CN106109485A - 注射用水溶性维生素组合物和质控方法 - Google Patents

注射用水溶性维生素组合物和质控方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及注射用水溶性维生素组合物和质控方法。具体地说，本发明涉及注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物进行质量控制的方法，所述组合物中包含以下重量配比的组分：硝酸硫胺2.8～3.4mg、烟酰胺36～44mg、盐酸吡哆辛4.4～5.4mg、泛酸钠14.8～18.1mg、核黄素磷酸钠4.4～5.4mg、维生素C钠102～124mg、生物素54～66ug、叶酸0.36～0.44mg、4.5～6.0ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.4～0.6mg、甘氨酸250～350mg、乙二胺四醋酸二钠0.3～0.7mg。本发明还涉及所述组合物。本发明提供的方法具有如说明书所述优异效果。

Description

注射用水溶性维生素组合物和质控方法
技术领域
本发明属于制药工程技术领域，具体地说，涉及一种注射用水溶性维生素粉针剂药物组合物以及其质控方法，特别是涉及一种包含B族维生素的注射用水溶性维生素粉针剂药物组合物以及其质控方法。
背景技术
维生素是人和动物为维持正常的生理功能而必需的一类微量有机物质，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用，人和动物缺乏维生素时不能正常生长，并发生特异性病变，即所谓维生素缺乏症。
维生素又名维他命，通俗来讲，即维持生命的物质，是维持人体生命活动必须的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但不可或缺。各种维生素的化学结构以及性质虽然不同，但它们却有着以下共同点：①维生素均以维生素原(维生素前体)的形式存在于食物中。②维生素不是构成机体组织和细胞的组成成分，它也不会产生能量，它的作用主要是参与机体代谢的调节。③大多数的维生素，机体不能合成或合成量不足，不能满足机体的需要，必须经常通过食物中获得。④人体对维生素的需要量很小，日需要量常以毫克(mg)或微克(μg)计算，但一旦缺乏就会引发相应的维生素缺乏症，对人体健康造成损害。维生素与碳水化合物、脂肪和蛋白质3大物质不同，在天然食物中仅占极少比例，但又为人体所必需。有些维生素如B6和K等能由动物肠道内的细菌合成，合成量可满足动物的需要。动物细胞可将色氨酸转变成烟酸(一种B族维生素)，但生成量不敷需要；维生素C除灵长类(包括人类)及豚鼠以外，其他动物都可以自身合成。植物和多数微生物都能自己合成维生素，不必由体外供给。许多维生素是辅基或辅酶的组成部分。
维生素是人和动物营养、生长所必需的某些少量有机化合物，对机体的新陈代谢、生长、发育、健康有极重要作用。如果长期缺乏某种维生素，就会引起生理机能障碍而发生某种疾病。
维生素是人体代谢中必不可少的有机化合物。人体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。可以认为，最好的维生素是以“生物活性物质”的形式，存在于人体组织中。
维生素的发现是20世纪的伟大发现之一。1897年，艾克曼(ChrIstIan EIjkman)在爪哇发现只吃精磨的白米即可患脚气病，未经碾磨的糙米能治疗这种病。并发现可治脚气病的物质能用水或酒精提取，当时称这种物质为“水溶性B”。1906年证明食物中含有除蛋白质、脂类、碳水化合物、无机盐和水以外的“辅助因素”，其量很小，但为动物生长所必需。1911年卡西米尔·冯克(KazImIerzFunk)鉴定出在糙米中能对抗脚气病的物质是胺类(一类含氮的化合物)，它是维持生命所必需的，所以建议命名为“VItamIne”。即VItal(生命的)amIne(胺)，中文意思为“生命胺”。以后陆续发现许多维生素，它们的化学性质不同，生理功能不同，也发现许多维生素根本不含胺，不含氮，但丰克的命名延续使用下来了，只是将最后字母“e”去掉。最初发现的维生素B后来证实为维生素B复合体，经提纯分离发现，是几种物质，只是性质和在食品中的分布类似，且多数为辅酶。有的供给量须彼此平衡，如维生素B1、B2和PP，否则可影响生理作用。维生素B复合体包括：泛酸、烟酸、生物素、叶酸、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、吡哆醇(维生素B6)和氰钴胺(维生素B12)。有人也将胆碱、肌醇、对氨基苯酸(对氨基苯甲酸)、肉毒碱、硫辛酸包括在B复合体内。
维生素是一个大家族，目前已知就有二十多种，人们按其溶解性的不同，把维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类。脂溶性维生素包括A、D、E、K四种，水溶性维生素包括B族维生素(B1、B2、B6、B12等)及维生素C。
例如，现有临床上使用的注射用脂溶性维生素I粉针剂，其典型的配比为(例如1瓶量或半瓶量)：310～415μg维生素A、4.5～6.0μg维生素D2、2.9～3.5mg维生素E、90～120μg维生素K1；或者其典型的配比为(例如2瓶量或1瓶量)：690μg维生素A、10μg维生素D2、6.4mg维生素E、200μg维生素K1。
还例如，现有临床上使用的注射用脂溶性维生素II粉针剂，其典型的配比为(例如1瓶量或半瓶量)：445～595μg维生素A、2.25～3.00μg维生素D2、4.1～5.0mg维生素E、67.5～90.0μg维生素K1；或者其典型的配比为(例如1瓶量或半瓶量)：495μg维生素A、2.5μg维生素D2、4.55mg维生素E、75μg维生素K1；或者其典型的配比为(例如2瓶量或1瓶量)：990μg维生素A、5μg维生素D2、9.1mg维生素E、150μg维生素K1。
再例如，现有临床上使用的注射用水溶性维生素粉针剂，其每1瓶中含：硝酸硫胺2.8～3.4mg、烟酰胺36～44mg、盐酸吡哆辛4.4～5.4mg、泛酸钠14.8～18.1mg、核黄素磷酸钠4.4～5.4mg、维生素C钠102～124mg、生物素54～66ug、叶酸0.36～0.44mg、4.5～6.0ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.4～0.6mg。
胃肠外营养(Parenteral nutrItIon，PN)广泛用于多种疾病的治疗和手术期病人的营养支持，维生素作为新陈代谢的重要辅助因子，是胃肠外营养的主要成分。临床主要用于由于手术、大面积烧伤、骨 折及其他外伤、严重性感染症以及昏迷状态等原因不能进食，需经胃肠外摄取营养的患者。
注射用水溶性维生素粉针剂中的各活性物质是肠外营养不可缺少的组成部分之一，用以满足成人和儿童每日对水溶性维生素的生理需要。
由于注射用水溶性维生素粉针剂中的各活性物质存在稳定性不足的问题，并且成分复杂，其质量控制方法给本领域技术人员带来了巨大挑战。
因此，本领域仍然期待有新的方法以便有效地对注射用水溶性维生素粉针剂的质量进行控制。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有优异性能的质量控制方法以便有效地对注射用水溶性维生素粉针剂的质量进行控制。本发明人出人意料地发现，当使用本发明方法时，可以有效地改进产品的质控方法。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物，其中包含以下重量配比的组分：
硝酸硫胺2.8～3.4mg、
烟酰胺36～44mg、
盐酸吡哆辛4.4～5.4mg、
泛酸钠14.8～18.1mg、
核黄素磷酸钠4.4～5.4mg、
维生素C钠102～124mg、
生物素54～66ug、
叶酸0.36～0.44mg、
4.5～6.0ug维生素B12、
对羟基苯甲酸甲酯0.4～0.6mg、
甘氨酸250～350mg、
乙二胺四醋酸二钠0.3～0.7mg。
根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其中包含以下重量配比的组分：
硝酸硫胺2.9～3.4mg、
烟酰胺39～43mg、
盐酸吡哆辛4.7～5.3mg、
泛酸钠15.5～17.5mg、
核黄素磷酸钠4.8～5.3mg、
维生素C钠110～123mg、
生物素58～65ug、
叶酸0.38～0.43mg、
5.0～5.9ug维生素B12、
对羟基苯甲酸甲酯0.45～0.60mg、
甘氨酸275～325mg、
乙二胺四醋酸二钠0.4～0.6mg。
根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其中包含以下重量配比的组分：
硝酸硫胺3.1mg、
烟酰胺40mg、
盐酸吡哆辛4.9mg、
泛酸钠16.5mg、
核黄素磷酸钠4.9mg、
维生素C钠113mg、
生物素60ug、
叶酸0.4mg、
5.0ug维生素B12、
对羟基苯甲酸甲酯0.5mg、
