物质的粘度选择重构液。如果药物物质(1)用作生产工艺A的起始材料,即显示少于3.2mPas,优选介于1.15和2mPas之间的粘度(在以20mg的量溶于1ml的2.5(w/v)％甘露醇水溶液后)的冻干的药物物质,优选将产生的冻干的药品与作为重构液的注射用水(WFI)组合。如果所述冻干的药品用WFI重构,则粘度一般在2至15mPas的范围内(如在20mg地加瑞克(游离碱)溶解于1ml WFI后测量的)。发现具有在此范围内的粘度的药品提供地加瑞克在体内的充足贮存制剂释放。

地加瑞克药品的生产工艺B

生产工艺B是生产包含冻干的地加瑞克药品和用于重构的液体(重构液)的地加瑞克药品的方法，所述地加瑞克药品在用所述液体以20mg地加瑞克游离碱/ml的量重构后,显示至多15mPas,优选在2至12mPas范围内的粘度,所述方法包括以下步骤：

a.将冻干的地加瑞克药物物质溶解于含甘露醇水溶液以提供地加瑞克-甘露醇混合物；

b.冻干所述地加瑞克-甘露醇混合物以提供所述地加瑞克药品,

其中在冻干之前将降粘度剂添加至所述地加瑞克-甘露醇混合物。

步骤a还可以被称为混合步骤。在一个优选的实施方案中,在混合之后和冷冻干燥之前进行过滤和装瓶，从而整个优选的生产工艺B包括以下步骤：

·混合以提供未过滤的原料药品

·过滤(无菌)

·装瓶

·冷冻干燥/冻干

生产工艺B与生产工艺A相同,除了在混合步骤中,在冻干之前添加降粘度剂,优选非离子型表面活性剂。优选将所述非离子型表面活性剂以0.0003至1.5mg/ml的量添加至原料药溶液,对应于重构的药品中0.001至5mg/ml,更优选0.1至1mg/ml的量(例如当重构至60mg地加瑞克游离碱/ml的地加瑞克浓度时)。优选的非离子型表面活性剂是带有具有至少8个碳原子直链烷基链(优选无双键)和糖部分的那些。特别优选的是被批准用于皮下注射的那些,比如Tween 20(聚山梨酯20)。其它合适的非离子型表面活性剂包括生育酚-聚乙二醇-1000-琥珀酸酯(TPGS)和其它Tweens。

优选使用药物物质(2)作为生产工艺B的起始材料,即显示至少3.2mPas粘度(在以20mg地加瑞克游离碱的量溶于1ml的2.5重量％甘露醇水溶液后)的冻干的药物物质。将产生的冻干的药品典型地与作为重构液的WFI组合。如果将冻干的药品用WFI重构,则粘度一般在2至15mPas的范围内(如在将20mg地加瑞克游离碱溶解于1ml WFI后测量的)。发现具有在该范围内粘度的药品提供充足的贮存制剂形成，用于地加瑞克在体内的延迟释放。

对于在重构后具有相对高的地加瑞克浓度,比如50mg地加瑞克游离碱/ml或更多,例如60mg地加瑞克游离碱/ml(240mg药品)的地加瑞克产品，生产工艺B是特别优选的。

新地加瑞克药品

生产工艺B提供新地加瑞克药品，其不同于已知药品之处在于重构的药品含有降粘度剂。所述降粘度剂是步骤B中使用的降粘度剂,优选非离子型表面活性剂。

本发明因此提供包含冻干的地加瑞克药品和用于重构的液体的地加瑞克药品,所述地加瑞克药品在用所述液体以20mg地加瑞克游离碱/ml的量重构后,显示至多15mPas,优选在2至12mPas范围内的粘度,并且含有0.001至5mg/ml,更优选0.1至1mg/ml的量的降粘度剂。

实验部分

实施例1：纯化,解聚合冻干

如在WO2012/055905A1中所述，合成粗品地加瑞克,直到实施例5中的步骤12。如在WO2012/055905A1中公开的步骤13由以下步骤替代。归纳起来,最后的脱保护步骤之后获得的粗品地加瑞克药物物质的纯化过程由三个制备型反相层析(RPC)步骤组成,其中第三个RPC步骤主要是脱盐步骤。

