CN103842337A

CN103842337A - 取代的3-(联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

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Publication number: CN103842337A
Application number: CN201280048665.9A
Authority: CN
Inventors: 刘宁姝; K·锡德; U·门宁; A·肖尔茨; C-S·希尔格; U·伯默; R·菲舍尔
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG; Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2011-08-04
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2014-06-04
Also published as: TN2014000046A1; KR20140051378A; IL230609A0; MX2014001393A; DE102011080406A1; US20140275199A1; JP2014524413A; CR20140063A; HK1198167A1; CO6870039A2; CU20140012A7; BR112014002674A2; AU2012292069A1; ECSP14013192A; SG2014005235A; US9278925B2; WO2013017600A1; EP2739607A1; DOP2014000022A; CA2843809A1

Abstract

本发明涉及特别用于治疗目的的取代的3-(联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮、药物组合物、以及它们在治疗中的用途特别是用于预防和/或治疗肿瘤病症的用途。

Description

取代的3-(联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

本发明涉及特别用于治疗目的的取代的3-(联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮、包含本发明的化合物的药物组合物，以及它们在治疗中的用途特别是用于预防和/或治疗肿瘤病症的用途。

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)在细胞脂肪酸内稳态中发挥关键作用。ACC是含生物素的酶，其以ATP依赖性方式催化乙酰辅酶A到丙二酰辅酶A的羧化作用(Kim,1997;Harwood,2005;Tong,2005)。以两个半反应(即，生物素羧化酶(BC)反应和羧基转移酶(CT)反应)方式进行的这种反应是脂肪酸生物合成的第一引导步骤并且是该途径的决速步。已知两种人ACC亚型(即ACC1和ACC2)是由两种不同的基因编码的(LuTFIABU-ELHEIGA等人,1995,Jane WIDMER等人,1996)。ACC1在脂肪生成组织(肝脏、脂肪组织)中表达，在胞浆中定位并且填充丙二酰辅酶A库，其对于通过FASN的长链脂肪酸的从头合成以及后续链延伸而言用作C2单位供体。ACC2主要在氧化组织(肝脏、心脏、骨骼肌)中表达(Bianchi等人，1990;Kim,1997)，与线粒体相关并且调节第二丙二酰辅酶A库。这通过抑制肉毒碱棕榈酰基转移酶I调节脂肪酸氧化，所述酶促进长链脂肪酸进入线粒体以用于β氧化(Milgraum LZ等人,1997,Widmer J等人,1996)。这两种酶均表现出非常高的序列同源性并且以相似方式被转录、翻译和翻译后机制的组合调节。在人和动物二者中，由许多饮食、激素和其它生理机制(例如柠檬酸盐的向前别构激活、长链脂肪酸的反馈抑制、通过修饰的基因表达的酶产生的可逆磷酸化和/或失活或调节)来高度控制ACC活性。

ACC1敲除小鼠是胚胎致死的(Swinnen等人,2006,Abu-Elheiga等人,2005)。ACC2敲除小鼠表现出在骨骼肌和心肌中丙二酰辅酶A浓度降低、在肌肉中脂肪酸氧化增加、肝脂肪水平降低、总体脂量降低、骨骼肌中UCP3水平增加(作为更高能量消耗的指示)、体重降低、游离脂肪酸血浆浓度降低、血浆葡萄糖水平降低、组织糖原量降低，并且使它们免受饮食诱导的糖尿病和肥胖(Abu-Elheiga等人,2001,2003;Oh等人,2005)。

除了参与脂肪生成组织中的脂肪酸合成以及氧化组织中的脂肪酸氧化外，在许多肿瘤细胞中观察到ACC的上调和增加的脂肪生成(Swinnen等人,2004,Heemers等人,2000,Swinnen等人,2002,Rossi等人,2003,Milgraum等人,1997,Yahagi等人,2005)。该表型以非常高的可能性促进肿瘤的产生和发展，然而所涉及的调节机制仍需要得到阐明。

EP0454782和US5759837保护了脂肪酸合成抑制剂用于抑制肿瘤细胞生长的用途。未公开环状酮-烯醇(ketoenol)。

已经发现了许多能够抑制植物和/或昆虫ACC的物质。

PCT专利申请PCT/EP99/01787(还公开为WO99/48869，其对应于欧洲专利EP1066258B1)涉及新的芳基苯基取代的环酮-烯醇、多种它们的制备方法以及它们作为杀虫剂和除草剂的用途。

已经描述了3-酰基吡咯烷-2,4-二酮具有药物性质(S.Suzuki等人，Chem.Pharm.Bull.151120(1967))。此外，已由R.Schmierer和H.Mildenberger合成了N-苯基吡咯烷-2,4-二酮(Liebigs Ann.Chem.1985,1095)。未描述这些化合物的生物活性。

EP-A-0262399和GB-A-2266888公开了类似结构(3-芳基吡咯烷-2,4-二酮)的化合物，然而已知其没有除草、杀虫或杀螨活性。已知未取代的二环3-芳基吡咯烷-2,4-二酮衍生物(EP-A-355599,EP-A-415211和JP-A-12-053670)和取代的单环3-芳基吡咯烷-2,4-二酮衍生物(EP-A-377893和EP-A-442077)具有除草、杀虫或杀螨活性。

此外已知的是多环3-芳基吡咯烷-2,4-二酮衍生物(EP-A-442073)和1H-芳基吡咯烷二酮衍生物(EP-A-456063、EP-A-521334、EP-A-596298、EP-A-613884、EP-A-613885、WO95/01971、WO95/26954、WO95/20572、EP-A-0668267、WO96/25395、WO96/35664、WO97/01535、WO97/02243、WO97/36868、WO97/43275、WO98/05638、WO98/06721、WO98/25928、WO99/24437、WO99/43649、WO99/48869、WO99/55673、WO01/17972、WO01/23354、WO01/74770、WO03/013249、WO03/062244、WO2004/007448、WO2004/024688、WO04/065366、WO04/080962、WO04/111042、WO05/044791、WO05/044796、WO05/048710、WO05/049569、WO05/066125、WO05/092897、WO06/000355、WO06/029799、WO06/056281、WO06/056282、WO06/089633、WO07/048545、DEA102005059892、WO07/073856、WO07/096058、WO07/121868、WO07/140881、WO08/067873、WO08/067910、WO08/067911、WO08/138551、WO09/015801、WO09/039975、WO09/049851、WO09/115262、WO10/052161、WO10/063378、WO10/063670、WO10/063380、WO10/066780、WO10/102758、WO2010/135914、WO2011/067131、WO2011/067135、WO2011/067203和WO2011/067240)。

此外已知的是来自WO99/16748的缩酮取代的1H-芳基吡咯烷-2,4-二酮以及来自P-A-14205984和Ito M.等人,Bioscience,Biotechnologyand Biochemistry67,1230-1238,(2003)的(螺)-缩酮取代的N-烷氧基烷氧基取代的芳基吡咯烷二酮。此外，WO06/024411公开了包含酮-烯醇的除草剂组合物。

WO2008/022725公开了用于治疗病毒性病症的4’-联苯取代的特窗酸(tetronic acid)衍生物。

WO2005/089118和WO2007/039286以一般性的方式公开了用于治疗的含氮二环结构；然而未具体提及5’-联苯取代的环状酮-烯醇。

可以由在氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮环系统的8位具有甲基而非三氟甲基或甲氧基甲基的化合物来代表结构上最接近的现有技术。那些化合物中的一些形成了现有技术的一部分并且公开于例如WO10/063378。

可以由在氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮环系统的8位具有氢原子而非甲氧基的化合物来代表结构上最接近的现有技术。那些化合物中的一些形成了现有技术的一部分并且公开于例如WO07/048545(实施例I-1-a-5)。

此处，WO10/063378和WO07/048545涉及另一领域，即除草剂领域的发明。

无例外地，在除草剂、杀虫剂或杀真菌剂的领域已知现有技术的最接近的结构。对于这些结构，首先未知且其次不可预测它们是否抑制人ACC。更何况，对于这些结构未知且不可预测它们是否选择性针对人ACC亚型之一。

基于该现有技术，本发明的目的是提供用于治疗人类和兽类病症的结构。

特别地，本发明的结构应适用于预防和治疗肿瘤病症，并且相对于现有技术已知的结构具有优势。

特别提供的是强烈抑制人ACC1的用于治疗病症的结构。所寻求的结构应与人ACC2相比更强地抑制人ACC1，即，它们应为对人ACC2具有选择性的。

优选地，为治疗病症而提供的结构应还具有下列性质之一，更好地具有更多的下列性质，最好具有所有的下列性质：

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，在所述试验中，它们以小于300nM、甚至更佳地小于200nM、甚至更佳地小于100nM的IC50抑制人ACC1，

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，在所述试验中，它们以大于0.5nM、甚至更佳地大于1.5μM、甚至更佳地大于2μM的IC50抑制人ACC2，

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，抑制人ACC2的IC50与抑制人ACC1的IC50之比为至少8倍、甚至更佳地为至少15倍、甚至更佳地为至少20倍，

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，在所述试验中，它们以小于250nM、甚至更佳地小于100nM、甚至更佳地小于50nM的IC50抑制MCF7细胞系的肿瘤细胞增殖，

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，在所述试验中，它们具有小于3、甚至更佳地小于2.5的logP/D值，

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，在所述试验中，它们具有小于3、甚至更佳地小于2.5、甚至更佳地小于2的logMA值，

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，在所述试验中，它们具有大于1μmol/l的HAS蛋白结合常数，

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，在所述试验中，就与人血浆蛋白的结合而言，它们具有大于0.1%、甚至更佳地大于0.2%的游离部分，

-根据单次测量，或甚至更佳地，根据多次测量的平均值，就与小鼠血浆蛋白和人血浆蛋白的结合而言，它们具有小于15倍、甚至更佳地小于10倍的游离部分之比，

-就各种物质(species)的血浆蛋白结合而言，它们具有产生可接受的估计人体剂量的游离部分之比，

-它们具有产生可接受的估计人体剂量并且使得能够以药物形式给药的药代动力学参数，

-它们具有低清除率，

-它们具有高生物利用度，

-它们具有中度至高度的分布容积，

-它们具有可接受的相对生物利用度，其产生可接受的估计人体剂量并且使得能够以药物形式给药，

-它们具有不多于两周的估计人体半衰期，

-它们在PC3异种移植小鼠模型中具有体内活性，

-它们在PC3异种移植小鼠模型中具有活性，并且血浆水平产生可接受的估计人体剂量，

-它们由所述方法估计的人体每日剂量为小于每个患者2g、甚至更佳地小于每个患者1g。

令人惊讶地，现已经发现式(I)的化合物及其盐特别适于治疗病症并且实现本发明的目的，

其中

R¹表示三氟甲基或甲氧基甲基，并且

R²表示氢或氟。

在此，不可预见的是，已知作为杀虫剂或除草剂的结构是否实现本发明的目的以及哪种已知作为杀虫剂或除草剂的结构实现本发明的目的，即，代表能够用于治疗人类和/或动物病症的结构。

甚至更加不可预见已知作为杀虫剂或除草剂的结构是否抑制人ACC以及哪种已知作为杀虫剂或除草剂的结构抑制人ACC，并且甚至更加不可预见已知作为杀虫剂或除草剂的结构是否种表现出针对人亚型之一的选择性以及哪种已知作为杀虫剂或除草剂的结构表现出针对人亚型之一的选择性。

由于对人ACC1的良好酶抑制，式(I)的化合物令人惊讶地区别于大量的已知作为杀虫剂、杀真菌剂或除草剂的环状酮-烯醇。在本文中，本发明的化合物具有对人ACC2的增加的选择性，并且特别抑制ACC1。该性质是不可预见的，并且使本发明的化合物能够用于具有降低的副作用的治疗。不期望的副作用可能由人ACC2的同时抑制而诱发，而该作用主要基于人ACC1的抑制。

对人ACC2的选择性可能在结构上基于本发明结构的氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮环系统的8位中的反式-甲氧基。如果在现有技术的相关结构中已意识到这种反式-甲氧基，则在本发明时未知这些结构是否抑制人ACC以及具有何种选择性的这些结构抑制人ACC。

本发明还包括本发明化合物的生理学可接受的盐的用途。

本发明还包括本发明的式(I)的化合物的互变异构形式的用途，例如

本发明的化合物的生理学可接受的盐还包括与常用碱形成的盐，例示且优选为碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)和源自氨或具有1至16个碳的有机胺的铵盐，所述有机胺例示且优选为乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、乙二胺和N-甲基哌啶。

本发明还提供了包含本发明的化合物以及至少一种或多种其它活性化合物的药物，其特别用于预防和/或治疗肿瘤病症。

本发明的化合物可全身和/或局部起效。对于该目的，其可以适当的方式给药，例如通过口服途径、肠胃外途径、肺途径、鼻途径、舌下途径、舌途径、含服途径、直肠途径、皮肤途径、经皮途径、结膜途径、耳途径给药，或以植入物或支架的形式给药。