甘氨酸300mg、
乙二胺四醋酸二钠0.5mg。
根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其中还包括酸碱调节剂。在一个实施方案中，所述的酸碱调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、或其组合。在一个实施方案中，所述的酸碱调节剂是盐酸溶液或者氢氧化钠溶液，例如1M盐酸溶液或者1M氢氧化钠溶液。
众所周知，经低温冷冻-真空干燥而获得的冷冻干燥粉针剂(通常简称为冻干粉针剂或冻干粉针)，其是首先将各物料用溶剂溶解(通常而言是用水溶解)，配制成一溶液，然后使该溶液进行低温冷冻，再进行抽真空、升华、干燥而获得的一种基本无水(通常而言水含量低于8％，特别是通常低于7％，特别是通常低于5％)的粉末状物或块状物。因此，该固体冻干物的酸碱度通常通过配制过程调节溶液的pH值来控制；或者可以通过处方调整以使获得的固体冻干物在规定的溶解/稀释程度下控制该溶解/稀 释液的pH值来控制(此称为控制固体冻干物的酸碱度)；后一方式通常更为普遍使用，例如药典中所载的诸多冻干粉针剂均以此方式控制制品的酸碱度，而这种方式控制产品的酸碱度通常可以不具体规定酸碱调节剂的处方量，而仅规定终产品的酸碱度即可。同样适用于本发明的是，根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂组合物，其中所述任选的酸碱调节剂的量是，使在冷冻干燥之前的药液的pH值在5.5～6.5范围内的量，例如该溶液的pH值在5.6～6.1范围内的量。
根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其由西林瓶密封包装。
根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其水分含量低于10％，优选低于8％，优选低于7％，更优选低于5％。
根据本发明第一方面任一实施方案的组合物，其基本上是照如下方法制备得到的：
(1)称取12种物料，加入注射用水(其量是硝酸硫胺重量的800倍)，搅拌均匀，用1mol/L的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至5.7～6.0，原辅料完全溶解，补加注射用水至硝酸硫胺重量的1000倍，加入药液体积计0.1w/v％的活性炭进行吸附30min，过滤脱碳，用酸碱调节剂调节溶液的pH值5.7～6.0；
(2)经0.22μm聚四氟乙烯滤芯过滤除菌，分装到玻璃瓶中，每瓶含硝酸硫胺3mg；
(3)置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，密塞，即得。
进一步的，本发明第二方面提供了对注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物进行质量控制的方法，所述组合物中包含以下重量配比的组分：
硝酸硫胺2.8～3.4mg、
烟酰胺36～44mg、
盐酸吡哆辛4.4～5.4mg、
泛酸钠14.8～18.1mg、
核黄素磷酸钠4.4～5.4mg、
维生素C钠102～124mg、
生物素54～66ug、
叶酸0.36～0.44mg、
4.5～6.0ug维生素B12、
对羟基苯甲酸甲酯0.4～0.6mg、
甘氨酸250～350mg、
乙二胺四醋酸二钠0.3～0.7mg；
该方法包括对所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物进行酸度检查、干燥失重检查、 溶解度检查、细菌内毒素检查、无菌检查、装量差异检查、可见异物检查、不溶性微粒检查。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述的酸度检查操作过程为：取供试品3瓶，加新沸冷水30ml溶解后，置50ml烧杯中，混匀，在校准后的pH计上测定。通常而言，要求注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂供试品的pH值应在5.7～6.0范围内。因此，该酸度检查时还包括确定产品酸度是否符合规定的判断过程，即，如果测定的pH值在5.7～6.0范围内，则产品酸度符合规定，否则不符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述的干燥失重检查操作过程为：取在80℃减压干燥至恒重的空称瓶，精密称定瓶重(M1)，向瓶中加入供试品(精密称定供试品1.0g)，称重(M2)；以五氧化二磷为干燥剂，在电热真空干燥箱80℃减压干燥4小时，称重(M3)；按下式计算减失重量：
通常而言，要求注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂供试品的干燥失重不超过1.5％。因此，该干燥失重检查时还包括确定产品干燥失重是否符合规定的判断过程，即，如果测定的干燥失重不超过1.5％，则干燥失重酸度符合规定，否则不符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述的溶解度检查操作过程为：取供试品1瓶，加入10ml注射用水，观察是否能在10分钟内完全溶解。一般地讲，如果能在10分钟内完全溶解，则本发明的注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂供试品的溶解度符合规定，否则不符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述的细菌内毒素检查操作过程为：
供试液的配制：取供试品1瓶，加细菌内毒素检查用水5ml溶解并稀释，混匀，取0.5ml置试管中加细菌内毒素检查用水2ml混匀，即得；
供试液(1)的配制：取供试液0.5ml至试管中，加细菌内毒素检查用水0.5ml稀释，混匀，即得；
细菌内毒素工作标准对照液的配制：取10EU/支细菌内毒素工作标准品1支，加细菌内毒素检查用水5ml，稀释成2.0EU/ml的细菌内毒素工作标准对照液；精密取0.5ml，加细菌内毒素检查用水0.5ml，稀释成1.0EU/ml的细菌内毒素工作标准对照液；
供试品阳性对照液的配制：取2.0EU/ml细菌内毒素工作标准对照液0.5ml，加供试液0.5ml，稀释成1.0EU/ml的供试品阳性对照液；
鲎试剂溶液的配制：取鲎试剂8支，加细菌内毒素检查用水0.8ml，混匀，即得；
按照下表加样：
将试管内溶液轻轻混匀，立即封闭管口，垂直放入37±1°恒温仪中，保温60分钟±2分钟后，将试管从恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°；
结果判断：样品管、阴性对照管为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管为阳性，即每瓶中含细菌内毒素量不超过25EU，此时判为符合规定，否则不符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述的无菌检查操作过程为：
沉降菌测定：取3个胰酪大豆胨琼脂培养基平皿，放置在操作台左、中、右三个点，考察工作台面菌落数；考察方案为：①实验时间大于4小时，考察时间为4小时，②实验时间小于4小时，考察时间为实验全过程；考察完毕，将沉降菌考察平皿和阴性对照平皿置30℃～35℃培养3天，观察菌落并计数；操作台平均菌落数应小于1个；
菌液制备：用0.9％氯化钠溶液10倍稀释金黄色葡萄球菌至每1ml中小于100cfu的菌液；分别取菌液1ml，加入2个平皿中，每皿倾注15～20ml胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固后置30℃～35℃培养72h，观察菌落并计数；金黄色葡萄球菌液的平均菌落数应小于100cfu；
供试品制备：取供试品60支，用300ml 0.1％灭菌蛋白胨溶液边溶解，边注入集菌器，过滤，分别将硫乙醇酸盐流体培养基200ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml注入相应滤筒内；2筒加硫乙醇酸盐流体培养基，另一筒加胰酪大豆胨液体培养基，每筒100ml；
供试品阳性对照制备：将一筒硫乙醇酸盐流体培养基转入阳性接种室，接种1ml金黄色葡萄球菌液，小于100cfu的菌液；
供试品阴性对照制备：以无菌操作注入300ml的0.1％灭菌蛋白胨溶液至集菌器，过滤，去除一个集菌管，其余两管分别注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml；
实验完毕后，将硫乙醇酸盐流体培养基置30℃～35℃培养，胰酪大豆胨液体培养基置20℃～25℃培养；阳性对照培养72h，供试品培养14天，逐日观察实验结果并记录；