步骤13(纯化步骤)：

将来自WO2012/055905A1中步骤12的粗品地加瑞克溶液施加于装填有反相材料的、用缓冲液(90％的0.12％TFA和10％的EtOH)预平衡的柱。加样：≤30g/L柱体积。将柱用梯度：缓冲液(EtOH 29％至50和0.12％TFA(水溶液)71％至50％)清洗和洗脱。分析获得的级分,并以以下方式合并：所述方式使得主要汇集物(pool)的纯度满足工艺控制的接受标准。

当通过HPLC方法核实洗脱时,纯度≥95％。

步骤14(纯化步骤)：

将步骤13中获得的主要汇集物用水稀释两倍并施加于装填有反相材料、用缓冲液(90％的1％AcOH和10％的EtOH)预平衡的柱。加样：≤25g/L柱体积。首先将柱用第一缓冲液(10％的EtOH和90％的0.5mol/LAcONH4)清洗并随后用第二缓冲液(90％的1％AcOH和10％of EtOH)清洗。

随后将柱用缓冲液和乙醇(76％的1％AcOH和24％的EtOH)的混合物洗脱。分析获得的级分,并以以下方式合并：所述方式使得主要汇集物(pool)的纯度满足工艺控制的接受标准。

当通过“HPLC方法”核实洗脱时,纯度≥97.5％。

步骤15(预浓缩/盐交换)：

将步骤14中获得的主要汇集物用水稀释两倍并施加于装填有反相材料、用缓冲液(90％的1％AcOH和10％的EtOH)预平衡的柱。加样：≤18g/L柱体积。首先将柱用第一缓冲液(10％的EtOH和90％的0.5mol/L AcONH4)清洗并随后用第二缓冲液(90％的1％AcOH和10％的EtOH)清洗。随后将柱用缓冲液和乙醇(50％的1％AcOH和50％的EtOH)的混合物洗脱。

作为替代,可以用AcOH/MeCN/水的溶液,比如12％AcOH和22％MeCN的水溶液，洗脱地加瑞克。

步骤16(浓缩-解聚-冻干)：

在冻干之前,将来自步骤15的纯地加瑞克溶液的汇集物在低于40℃浓缩。将乙酸水溶液和水添加至浓缩的溶液,产生低于15g/L的浓度,和30％的乙酸浓度。随后将该溶液过滤和冻干以收获地加瑞克药物物质。

压力：在主要和二级干燥过程中≤0.5mbar

温度：最后冷冻温度：≤-30℃

最后主要干燥温度：20℃

最后二级干燥温度：20℃

时间：5天

结果

通过顺序步骤获得的药物物质的粘度低于2.5mPas，如以20mg/ml的浓度溶于2.5(w/V)％甘露醇溶液所确定的。

实施例2：测量药物物质和药品粘度的方法

药物物质和药品溶液粘度的确定是基于当前版本的欧洲药典(Ph.Eur.)和USP工序，其使用装备有D＝60mm和1°的锥板测量系统的旋转式粘度计。以20个阶梯，在20±0.2℃的恒温下，使用控速(CR)旋转步骤程序将剪切速率从0增加至500s^-1,确定在500s^-1的剪切速率下记录粘度之前系统达到平衡。

实施例3：测量药物物质和药品的光密度的方法

设备和材料

·UV分光光度计

·UV光透射比色皿,10mm路径

·比色皿盖

·注射用水(用于重构地加瑞克药品和用于参考孔)

性能分析

在重构和测量之间，必须将重构的样品保持在22℃±1℃。

将药物物质小瓶重构在2.5％甘露醇的水溶液(w/V)中。将药品小瓶以注射用水重构。将溶剂分配到小瓶中并且旋动小瓶直到重构完成或使用涡旋几秒。液体应当看上去澄清并且无可见的未溶解粉末或颗粒。保持小瓶垂直并不摇动。在加入溶剂后120分钟，在350nm测量样品。

测量前四分钟,必须通过大约180度温和地来回翻转比色皿五次来将样品均化。延迟四分钟使得任何气泡在读数前都散开。

必须将由比色皿和由注射用水引起的吸收从样品的读数中减去。

实施例4：喷雾干燥

进料制备

在进料的制备中,使用磁力搅拌器将显示在下表中的称出的量的地加瑞克溶解。通过添加Milli-Q水,或纯冰乙酸(99.9％)，以以下方式制备不同的进料溶液,W-VI和AI-IV：

a.批次W-IV：将适当体积的水添加至称出的量的地加瑞克

b.批次A-I至A-III：对于各个实验,通过用Milli-Q水稀释99.0％冰乙酸产生30,5,2百分比的溶液而制备乙酸溶液,向其中添加称出量的地加瑞克

在所有喷雾干燥运行之前,在喷雾干燥前，将重构的肽通过0.20μm SartoriuosMinistar滤器过滤至测量瓶。

喷雾干燥

在喷雾干燥前,调整进口温度和进料速率。将泵的管道置于进料溶液中,并起始干燥。当干燥完成时,让进口温度降低至700℃，之后拆除旋风分离器和收集容器以用于粉末收集。用刷子将粉末收集于皮氏培养皿(Petri dishes),在收集之前和之后将所述培养皿称重以确定收率。