本发明的化合物可以适于这些给药途径的给药形式来给药。

用于口服给药的合适的给药形式是根据现有技术而使用的那些，其迅速和/或以缓释(modified)方式释放本发明的化合物，并且其包含结晶形式和/或无定形形式和/或溶解形式的本发明的化合物，所述形式例如片剂(未包衣片剂或包衣片剂，例如包覆有控制本发明化合物的释放的耐胃液包衣或溶出延迟包衣或不溶性包衣的片剂)、在口腔中迅速崩解的片剂或膜剂/糯米纸囊剂(wafer)、膜剂/冻干制剂(lyophilizate)、胶囊剂(例如硬胶囊剂或软胶囊剂)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、散剂、乳剂、混悬剂、气雾剂或溶液剂。

肠胃外给药可绕开吸收步骤(例如静脉内给药、动脉内给药、心脏内给药、脊柱内给药或腰内给药)或包括吸收(例如肌内给药、皮下给药、皮内给药、经皮给药或腹膜内给药)。适用于肠胃外给药的给药形式包括溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂或无菌粉末形式的注射制剂和输注制剂。

对于其它给药途径，适当的实例为吸入药物(包括粉末吸入器、喷雾器)、滴鼻剂、溶液剂或喷雾剂；用于舌部给药、舌下给药或含服给药的片剂，膜剂/糯米纸囊剂或胶囊剂、栓剂、耳部或眼部制剂、阴道胶囊剂、水性混悬剂(洗液、振烫合剂(shaking mixture))、亲脂性混悬剂、软膏剂、乳膏剂、经皮治疗系统(例如贴剂)、乳剂(milk)、糊剂、泡沫剂、扑粉剂、植入物或支架。

本发明的化合物可被转化成所述给药形式。这可以本领域已知的方式，通过与惰性无毒的药学适合的助剂混合而实现。这些助剂包括载体(例如微晶纤维素、乳糖、甘露醇)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂以及分散剂或湿润剂(例如月桂基硫酸钠、聚氧化山梨糖醇酐油酸酯)、粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成聚合物和天然聚合物(例如白蛋白)、稳定剂(例如抗氧化剂，如抗坏血酸)、染料(例如无机颜料，如铁氧化物)、以及味道和/或气味矫味剂。

此外，本发明还提供了包含通常与一种或多种惰性无毒的药学适合的助剂一起的本发明的化合物的药物，以及其用于前述目的的用途。

以本领域已知的方式，通过将一种或多种活性化合物转化成含有药物制剂中常用的助剂的期望的给药形式，从而将本发明的化合物配制成药物制剂。

所用的助剂可以是例如载体物质、增充剂、崩解剂、粘合剂、保湿剂、助流剂、吸收剂和吸附剂、稀释剂、溶剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、矫味剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、用于调节渗透压的盐、或者缓冲剂。

应参考Remington’s Pharmaceutical Science，第15版，MackPublishing Company,East Pennsylvania(1980)。

所述药物制剂可以固体形式如片剂、糖衣片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、经皮系统形式存在，或者以半固体形式如软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂、乳剂形式存在，或者以液体形式如溶液剂、酊剂、混悬剂或乳剂形式存在。

用于本发明上下文中的助剂可以是例如盐、糖(单糖、二糖、三糖、寡糖和/或多糖)、蛋白质、氨基酸、肽、脂肪、蜡、油、烃及其衍生物，并且所述助剂可以是天然来源的或合成的或部分合成的。

用于口服或经口给药的有用形式特别为片剂、包衣片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、混悬剂、乳剂或溶液剂。

用于肠胃外给药的有用形式特别为混悬剂、乳剂，并且尤其为溶液剂。

本发明涉及本发明的化合物。它们可用于预防和治疗人类病症特别是肿瘤病症。

本发明的化合物可特别用于抑制或降低细胞增殖和/或细胞分裂和/或诱导细胞凋亡。

本发明的化合物特别适于预防和/或治疗过度增殖病症，例如：

-银屑病，

-疤痕疙瘩和其它皮肤增生，

-良性前列腺增生(BPH)，

-实体瘤以及

-血液瘤。

可根据本发明治疗的实体瘤为例如下列肿瘤以及这些肿瘤的转移：乳腺肿瘤、呼吸道肿瘤、脑肿瘤、生殖器官肿瘤、胃肠道肿瘤、泌尿生殖道肿瘤、眼肿瘤、肝肿瘤、皮肤肿瘤、头颈肿瘤、甲状腺肿瘤、甲状旁腺肿瘤、骨肿瘤以及结缔组织肿瘤。

可治疗的血液瘤为例如：

-多发性骨髓瘤

-淋巴瘤或

-白血病。

可治疗的乳腺肿瘤为例如：

-具有阳性激素受体状态的乳腺癌

-具有阴性激素受体状态的乳腺癌

-Her-2阳性乳腺癌

-激素受体和Her-2阴性乳腺癌

-与BRCA相关的乳腺癌

-炎性乳腺癌。

可治疗的呼吸道肿瘤为例如：

-非小细胞支气管癌以及

-小细胞支气管癌。

可治疗的脑肿瘤为例如：

-神经胶质瘤，

-胶质母细胞瘤，

-星形细胞瘤，

-脑膜瘤以及

-髓母细胞瘤。

可治疗的男性生殖器官肿瘤为例如：

-前列腺癌，

-恶性睾丸肿瘤以及

-阴茎癌。

可治疗的女性生殖器官肿瘤为例如：

-子宫内膜癌，

-宫颈癌，

-卵巢癌，

-阴道癌，

-外阴癌。

可治疗的胃肠道肿瘤为例如：

-结肠直肠癌，

-肛门癌，

-胃癌，

-胰腺癌，

-食管癌，

-胆囊癌，

-小肠癌，

-唾液腺癌，

-神经内分泌瘤，

-胃肠道间质瘤。

可治疗的泌尿生殖道的肿瘤为例如：

-膀胱癌，

-肾细胞癌，

-肾盂癌和下泌尿道癌。

可治疗的眼肿瘤为例如：

-视网膜母细胞瘤，

-眼内黑色素瘤。

可治疗的肝肿瘤为例如：

-肝细胞癌，

-胆管细胞癌。

可治疗的皮肤肿瘤为例如：

-恶性黑色素瘤，

-基底细胞瘤，

-鳞状细胞癌(spinaliomas)，

-卡波西肉瘤，

-Merkel细胞癌。

可治疗的头颈肿瘤为例如：

-喉癌，

-咽癌和口腔癌。

可治疗的肉瘤为例如：

-软组织肉瘤，

-骨肉瘤。

可治疗的淋巴瘤为例如：

-非霍奇金淋巴瘤，

-霍奇金淋巴瘤，

-皮肤淋巴瘤，

-中枢神经系统淋巴瘤，

-艾滋病相关淋巴瘤。

可治疗的白血病为例如：

-急性髓性白血病，

-慢性髓性白血病，

-急性淋巴白血病，

-慢性淋巴白血病，

-毛细胞白血病。

有利地，本发明的化合物可用于预防和/或治疗：

乳腺癌，特别是激素受体阴性的、激素受体阳性的或与BRCA相关的乳腺癌，以及

胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤以及其它皮肤肿瘤、非小细胞支气管瘤、子宫内膜瘤，

结肠直肠癌以及前列腺癌。

特别有利地，本发明的化合物可用于预防和/或治疗乳腺癌特别是激素受体阳性乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌特别是雄激素受体阴性前列腺癌、或者非小细胞支气管癌。

这些病症的特征在人类中充分表现，但还存在于其它哺乳动物中。

本发明提供了本发明的式(I)的化合物，特别是下述化合物：

-(5r,8r)-3-(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(甲氧基甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

-(5r,8r)-3-(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(甲氧基甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

-(5r,8r)-3-(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

-(5r,8r)-3-(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮。

本发明还提供了用作药物特别用于预防和/或治疗肿瘤病症的本发明的化合物。

此外，本发明提供了用于预防和/或治疗乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤及其它皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌或前列腺癌的本发明的化合物。

此外，本发明提供了用于预防和/或治疗乳腺癌特别是激素受体阳性乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌特别是雄激素受体阴性前列腺癌、或者非小细胞支气管癌的本发明的化合物。

此外，本发明还提供了本发明的化合物用于制备药物的用途。

此外，本发明还提供了本发明的化合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤病症的药物中的用途。

此外，本发明提供了本发明的化合物在制备用于预防和/或治疗乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤及其它皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌或前列腺癌的药物中的用途。

此外，本发明提供了本发明的化合物在制备用于预防和/或治疗乳腺癌特别是激素受体阳性乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌特别是雄激素受体阴性前列腺癌、或者非小细胞支气管癌的药物中的用途。

此外，本发明还提供了所述化合物用于预防和/或治疗肿瘤病症的用途。

此外，本发明提供了本发明的化合物用于预防和/或治疗乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤及其它皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌或前列腺癌的用途。

此外，本发明提供了本发明的化合物用于预防和/或治疗乳腺癌特别是激素受体阳性乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌特别是雄激素受体阴性前列腺癌、或者非小细胞支气管癌的用途。

此外，本发明提供了用于预防和/或治疗乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤及其它皮肤肿瘤、非小细胞支气管癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌或前列腺癌的包含一种本发明的化合物的药物制剂，其为片剂形式。

此外，本发明提供了用于预防和/或治疗乳腺癌特别是激素受体阳性乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌特别是雄激素受体阴性前列腺癌、或者非小细胞支气管癌的包含一种本发明的化合物的药物制剂，其为片剂形式。

此外，本发明还提供了本发明的化合物用于治疗与增殖过程相关的病症的用途。

本发明的化合物可单独使用，或者可视需要与一种或多种其它药理学活性物质组合使用，只要该组合不导致不期望和不可接受的副作用。因此，本发明还提供了包含本发明化合物以及一种或多种其它活性化合物的药物，其特别用于预防和/或治疗上述病症。

例如，本发明的化合物可与已知的抗过度增殖的、抑制细胞生长的或具有细胞毒性的物质组合以治疗癌症。本发明的化合物与常用于癌症治疗的其它物质或与放射疗法的组合是特别适合的。