结果判断：阳性对照管72h内应生长良好，阴性对照管无菌生长，供试品管无菌生长，满足此结果判为符合规定，否则不符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述的装量差异检查操作过程为：取供试品5瓶，除去标签、铝盖，容器外壁用乙醇擦净，干燥，开启内塞时要小心，使容器内外气压平衡，盖紧后精密称定重量。倾出内容物，用水洗净后再用乙醇淌洗；待晾干后称取每瓶重量，求出每瓶的装量与平均装量。一般 而言，每瓶的装量与平均装量相比较，5瓶装量均在±6.5％上下限范围内，则判为符合规定；若1瓶不符合规定，另取10瓶复测符合规定，则判为符合规定，否则认为不符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述的可见异物检查操作过程为：
取供试品5瓶，分别加经0.45um微孔滤膜过滤的纯化水5ml溶解，在澄明度检测仪上2000～3000lx照度下，手持供试品颈部，轻轻旋转和翻转容器，避免产生气泡，使药液中可能存在的可见异物悬浮，分别在黑色和白色背景下目视检查。
一般的粉针剂结果判断方式为：供试品中不得检出金属屑、玻璃屑、长度超过2mm的纤维、最大粒径超过2mm的块状物以及静置一定时间后轻轻旋转时肉眼可见的烟雾状微粒沉积物、无法计数的微粒群或摇不散的沉淀；5瓶供试品均未检出明显可见异物，供试品中如检出点状物、2mm以下的短纤维和块状物等微细可见异物，微细可见异物不超过3个/瓶；以上两项均合格，则判为符合规定；5瓶中有1瓶不符合规定，另取10瓶同法复试均符合规定，则判为“符合规定”。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述的不溶性微粒检查操作过程为：
取供试品4瓶，每瓶加微粒检查用水10ml溶解，摇匀，合并溶液，静置2分钟或适当时间脱气泡后在不溶性微粒检测仪上检测。一般的粉针剂结果判断方式为：供试品每瓶含10μm及10μm以上的微粒数未过5000粒，含25μm及25μm以上的微粒数未过500粒，则判为“符合规定”。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，该方法还包括对所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物中的烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠和核黄素磷酸钠进行含量测定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述对烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠和核黄素磷酸钠进行含量测定包括以下操作：
色谱条件与系统适用性试验：用氨基键合多孔硅胶为填料；以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(27：73)用10％盐酸溶液调节pH为5.3的溶液为流动相，流速：烟酰胺组1.0ml/min，核黄素磷酸钠1.5ml/min，检测波长：烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠为214nm；核黄素磷酸钠用荧光检测λEX＝445nm、λEM＝520nm；各组分的分离度应大于1.5；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异检查中的内容物约2瓶重量，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取15ml置200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；
(1)取硝酸硫胺对照品约12mg、盐酸吡哆辛对照品约18mg、泛酸钠对照品62mg，精密称定，置50ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇匀，作为对照品储备液①，同法制得对照品储备液②；取烟酰胺对照品约 6mg、维生素C钠对照品约17mg，精密称定，置100ml量瓶中，再精密量取对照品储备液①2ml置上述100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
(2)取核黄素磷酸钠对照品约19mg，精密称定，置50ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为核黄素磷酸钠对照品溶液①，同法制得核黄素磷酸钠对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液制备后，应立即进样，各取10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：
用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
S对照品：对照品峰面积，S样品：供试品中相应组分的峰面积，
M对照品：对照品称样量，M供试品：供试品称样量，
N对照品：对照品稀释倍数，N供试品：供试品稀释倍数，
B平均装量：平均装量，C对：对照品的含量；
结果判断：每瓶中各成分实际测定的量在理论量的90～120％范围内时，判为符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，该方法还包括对所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物中的叶酸、生物素、对羟基苯甲酸甲酯进行含量测定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述对叶酸、生物素、对羟基苯甲酸甲酯进行含量测定包括以下操作：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；磷酸二氢钾缓冲液[精密称取磷酸二氢钾(KH2PO4)2.27g和磷酸0.96g，加水溶解并稀释至5000ml]-乙腈(93：7)用磷酸调节pH值至3.0为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为200nm，各组分的分离度应大于1.5；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异检查中的内容物约1瓶重量，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；
(1)取叶酸对照品约16mg，精密称定，置50ml量瓶中用2mmol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度摇匀， 作为对照品储备液A①，同法制得对照品储备液A②；取生物素对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙醇-水(1﹕3)混合液溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液B①，同法制得对照品储备液B②；精密量取对照品储备液A①5ml和B①2ml，置同一100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液①，再精密量取对照品储备液A②5ml和B②2ml，同法操作制得对照品溶液②；
(2)取对羟基苯甲酸甲酯对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中用乙醇-水(1﹕3)混合液溶解并稀释至刻度，精密量取5ml置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液配制后，应立即进样，各取20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：
用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
S对照品：对照品峰面积，S样品：供试品中相应组分的峰面积，
M对照品：对照品称样量，M供试品：供试品称样量，
N对照品：对照品稀释倍数，N供试品：供试品稀释倍数，
B平均装量：平均装量，C对：对照品的含量；
结果判断：每瓶中各成分实际测定的量在理论量的90～120％范围内时，判为符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，该方法还包括对所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物中的维生素B12进行含量测定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述对维生素B12进行含量测定包括以下操作：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；梯度洗脱：流动相A：精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解后加乙腈125ml，用水稀释至1000ml，pH值为7.5；流动相B：水-乙腈-磷酸(499：499：2)；