用于喷雾干燥的设置总览

与从水(W-IV)喷雾干燥的地加瑞克的一个批次相比，从四个不同浓度(A-I至A-III)的乙酸溶液喷雾干燥的重构的地加瑞克的粘度

批次号	W-IV	A-I	A-II	A-III
					粘度,mPas*S	2.40	1.68	2.11	2.10

实施例5：柱浓缩–冻干

将来自实施例1的步骤14的汇集物用水稀释并施加于装填有反相材料的柱。在用1％AcOH的水溶液冲洗柱之后，将地加瑞克用35％AcOH的水溶液洗脱。调整级分至含有35g地加瑞克/l,27％AcOH(样品1)和15g地加瑞克/l,30％AcOH(样品2)。将调整的级分冻干并分析。结果：参见下表：

对药物物质的分析	样品1	样品2
			水(w/w)	2.1％	2.5％
残余AcOH(w/w)	7.2％	7.0％
			OD 20mg/ml(15min/6h)	<0.02AU/0.02AU	<0.02AU/0.02AU
粘度20mg/ml	1.88mPas	1.94mPas

实施例6：制造地加瑞克药物物质和解聚研究

°材料

纯化的,粗品药物物质的解聚研究

-以57.4mg/ml的浓度提供粗制的,纯化的地加瑞克

-乙酸100％由Merck提供

-解聚设备：

·混合容器：300ml双层玻璃容器

·蓝帽瓶,50或100ml

·磁铁

·磁力搅拌器

-初级包装：

·无色20R玻璃小瓶。清洗小瓶并在加热室(heat chamber)中干燥。

·根据欧洲药典/USP的20mm冷冻干燥瓶塞类型I 20mm翻转盖(Flip-Off Caps)

使用解聚的药物物质制造药品

-使用两种实验药物物质。作为对照,使用商品药物物质。

-甘露醇：D(-)甘露醇(PF-05-0232)

-初级包装：

·无色10R玻璃小瓶(根据DIN ISO 8362)。将小瓶清洗并在加热室中干燥。

·根据欧洲药典/USP的20mm冷冻干燥瓶塞类型I(类型1319,橡胶W4416/50/灰色,The West Company)

·20mm翻转盖(The West Company)