合适的组合活性化合物的实例包括：

依维莫司、阿地白介素、阿仑膦酸、alfaferone、阿利维A酸、别嘌呤醇、别嘌醇钠、帕洛诺司琼、六甲蜜胺、氨鲁米特、氨磷汀、氨柔比星、安丫啶、阿那曲唑、多拉司琼、安然爱斯普、阿格拉宾(arglabin)、三氧化砷、阿诺新、5-氮杂胞苷、咪唑硫嘌呤、BCG或tice BCG、贝他定、乙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、蓓萨罗丁、硫酸博莱霉素、溴脲苷、硼替佐米、白消安、降钙素、坎帕斯、卡培他滨、卡铂、比卡鲁胺、cefesone、西莫白介素、柔红霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯屈磷酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素脂质体(DaunoXome)、地塞米松、磷酸地塞米松、戊酸雌二醇(delestrogen)、地尼白介素、甲基强的松龙、地洛瑞林、右丙亚胺、己烯雌酚、大扶康、多西他赛、脱氧氟脲苷、阿霉素、屈大麻酚、DW-166HC、艾里咖、埃立特、表阿霉素(ellence)、阿瑞吡坦、表柔比星、依泊亭-α、阿法依泊汀、依他铂、ergamisol、estrace、雌二醇、雌莫司汀磷酸钠、乙炔雌二醇、阿米福汀、羟乙二磷酸、凡毕复、依托泊苷、法倔唑、farstone、非格司亭、非那雄胺、fligrastim、氟脲苷、氟康唑、氟达拉滨、单磷酸5-氟脱氧脲苷、5-氟脲嘧啶(5-FU)、氟甲睾酮、氟他胺、福美司坦、fosteabine、福莫司汀、氟维司群、gammagard、吉西他滨、吉妥单抗、格列卫、gliadel、戈舍瑞林、盐酸格拉司琼、组氨瑞林、托泊替康、氢化可的松、赤式-羟基壬基腺嘌呤、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素-α、干扰素-α-2、干扰素-α-2α、干扰素-α-2β、干扰素-α-n1、干扰素-α-n3、干扰素-β、干扰素-γ-1α、白介素-2、内含子A、易瑞沙、伊立替康、凯特瑞、拉帕替尼、硫酸香菇多糖、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、乙酸亮丙瑞林、左旋咪唑、左旋亚叶酸钙盐、左甲状腺素钠、levoxyl、洛莫司汀、氯尼达明、屈大麻酚、氮芥、甲钴胺、乙酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、美法仑、酯化雌激素、6-巯嘌呤、美司那、甲氨蝶呤、美特维克、米替福新、米诺环素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、Modrenal、Myocet、奈达铂、聚乙二醇化非格司亭、纽密伽、neupogen、尼鲁米特、他莫昔芬、NSC-631570、OCT-43、奥曲肽、盐酸昂丹司琼、orapred、奥沙利铂、紫杉醇、pediapred、培门冬酶、派罗欣、喷司他丁、毕西巴尼、盐酸匹鲁卡品、吡柔比星、普卡霉素、卟吩姆钠、泼尼氮芥、泼尼松龙、强的松、普雷马林、丙卡巴肼、普罗克瑞、雷替曲塞、RDEA119、利比、依替磷酸铼-186、利妥昔单抗、罗扰素-A、罗莫肽、salagen、善宁、沙格司亭、司莫司汀、西索菲兰、索布佐生、甲强龙、链佐星、氯化锶-89、左旋甲状腺索钠、他莫昔芬、坦索罗辛、他索纳明、tastolactone、泰索帝、替西白介素、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、testred、硫鸟嘌呤、塞替哌、促甲状腺激素、替鲁磷酸、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维甲酸、trexall、三甲基三聚氰胺、三甲曲沙、乙酸曲谱瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、UFT、脲苷、戊柔比星、维司力农、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、维如利金、zinecard、净司他丁-斯酯、枢复宁、ABI-007、阿考必芬、干扰素r-lb、affinitak、氨基喋呤、阿佐昔芬、asoprisnil、阿他美坦、阿曲生坦、BAY43-9006(索拉非尼)、阿瓦斯丁、CCI-779、CDC-501、西乐葆、西妥昔单抗、克立那托、乙酸环丙孕酮、地西他滨、DN-101、阿霉素-MTC、dSLIM、度他雄胺、edotecarin、依洛尼塞、依喜替康、芬维A胺、二盐酸组胺、组氨瑞林水凝胶植入物、钬-166DOTMP、伊班膦酸、干扰素-γ、内含子-PEG、伊沙匹隆、匙孔形血蓝蛋白、L-651582、兰瑞肽、拉索昔芬、libra、洛那法尼、米泼昔芬、米诺磷酸、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、新伐司他、诺拉曲特、奥利默森、onco-TCS、osidem、紫杉醇聚谷氨酸酯、帕米磷酸二钠、PN-401、QS-21、夸西洋、R-1549、雷洛昔芬、豹蛙酶、13-顺维甲酸、沙铂、西奥骨化醇、T-138067、特罗凯、taxoprexin、胸腺素-α1、嘎唑呋林、替吡法尼、替拉扎明、TLK-286、托瑞米芬、反式MID-107R、伐司朴达、伐普肽、瓦他拉你、维替泊芬、长春氟宁、Z-100、唑来膦酸，或这些的组合。

在一个优选实施方案中，本发明的化合物可与抗过度增殖剂组合，所述抗过度增殖剂的实例在以下非穷举列表中给出：

氨鲁米特、左旋门冬酰胺酶、咪唑硫嘌呤、5-氮杂胞苷、博来霉素、白消安、卡铂、卡莫司汀苯丁酸氮芥、顺铂、利血生(colaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、己烯雌酚、2’,2’-二氟脱氧胞苷、多西他赛、阿霉素(阿霉素(adriamycin))、表柔比星、埃博霉素及其衍生物、赤式-羟基壬基腺嘌呤、炔雌醇、依托泊苷、磷酸氟达拉滨、5-氟脱氧尿苷、单磷酸5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、六甲蜜胺、羟基脲、己酸羟孕酮、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素、伊立替康、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、乙酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、美法仑、6-巯基嘌呤、美司那、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、紫杉醇、喷司他丁、N-瞵乙酰基L-天冬氨酸(PALA)、普卡霉素、泼尼松龙、强的松、丙卡巴肼、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、丙酸睾酮、硫鸟嘌呤、塞替哌、拓扑替康、三甲基三聚氰胺、尿苷、长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

以非常期望的方式，本发明的化合物还可与诸如抗体(例如，阿瓦斯汀、美罗华、爱必妥、赫赛汀)和重组蛋白质的生物治疗剂组合。

本发明的化合物还可与针对血管发生的其它疗法例如与阿瓦斯汀、阿西替尼、瑞格菲尼、recentin、索拉非尼或舒尼替尼组合地实现积极效应。与蛋白酶体的抑制剂和mTOR的抑制剂以及抗激素和甾体代谢酶抑制剂的组合由于其副作用方面的有利性质而为特别合适的。

通常，可以使用本发明的化合物与其它抑制细胞生长的或具有细胞毒性的活性剂的组合来追求下列目的：

·与使用单一活性化合物的疗法相比，在减缓肿瘤生长、降低其尺寸或者甚至将其完全消除的方面的改善的功效；

·与单一疗法的情况相比，以更低的剂量使用化疗药物的可能性；

·与单独给药相比，具有更少副作用的更加可耐受的治疗的可能性；

·治疗更宽范围的肿瘤疾病的可能性；

·实现更高的对治疗的应答速率；

·与现在的标准疗法相比，更长的患者存活时间。

此外，本发明的化合物还可与发射疗法和/或外科手术联合使用。

1.式(I)的化合物的合成路线

可通过合成路线A和/或B制备本发明的式(I)的化合物。

合成路线A

使式(II)的芳基溴衍生物与式(III)的化合物在Suzuki偶联中反应，

其中R¹具有上述规定的含义，

其中R²具有上述规定的含义，并且

A表示-B(OH)₂、硼酸酯(优选硼酸频哪醇酯)或者-BF₃ ^–K⁺。

Suzuki偶联通常在惰性溶剂中，在催化剂的存在下，(如果适当)在其它试剂的存在下，优选在室温至130℃的温度范围及大气压下进行。该反应还可在封闭的容器中进行，并且在微波炉中加热。

催化剂例如为常用于Suzuki反应条件的钯催化剂；优选诸如二氯双(三苯基膦)钯、四三苯基膦钯(0)、钯碳、乙酸钯(II)、乙酸钯(II)/三环己基膦(palladium(II)acetate/triscyclohexylphosphine)、乙酰丙酮酸钯(II)/三叔丁基鏻四氟硼酸盐(palladium(II)acetoacetonate/tri-tert-butylphosphonium tetrafluoroborate)、二氯[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]钯/二氯甲烷络合物、或者具有诸如二环己基[2’,4’,6’-三(丙-2-基)联苯-2-基]磷烷(phosphane)的配体的乙酸钯(II)的催化剂。

其它试剂例如为乙酸钾或乙酸铯、碳酸铯、碳酸钾或碳酸钠、叔丁醇钾、氟化铯、磷酸钾或氢氧化钠或氢氧化钾，优选的其它试剂例如为碳酸铯和/或氢氧化钠水溶液。

惰性溶剂例如为：醚，例如二恶烷、四氢呋喃或1,2-二甲氧基乙烷；烃，例如苯、二甲苯或甲苯；或者羧酰胺，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮；或者烷基亚砜，例如二甲基亚砜；或者溶剂与醇的混合物，例如甲醇或乙醇和/或水；优选的是1,2-二甲氧基乙烷。

可通过在Dieckmann缩合条件下使式(IV)的化合物反应来制备式(II)的化合物，

其中R¹具有上述规定的含义，并且

B表示C1-C6-烷基，优选乙基或甲基。

Dieckmann缩合通常在惰性溶剂中，在碱的存在下，优选在室温至130℃的温度范围及大气压下进行。

碱例如为碱金属醇盐或碱土金属醇盐，例如叔丁醇钠或叔丁醇钾、甲醇钠或乙醇钠；优选的是叔丁醇钾。

惰性溶剂例如为：醚，例如二恶烷、四氢呋喃或1,2-二甲氧基乙烷；烃，例如苯、二甲苯或甲苯；或者羧酰胺，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮；或者烷基亚砜，例如二甲基亚砜；或者醇，例如甲醇或乙醇；优选的是二甲基甲酰胺。

可通过在酰胺偶联条件下，使式(V)的化合物或式(V)的化合物的盐与式(VI)的化合物反应来制备式(IV)的化合物，

其中R¹和B具有上述规定的含义，

该反应通常在惰性溶剂中通过下述方法而进行：使式(VI)的化合物首先与亚硫酰氯或者本领域技术人员已知的等效试剂反应，并且在第二步中与式(V)的化合物或式(V)的化合物的盐在诸如三乙胺或碳酸钾的碱的存在下反应。

在备选方法中，该反应可在惰性溶剂中，在脱水剂的存在下，(如果适当)在碱的存在下，优选在-30℃至50℃的温度范围及大气压下进行

惰性溶剂例如为：卤代烃，例如二氯甲烷或三氯甲烷；烃，例如苯或甲苯，硝基甲烷，四氢呋喃，1,4-二恶烷，二甲基甲酰胺或乙腈。还可以使用溶剂的混合物。特别优选的是乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或甲苯。

碱例如为：碱金属碳酸盐，例如碳酸钠或碳酸钾，或碳酸氢钠或碳酸氢钾；或者有机碱，例如三烷基胺如三乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、4-二甲基氨基吡啶或者二异丙基乙胺。

合适的脱水剂为例如：碳二亚胺，例如N,N’-二乙基碳二亚胺、N,N,’-二丙基碳二亚胺、N,N’-二异丙基碳二亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺、N-(3-二甲基氨基异丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-环己基碳二亚胺-N’-丙氧基甲基聚苯乙烯(PS-碳二亚胺)；或羰基化合物，例如羰基二咪唑；或者1,2-恶唑鎓(oxazolium)化合物，例如2-乙基-5-苯基-1,2-恶唑鎓3-硫酸盐、或2-叔丁基-5-甲基异恶唑鎓高氯酸盐；或酰氨基化合物，例如2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉；或丙烷磷酸酐；或氯甲酸异丁酯；或双(2-氧-3-恶唑烷基)磷酰氯；或O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、2-(2-氧-1-(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TPTU)、或O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲酯六氟磷酸盐(HATU)、或1-羟基苯并三唑(HOBt)、或苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、或苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)；或N-羟基琥珀酰亚胺，或者这些与碱的混合物。

优选地，在HOBt的存在下与PyBOP、TBTU或与EDC进行缩合。

上述方法由下列合成路线例示：

a):1.SOCl₂,80℃,2.三乙胺，二氯甲烷，室温；

b):KOtBu,DMF,80℃；

c):催化剂：二氯[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]钯/二氯甲烷络合物，Cs₂CO₃,1,2-二甲氧基乙烷/水，回流。

合成路线B

或者，可在上述Dieckmann缩合中所指出的条件下，通过使式(VII)的化合物反应来制备本发明的式(I)化合物，

其中R¹、R²和B具有上述规定的含义。

可在以上所指出的酰胺偶联条件下，通过使式(V)的化合物或式(V)的化合物的盐(其中R¹和B具有上述规定的含义)与式(VIII)的化合物反应来制备式(VII)的化合物，

其中R²具有上述规定的含义。

可在上述所指出的条件下，通过在Suzuki反应中使式(VI)的化合物与式(III)的化合物(其中R²和A具有上述规定的含义)反应来制备式(VIII)的化合物。

上述方法由下列合成路线例示：

a)：催化剂：乙酰丙酮酸钯(II)，催化剂：三叔丁基鏻四氟硼酸盐，NaOH，THF/水；

b):1.SOCl₂，80℃，2.K₂CO₃，乙腈，室温；

c):KOtBu,DMF，室温。

可按照已知的方法，例如与WO2002/02532或WO2010/063378类似的方法，通过将式(IX)的化合物或式(IX)的化合物的盐酯化来制备合成路线A和B所需的式(V)的化合物或式(V)的化合物的盐(其中R¹和B具有上述规定的含义)，

其中R¹具有上述规定的含义。

可按照已知的方法，例如与WO2002/02532或WO2010/063378类似的方法，通过将式(X)的化合物裂解来制备式(IX)的化合物或式(IX)的化合物的盐(其中R¹具有上述规定的含义)，

其中R¹具有上述规定的含义。

可按照在Bucherer-Bergs反应中已知的方法，例如与WO2002/02532或WO2010/063378类似的方法，通过使式(XI)的化合物反应来制备式(X)的化合物(其中R¹具有上述规定的含义)，

其中R¹具有上述规定的含义。在形成式(X)的乙内酰脲期间，获得式(X)的顺式异构体以及其式(X-a)的反式异构体的异构体混合物

在该合成步骤中可以分离式(X-a)的反式异构体。或者，可以使异构体混合物进一步反应，并且可以在其它合成步骤之一中或从式(I)的最终产物分离各反式异构中间体。

或者，使用Strecker合成，可以通过已知方法从式(XI)的酮制备氨基腈，其可通过已知的方法被水解成式(IX)的氨基酸。

可通过使式(XII)的化合物进行缩酮裂解(参见Protective Groups inOrganic Synthesis;Theodora W.Greene)来制备式(XI)的化合物(其中R¹具有上述规定的含义)，