检测波长360nm，柱温40℃，维生素B12与未知峰之间的分离度应大于1.0；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异项下的内容物约5瓶重量，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；精密称取维生素B12对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中用水溶解并稀释至刻度摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液配制后，应立即进样，各取30μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：
用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
S对照品：维生素B12对照品峰面积，S样品：供试品中维生素B12峰面积，
M对照品：维生素B12对照品称样量，M供试品：供试品称样量，
N对照品：维生素B12对照品稀释倍数，N供试品：供试品稀释倍数，
B平均装量：平均装量，C对：对照品的含量；
结果判断：每瓶中维生素B12实际测定的量在理论量的90～130％范围内时，判为符合规定。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述对维生素B12进行含量测定时，所用的流动相A和流动相B中还添加剂有酒石酸。酒石酸在流动相A和流动相B中的浓度为5mmol/L。已经出人意料地发现，当向流动相中添加适量的酒石酸后，不但可以大大提高维生素B12与未知峰之间的分离度，而且可以显著提高维生素B12的精密度。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述组合物中包含以下重量配比的组分：
硝酸硫胺2.9～3.4mg、
烟酰胺39～43mg、
盐酸吡哆辛4.7～5.3mg、
泛酸钠15.5～17.5mg、
核黄素磷酸钠4.8～5.3mg、
维生素C钠110～123mg、
生物素58～65ug、
叶酸0.38～0.43mg、
5.0～5.9ug维生素B12、
对羟基苯甲酸甲酯0.45～0.60mg、
甘氨酸275～325mg、
乙二胺四醋酸二钠0.4～0.6mg。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述组合物中包含以下重量配比的组分：
硝酸硫胺3.1mg、
烟酰胺40mg、
盐酸吡哆辛4.9mg、
泛酸钠16.5mg、
核黄素磷酸钠4.9mg、
维生素C钠113mg、
生物素60ug、
叶酸0.4mg、
5.0ug维生素B12、
对羟基苯甲酸甲酯0.5mg、
甘氨酸300mg、
乙二胺四醋酸二钠0.5mg。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述组合物中还包括酸碱调节剂。在一个实施方案中，所述的酸碱调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、或其组合。在一个实施方案中，所述的酸碱调节剂是盐酸溶液或者氢氧化钠溶液，例如1M盐酸溶液或者1M氢氧化钠溶液。
众所周知，经低温冷冻-真空干燥而获得的冷冻干燥粉针剂(通常简称为冻干粉针剂或冻干粉针)，其是首先将各物料用溶剂溶解(通常而言是用水溶解)，配制成一溶液，然后使该溶液进行低温冷冻，再进行抽真空、升华、干燥而获得的一种基本无水(通常而言水含量低于8％，特别是通常低于7％，特别是通常低于5％)的粉末状物或块状物。因此，该固体冻干物的酸碱度通常通过配制过程调节溶液的pH值来控制；或者可以通过处方调整以使获得的固体冻干物在规定的溶解/稀释程度下控制该溶解/稀 释液的pH值来控制(此称为控制固体冻干物的酸碱度)；后一方式通常更为普遍使用，例如药典中所载的诸多冻干粉针剂均以此方式控制制品的酸碱度，而这种方式控制产品的酸碱度通常可以不具体规定酸碱调节剂的处方量，而仅规定终产品的酸碱度即可。同样适用于本发明的是，根据本发明第一方面任一实施方案所述的冻干粉针剂组合物，其中所述任选的酸碱调节剂的量是，使在冷冻干燥之前的药液的pH值在5.5～6.5范围内的量，例如该溶液的pH值在5.6～6.1范围内的量。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂组合物由西林瓶密封包装。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂组合物的水分含量低于10％，优选低于8％，优选低于7％，更优选低于5％。
根据本发明第二方面任一实施方案的方法，所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂组合物基本上是照如下方法制备得到的：
(1)称取12种物料，加入注射用水(其量是硝酸硫胺重量的800倍)，搅拌均匀，用1mol/L的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至5.7～6.0，原辅料完全溶解，补加注射用水至硝酸硫胺重量的1000倍，加入药液体积计0.1w/v％的活性炭进行吸附30min，过滤脱碳，用酸碱调节剂调节溶液的pH值5.7～6.0；
(2)经0.22μm聚四氟乙烯滤芯过滤除菌，分装到玻璃瓶中，每瓶含硝酸硫胺3mg；
(3)置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，密塞，即得。
在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。
下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
冷冻干燥粉针剂的制备过程是本领域技术人员公知的制药工艺，例如如下冻干曲线A和冻干曲线B所示的两种示意性的冻干曲线：
在下文制备冷冻干燥粉针剂中的具体实例中，如未另外特别说明，所用的冻干曲线是冻干曲线A。另外，两种冻干曲线均可以适用于注射用水溶性维生素与注射用脂溶性维生素II两种粉针剂。
冷冻干燥粉针剂中的水含量是一般在8％以下，优选低于7％，更优选低于5％。水分控制可通过 适当调整冷冻干燥程序来控制。该冷冻干燥粉针剂中的水分含量可根据许多已知方法来测定，例如干燥失重法。
上述水含量的指标，以及本发明上下文其它指标例如固形物含量等指标，这些指标所列明的数值范围，如果没有特别说明，是适用于两种粉针剂的。
在本发明中，为了在必要时调节药液的pH值，可以向组合物中加入适当的pH调节剂或酸碱调节剂。尽管本发明人仅用不具缓冲能力的强酸或强碱溶液例如氢氧化钠水溶液和盐酸水溶液进行调节，然而，本领域技术人员理解，如果用这种不具缓冲能力的pH调节剂处理能满足体系的pH要求，则具有缓冲能力的pH调节剂将更加能够实现本发明目的，因此这些缓冲剂不但能够调节pH值，而且能稳定pH值。因此本发明所列任一pH调节剂或其组合均包括在本发明精神和范围内。
在制备本发明冻干粉针剂时，所配制的药液中，固形物含量是为1～20％(w/v)，优选2～15％(w/v)，例如2～8％，例如8～15％，例如4～10％。由于冻干粉针剂通常是在管状西林瓶中进行冷冻干燥得到，本领域技术人员理解这种产品在获得成品甚至在供医生使用之前，通常均呈现一个圆饼状，尽管该圆饼的体积理论上讲会比原有水溶液的体积少(稍有缩小)，然而通常这种缩小通常不会缩小到原水溶液体积50％，通常会在原水溶液体积的80-120％之间，更通常在原水溶液体积的90-100％之间，而从终产品西林瓶内可观察到原水溶液液面痕迹(主体饼状物因冻干缩小后残留在瓶壁上的液面痕迹，即便西林瓶中的冻干品因各种原因例如碰撞等原因而呈粉末状，通常仍然可以保留原有的液面痕迹)，据此痕迹亦可估计出该冷冻干燥组合物在冷冻干燥之前的水溶液体积。因此，虽然本发明提供的是一种基本无水的冷冻干燥粉针剂，然而根据该粉针剂仍然可以大致估计出其在配制时，至少在冷冻干燥开始之前的药液体积，根据该估计出的体积以及西林瓶中的干燥终产物的重量，亦可计算到在制备本发明冻干粉针剂时，所配制的药液中的固形物的含量。因此，根据本发明第一方面的冻干粉针剂，其在配制时的药液的固形物含量为1～20％(w/v)，优选2～15％(w/v)，例如2～8％，例如8～15％，例如4～10％。
在本发明中，符号％，根据其所使用的语境，可以具有本领域技术人员容易理解的含义。例如在提及固形物含量时，该符号表示重量/体积的百分数(w/v，例如g/100ml)；又例如在提及冷冻干燥粉针剂中的“水含量”时，例如水含量在8％以下，此时该符号％表示重量/重量的百分数(w/w，g/100g)。一般而言，在固体分散在液体中时，％表示重量/体积百分数；在固体分散在固体中或者液体分散在固体中(例如粉针的含水量)时，％表示重量/重量百分数。在其它情况下，如无另外说明，符号％表示重量/重量百分数。