°方法

使用药物物质储备溶液的解聚实验

实验过程中的温度：

解聚研究过程中，将温度设为5,20,25,或35℃

在实验过程中的储备溶液中地加瑞克药物物质的浓度：

地加瑞克药物物质的浓度为5,15,25,或35mg/ml。

实验过程中乙酸的浓度：

乙酸的浓度为13,15,18,20,22,26,30,35或40％。

实验过程中进行的分析：

粘度：在T＝1,60,120,和240min取出～1.2ml。

如果在另一时间点取出样品更符合时间表,那么假如将正确时间写入制剂记录则可以这样做。然而,T＝1min的样品点应该被保留。

光密度(OD)：应该在各实验的最后取样品(～1ml)用于测量最终光密度。

解聚实验方案,总体积20或69ml：

1.将所需量的储备溶液称于烧杯中。平衡至所需温度

2.将所需量的乙酸(100％)称重于烧杯中

3.将乙酸(100％)与3或10ml的milli-Q水混合并平衡至所需的温度

4.将地加瑞克储备溶液与乙酸/milli-Q水溶液混合

5.填充milli-Q水至多20或69ml

6.充分混合

7.如上文描述的取样品用于粘度和光密度。在实验过程中注意溶液的外观

用于解聚两种69ml地加瑞克储备溶液的设置：

在两种实验中地加瑞克药物物质浓度25mg/ml

乙酸：10％或13％

温度：5℃

将两种测试解聚的药物物质(69ml)装填于小瓶中并冷冻干燥：

将解聚的溶液立即填装于20R小瓶。每个小瓶装5ml。在装填过程中小瓶和原料药应该保持冷的(优选5-10℃之间)。一填装完小瓶就将它们放置在冷冻干燥中并起始程序。

冷冻干燥和关闭小瓶之后,在5℃将小瓶储存在冷冻干燥器中直到减载(de-loading)。

将两种冷冻干燥的药物物质进行以下分析：

对20mg/ml游离碱的样品测量粘度

对20mg/ml的样品测量光密度

地加瑞克含量

乙酸盐含量

°结果

实施例7：无降粘度剂的药品的生产

使用两种解聚的药物物质混合实验室规模的药品批次

下表1中列出的赋形剂用于所有混合实验。

混合设备：

混合容器：300ml双层玻璃容器

蓝帽瓶,100ml

磁铁

磁力搅拌器

初级包装：

·无色10R玻璃小瓶。清洗小瓶并在加热室中干燥。

·20mm冷冻干燥瓶塞类型I

·20mm翻转盖

研究描述

使用不同批次的药物物质和不同的温度设置，将含有20mg/g地加瑞克和25mg/g甘露醇的地加瑞克原料药(bulk)溶液混合。

在两种情况下(溶解后和在t＝120分钟)，在混合过程中/混合之后测量原料药溶液的粘度。

原料药组成：

两种原料药溶液的批量和组成显示于表2中。

表1：原料药溶液的批量和组成

批量(g)	50
		药物物质(g)	1.000g/地加瑞克游离碱含量的药物物质
甘露醇(g)	1.25
		Milli-Q水–总共(g)	加至50

实验设计：

混合参数在表2中给出。

表2：混合参数

时间	参数
		药物物质	测试药物物质批次
温度	15℃
		搅拌速度	50rpm
水,初始体积	80％

混合：

混合用位于中间的搅拌器进行。在开始实验之间，中间位置应该被固定。

1.称所需的成分

·40g的Milli-Q水放入混合容器中。

·1.25g的甘露醇放入合适容器中

·称准确量的地加瑞克药物物质(见表2)，放入合适容器。

·称残余量的Milli-Q水，放入合适容器。

2.将含有Milli-Q水的双壁混合容器连接于冷却循环器。串连第二双壁容器。将含有剩余水的容器置于所述第二双壁容器中，从而其将平衡以在被添加至原料药之前校正温度(步骤9)。

3.小心将搅拌磁铁置于混合容器中。使用测速计设置搅拌率为50rpm。

4.设置冷却器以校正温度,起始搅拌并将甘露醇加入混合容器。搅拌直到甘露醇溶解。

5.让系统平衡至设置温度。

6.测量甘露醇溶液中的温度。

7.移去搅拌器。启动计时器并立即添加药物物质。随后再插入搅拌器。

8.在t＝5分钟，使用玻璃巴斯德吸管加入剩余的Milli-Q水,均匀地超过药物物质表面。

9.当仅残留少许团块时,用溶解介质从容器的侧壁冲下药物物质。

10.当药物物质完全溶解时，记录时间并测量温度。取出样品用于原料药的粘度测量。

11.继续实验直到t＝120分钟。取出样品用于原料药的粘度测量。

过滤

原料药将不被过滤，因为预期至少一个批次将是高度聚集的并因此难以过滤。同样,该批次将不用于需要无菌的目的。

装填

将6.40g原料药装入10R小瓶。在装填过程中应该将小瓶和原料药保持冷的(优选5-10℃之间)。一将小瓶填装，即应该将它们置于冷冻干燥中并应该起始程序。每个原料药应该产生约6-7小瓶。

°结果

将如下表指示的18种具有不同粘度的不同的药物物质批次如上文描述进行处理。相应药品的粘度如下确定：

这些结果图示在图1中。图1显示药物物质粘度和药品粘度之间的关联。

实施例8：具有降粘度剂的药品的生产

实验1：测试的表面活性剂(使用WFI/表面活性剂溶液重构)

工序：

·使用WFI(作为对照)和使用含表面活性剂的WFI重构地加瑞克批次。将小瓶重构至60mg/ml地加瑞克。用于这些实验的药品批次具有约3.8mPas的批次粘度。

·将TPGS和Tween 20制备为含1mg/ml的溶液(0.1％溶液)

·在350nm测量OD(吸光度)

·在30min,60min,120min和24小时之后记录吸光度

结果：

TPCG和Tween 20二者都降低光密度至低于对照的水平。

实验2：用[WFI+Tween 20]重构地加瑞克小瓶不改变40mg/ml的地加瑞克的体外释放属性(IVD测定)