其中R¹具有上述规定的含义。

可按照已知的方法，例如与WO2010/063378类似的方法，通过将式(XIII)的化合物甲基化来制备式(XII)的化合物(其中R¹具有上述规定的含义)，

其中R¹具有上述规定的含义。

上述方法由以下合成路线例示：

a):NaH，碘甲烷，THF，室温；

b):甲苯磺酸一水合物，丙酮/水；

c):NaCN，(NH₄)₂CO₃，水/乙醇，60℃；

d):KOH或NaOH，水，回流；

e):SOCl₂，甲醇，40℃至回流。

可通过使式(XIV)的化合物与(三氟甲基)三甲基硅烷反应来制备式(XIII)的化合物(其中R¹表示三氟甲基)，

由式(XIV)的酮与(三氟甲基)三甲基硅烷得到式(XIII)的化合物的反应通常在惰性溶剂中，在催化剂的存在下，优选在-20℃至100℃的温度范围及在大气压下进行。催化剂例如为碱金属或碱土金属碳酸盐，如碳酸钠、碳酸钾或碳酸铯。此外，还可以采用碱金属或碱土金属氟化物如氟化锂和氟化铯，并且还可以采用有机碱的氟化物盐如四乙基氟化铵或四丁基氟化铵，从而催化期望的反应。惰性溶剂例如为醚，例如二恶烷、四氢呋喃或1,2-二甲氧基乙烷；或者羧酰胺，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮；或者烷基亚砜，例如二甲基亚砜；优选的是二甲基甲酰胺。最终通过本领域技术人员已知的方法(参见ProtectiveGroups in Organic Synthesis;Theodora W.Greene)来裂解最初获得的式(XIII)的甲硅烷基衍生物。

可通过已知的方法，例如与Rodriguez,Benjamin;Torre,Maria C.de la;Perales,Aurea;Malakov,Peter Y.;Papanov,Y.;等人.,Tetrahedron,1994,第50卷,第5451-5468页类似的方法，通过将式(XV)的环氧化物开环来制备式(XIII)的化合物(其中R¹表示甲氧基甲基)，

式(XV)的环氧化物是已知的，并且可以由式(XIV)的化合物制备(Ciaccio,James A.;Drahus,Antoinette L.;Meis,Regina M.;Tingle,CariceT.;Smrtka,Michael;Geneste,Richard,Synthetic Communications,2003,33卷,第2135-2144页)。

缩写和首字母缩略词

DMF 二甲基甲酰胺

DMSO 二甲基亚砜

ELSD 蒸发光散射检测器

ESI 电喷雾电离(在MS中)

h 小时

HPLC 高压高效液相色谱法

LC-MS 液相色谱-质谱法联用

min 分钟

MS 质谱法

neg 负的/阴性的

NMR 核磁共振波谱法

pos 正的/阳性的

RP 反相(在色谱中)

RT 室温

Rt 保留时间(在HPLC中)

tert 叔

THF 四氢呋喃

UPLC 超高效液相色谱

LC-MS和HPLC方法：

方法1(UPLC-MS)：

仪器：WatersAcquity UPLC-MS SQD3001；柱：Acquity UPLC BEHC181.750×2.1mm；流动相A：水+0.1%甲酸，流动相B：乙腈；梯度：0-1.6min1-99%B,1.6-2.0min99%B；流速0.8ml/min；温度：60℃；进样量：2μl；DAD扫描：210-400nm；ELSD。

方法2(UPLC-MS)：

仪器：Waters Acquity UPLC-MS SQD；柱：Acquity UPLC BEH C181.750×2.1mm；流动相A：水+0.05%甲酸，流动相B：乙腈+0.05%甲酸；梯度：0-1.6min1-99%B,1.6-2.0min99%B；流速0.8ml/min；温度：60℃；进样量：2μl；DAD扫描：210-400nm；ELSD。

方法3(UPLC-MS)：

仪器：Waters Acquity UPLC-MS ZQ4000；柱：Acquity UPLC BEH C181.750×2.1mm；流动相A：水+0.05%甲酸，流动相B：乙腈+0.05%甲酸；梯度：0-1.6min1-99%B,1.6-2.0min99%B；流速0.8ml/min；温度：60℃；进样量：2μl；DAD扫描：210-400nm。

2.比较例和实施例的制备

起始化合物和中间体：

实施例1A

(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酸

在氩气下，向在437ml(437mmol)脱气的1N氢氧化钠水溶液、160ml脱气的水和160ml脱气的四氢呋喃的混合物中的40.0g(175mmol)(5-溴-2-甲基苯基)乙酸(EP1791816和WO2006/29799)的溶液中添加33.5g(192mmol)的(4-氯-3-氟苯基)硼酸。将混合物搅拌10分钟，添加507mg(1.75mmol)三叔丁基鏻四氟硼酸盐和532mg(1.75mmol)乙酰丙酮酸钯(II)，并且将混合物在室温搅拌20h。然后，添加甲苯和水，用浓盐酸水溶液将pH调节至1-2，将混合物搅拌10分钟，将相分离，用甲苯萃取水相两次，并且将合并的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。将残留物在300ml的正己烷/叔丁基甲基醚的6/1混合物中搅拌30分钟，吸滤，用正己烷洗涤并且减压干燥。产生38.0g(理论的78%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=2.27(s,3H),3.67(s,2H),7.27(d,1H),7.49-7.59(m,3H),7.61-7.75(m,2H),12.4(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.31min;MS(ESIneg):m/z=277[M–H]–。

实施例2A

(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰氯

将5.00g(19.18mmol)的(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酸(EP2029531A1和US2009/298828A1)溶解在36.51g(306.84mmol)的亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃搅拌4小时，然后减压浓缩。在高真空下干燥，产生5.4g(理论的100%)的褐色油形式的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):d[ppm]=2.36(s,3H),4.22(s,2H),7.29(d,1H),7.35-7.55(m,6H)。

实施例3A

(5-溴-2-甲基苯基)乙酰氯

将6.00g(26.19mmol)的(5-溴-2-甲基苯基)乙酸(EP1791816A1和US2006/29799A1)溶解在31.20g(261.92mmol)的亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃搅拌2小时，然后减压浓缩。在高真空下干燥，产生6.29g(理论的97%)的褐色油形式的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):d[ppm]=2.26(s,3H),4.12(s,2H),7.09(d,1H),7.34(d,1H),7.37(dd,1H)。

实施例4A

(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酰氯

将10.00g(35.88mmol)(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酸(实施例1A)溶解在24.33g(204.51mmol)亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃搅拌1小时，然后减压浓缩。在高真空下干燥，产生10.54g(理论的99%)的褐色油形式的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):d[ppm]=2.36(s,3H),4.22(s,2H),7.26-7.39(m,4H),7.41-7.49(m,2H)。

实施例5A

三甲基{[8-(三氟甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基]氧基}硅烷

将5.00g(32.01mmol)1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-酮溶解在50ml1,2-二甲氧基乙烷中，并且添加14.60g(44.82mmol)的碳酸铯。在30℃的内部温度下，向所得悬浮液滴加溶解在100ml1,2-二甲氧基乙烷中的36.42g(256.11mmol)三甲基(三氟甲基)硅烷，并且将反应混合物在室温搅拌过夜。为了分离纯化，向反应中滴加约600ml的水，并且用二氯甲烷萃取目标分子。将有机层用水反复洗涤，在硫酸钠上干燥并减压浓缩。干燥产生10.6g(理论的100%)的褐色油形式的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=0.11(s,9H),1.57-1.78(m,8H),3.85(s,4H)。

实施例6A

1,7,10-三氧杂二螺[2.2.4.2]十二烷

向50.7g(231mmol)三甲基碘化亚砜(trimethylsulphoxonium iodide)和25.9g(231mmol)的叔丁醇钾的均匀混合物添加30.0g(192mmol)1,4-环己二酮单乙二醇缩醛(1,4-cyclohexanedione monoethlene acetal)于750ml二氯甲烷中的溶液，并且将反应混合物在室温搅拌1小时。添加冰水，将相分离，用二氯甲烷反复萃取水相，并且用水反复洗涤合并的有机相，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生28.3g(理论的87%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.41-1.52(m,2H),1.65-1.76(m,6H),2.61(s,2H),3.88(s,4H)。

实施例7A

8-(三氟甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-醇

在0℃下，将12.20g(40.89mmol)三甲基{[8-(三氟甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基]氧基}硅烷(实施例5A)溶解在164ml的于四氢呋喃中的1摩尔四丁基氟化铵溶液中，并且将混合物在室温搅拌3小时。为了分离纯化，向反应中添加约600ml的水，并且用二氯甲烷萃取目标分子。将有机层用水反复洗涤，在硫酸钠上干燥并减压浓缩。干燥产生9.33g(理论的100%)的褐色油形式的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.49-1.58(m,2H),1.59-1.77(m,6H),3.83(s,4H),5.78(s,1H)。

实施例8A

8-(甲氧基甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-醇

向在150ml乙醇中的4.56g(26.8mmol)来自实施例6A的化合物添加75ml的25%浓度的甲醇钠甲醇溶液，并且将混合物在60℃搅拌过夜。在冷却之后，将反应混合物浓度，并将残留物溶解在饱和氯化铵水溶液中，并用乙酸乙酯反复萃取。将结合的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生3.23g(理论的60%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.37-1.47(m,4H),1.50-1.63(m,2H),1.68-1.80(m,2H),3.10(s,2H),3.25(s,3H),3.82(s,4H),4.24(s,1H)。

实施例9A

8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷

在0℃下，将16.23g(71.75mmol)8-(三氟甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-醇(实施例7A)溶解在582ml四氢呋喃中，每次少量添加5.74g(143.50mmol)氢化钠(于石蜡油中为60%)，并且将混合物在室温搅拌1小时。向所得悬浮液滴加50.92g(358.76mmol)的碘甲烷，并且将反应混合物在室温搅拌过夜。为了分离纯化，将混合物请入约1l的冰水中，并且用二氯甲烷萃取产物。将有机层用水反复洗涤，在硫酸钠上干燥并减压浓缩。干燥产生17.34g(理论的100%)的褐色油形式的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.50-1.75(m,6H),1.85-1.98(m,2H),3.30(s,3H),3.84(s,4H)。

实施例10A

8-甲氧基-8-(甲氧基甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷

将3.40g(16.8mmol)来自实施例8A的化合物溶解在170ml四氢呋喃中，添加1.01g(25.2mmol)的氢化钠(在石蜡油中为60%)，并且将混合物在室温搅拌0.5小时。然后，添加3.58g(25.2mmol)碘甲烷，并且将反应混合物在室温搅拌2小时。然后，添加3.58g(25.2mmol)碘甲烷，并且将反应混合物在室温搅拌2小时。添加水，用乙酸乙酯反复萃取混合物，并且将合并的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生3.35g(理论的92%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.37-1.77(m,8H),3.11(s,3H),3.25(s,5H),3.83(s,4H)。

实施例11A

4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己酮

将11.80g(49.12mmol)8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷(实施例9A)溶解在236ml丙酮和118ml水中，添加1.50g(7.86mmol)4-甲苯磺酸一水合物，并且将混合物在回流下加热过夜。然后，将混合物倾入1.2l水中，并用乙醚萃取产物。将有机层用水洗涤，在硫酸钠上干燥并减压浓缩。所得残留物减压蒸馏(在40mbar下沸点为106-110℃)。这产生6.86g(理论的71%)的淡黄色油形式的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):d[ppm]=1.90-2.07(m,2H),2.26-2.43(m,4H),2.48-2.65(m,2H),3.52(s,3H)。

实施例12A

4-甲氧基-4-(甲氧基甲基)环己酮

将13.3g(61.5mmol)来自实施例10A的化合物溶解在200ml丙酮和100ml水中，添加1.87g(9.84mmol)4-甲苯磺酸一水合物，并且将混合物在室温下搅拌2天。然后，蒸馏出丙酮，并且通过添加碳酸氢钠来中和残留物水溶液，且添加23.2g氯化钠。用乙酸乙酯反复萃取混合物，并且将合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生10.3g(理论的97%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.61-1.76(m,2H),1.97-2.12(m,4H),2.34-2.46(m,2H),3.22(s,3H),3.28(s,3H),3.36(s,2H)。

实施例13A

8-甲氧基-8-甲基-1,3-二氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮

将608g(6.33mol)碳酸铵和68.2g(1.39mmol)氰化钠溶解在2800ml水中。在室温下，滴加180g(1.27mmol)4-甲氧基-4-甲基环己酮(描述于WO2010/063378)，并且将混合物在60℃搅拌过夜。将固体抽滤并干燥。这产生169.6g(理论的19%)的4/1反式/顺式非对映异构体混合物形式的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

实施例14A

8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1,3-二氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮

将8.80g(44.86mmol)4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己酮(实施例11A)、4.40g(89.72mmol)氰化钠和17.24g(179.44mmol)碳酸铵悬浮在102ml乙醇和102ml水中。将所得悬浮液在60℃搅拌20小时。将沉淀的产物滤除，用水洗涤，并减压干燥。这产生10.05g(理论的84%)的白色粉末形式的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.38-2.20(m,8H),3.31(s,H),7.87(s,0.25H),8.70(s,0.75H),10.64(s,1H)。

实施例15A

(5r,8r)-8-甲氧基-8-(甲氧基甲基)-1,3-二氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮

将28.6g(298mmol)碳酸铵和3.21g(65.5mmol)氰化钠溶解在130ml水中。在室温下，滴加10.3g(59.5mmol)来自实施例12A的化合物，并且将混合物在60℃搅拌过夜。将固体吸滤，用少量水洗涤并干燥。这产生8.67g(理论的60%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.26-1.34(m,2H),1.39-1.50(m,2H),1.71-1.88(m,4H),3.12(s,3H),3.23(s,2H),3.26(s,3H),8.43(s,1H),10.54(s,1H)。

实施例16A

8-甲氧基-8-(甲氧基甲基)-1,3-二氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮

5.74g(59.7mmol)碳酸铵和1.46g(29.8mmol)氰化钠溶解在33ml水中。在室温下，滴加2.57g(14.9mmol)的来自实施例12A的化合物于33ml乙醇中的溶液，并且将混合物在60℃搅拌过夜。将反应混合物浓缩至其原始体积的四分之一，并且用二氯甲烷和乙酸乙酯反复萃取，并且将有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生675mg(理论的19%)的非对映异构体混合物形式的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

实施例17A

1-氨基-4-甲氧基-4-甲基环己烷羧酸盐酸盐

将在970ml的30%浓度的氢氧化钾水溶液中的169.5g来自实施例13A的化合物在回流下加热20小时。在冷却之后，通过添加670ml浓盐酸水溶液将反应混合物调节至pH2，将沉淀物抽滤并将滤液浓缩。这产生110.7g的非对映异构体混合物形式的粗制产物，其仍含有盐并且在不进一步纯化的情况下进行反应。

实施例18A

1-氨基-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸

将10.00g(37.56mmol)8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1,3-二氮杂螺[4.5]癸烷-2,4-二酮(实施例14A)悬浮在125ml3摩尔氢氧化钠水溶液中，并且在回流条件下搅拌3天。随后，使用浓盐酸水溶液将pH调节至6，并且将沉淀的产物滤除，用水洗涤并减压干燥。这产生12.20g(理论的135%，产物含有无机盐)的白色粉末形式的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄):d[ppm]=1.64-1.79(m,3.6H),1.89-2.08(m,2.4H),2.24-2.40(m,2H),3.40(q,0.5H),3.42(q,2.5H)。

实施例19A

反式-1-氨基-4-甲氧基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸盐酸盐

将在52ml的30%浓度的氢氧化钾水溶液中的8.67g(35.8mmol)来自实施例15A的化合物在回流下加热36小时。在冷却之后，将反应混合物浓缩至其原始体积的四分之一，通过添加浓盐酸水溶液调节至pH2，并且蒸干。这产生40.4g的粗制产物，其仍含有盐并且在不进一步纯化的情况下进行反应。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.57-1.77(m,6H),1.87-2.05(m,2H),3.08(s,3H),3.23(s,3H),3.27(s,2H),8.50(s,3H)。

实施例20A

1-氨基-4-甲氧基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸盐酸盐

将在4ml的30%浓度的氢氧化钾水溶液中的670mg来自实施例16A的化合物在回流下加热18小时。在冷却之后，将反应混合物浓缩至其原始体积的四分之一，通过添加浓盐酸水溶液调节至pH2，并且浓缩。这产生4.70g的非对映异构体混合物形式的粗制产物，其仍含有盐并且在不进一步纯化的情况下进行反应。

实施例21A

反式-1-氨基-4-甲氧基-4-甲基环己烷羧酸甲酯盐酸盐

在氮气和5℃下，向在2500ml甲醇中的110.5g来自实施例17A的化合物滴加172ml(2.36mol)亚硫酰氯。将混合物在0℃搅拌30分钟并且在40℃搅拌24小时。在冷却之后，将固体抽滤，将滤液浓缩，将残留物在1000ml甲基叔丁基醚和300ml乙腈的混合物中搅拌10分钟，并且将固体抽滤。这产生37.1g(由实施例13A的4-甲氧基-4-甲基环己酮得到的理论值的12%)的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.08(s,3H),1.60-1.79(m,6H),1.94-2.11(m,2H),3.07(s,3H),3.75(s,3H),8.68(s,3H)。

实施例22A

1-氨基-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯

将12.20g(相当于约37.58mmol)的1-氨基-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸(实施例18A)悬浮在210ml甲醇中，在0℃添加10.4ml(142.80mmol)的亚硫酰氯。将混合物在回流下煮沸2小时并冷却，在0℃添加另外10.4ml(142.80mmol)亚硫酰氯，并且将混合物在回流下再煮沸2小时。将反应冷却，添加另外10.4ml(142.80mmol)亚硫酰氯，并且将混合物在回流下加热过夜，直至反应已完成。为了分离纯化，将约100ml甲醇蒸馏出，并且将浓缩物倾入1l饱和碳酸钠水溶液中。用乙酸乙酯萃取产物，并且将有机相在硫酸钠上干燥。蒸发浓缩产生7.01g(理论的73%)的淡黄色油形式的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.39-2.00(m,10H),3.28(q,3H),3.59(s,2.4H),3.60(s,0.6H)。

实施例23A

反式-1-氨基-4-甲氧基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯

在0℃下，向在400ml甲醇中的40.4g来自实施例19A的化合物滴加34.8ml(478mmol)亚硫酰氯。将混合物在0℃搅拌0.5小时，并且在40℃搅拌24小时。在冷却之后，将混合物浓缩，并且将残留物溶解在乙酸乙酯中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，将水相用乙酸乙酯和二氯甲烷反复萃取，并且将合并的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生7.16g(由实施例15A得到的理论的87%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.27-1.35(m,2H),1.46-1.55(m,2H),1.58-1.72(m,4H),1.74-1.84(m,2H),3.09(s,3H),3.23(s,2H),3.25(s,3H),3.60(s,3H)。

实施例24A

1-氨基-4-甲氧基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯

在℃下，向在50ml甲醇中的4.70g来自实施例20A的化合物滴加4.1ml(55.60mmol)亚硫酰氯。将混合物在0℃搅拌0.5小时，并且在40℃搅拌过夜。在冷却之后，将混合物浓缩，并且将残留物溶解在乙酸乙酯中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，将水相用乙酸乙酯反复萃取，并且将合并的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生392mg(由实施例16A得到的理论的61%)的非对映异构体混合物形式的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

实施例25A

反式-1-{[(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-甲基环己烷羧酸甲酯

将8.08g(31.0mmol)的(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酸(EP2029531A1和US2009/298828A1)溶解在12.9ml(428mmol)的亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃搅拌1小时，然后浓缩。将残留物溶解在70ml的乙腈中。向6.00g(25.2mmol)来自实施例21A的化合物添加乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液。将相分离，将水相用乙酸乙酯反复萃取，并且将合并的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。向残留物添加120ml乙腈和12.2g(88.3mmol)碳酸钾。在冰冷却下，滴加酰基氯溶液，并且将混合物在室温搅拌2天。然后，将混合物浓缩，将残留物溶解在水中并用二氯甲烷反复萃取，并且将合并的有机相用1N氯化氢水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液反复洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。将粗制产物通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)纯化。这产生7.87g(理论的68%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=0.98(s,3H),1.34-1.46(m,2H),1.54-1.64(m,2H),1.74-1.87(m,4H),2.28(s,3H),3.04(s,3H),3.51(s,3H),3.58(s,2H),7.23(d,1H),7.43(dd,1H),7.47-7.53(m,2H),7.55(d,1H),7.61-7.68(m,2H),8.23(s,1H)。

LC-MS(方法2):R_t=1.41min;MS(ESIpos):m/z=444[M+H]⁺。

实施例26A

顺式-1-{[(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯

在室温下，将5.00g(19.09mmol)顺式-1-氨基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯盐酸盐(EP1220841A2和WO2001/23354A3)、4.83g(47.73mmol)的三乙胺和117mg(0.955mmol)N,N-二甲基氨基吡啶溶解在40ml的二氯甲烷中。然后向混合物滴加5.33g(19.09mmol)的(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰氯(实施例2A)于40ml二氯甲烷中的溶液。将所得的反应混合物在室温搅拌过夜。为了分离纯化，将混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用5%浓度柠檬酸水溶液洗涤。在硫酸钠上干燥之后，将混合物通过蒸发而浓缩，并且将残留物通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)纯化。浓缩和干燥产生6.36g(理论的71%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.35-1.80(m,6H),2.05-2.18(m,2H),2.24(s,3H),2.25-2.40(m,1H),3.49(s,3H),3.56(s,2H),7.19(d,1H),7.40(dd,1H),7.42-7.52(m,3H),7.56-7.65(m,2H),8.34(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.50min;MS(ESIpos):m/z=468[M+H]⁺。

实施例27A

8-{[(5-溴-2-甲基苯基)乙酰基]氨基}-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-羧酸甲酯

在室温下，将5.47g(25.41mmol)8-氨基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-羧酸甲酯[T.Satoh等人,Tetrahedron63(2007),4806-4813]、3.86g(38.12mmol)三乙胺和155mg(1.27mmol)N,N-二甲基氨基吡啶溶解在45ml二氯甲烷中。然后向混合物滴加6.29g(25.41mmol)的(5-溴-2-甲基苯基)乙酰氯(实施例3A)于45ml二氯甲烷中的溶液。将所得的反应混合物在室温搅拌过夜。为了分离纯化，将混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。在硫酸钠上干燥之后，将混合物通过蒸发而浓缩，并且将残留物通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度/1%三乙胺)纯化。蒸发和干燥产生3.64g(理论的34%)的题述化合物，其在不进一步表征的情况下用于下一步。

实施例28A

反式-1-{[(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-甲基环己烷羧酸甲酯

将20.9g(75.0mmol)的来自实施例1A的化合物溶解在31.2ml(428mmol)的亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃搅拌1小时，然后浓缩。将残留物溶解在200ml的乙腈中。向16.0g(67.3mmol)来自实施例21A的化合物添加乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液。将相分离，将水相用乙酸乙酯反复萃取，并且将合并的有机相在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。向残留物添加250ml乙腈和28.5g(206mmol)碳酸钾。在冰冷却下，滴加酰基氯溶液，并且将混合物在室温搅拌过夜。然后，将混合物浓缩，将残留物溶解在水中并用二氯甲烷反复萃取，并且将合并的有机相用1N氯化氢水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液反复洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。为了进一步纯化，将残留物再次溶解在二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠水溶液反复洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生23.6g(理论的76%)的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=0.98(s,3H),1.32-1.45(m,2H),1.55-1.63(m,2H),1.74-1.86(m,4H),2.29(s,3H),3.04(s,3H),3.52(s,3H),3.58(s,2H),7.24(d,1H),7.46-7.55(m,2H),7.59-7.73(m,3H),8.23(s,1H)。

LC-MS(方法2):R_t=1.46min;MS(ESIpos):m/z=462[M+H]⁺。

实施例29A

顺式-1-{[(5-溴-2-甲基苯基)乙酰基]氨基}-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯

在室温下，将10.00g(38.22mmol)顺式-1-氨基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯盐酸盐(EP1220841A2和WO2001/23354A3)、9.67g(95.54mmol)的三乙胺和233mg(1.91mmol)N,N-二甲基氨基吡啶溶解在95ml的二氯甲烷中。然后向混合物滴加9.46g(38.22mmol)的(5-溴-2-甲基苯基)乙酰氯(实施例3A)于95ml二氯甲烷中的溶液。将所得的反应混合物在室温搅拌过夜。为了分离纯化，将混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用碳酸氢钠水溶液和5%浓度柠檬酸水溶液洗涤。在硫酸钠上干燥之后，将混合物通过蒸发而浓缩，并且将残留物通过硅胶上的色谱(流动相：二氯甲烷/甲醇梯度)纯化。蒸发和干燥产生8.84g(理论的53%)的题述化合物，其在不进一步表征的情况下用于下一步。