在配制本发明的药液时，本领域技术人员公知，可使用例如约0.45um的微孔滤膜进行粗滤过滤，在将药液灌装到西林瓶中之前，可以使用例如约0.22μm的微孔滤膜进行精滤过滤以除菌，必要时可以过滤多次。
根据本发明的冻干粉针剂，其为冷冻干燥粉针剂。在一个实施方案中，该水溶性维生素冷冻干燥粉针剂为单剂量制剂(例如西林瓶装的粉针剂)，每一单位剂量中活性化合物的量，以硝酸硫胺计，可以例如但不限于约2.0mg、约2.5mg、约3.0mg、约3.5mg、约4.0mg、约4.5mg、约5.0mg。
根据本发明的冻干粉针剂，其用注射用水复溶，通常而言复溶时间在30秒内，优选在20秒内，更优选在15秒内。
根据本发明的水溶性维生素冷冻干燥粉针剂冻干粉针剂，其用水制成每1ml中含0.3mg硝酸硫胺的溶液并根据中国药典2010年版二部附录VIH项下的方法测定，该溶液的pH值为5.6～6.1。
本发明提供的冻干粉针剂可以在在20℃以下干燥处保存至少18个月，可以满足一般的冷冻干燥粉针剂的贮藏要求。
注射用水溶性维生素，成人和体重10kg以上儿童，每日一瓶；新生儿及体重不满10kg的儿童，每日需要量为每公斤体重1ml(用下列溶液10ml溶解后)，静脉滴注。在无菌条件下，在配伍性得到保证时本品可用下列溶液10ml加以溶解：(1)脂溶性维生素注射液(II)(供成人和十一岁以上的儿童使用)；(2)复方脂溶性维生素注射液(I)(供十一岁以下的儿童使用)；(3)脂肪乳注射液；(4)无电解质的葡萄糖注射液；5、注射用水；用上述(1)、(2)和(3)配制的混合液需加入脂肪乳注射液后再经静脉输注，而用方法(4)或(5)配制的混合液可加入脂肪乳注射液中也可加入葡糖糖注射液中再经静脉输注。本品溶解后，应在无菌条件下立即加入输液中，并在24小时内用完。
本发明具有如本发明所述有益效果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。任何依据本发明构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明的技术方案范畴。
在下面的例子中，如未另外说明，制备粉针剂时是使用同一批次的原料药和辅料。
在下面的例子中，使用的pH调节剂(在本发明中亦即酸碱调节剂)，如无另外说明，是1M氢氧化钠溶液或者1M盐酸溶液，其用量是使制备粉针剂时，使冷冻干燥前所配制的溶液的pH值调节至某一规定值或范围。下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明制备冻干粉针剂的方法。在下面配液制备各 种组合物中，如未另外说明，每批的总配液量为2000ml，但是列明配方时，均以每瓶中的物料含量阐明。以下实例中使用到乙醇时，如未特别说明，均是指95％乙醇。
实施例1：制备注射用水溶性维生素组合物
每瓶重量配比：硝酸硫胺3.1mg、烟酰胺40mg、盐酸吡哆辛4.9mg、泛酸钠16.5mg、核黄素磷酸钠4.9mg、维生素C钠113mg、生物素60ug、叶酸0.4mg、5.0ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.5mg、甘氨酸300mg、乙二胺四醋酸二钠0.5mg。
制法：
(1)称取12种物料，加入注射用水(其量是硝酸硫胺重量的800倍)，搅拌均匀，用1mol/L的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至5.7～6.0，原辅料完全溶解，补加注射用水至硝酸硫胺重量的1000倍，加入药液体积计0.1w/v％的活性炭进行吸附30min，过滤脱碳，用酸碱调节剂调节溶液的pH值5.7～6.0；
(2)经0.22μm聚四氟乙烯滤芯过滤除菌，分装到玻璃瓶中，每瓶含硝酸硫胺3mg；
(3)置冷冻干燥机中进行冷冻干燥，密塞，即得。
实施例2：制备注射用水溶性维生素组合物
每瓶重量配比：硝酸硫胺3.4mg、烟酰胺39mg、盐酸吡哆辛5.3mg、泛酸钠15.5mg、核黄素磷酸钠5.3mg、维生素C钠110mg、生物素65ug、叶酸0.38mg、5.9ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.45mg、甘氨酸325mg、乙二胺四醋酸二钠0.4mg。
制法：照实施例1进行，但是采用冻干曲线B进行冷冻干燥。
实施例3：制备注射用水溶性维生素组合物
每瓶重量配比：硝酸硫胺2.9mg、烟酰胺43mg、盐酸吡哆辛4.7mg、泛酸钠17.5mg、核黄素磷酸钠4.8mg、维生素C钠123mg、生物素58ug、叶酸0.43mg、5.0ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.60mg、甘氨酸275mg、乙二胺四醋酸二钠0.6mg。
制法：照实施例1进行。
实施例4：制备注射用水溶性维生素组合物
每瓶重量配比：硝酸硫胺2.8mg、烟酰胺44mg、盐酸吡哆辛4.4mg、泛酸钠18.1mg、核黄素磷酸钠4.4mg、维生素C钠124mg、生物素54ug、叶酸0.44mg、4.5ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.6mg、甘氨酸350mg、乙二胺四醋酸二钠0.3mg；
制法：照实施例1进行。
实施例5：制备注射用水溶性维生素组合物
每瓶重量配比：硝酸硫胺3.4mg、烟酰胺36mg、盐酸吡哆辛5.4mg、泛酸钠14.8mg、核黄素磷酸钠 45.4mg、维生素C钠102mg、生物素66ug、叶酸0.36mg、6.0ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.4mg、甘氨酸350mg、乙二胺四醋酸二钠0.3mg；
制法：照实施例1进行。
下面的各试验例对实施例1-5所得粉针剂进行质量检测。
试验例1：对粉针剂进行酸度检查
取供试品3瓶，加新沸冷水30ml溶解后，置50ml烧杯中，混匀，在校准后的pH计上测定。通常而言，要求注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂供试品的pH值应在5.7～6.0范围内。因此，该酸度检查时还包括确定产品酸度是否符合规定的判断过程，即，如果测定的pH值在5.7～6.0范围内，则产品酸度符合规定，否则不符合规定。
试验例2：对粉针剂进行干燥失重检查
取在80℃减压干燥至恒重的空称瓶，精密称定瓶重(M1)，向瓶中加入供试品(精密称定供试品1.0g)，称重(M2)；以五氧化二磷为干燥剂，在电热真空干燥箱80℃减压干燥4小时，称重(M3)；按下式计算减失重量：
通常而言，要求注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂供试品的干燥失重不超过1.5％。因此，该干燥失重检查时还包括确定产品干燥失重是否符合规定的判断过程，即，如果测定的干燥失重不超过1.5％，则干燥失重酸度符合规定，否则不符合规定。
试验例3：对粉针剂进行溶解度检查
取供试品1瓶，加入10ml注射用水，观察是否能在10分钟内完全溶解。一般地讲，如果能在10分钟内完全溶解，则本发明的注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂供试品的溶解度符合规定，否则不符合规定。
试验例4：对粉针剂进行细菌内毒素检查
供试液的配制：取供试品1瓶，加细菌内毒素检查用水5ml溶解并稀释，混匀，取0.5ml置试管中加细菌内毒素检查用水2ml混匀，即得；
供试液(1)的配制：取供试液0.5ml至试管中，加细菌内毒素检查用水0.5ml稀释，混匀，即得；
细菌内毒素工作标准对照液的配制：取10EU/支细菌内毒素工作标准品1支，加细菌内毒素检查用水5ml，稀释成2.0EU/ml的细菌内毒素工作标准对照液；精密取0.5ml，加细菌内毒素检查用水0.5ml，稀释成1.0EU/ml的细菌内毒素工作标准对照液；
供试品阳性对照液的配制：取2.0EU/ml细菌内毒素工作标准对照液0.5ml，加供试液0.5ml，稀释成1.0EU/ml的供试品阳性对照液；
鲎试剂溶液的配制：取鲎试剂8支，加细菌内毒素检查用水0.8ml，混匀，即得；
按照下表加样：
将试管内溶液轻轻混匀，立即封闭管口，垂直放入37±1°恒温仪中，保温60分钟±2分钟后，将试管从恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°；
结果判断：样品管、阴性对照管为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管为阳性，即每瓶中含细菌内毒素量不超过25EU，此时判为符合规定，否则不符合规定。
试验例5：对粉针剂进行无菌检查
沉降菌测定：取3个胰酪大豆胨琼脂培养基平皿，放置在操作台左、中、右三个点，考察工作台面菌落数；考察方案为：①实验时间大于4小时，考察时间为4小时，②实验时间小于4小时，考察时间为实验全过程；考察完毕，将沉降菌考察平皿和阴性对照平皿置30℃～35℃培养3天，观察菌落并计数；操作台平均菌落数应小于1个；