测试的Tween 20浓度：

1mg/ml；0.5mg/ml；0.25mg/ml；

对照：WFI

结果：体外释放曲线不被Tween-20的添加改变。

实施例9：药品粘度和生物利用度

总结

以来自地加瑞克药品的n＝38批次的一组数据(包括体内药代动力学数据(大鼠模型))进行多元数据分析。

建立了物理化学特性和大鼠模型中体内药代动力学之间的关系。该研究揭示，重构的地加瑞克产品的粘度似乎是具有预测贮存制剂的体内性能的某种能力的突出的和唯一的参数。

o引言

将地加瑞克药品制造为含甘露醇的冷冻干燥的产品。该产品用作临床研究中的研究用医药产品。生产了一些制剂,所述制剂每瓶含有不同量的地加瑞克,即10mg,20mg,40mg,88mg,128mg,120mg(40mg/ml),180mg(60mg/ml)和240mg(60mg/ml)和不同比例的地加瑞克/甘露醇。

o材料

已经以不同批次的地加瑞克物质和制剂生产了大约40个不同批次的地加瑞克。除非另有说明，原料药中的标准地加瑞克浓度为20g/l。

o方法

·物理化学方法

表征聚集的不同方法选自多元数据分析。将来自n＝38个批次的数据汇编。然而,对于一些仅用一些制剂实施的方法(例如在40mg/ml而未用20mg制剂进行的测量)，使用更小的群体。

·大鼠生物测定

使用标准化的大鼠测定，所述测定由以下地加瑞克经28天的药代动力学曲线组成。为了避免局部副作用，以100μl的注射体积将20mg/ml悬浮液地加瑞克施用于大鼠。使用n＝8大鼠的组,所有都用源自一个单个小瓶的重构的悬浮液处理。在2hrs,第1天,第7天和第28天起始测量血浆浓度并且部分AUC计算为AUC 0-7天和AUC 7-28天。随后改变设计为跳过血浆浓度(Cp)-2hrs的测量并由Cp-3天替代。类似的,AUC 0-7天由AUC 1-7天替代。这解释了一些体内可变因素在群体大小中的不连续性。

·多元数据分析

鉴于数据集的大小,实施通过用Simca-P,版本10软件(Umetrics AB,)的多元数据分析(PCA和PLS)的方法。如之前的，包括软块缩放(soft block scaling)(1/4根),缩放到单位方差(UV)和定中(centering)，操作数据。将浊度数据对数变换以改善数据分布。将体内Cp数据也进行对数变换以稳定方差。

药品物理化学和大鼠模型中体内性能之间的关系

·物理化学和体内性能之间的关系

基于2个分量(component)计算第一模型。考虑到生物数据的高可变性(20-30％)，吻合度(R2＝0.58)相对低,但可预测性的良好度(Q2＝0.35)符合要求(R2-Q2应该在0.2至0.3范围内)。从加载的散点图(未显示)可以看出，变量比如在20mg/ml测量的浊度和乙酸盐含量无影响。

因此，排除这3个变量(在20mg/ml测量的2个浊度变量和乙酸盐),基于2个显著的分量产生新模型并且产生类似的数据描述(R2＝0.53)，但是具有改善的预测度(Q2＝0.42)。最佳解释和预测的大鼠变量是在3天和28天的血浆浓度(Cp-3d,Cp-28d),和第1天和第7天之间的曲线下面积(AUC 1-7d)。系数总览图表表明，由20mg/ml和随后40mg/ml的粘度数据分别带来更大的影响,对于每个生物学变量，在0.95的置信水平全都是显著的。比表面积和浊度显然影响更小并且不显著,即使在0.90的置信水平。

在20mg/ml测量的动态粘度和拟合最佳的生物变量之间的关系显示于图2和3。

·结论

在构成的产品粘度和在大鼠模型所研究的体内性能之间建立了坚实的关系(R2＝0.53)。在两种情况下,更高的粘度产生了降低的从贮存制剂的释放。除了用于体外溶解的乙酸盐含量，其它物理-化学变量不相关。因此,构成的地加瑞克产品的粘度似乎是具有预测贮存制剂的体外释放和体内性能的某种能力的显著参数。