实施例30A

顺式-1-{[(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯

将28.3g(119mmol)顺式-1-氨基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯盐酸盐(描述于WO2007/048545)溶解在100ml水中，添加20.0g(238mmol)碳酸氢钠，并且将混合物用乙酸乙酯反复萃取。将结合的有机相在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩。这产生9.88g顺式-1-氨基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯。向于50ml乙腈中的5.93g(29.4mmol)顺式-1-氨基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯添加7.46g(54.0mmol)碳酸钾。用冰冷却，滴加6.85g(24.5mmol)来自实施例2A的化合物于50ml乙腈中的溶液，并且将混合物在室温下搅拌1天。然后，将混合物浓缩，将残留物溶解在水中并用二氯甲烷萃取，并且将合并的有机相用1N氯化氢水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩。这产生10.5g的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.05-1.25(m,2H),1.44-1.65(m,5H),2.01-2.12(m,2H),2.28(s,3H),3.04(d,2H),3.17(s,3H),3.51(s,3H),3.58(s,2H),7.23(d,1H),7.43(dd,1H),7.47-7.57(m,3H),7.62-7.68(m,2H),8.21(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.43min;MS(ESIpos):m/z=444[M+H]⁺。

实施例31A

顺式-1-{[(5-溴-2-甲基苯基)乙酰基]氨基}-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯

将55.3g(232mmol)顺式-1-氨基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯盐酸盐(描述于WO2007/048545，第144页)溶解在200ml水中，添加39.0g(465mmol)碳酸氢钠，并且将混合物用乙酸乙酯反复萃取。将结合的有机相在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩。这产生17.2g顺式-1-氨基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯。将1.90g(8.30mmol)的(5-溴-2-甲基苯基)乙酸(描述于EP1791816和WO2006/29799)溶解在3.5ml(47.3mmol)的亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃搅拌1小时，然后浓缩。将残留物溶解在15ml的乙腈中。向于20ml乙腈中的2.00g(9.94mmol)顺式-1-氨基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯添加2.52g(18.2mmol)碳酸钾。在冰冷却下，滴加酰基氯溶液，并且将混合物在室温搅拌24h。然后，将混合物浓缩，将残留物溶解在水中并且用二氯甲烷萃取，并且将合并的有机相用1N氯化氢水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩。这产生3.11g(理论的91%)的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.07-1.29(m,2H),1.47-1.66(m,5H),2.01-2.12(m,2H),2.20(s,3H),3.13(d,2H),3.22(s,3H),3.51(s,2H),3.54(s,3H),7.10(d,1H),7.30(dd,1H),7.41(d,1H),8.22(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.25min;MS(ESIpos):m/z=412[M+H]⁺。

实施例32A

1-{[(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯

将3.94g(15.44mmol)1-氨基-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯(实施例22A)和1.56g(15.44mmol)三乙胺溶解在56ml二氯甲烷中。向该溶液滴加溶解在56ml二氯甲烷中的3.92g(14.03mmol)(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰氯(实施例2A)，并且将反应混合物在室温搅拌过夜。为了分离纯化，将混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用碳酸氢钠水溶液和1%浓度柠檬酸水溶液洗涤。在硫酸钠上干燥之后，将有机相浓缩并且将产物干燥。这产生6.81g(理论的97%)的白色粉末形式的题述化合物。

LC-MS(方法1):R_t=1.51min;MS(ESIpos):m/z=498[M+H]⁺。

实施例33A

1-{[(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯

将20.50g(80.32mmol)1-氨基-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯(实施例22A)和8.13g(80.32mmol)三乙胺溶解在280ml二氯甲烷中。向该溶液滴加溶解在280ml二氯甲烷中的21.70g(73.02mmol)(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)酰基氯(实施例4A)，并且将反应混合物在室温搅拌过夜。为了分离纯化，将混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用碳酸氢钠水溶液和1%浓度柠檬酸水溶液洗涤。在硫酸钠上干燥之后，将有机相浓缩并且将产物干燥。这产生37.05g(理论的98%)的米色粉末形式的题述化合物。

LC-MS(方法1):R_t=1.51min;MS(ESIpos):m/z=516[M+H]⁺。

实施例34A

反式-1-{[(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯

将4.48g(16.1mmol)的来自实施例1A的化合物溶解在5.6ml(76.4mmol)的亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃搅拌1小时，然后浓缩。将残留物溶解在20ml的乙腈中。向于30mL乙腈中的3.10g(13.4mmol)来自实施例23A的化合物添加6.48g(46.9mmol)的碳酸钾。在冰冷却下，滴加酰基氯溶液，并且将混合物在室温搅拌过夜。然后，将混合物添加至冰水并且用二氯甲烷反复萃取，并且将合并的有机相用1N氯化氢水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液反复洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生6.59g(理论的96%)的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.32-1.49(m,2H),1.54-1.66(m,2H),1.70-1.91(m,4H),2.29(s,3H),3.09(s,3H),3.14(s,2H),3.20(s,3H),3.52(s,3H),3.57(s,2H),7.24(d,1H),7.46-7.56(m,2H),7.58-7.74(m,3H),8.27(s,1H)。

LC-MS(方法2):R_t=1.38min;MS(ESIpos):m/z=492[M+H]⁺。

实施例35A

1-{[(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-(甲氧基甲基)环己烷羧酸甲酯

将574mg(2.20mmol)的(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酸(EP2029531A1和US2009/298828A1)溶解在0.9g(12.5mmol)的亚硫酰氯中。将反应混合物在80℃搅拌1小时，然后浓缩。将残留物溶解在5ml的乙腈中。向于10mL乙腈中的390mg(1.69mmol)来自实施例24A的化合物添加816mg(5.90mmol)的碳酸钾。在冰冷却下，滴加酰基氯溶液，并且将混合物在室温搅拌过夜。然后，将混合物浓缩，将残留物溶解在冰水中并用二氯甲烷反复萃取，并且将合并的有机相用1N氯化氢水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液反复洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。这产生570mg的非对映异构体混合物形式的题述化合物，其在不进一步纯化的情况下进行反应。

LC-MS(方法2):R_t=1.36min;MS(ESIpos):m/z=474[M+H]⁺。

实施例36A

1-{[(5-溴-2-甲基苯基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯

将3.00g(11.75mmol)1-氨基-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯(实施例22A)和1.19g(11.75mmol)三乙胺溶解在40ml的二氯甲烷中。向该溶液滴加溶解在40ml二氯甲烷中的2.65g(10.69mmol)(5-溴-2-甲基苯基)酰基氯(实施例3A)，并且将反应混合物在室温搅拌过夜。为了分离纯化，将混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用碳酸氢钠水溶液和1%浓度柠檬酸水溶液洗涤。在硫酸钠上干燥之后，将有机相浓缩并且将产物干燥。这产生4.79g(理论的87%)的米色粉末形式的题述化合物。

LC-MS(方法1):R_t=1.33min;MS(ESIpos):m/z=468[M+H]⁺。

实施例37A

(5s,8s)-3-(5-溴-2-甲基苯基)-4-羟基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

向于100ml N,N-二甲基甲酰胺中的8.80g(20.17mmol)的顺式-1-{[(5-溴-2-甲基苯基)乙酰基]氨基}-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯(实施例29A)添加4.53g(40.34mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在80℃搅拌60分钟。为了分离纯化，将冷的反应混合物倾入800ml的冰水中，并且用盐酸水溶液酸化。将粗制产物滤除，并且通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)纯化。干燥产生5.23g(理论的64%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.40-1.50(m,2H),1.58-1.72(m,2H),1.77-1.86(m,2H),1.86-1.96(m,2H),2.07(s,3H),2.12-2.28(m,1H),7.14(d,1H),7.19(d,1H),7.33(dd,1H),8.33(s,1H),11.01(s,1H)。

LC-MS(方法3):R_t=1.18min;MS(ESIpos):m/z=406[M+H]⁺。

实施例38A

11-(5-溴-2-甲基苯基)-12-羟基-1,4-二氧杂-9-氮杂二螺[4.2.4.2]十四碳-11-烯-10-酮

向于43ml N,N-二甲基甲酰胺中的3.64g(8.54mmol)的8-{[(5-溴-2-甲基苯基)乙酰基]氨基}-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-羧酸甲酯(实施例27A)添加1.92g(17.08mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在80℃搅拌30分钟。为了分离纯化，将冷的反应混合物倾入500ml的冰水中，并且用盐酸水溶液酸化至pH=4。将粗制产物滤除。干燥产生2.49g(理论的74%)的题述化合物，其在不进一步表征的情况下用于下一步。

实施例39A

3-(5-溴-2-甲基苯基)-4-羟基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2,8-二酮

向于26ml丙酮和13ml水中的2.49g(6.32mmol)11-(5-溴-2-甲基苯基)-12-羟基-1,4-二氧杂-9-氮杂二螺[4.2.4.2]十四碳-11-烯-10-酮(实施例38A)添加192mg(1.01mmol)4-甲苯磺酸一水合物。将反应混合物在80℃搅拌过夜。为了分离纯化，将冷的反应混合物用水稀释，并且在旋转蒸发器上去除丙酮。将沉淀的粗制产物用乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，在硫酸钠上干燥并减压浓缩。干燥产生1.97g(理论的89%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.68-1.78(m,2H),2.09(s,3H),2.21-2.34(m,4H),2.64-2.78(m,2H),7.15(d,1H),7.23(d,1H),7.35(dd,1H),8.53(s,1H),11.12(s,1H)。

LC-MS(方法3):R_t=0.87min;MS(ESIpos):m/z=352[M+H]⁺。

实施例40A

(5r,8r)-3-(5-溴-2-甲基苯基)-4,8-二羟基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

向于8.3ml N,N-二甲基甲酰胺中的400mg(1.14mmol)3-(5-溴-2-甲基苯基)-4-羟基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2,8-二酮(实施例39A)添加521mg(1.60mmol)碳酸铯和975mg(6.85mmol)(三氟甲基)三甲基硅烷。将反应混合物在室温搅拌3小时。随后，将混合物用水稀释，用柠檬酸水溶液酸化至pH=4.5，并且用乙酸乙酯萃取。将有机层用水洗涤，在硫酸钠上干燥并减压浓缩。将残留物溶解在5ml四氢呋喃中，添加1ml4N盐酸水溶液，并且将混合物在室温搅拌1小时，然后用水稀释。用乙酸乙酯萃取粗制产物，并且将有机相在硫酸钠上干燥。在减压浓缩之后，残留物通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)纯化。蒸发和干燥产生367mg(理论的76%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄):d[ppm]=1.39-1.50(m,2H),1.84-1.98(m,4H),2.15(s,3H),2.30-2.43(m,2H),7.15(d,1H),7.27(d,1H),7.34(dd,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=0.96min;MS(ESIpos):m/z=420[M+H]⁺。

实施例41A

(5s,8s)-3-(5-溴-2-甲基苯基)-4-羟基-8-(甲氧基甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

向于11mL N,N-二甲基甲酰胺中的3.11g(7.54mmol)来自实施例31ml的化合物添加1.69g(15.1mmol)的叔丁醇钾。将反应混合物在80℃加热15分钟。在冷却之后，将混合物浓缩，并且将残留物溶解在水中，滴加1N氯化氢水溶液，并且将混合物搅拌0.5h。将沉淀物抽滤，用水洗涤并干燥。这产生2.83g(理论的96%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.22-1.44(m,4H),1.46-1.63(m,1H),1.65-1.75(m,2H),1.80-1.85(m,2H),2.11(s,3H),3.15(d,2H),3.23(s,3H),7.17(d,1H),7.22(d,1H),7.36(dd,1H),8.16(s,1H),10.89(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.05min;MS(ESIpos):m/z=380[M+H]⁺。

实施例42A

3-(5-溴-2-甲基苯基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

向于50ml N,N-二甲基甲酰胺中的4.70g(10.08mmol)的1-{[(5-溴-2-甲基苯基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯(实施例36A)添加2.26g(20.16mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在80℃搅拌60分钟。为了分离纯化，将冷的反应混合物倾入800ml的冰水中，并且用盐酸水溶液酸化。将粗制产物滤除并干燥。这产生3.68g(理论的84%)的米色粉末形式的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄):d[ppm]=1.39-2.45(m,11H),3.42-3.46(m,3H),7.12-7.18(m,1H),7.25-7.29(m,1H),7.32-7.38(m,1H)。

比较例：

对于实施例1-1

V.1-a(=WO10/063378第40页表1第20行的化合物)

(5r,8r)-3-(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-甲基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氮气下，向于75ml N,N-二甲基甲酰胺中的7.83g(17.6mmol)来自实施例25A的化合物添加2.18g(19.4mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在室温搅拌15分钟。然后，将混合物浓缩，将残留物溶解在冰水中，并且用1N氯化氢水溶液酸化，将混合物搅拌30分钟并抽滤，并且将沉淀物用水洗涤并干燥。为了进一步纯化，将产物溶解在1N氢氧化钠水溶液中，将混合物过滤，并且产物通过用1N盐酸水溶液酸化而沉淀，用水洗涤，滤除并干燥。这产生4.78g(理论的65%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.09(s,3H),1.12-1.20(m,2H),1.60-1.71(m,2H),1.71-1.80(m,2H),2.04-2.14(m,2H),2.18(s,3H),3.10(s,3H),7.30(d,1H),7.34(d,1H),7.46-7.52(m,3H),7.62-7.68(m,2H),8.15(s,1H),10.79(s,1H)。