菌液制备：用0.9％氯化钠溶液10倍稀释金黄色葡萄球菌至每1ml中小于100cfu的菌液；分别取菌液1ml，加入2个平皿中，每皿倾注15～20ml胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固后置30℃～35℃培养72h，观察菌落并计数；金黄色葡萄球菌液的平均菌落数应小于100cfu；
供试品制备：取供试品60支，用300ml 0.1％灭菌蛋白胨溶液边溶解，边注入集菌器，过滤，分别将硫乙醇酸盐流体培养基200ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml注入相应滤筒内；2筒加硫乙醇酸盐流体培养基，另一筒加胰酪大豆胨液体培养基，每筒100ml；
供试品阳性对照制备：将一筒硫乙醇酸盐流体培养基转入阳性接种室，接种1ml金黄色葡萄球菌液，小于100cfu的菌液；
供试品阴性对照制备：以无菌操作注入300ml的0.1％灭菌蛋白胨溶液至集菌器，过滤，去除一个集菌管，其余两管分别注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml；
实验完毕后，将硫乙醇酸盐流体培养基置30℃～35℃培养，胰酪大豆胨液体培养基置20℃～25℃培养；阳性对照培养72h，供试品培养14天，逐日观察实验结果并记录；
结果判断：阳性对照管72h内应生长良好，阴性对照管无菌生长，供试品管无菌生长，满足此结果判为符合规定，否则不符合规定。
试验例6：对粉针剂进行装量差异检查
取供试品5瓶，除去标签、铝盖，容器外壁用乙醇擦净，干燥，开启内塞时要小心，使容器内外气压平衡，盖紧后精密称定重量。倾出内容物，用水洗净后再用乙醇淌洗；待晾干后称取每瓶重量，求出每瓶的装量与平均装量。一般而言，每瓶的装量与平均装量相比较，5瓶装量均在±6.5％上下限范围内，则判为符合规定；若1瓶不符合规定，另取10瓶复测符合规定，则判为符合规定，否则认为不符合规定。
试验例7：对粉针剂进行可见异物检查
取供试品5瓶，分别加经0.45um微孔滤膜过滤的纯化水5ml溶解，在澄明度检测仪上2000～3000lx照度下，手持供试品颈部，轻轻旋转和翻转容器，避免产生气泡，使药液中可能存在的可见异物悬浮，分别在黑色和白色背景下目视检查。
一般的粉针剂结果判断方式为：供试品中不得检出金属屑、玻璃屑、长度超过2mm的纤维、最大粒径超过2mm的块状物以及静置一定时间后轻轻旋转时肉眼可见的烟雾状微粒沉积物、无法计数的微粒群或摇不散的沉淀；5瓶供试品均未检出明显可见异物，供试品中如检出点状物、2mm以下的短纤维和块状物等微细可见异物，微细可见异物不超过3个/瓶；以上两项均合格，则判为符合规定；5瓶中有1瓶不符合规定，另取10瓶同法复试均符合规定，则判为“符合规定”。
试验例8：对粉针剂进行不溶性微粒检查
取供试品4瓶，每瓶加微粒检查用水10ml溶解，摇匀，合并溶液，静置2分钟或适当时间脱气泡后在不溶性微粒检测仪上检测。一般的粉针剂结果判断方式为：供试品每瓶含10μm及10μm以上的微粒数未过5000粒，含25μm及25μm以上的微粒数未过500粒，则判为“符合规定”。
在上述试验例1-8中，对实施例1-5的五批粉针进行检查，结果各项指标均符合规定。
试验例9：使用HPLC法对粉针剂中的维生素B12进行含量测定
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；梯度洗脱：流动相A：精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解后加乙腈125ml，用水稀释至1000ml，pH值为7.5；流动相B：水-乙腈-磷酸(499：499：2)；
时间(min) 流动相A(％v/v) 流动相B(％v/v) 流速(ml/min)
0-13 100 0 1.2
13-28 0 100 1.5
28-38 100 0 1.2
检测波长360nm，柱温40℃，维生素B12与未知峰之间的分离度应大于1.0；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异项下的内容物约5瓶重量，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；精密称取维生素B12对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中用水溶解并稀释至刻度摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液配制后，应立即进样，各取30μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：
用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
S对照品：维生素B12对照品峰面积，S样品：供试品中维生素B12峰面积，
M对照品：维生素B12对照品称样量，M供试品：供试品称样量，
N对照品：维生素B12对照品稀释倍数，N供试品：供试品稀释倍数，
B平均装量：平均装量，C对：对照品的含量；
结果判断：每瓶中维生素B12实际测定的量在理论量的90～130％范围内时，判为符合规定。
在上述试验例9中，对实施例1-5的五批粉针进行含量测定，结果各项指标均符合规定。测定结果显示，维生素B12与未知峰之间的分离度在1.2～1.4范围内。通常而言，药典规定目的峰与最近峰之间的分离度应大于1.5，但是在分离度不理想的情况下可以适当降低要求，例如本领域中在对注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物中的维生素B12进行含量测定时，就适当降低了要求，规定分离度大于1.0即可。
另外，在上述试验例9中，对实施例1-5的五批粉针进行检查，每一样品HPLC进行测定5次，计算5次测定时主成份维生素B12峰面积的相对标准偏差，其能够反映测定结果的精密度。结果显示，对于全部5批样品，它们重复测定5次的峰面积的相对标准偏差均在1.4～1.9％范围内，呈现较大的差异，尽管本领域尚可接受，但是并不令人满意。
补充试验：参照试验例9的方法，使用HPLC法对粉针剂中的维生素B12进行含量测定，不同的仅是在所用的流动相A和流动相B中还添加剂有酒石酸，酒石酸在流动相A和流动相B中的浓度为5mmol/L，对实施例1-5的五批粉针进行含量测定。结果：维生素B12与未知峰之间的分离度在1.9～2.1范围内，分离 度明显地有改善；全部5批样品，它们重复测定5次的峰面积的相对标准偏差均在0.33～0.56％范围内，精密度有显著的改善。在流动相中添加适量酒石酸能改善HPLC的分离度和精密度，这是现有技术根本无法预见的。
试验例10：使用HPLC法对粉针剂中的烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠和核黄素磷酸钠进行含量测定
色谱条件与系统适用性试验：用氨基键合多孔硅胶为填料；以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(27：73)用10％盐酸溶液调节pH为5.3的溶液为流动相，流速：烟酰胺组1.0ml/min，核黄素磷酸钠1.5ml/min，检测波长：烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠为214nm；核黄素磷酸钠用荧光检测λEX＝445nm、λEM＝520nm；各组分的分离度应大于1.5；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异检查中的内容物约2瓶重量，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取15ml置200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；
(1)取硝酸硫胺对照品约12mg、盐酸吡哆辛对照品约18mg、泛酸钠对照品62mg，精密称定，置50ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇匀，作为对照品储备液①，同法制得对照品储备液②；取烟酰胺对照品约6mg、维生素C钠对照品约17mg，精密称定，置100ml量瓶中，再精密量取对照品储备液①2ml置上述100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
(2)取核黄素磷酸钠对照品约19mg，精密称定，置50ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为核黄素磷酸钠对照品溶液①，同法制得核黄素磷酸钠对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液制备后，应立即进样，各取10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