Claims

1.冻干的地加瑞克药物物质，所述药物物质由以下组成：地加瑞克、4.5至10.0重量％的乙酸和残余量的水，所述药物物质在以20mg地加瑞克游离碱/ml含有2.5重量％甘露醇的水的量溶解于水后，显示至多2.5mPas的粘度，其中所述地加瑞克药物物质通过包括以下步骤的方法获得：用乙酸终浓度6至40重量％的乙酸处理纯化的地加瑞克。

2.冻干的地加瑞克药物物质，所述药物物质由以下组成：地加瑞克、4.5至10.0重量％的乙酸、残余量的水和由于生产工艺产生的杂质，所述药物物质在以20mg地加瑞克游离碱/ml含有2.5重量％甘露醇的水的量溶解于水后，显示至多2.5mPas的粘度，其中所述地加瑞克药物物质通过包括以下步骤的方法获得：用乙酸终浓度6至40重量％的乙酸处理纯化的地加瑞克。

3.根据权利要求1或2所述的冻干的地加瑞克药物物质，所述药物物质在以20mg地加瑞克游离碱/ml含有2.5重量％甘露醇的水的量溶解于水后，显示1.15至2.0mPas的粘度。

4.根据权利要求1或2所述的冻干的地加瑞克药物物质，所述药物物质具有10重量％或更小的含水量。

5.一种生产根据权利要求1至4中任一项所述的地加瑞克药物物质的方法，所述方法包括以下步骤：

a.纯化通过液相或固相肽合成所获得的地加瑞克，以获得具有至少95％的纯度的地加瑞克溶液；

b.蒸发溶剂以浓缩所述地加瑞克溶液，以获得聚集的地加瑞克；

c.用乙酸将聚集的地加瑞克解聚，其中结束时的乙酸浓度在15至35体积％的范围内；和

d.冻干解聚的地加瑞克以提供所述地加瑞克药物物质。

6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤c中的温度在-5至30℃的范围内。

7.根据权利要求5和6中任一项所述的方法，其中地加瑞克游离碱的浓度在10至35g/l的范围内。

8.一种生产根据权利要求1至4中任一项所述的地加瑞克药物物质的方法，所述方法包括以下步骤：

b.将所述地加瑞克溶液加样于色谱柱；

c.用具有在27至37重量％范围内的浓度的乙酸从所述柱上洗脱地加瑞克以提供洗脱的地加瑞克；

d.冻干所述洗脱的地加瑞克以提供所述地加瑞克药物物质。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在冻干前将所述洗脱的地加瑞克过滤。

10.一种生产根据权利要求1至4中任一项所述的地加瑞克药物物质的方法，所述方法包括以下步骤：

b.如果需要，将纯化的地加瑞克溶液的乙酸浓度调整至6至40重量％；

c.喷雾干燥所述地加瑞克溶液以提供所述地加瑞克药物物质。

11.一种生产地加瑞克药品的方法，所述药品包含地加瑞克药物物质和甘露醇，其在以20mg地加瑞克游离碱/ml的量用注射用水重构后，显示至多15mPas的粘度，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据权利要求1至4中任一项所述的冻干的地加瑞克药物物质；

b.将所述冻干的地加瑞克药物物质溶解于含甘露醇的水中，提供含水地加瑞克-甘露醇混合物，其含有10-60g地加瑞克和10-60g甘露醇/1000g水；

c.冻干所述含水地加瑞克-甘露醇混合物以提供所述地加瑞克药品。

12.根据权利要求11所述的方法，所述地加瑞克药品在以20mg地加瑞克游离碱/ml的量用注射用水重构后，显示2至12mPas范围内的粘度。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述溶解步骤这样进行，以致于所述含水地加瑞克甘露醇混合物的粘度被保持在2.5mPas或更小。

14.一种控制冻干的地加瑞克产品的粘度不大于15mPas的方法，所述粘度是在以20mg地加瑞克游离碱/ml的量用注射用水重构后确定的，所述方法包括以下步骤：

a.提供根据权利要求中1至4中任一项所述的冻干的地加瑞克药物物质；

b.将所述冻干的地加瑞克药物物质溶解于含甘露醇的水，以提供含水地加瑞克-甘露醇混合物，其含有10-60g地加瑞克和10-60g甘露醇/1000g水；和

15.根据权利要求14所述的方法，所述地加瑞克产品的粘度在2至12mPas范围内。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中在冻干之前，所述溶解步骤接着过滤步骤和装填步骤。

17.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述冻干步骤包括低于塌陷温度的升华步骤。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述冻干步骤包括低于塌陷温度的升华步骤。