S对照品：对照品峰面积，S样品：供试品中相应组分的峰面积，
M对照品：对照品称样量，M供试品：供试品称样量，
N对照品：对照品稀释倍数，N供试品：供试品稀释倍数，
B平均装量：平均装量，C对：对照品的含量；
结果判断：每瓶中各成分实际测定的量在理论量的90～120％范围内时，判为符合规定。
在上述试验例10中，对实施例1-5的五批粉针进行含量测定，结果各项指标均符合规定，每瓶中各成分实际测定的量在理论量的98～109％范围内。
试验例11：使用HPLC法对粉针剂中的叶酸、生物素、对羟基苯甲酸甲酯进行含量测定
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；磷酸二氢钾缓冲液[精密称取磷酸二氢钾(KH2PO4)2.27g和磷酸0.96g，加水溶解并稀释至5000ml]-乙腈(93：7)用磷酸调节pH值至3.0为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为200nm，各组分的分离度应大于1.5；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异检查中的内容物约1瓶重量，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；
(1)取叶酸对照品约16mg，精密称定，置50ml量瓶中用2mmol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度摇匀，作为对照品储备液A①，同法制得对照品储备液A②；取生物素对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙醇-水(1﹕3)混合液溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液B①，同法制得对照品储备液B②；精密量取对照品储备液A①5ml和B①2ml，置同一100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液①，再精密量取对照品储备液A②5ml和B②2ml，同法操作制得对照品溶液②；
(2)取对羟基苯甲酸甲酯对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中用乙醇-水(1﹕3)混合液溶解并稀释至刻度，精密量取5ml置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液配制后，应立即进样，各取20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
S对照品：对照品峰面积，S样品：供试品中相应组分的峰面积，
M对照品：对照品称样量，M供试品：供试品称样量，
N对照品：对照品稀释倍数，N供试品：供试品稀释倍数，
B平均装量：平均装量，C对：对照品的含量；
结果判断：每瓶中各成分实际测定的量在理论量的90～120％范围内时，判为符合规定。
在上述试验例11中，对实施例1-5的五批粉针进行含量测定，结果各项指标均符合规定，每瓶中各成分实际测定的量在理论量的99～108％范围内。
产业适用性
以上所述，仅为本发明的优选实施例，不能解释为以此限定本发明的范围，凡在本发明的权利要求书要求保护的范围内所做出的等同的变形和改变的实施方式均在本发明所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.对注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物进行质量控制的方法，所述组合物中包含以下重量配比的组分：硝酸硫胺2.8～3.4mg、烟酰胺36～44mg、盐酸吡哆辛4.4～5.4mg、泛酸钠14.8～18.1mg、核黄素磷酸钠4.4～5.4mg、维生素C钠102～124mg、生物素54～66ug、叶酸0.36～0.44mg、4.5～6.0ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.4～0.6mg、甘氨酸250～350mg、乙二胺四醋酸二钠0.3～0.7mg；
该方法包括对所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物进行酸度检查、干燥失重检查、溶解度检查、细菌内毒素检查、无菌检查、装量差异检查、可见异物检查、不溶性微粒检查。
2.根据权利要求1的方法，其中：
所述的酸度检查操作过程为：取供试品3瓶，加新沸冷水30ml溶解后，置50ml烧杯中，混匀，在校准后的pH计上测定；
所述的干燥失重检查操作过程为：取在80℃减压干燥至恒重的空称瓶，精密称定瓶重(M1)，向瓶中加入供试品(精密称定供试品1.0g)，称重(M2)；以五氧化二磷为干燥剂，在电热真空干燥箱80℃减压干燥4小时，称重(M3)；按下式计算减失重量：
所述的溶解度检查操作过程为：取供试品1瓶，加入10ml注射用水，观察是否能10分钟内完全溶解。
3.根据权利要求1的方法，其中：
所述的细菌内毒素检查操作过程为：
供试液的配制：取供试品1瓶，加细菌内毒素检查用水5ml溶解并稀释，混匀，取0.5ml置试管中加细菌内毒素检查用水2ml混匀，即得；
供试液(1)的配制：取供试液0.5ml至试管中，加细菌内毒素检查用水0.5ml稀释，混匀，即得；
细菌内毒素工作标准对照液的配制：取10EU/支细菌内毒素工作标准品1支，加细菌内毒素检查用水5ml，稀释成2.0EU/ml的细菌内毒素工作标准对照液；精密取0.5ml，加细菌内毒素检查用水0.5ml，稀释成1.0EU/ml的细菌内毒素工作标准对照液；
供试品阳性对照液的配制：取2.0EU/ml细菌内毒素工作标准对照液0.5ml，加供试液0.5ml，稀释成1.0EU/ml的供试品阳性对照液；
鲎试剂溶液的配制：取鲎试剂8支，加细菌内毒素检查用水0.8ml，混匀，即得；
按照下表加样：
将试管内溶液轻轻混匀，立即封闭管口，垂直放入37±1°恒温仪中，保温60分钟±2分钟后，将试管从恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°；
结果判断：样品管、阴性对照管为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管为阳性，即每瓶中含细菌内毒素量不超过25EU，此时判为符合规定，否则不符合规定；
所述的无菌检查操作过程为：
沉降菌测定：取3个胰酪大豆胨琼脂培养基平皿，放置在操作台左、中、右三个点，考察工作台面菌落数；考察方案为：①实验时间大于4小时，考察时间为4小时，②实验时间小于4小时，考察时间为实验全过程；考察完毕，将沉降菌考察平皿和阴性对照平皿置30℃～35℃培养3天，观察菌落并计数；操作台平均菌落数应小于1个；
菌液制备：用0.9％氯化钠溶液10倍稀释金黄色葡萄球菌至每1ml中小于100cfu的菌液；分别取菌液1ml，加入2个平皿中，每皿倾注15～20ml胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固后置30℃～35℃培养72h，观察菌落并计数；金黄色葡萄球菌液的平均菌落数应小于100cfu；
供试品制备：取供试品60支，用300ml 0.1％灭菌蛋白胨溶液边溶解，边注入集菌器，过滤，分别将硫乙醇酸盐流体培养基200ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml注入相应滤筒内；2筒加硫乙醇酸盐流体培养基，另一筒加胰酪大豆胨液体培养基，每筒100ml；
供试品阳性对照制备：将一筒硫乙醇酸盐流体培养基转入阳性接种室，接种1ml金黄色葡萄球菌液，小于100cfu的菌液；
供试品阴性对照制备：以无菌操作注入300ml的0.1％灭菌蛋白胨溶液至集菌器，过滤，去除一个集菌管，其余两管分别注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml；
实验完毕后，将硫乙醇酸盐流体培养基置30℃～35℃培养，胰酪大豆胨液体培养基置20℃～25℃培养；阳性对照培养72h，供试品培养14天，逐日观察实验结果并记录；
结果判断：阳性对照管72h内应生长良好，阴性对照管无菌生长，供试品管无菌生长，满足此结果判为符合规定，否则不符合规定。
4.根据权利要求1的方法，其中：
所述的装量差异检查操作过程为：取供试品5瓶，除去标签、铝盖，容器外壁用乙醇擦净，干燥，开 启内塞时要小心，使容器内外气压平衡，盖紧后精密称定重量。倾出内容物，用水洗净后再用乙醇淌洗；待晾干后称取每瓶重量，求出每瓶的装量与平均装量；
所述的可见异物检查操作过程为：取供试品5瓶，分别加经0.45um微孔滤膜过滤的纯化水5ml溶解，在澄明度检测仪上2000～3000lx照度下，手持供试品颈部，轻轻旋转和翻转容器，避免产生气泡，使药液中可能存在的可见异物悬浮，分别在黑色和白色背景下目视检查；
所述的不溶性微粒检查操作过程为：取供试品4瓶，每瓶加微粒检查用水10ml溶解，摇匀，合并溶液，静置2分钟或适当时间脱气泡后在不溶性微粒检测仪上检测。
5.根据权利要求1的方法，该方法还包括对所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物中的烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠和核黄素磷酸钠进行含量测定，包括以下操作：
色谱条件与系统适用性试验：用氨基键合多孔硅胶为填料；以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(27：73)用10％盐酸溶液调节pH为5.3的溶液为流动相，流速：烟酰胺组1.0ml/min，核黄素磷酸钠1.5ml/min，检测波长：烟酰胺、盐酸吡哆辛、硝酸硫胺、泛酸钠、维生素C钠为214nm；核黄素磷酸钠用荧光检测λEX＝445nm、λEM＝520nm；各组分的分离度应大于1.5；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异检查中的内容物约2瓶重量，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取15ml置200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；
(1)取硝酸硫胺对照品约12mg、盐酸吡哆辛对照品约18mg、泛酸钠对照品62mg，精密称定，置50ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇匀，作为对照品储备液①，同法制得对照品储备液②；取烟酰胺对照品约6mg、维生素C钠对照品约17mg，精密称定，置100ml量瓶中，再精密量取对照品储备液①2ml置上述100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
(2)取核黄素磷酸钠对照品约19mg，精密称定，置50ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度摇匀，精密量取1ml置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即为核黄素磷酸钠对照品溶液①，同法制得核黄素磷酸钠对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液制备后，应立即进样，各取10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
S对照品：对照品峰面积，S样品：供试品中相应组分的峰面积，
M对照品：对照品称样量，M供试品：供试品称样量，
N对照品：对照品稀释倍数，N供试品：供试品稀释倍数，
B平均装量：平均装量，C对：对照品的含量。
6.根据权利要求1的方法，该方法还包括对所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物中的叶酸、生物素、对羟基苯甲酸甲酯进行含量测定，包括以下操作：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；磷酸二氢钾缓冲液[精密称取磷酸二氢钾(KH2PO4)2.27g和磷酸0.96g，加水溶解并稀释至5000ml]-乙腈(93：7)用磷酸调节pH值至3.0为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为200nm，各组分的分离度应大于1.5；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异检查中的内容物约1瓶重量，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；
(1)取叶酸对照品约16mg，精密称定，置50ml量瓶中用2mmol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度摇匀，作为对照品储备液A①，同法制得对照品储备液A②；取生物素对照品约12mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙醇-水(1﹕3)混合液溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液B①，同法制得对照品储备液B②；精密量取对照品储备液A①5ml和B①2ml，置同一100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液①，再精密量取对照品储备液A②5ml和B②2ml，同法操作制得对照品溶液②；
(2)取对羟基苯甲酸甲酯对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中用乙醇-水(1﹕3)混合液溶解并稀释至刻度，精密量取5ml置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液配制后，应立即进样，各取20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
7.根据权利要求1的方法，该方法还包括对所述注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物中的维生素B12进行含量测定，包括以下操作：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；梯度洗脱：流动相A：精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解后加乙腈125ml，用水稀释至1000ml，pH值为7.5；流动相B：水-乙腈-磷酸(499：499：2)；
时间(min) 流动相A(％v/v) 流动相B(％v/v) 流速(ml/min) 0-13 100 0 1.2 13-28 0 100 1.5 28-38 100 0 1.2
检测波长360nm，柱温40℃，维生素B12与未知峰之间的分离度应大于1.0；
测定法：
供试品溶液：临用新制；取装量差异项下的内容物约5瓶重量，精密称定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液①，同法制得供试品溶液②；
对照品溶液：临用新制；精密称取维生素B12对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中用水溶解并稀释至刻度摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液①，同法制得对照品溶液②；
对照品溶液和供试品溶液配制后，应立即进样，各取30μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算各组分含量，即得；
分析：用式下计算各组分含量：
式中：K对：对照品的平均毫克峰面积，
8.根据权利要求7的方法，所述对维生素B12进行含量测定时，所用的流动相A和流动相B中还添加剂有酒石酸；进一步地，酒石酸在流动相A和流动相B中的浓度为5mmol/L。
9.根据权利要求1的方法，所述组合物中包含以下重量配比的组分：硝酸硫胺2.9～3.4mg、烟酰胺39～43mg、盐酸吡哆辛4.7～5.3mg、泛酸钠15.5～17.5mg、核黄素磷酸钠4.8～5.3mg、维生素C钠110～123mg、生物素58～65ug、叶酸0.38～0.43mg、5.0～5.9ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.45～0.60mg、甘氨酸275～325mg、乙二胺四醋酸二钠0.4～0.6mg；
或者，所述组合物中包含以下重量配比的组分：硝酸硫胺3.1mg、烟酰胺40mg、盐酸吡哆辛4.9mg、泛酸钠16.5mg、核黄素磷酸钠4.9mg、维生素C钠113mg、生物素60ug、叶酸0.4mg、5.0ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.5mg、甘氨酸300mg、乙二胺四醋酸二钠0.5mg。
10.注射用水溶性维生素冷冻干燥粉针剂的组合物，其中包含以下重量配比的组分：硝酸硫胺2.8～3.4mg、烟酰胺36～44mg、盐酸吡哆辛4.4～5.4mg、泛酸钠14.8～18.1mg、核黄素磷酸钠4.4～5.4mg、维生素C钠102～124mg、生物素54～66ug、叶酸0.36～0.44mg、4.5～6.0ug维生素B12、对羟基苯甲酸甲酯0.4～0.6mg、甘氨酸250～350mg、乙二胺四醋酸二钠0.3～0.7mg。
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