LC-MS(方法2):R_t=1.23min;MS(ESIpos):m/z=412[M+H]⁺。

V.1-b

(5s,8s)-3-(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

向于68ml N,N-二甲基甲酰胺中的6.36g(13.59mmol)的顺式-1-{[(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯(实施例26A)添加3.05g(27.18mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在80℃搅拌60分钟。为了分离纯化，将冷的反应混合物倾入800ml的冰水中，并且用盐酸水溶液酸化。将粗制产物滤除，干燥并且通过硅胶上的色谱(己烷/乙酸乙酯梯度)纯化。蒸发产生4.1g(理论的69%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.40-1.55(m,2H),1.58-1.77(m,2H),1.78-2.02(m,4H),2.15(s,3H),2.17-2.30(m,1H),7.27(d,1H),7.32(d,1H),7.42-7.51(m,3H),7.58-7.66(m,2H),8.29(s,1H),10.90(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.32min;MS(ESIpos):m/z=436[M+H]⁺。

V.1-c

(5r,8r)-3-(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)-4,8-二羟基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氩气下，向在13ml脱气的1,2-二甲氧基乙烷中的125mg(0.30mmol)(5r,8r)-3-(5-溴-2-甲基苯基)-4,8-二羟基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮(实施例40A)添加24mg(0.030mmol)二氯[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]钯/二氯甲烷络合物。将混合物在室温搅拌5分钟，然后添加70mg(0.45mmol)(4-氯苯基)硼酸以及339mg(1.04mmol)碳酸铯于815μl脱气水中的溶液。将反应混合物在封闭的容器中、在微波辐射下于150℃加热10分钟。在冷却之后，向反应中添加100μl浓盐酸水溶液，并且将混合物减压浓缩。将残留物溶解在二氯甲烷中，并用5%浓度的柠檬酸水溶液(pH=4.0-4.5)和水洗涤。将有机相在硫酸钠上干燥并且通过蒸发而浓缩。粗制产物通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)并通过HPLC色谱(C18相，流动相：水/乙腈梯度/0.1%甲酸)纯化，产生17.4mg(理论的13%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄):d[ppm]=1.41-1.53(m,2H),1.85-2.01(m,4H),2.24(s,3H),2.33-2.46(m,2H),7.32(d,1H),7.35-7.42(m,3H),7.46(dd,1H),7.58(“d”,2H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.19min;MS(ESIpos):m/z=452[M+H]⁺。

对于实施例1-2

V.2-a(=WO10/063378第45页表2第10行的化合物)

(5r,8r)-3-(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-甲基-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氮气下，向于250ml N,N-二甲基甲酰胺中的23.5g(50.4mmol)来自实施例28A的化合物添加6.22g(55.4mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在室温搅拌15分钟。然后，将混合物浓缩，将残留物溶解在水中，并且用1N氯化氢水溶液酸化，将混合物搅拌30分钟并抽滤，并且将沉淀物用水洗涤并干燥。这产生21.4g(约90%纯，理论的89%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.08(s,3H),1.10-1.22(m,2H),1.56-1.81(m,4H),1.99-2.14(m,2H),2.19(s,3H),3.10(s,3H),7.29(d,1H),7.40(d,1H),7.46-7.56(m,2H),7.60-7.72(m,2H),8.05(s,1H),10.86(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.25min;MS(ESIpos):m/z=430[M+H]⁺。

V.2-b

(5s,8s)-3-(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氩气下，向于500ml脱气1,2-二甲氧基乙烷中的5.00g(12.4mmol)来自实施例37A的化合物添加1.01g(1.24mmol)的二氯[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]钯/二氯甲烷络合物。将混合物在室温搅拌5分钟，然后添加3.24g(18.5mmol)(4-氯-3-氟苯基)硼酸以及14.1g(43.3mmol)碳酸铯于30ml脱气水中的溶液。将反应混合物在回流下加热2h。在冷却之后，添加10ml浓盐酸水溶液，将水相分离，添加硫酸镁，混合物通过硅胶过滤，将滤饼用乙酸乙酯洗涤，并且浓缩混合物。通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)纯化粗制产物并从乙酸乙酯结晶，产生了2.48g(理论的44%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.45-1.57(m,2H),1.62-1.79(m,2H),1.81-2.05(m,4H),2.19(s,3H),2.20-2.33(m,1H),7.32(d,1H),7.41(d,1H),7.49-7.58(m,2H),7.64(t,1H),7.70(dd,1H),8.33(s,1H),10.95(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.34min;MS(ESIpos):m/z=454[M+H]⁺。

V.2-c

(5r,8r)-3-(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)-4,8-二羟基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氩气下，向于13ml脱气的1,2-二甲氧基乙烷中的125mg(0.30mmol)(5r,8r)-3-(5-溴-2-甲基苯基)-4,8-二羟基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮(实施例40A)添加24mg(0.030mmol)二氯[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]钯/二氯甲烷络合物。将混合物在室温搅拌5分钟，然后添加78mg(0.45mmol)(4-氯-3-氟苯基)硼酸以及340mg(1.04mmol)碳酸铯于815μl脱气水中的溶液。将反应混合物在封闭的容器中、在微波辐射下于150℃加热10分钟。在冷却之后，向反应中添加100μl浓盐酸水溶液，并且将混合物减压浓缩。将残留物溶解在二氯甲烷中，并用5%浓度的柠檬酸水溶液(pH=4.0-4.5)和水洗涤。将有机相在硫酸钠上干燥并且通过蒸发而浓缩。将粗制产物通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)纯化，产生68mg(理论的49%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,甲醇-d₄):d[ppm]=1.41-1.56(m,2H),1.85-1.99(m,4H),2.25(s,3H),2.32-2.48(m,2H),7.10-7.25(m,1H),7.34(d,1H),7.40(dd,1H),7.43-7.56(m,3H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.19min;MS(ESIpos):m/z=470[M+H]⁺。

对于实施例1-3

V.3-a(=V.1-a)=WO10/063378第40页表1第20行的化合物

V.3-b

(5s,8s)-3-(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-(甲氧基甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

向于35ml N,N-二甲基甲酰胺中的10.4g(23.4mmol)来自实施例30A的化合物添加5.26g(46.9mmol)的叔丁醇钾。将反应混合物在80℃加热15分钟。在冷却之后，将混合物浓缩，将残留物溶解在水中，并且将该溶液滴加至2N氯化氢水溶液。将残留物吸滤，用水洗涤并干燥。这产生9.3g的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.21-1.47(m,4H),1.48-1.64(m,1H),1.65-1.78(m,2H),1.81-1.97(m,2H),2.18(s,3H),3.16(d,2H),3.24(s,3H),7.30(d,1H),7.34(d,1H),7.44-7.53(m,3H),7.61-7.68(m,2H),8.13(s,1H),10.77(s,1H)。

LC-MS(方法3):R_t=1.25min;MS(ESIpos):m/z=412[M+H]⁺。

所述物质公开为WO07/048545的实施例I-1-a-5的异构体混合物。

对于实施例1-4

V.4-a(=V.2-a)=WO10/063378第45页表2第10行的化合物

V.4-b

(5s,8s)-3-(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-(甲氧基甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氩气下，向于213ml脱气1,2-二甲氧基乙烷中的2.00g(5.26mmol)来自实施例41A的化合物和215mg(0.26mmol)二氯[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]钯/二氯甲烷络合物添加1.10g(6.31mmol)(4-氯-3-氟苯基)硼酸以及6.00g(18.4mmol)碳酸铯于13ml脱气水中的溶液。将反应混合物在回流下加热2h。在冷却之后，添加2.5ml浓盐酸水溶液和硫酸钠，将混合物通过硅胶和硫酸钠过滤，将滤饼用乙酸乙酯洗涤，并且将滤液浓缩。将粗制产物通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)纯化。然后，将产物与碳酸氢钠水溶液一起搅拌，用浓盐酸水溶液酸化，抽滤，用水洗涤并干燥。这产生1.50g(理论的65%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.21-1.47(m,4H),1.48-1.64(m,1H),1.65-1.78(m,2H),1.81-1.97(m,2H),2.19(s,3H),3.16(d,2H),3.24(s,3H),7.31(d,1H),7.40(d,1H),7.48-7.57(m,2H),7.60-7.74(m,2H),8.13(s,1H),10.79(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.26min;MS(ESIpos):m/z=430[M+H]⁺。

表V给出了申请人认为是最接近的现有技术的比较例的概述。

表V

实施例：

实施例1-1

(5r,8r)-3-(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

向于68ml N,N-二甲基甲酰胺中的6.80g(13.66mmol)的1-{[(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯(实施例32A)添加3.07g(27.31mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在80℃搅拌60分钟。为了分离纯化，将冷的反应混合物倾入1500ml的冰水中，并且用盐酸水溶液酸化。将粗制产物滤除，干燥并通过色谱(柱：Chiralpak IA5μm,250×30mm；在0.1%甲酸存在下的己烷/乙醇梯度)预纯化。蒸发浓缩和从二乙醚结晶产生3.57g(理论的56%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.25-1.41(m,2H),1.83-1.99(m,4H),2.00-2.14(m,2H),2.15(s,3H),3.34(s,3H),7.28(d,1H),7.32(d,1H),7.42-7.51(m,3H),7.58-7.67(m,2H),8.41(s,1H),10.98(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.31min;MS(ESIpos):m/z=466[M+H]⁺。

实施例1-2

(5r,8r)-3-(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氩气下，向于28ml脱气的1,2-二甲氧基乙烷中的300.00mg(0.69mmol)3-(5-溴-2-甲基苯基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(三氟甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮(实施例42A)添加67.70mg(0.083mmol)二氯[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]钯/二氯甲烷络合物。将混合物在室温搅拌5分钟，然后添加216.83mg(1.24mmol)(4-氯-3-氟苯基)硼酸以及945.40mg(2.90mmol)碳酸铯于1ml脱气水中的溶液。将反应混合物在微波中于150℃加热40min。在冷却之后，添加0.4ml浓盐酸水溶液，将混合物过滤，将沉淀物用二氯甲烷以及用甲醇洗涤，并且将合并的有机相减压浓缩。将粗制产物通过硅胶上的色谱(流动相：己烷/乙酸乙酯梯度)预纯化。最终纯化通过RP色谱(流动相：水/甲酸/乙腈梯度)进行。这产生43mg(理论的13%)的题述化合物。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.27-1.39(m,2H),1.85-1.99(m,4H),2.00-2.13(m,2H),2.16(s,3H),3.34(s,3H),7.29(d,1H),7.38(d,1H),7.45-7.54(m,2H),7.57-7.70(m,2H),8.36(s,1H),10.97(s,1H)。

LC-MS(方法1):R_t=1.34min;MS(ESIpos):m/z=484[M+H]⁺。

或者，可以如下制备目标结构：

向于350ml N,N-二甲基甲酰胺中的35.00g(67.84mmol)的1-{[(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)乙酰基]氨基}-4-甲氧基-4-(三氟甲基)环己烷羧酸甲酯(实施例33A)添加15.22g(135.68mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在室温搅拌30分钟。为了分离纯化，将冷的反应混合物倾入8000ml的冰水中，并且用盐酸水溶液酸化。将粗制产物滤除，干燥并且通过硅胶色谱(二氯甲烷/乙酸乙酯梯度)预纯化。将获得的固体从二乙醚结晶。这产生9.33g(理论的28%)的题述化合物。

实施例1-3

(5r,8r)-3-(4'-氯-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(甲氧基甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氮气下，向于5ml N,N-二甲基甲酰胺中的570mg(1.20mmol)来自实施例35A的化合物添加148mg(1.32mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在室温搅拌15分钟。然后，将混合物浓缩，将残留物溶解在冰水中，并且用1N氯化氢水溶液酸化，将混合物搅拌30分钟并抽滤，并且将沉淀物用水洗涤并干燥。通过两个制备型HPLC[1.柱:Chromatorex C18,10μm,125mm

30mm;流动相:添加有0.1%甲酸的水/乙腈梯度;2.柱:Chiralpak IC,5μm,250mm×20mm;流动相:添加有0.1%甲酸的己烷/乙醇=80/20;流率:25ml/min;温度:RT]，分离非对映异构体。这产生105mg(理论的20%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.12-1.27(m,2H),1.48-1.65(m,2H),1.75-1.88(m,2H),1.99-2.14(m,2H),2.18(s,3H),3.15(s,3H),3.28(m,5H),7.30(d,1H),7.34(d,1H),7.44-7.54(m,3H),7.61-7.69(m,2H),8.10(s,1H),10.83(s,1H)。

LC-MS(方法2):R_t=1.19min;MS(ESIpos):m/z=442[M+H]⁺。

实施例1-4

(5r,8r)-3-(4'-氯-3'-氟-4-甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-甲氧基-8-(甲氧基甲基)-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮

在氮气下，向于60ml N,N-二甲基甲酰胺中的6.55g(13.3mmol)来自实施例34A的化合物添加1.64g(14.7mmol)叔丁醇钾。将反应混合物在室温搅拌15分钟。然后，将反应混合物添加至冰水，滴加1N氯化氢水溶液，直至达到pH为1-2，将混合物搅拌30分钟并吸滤，将滤饼用水洗涤，并且干燥沉淀物。为了进一步纯化，将产物溶解在1N氢氧化钠水溶液中，通过用1N盐酸水溶液酸化而沉淀，搅拌30分钟，用水洗涤，滤除并干燥。这产生6.00g(理论的98%)的题述化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):d[ppm]=1.12-1.26(m,2H),1.50-1.65(m,2H),1.76-1.89(m,2H),1.98-2.15(m,2H),2.19(s,3H),3.15(s,3H),3.28(s,5H),7.31(d,1H),7.39(d,1H),7.49-7.57(m,2H),7.64(t,1H),7.69(dd,1H),8.14(s,1H),10.82(s,1H)。

LC-MS(方法2):R_t=1.21min;MS(ESIpos):m/z=460[M+H]⁺。

3.试验

3.1人ACC酶试验

使用下述两个试验来获得ACC1和ACC2抑制数据。在大部分的情况中，为这两个测量制备测试物质的常用连续稀释系列，然后使用384孔50nl毛细管移液器(来自Genomics Solutions的Hummingbird^TM)从该稀释系列制得多个物质板拷贝(plate copies)。然后，这些在每一情况中用于ACC1和ACC2试验，从而为了最佳比较，使用相同物质稀释系列的拷贝来进行这两个酶抑制测量。

人ACC1酶试验

使用下面段落所述的hACC1试验来测量本发明的物质的hACC1抑制活性。

基本上，通过使用来自Promega的ADP-Glo^TM检测系统定量以酶反应副产物形式形成的二磷酸腺苷，从而测量酶活性。在该测试中，首先使用腺苷酸环化酶(“ADP-GLO试剂”)将在酶反应中未消耗的三磷酸腺苷(ATP)定量地转化成cAMP，然后停止腺苷酸环化酶(“激酶检测试剂”)，随后将所形成的ADP转化成ATP，其在基于荧光素酶的反应中被转化成连续发光(glow luminescence)信号。

所用的酶为C-端FLAG标记的重组人ACC1(乙酰辅酶A羧化酶α转录变体1)(GenBank Accession No.NM_198834)(氨基酸39末端)，其在杆状病毒感染的昆虫细胞(Hi5)中表达并由抗-FLAG亲和色谱法纯化。

对于该试验，将受试物质的DMSO的50nl100倍浓缩溶液用移液器转移到白色低容量384孔微量滴定板(Greiner Bio-One,Frickenhausen,Germany)中，添加hACC1的试验缓冲液[50mM HEPES/NaOH pH7.5、2mM MgCl₂、2mM柠檬酸钾、12mM NaHCO₃、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.005%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)]的2.5μl溶液，并且将混合物孵育15min以使物质在酶反应之前预结合到酶上。然后，通过添加三磷酸腺苷(ATP,100μM=>在5μl试验体积中的最终浓度:50μM)和乙酰辅酶A(20μM=>在5μl试验体积中的最终浓度:10μM)的试验缓冲液的2.5μl溶液来启动酶反应，并且将所得混合物在22℃孵育45min的反应时间。将hACC1的浓度调节至酶的各自活性并进行设定以使试验在线性范围内进行。典型的浓度在1.75ng/μl的范围内。通过添加2.5μl“ADP-GLO试剂”(1:1.5倍稀释的)而停止反应，并且将所得混合物在22℃孵育1h以将未反应的ATP完全转化成cAMP。然后添加2.5μl的“激酶检测试剂”(比制造商所推荐的更浓1.2倍)，将所得混合物在22℃孵育1h，然后使用合适的测量仪器(来自Perkin-Elmer的Viewlux or Topcount或来自BMGLabtechnologies的Pherastar)测量发光。发射光的量被用作所形成的ADP的量的测量值，由此为hACC1的酶活性的测量值。使数据归一化(在没有抑制剂=0%抑制的情况下的酶反应，没有酶之外的所有其它试验组分=100%抑制)。通常，在相同微量滴定板上以10种不同浓度来测试受试物质，每个浓度重复测试两次，并且使用内部软件通过4参数拟合来计算IC₅₀值，所述浓度为20μM至1nM(20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、82nM、27nM、9.2nM、3.1nM和1nM，配制稀释系列，然后是基于通过一系列1:3稀释产生的100倍浓溶液的试验)。

人ACC2酶试验

使用下面段落所述的hACC2试验来测量本发明的物质的hACC2-抑制活性。

基本上，通过使用来自Promega的ADP-Glo^TM检测系统定量以酶反应副产物形式形成的二磷酸腺苷，从而测量酶活性。在该测试中，首先使用腺苷酸环化酶(“ADP-GLO试剂”)将在酶反应中未消耗的三磷酸腺苷(ATP)定量地转化成cAMP，然后停止腺苷酸环化酶(“激酶检测试剂”)，随后将所形成的ADP转化成ATP，其在基于荧光素酶的反应中被转化成连续发光信号。

所用的酶为C-端FLAG标记的重组人ACC2(乙酰辅酶A羧化酶2,GenBank Accession No.NP_001084)(氨基酸27-末端)，其在杆状病毒感染的昆虫细胞(Hi5)中表达并由抗-FLAG亲和色谱法来纯化。

对于该试验，将受试物质的DMSO的50nl100倍浓缩溶液用移液器转移到白色低容量384孔微量滴定板(Greiner Bio-One,Frickenhausen,Germany)中，添加hACC1的试验缓冲液[50mM HEPES/NaOH pH7.5、2mM MgCl₂、2mM柠檬酸钾、12mM NaHCO₃、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.005%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)]的2.5μl溶液，并且将混合物孵育15min以使物质在酶反应之前预结合到酶上。然后，通过添加三磷酸腺苷(ATP,100μM=>在5μl试验体积中的最终浓度:50μM)和乙酰辅酶A(20μM=>在5μl试验体积中的最终浓度:10μM)的试验缓冲液的2.5μl溶液来启动酶反应，并且将所得混合物在22℃孵育45min的反应时间。将hACC2的浓度调节至酶的各自活性并进行设定以使试验在线性范围内进行。典型的浓度在2ng/μl的范围内。通过添加2.5μl“ADP-GLO试剂”(1:1.5倍稀释的)而停止反应，并且将所得混合物在22℃孵育1h以将未反应的ATP完全转化成cAMP。然后添加2.5μl的“激酶检测试剂”(比制造商所推荐的更浓1.2倍)，将所得混合物在22℃孵育1h，然后使用合适的测量仪器(来自Perkin-Elmer的Viewlux or Topcount或来自BMGLabtechnologies的Pherastar)测量发光。发射光的量被用作所形成的ADP的量的测量值，由此为hACC2的酶活性的测量值。使数据归一化(在没有抑制剂=0%抑制的情况下的酶反应，没有酶之外的所有其它试验组分=100%抑制)。通常，在相同微量滴定板上以10种不同浓度来测试受试物质，每个浓度重复测试两次，并且使用内部软件通过4参数拟合来计算IC₅₀值，所述浓度为20μM至1nM(20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、82nM、27nM、9.2nM、3.1nM和1nM，配制稀释系列，然后是基于通过一系列1:3稀释产生的100倍浓溶液的试验)。

3.2细胞试验

根据本发明，在基于细胞的试验中测试所述物质，即在用该物质孵育96小时之后该物质抑制肿瘤细胞增殖的能力。使用CellTiter-

发光细胞活性检测(Promega)来测试细胞活性。以2000-5000个细胞/孔的密度(取决于细胞系)将细胞接种在96孔微量滴定板上的100μl生长培养基中。对于所检测的每一细胞系，将细胞接种到单独的板上以测定t=0小时和t=96小时的发光。在37℃过夜孵育之后，测定t=0样品的发光值。用由生长培养基稀释的物质处理t=96小时时点的剂量板。然后，将细胞在37℃孵育96小时，然后测定t=96小时样品的发光值。对于数据分析，对经处理和未处理的样品，从t=96小时值减去t=0值。用该物质处理的样品与对照值之间的以百分比计的发光差值用于测定以百分比计的生长抑制。

在下列细胞系中测试物质，下列细胞系以示例性方式代表所述适应症：

细胞系	来源	指示
			MCF7	ATCC	激素受体阳性乳腺癌
KM12	NCI	结肠直肠癌
			PC3	DMSZ	雄激素受体阴性前列腺癌
H460	ATCC	非小细胞支气管癌

ATCC：美国典型培养物保存中心

NCI：国家癌症研究所

DMSZ：德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)

3.3在肿瘤组织和正常组织中ACC1表达的分析

使用微阵列测定ACC1表达。为此，分离各种肿瘤组织和相应的正常组织的RNA。该方法使用Trizol RNA提取试剂(Invitrogen)并随后使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)来纯化。此外，进行DNase I(Qiagen)消化以消除基因组DNA。对于质量控制，在Agilent Bioanalyzer2100Platform(Agilent Technologies)上的RNA LabChip辅助下分析总RNA，并且使用Peqlab NanoDrop系统测定RNA浓度。对于杂化，使用单周真核靶向标记检测，然后在AffymetrixGeneChip3000扫描仪(Affymetrix)上读取阵列。使用Expressionist Pro4.0Refiner(GeneData)软件进行评价和质量控制。

3.4测定辛醇/水分布系数(logP/D)、膜亲和性(logMA)和蛋白质与人血清白蛋白结合(K_d HSA)的试验

用于测定辛醇/水分布系数(logP/D)的试验：

分配系数辛醇/水P或D是评估膜渗透和渗透性的关键参数。其被定义为物质在两相体系辛醇/水中的平衡浓度的比。

P=分配(partition)

D=分布(distribution)

C_辛醇=所述物质在辛醇相中的浓度

C_水=所述物质在水相中的浓度

其通常以十进制对数(logP或logD)的形式表示。

logP描述了仅以其中性形式存在的物质的分布行为。logD描述了在特定pH下的物质的分布行为；这取决于物质的电离常数pKa，某些物质可以离子形式存在，而某些以中性形式存在。

使用等度HPLC法(HPLC=高效液相色谱)(文献：OECD Guidelinefor Testing of Chemicals No.117)测定活性化合物的logP/D。该方法基于受试物质的HPLC保留时间与具有已知分布系数的参比物质的HPLC保留时间的相关性。

以在DMSO(DMSO=二甲基亚砜)中10mM溶液形式来使用受试物质。10μl该溶液由比率为7+3的乙醇/水混合物而补充至100μl。

将九种参比物质单独溶解在甲醇中。浓度在表1中示出。将100μl的每一原液添加到HPLC小瓶并与300μl水混合。

表1

甲酰胺溶液用于测定滞留时间(hold-up time)。为此，将7mg的甲酰胺溶解在10ml的甲醇中。将100μl的该原液与500μl的甲醇和200μl的水混合。

使用1.00ml/min的流速来色谱分析所有溶液。

色谱条件：

HPLC系统 Waters Alliance HT2790

UV检测器 DAD Waters996

MS检测器 MS Micromass ZQ

HPLC软件来自Waters的MassLynx 4.1

柱 Spherisorb ODS 3μm4.6×60mm

流动相甲醇+含有0.01M乙酸铵(0.77g/升)的水

75+25,pH7.0

进样量：

甲酰胺 5μl

参比 5μl

受试物质 15μl

进样方案：

甲酰胺、参比、受试物质1、受试物质2、……甲酰胺、参比。

在200-400nm下，在二极管阵列检测器(DAD)中进行保留时间的评价。通过分子质量，使用下游质谱仪来检测受试物质的特性。

使用Waters软件Masslynx 4.1来评价HPLC运行。

使用软件“POW Determination” (专用开发)来计算logP/D值。

用于测定膜亲和性logMA和蛋白质与人血清白蛋白(HSA)的结合的试验：

通过Transil技术(文献：A. Loidl-Stahlhofen, A. Eckert, T. Hartmann,M.J Pharm Sci 90, 599-606 (2001))来进行膜亲和性和蛋白质与人血清白蛋白(HSA)的结合的测定。

(商购自德国莱比锡的Sovicell)为涂覆有磷脂酰胆碱(MA-Transil)或共价连接的人血清白蛋白(HSA-Transil)的双层膜的玻璃珠(直径10-12 μm)。

为了测定logMA和蛋白质与HAS的结合常数，使用可商购的TRANSIL Intestinal Absorption & HAS结合组合测试试剂盒。这是96孔微量滴定板(96孔-MTP)，其填充有Transil并且可用于测定在每一情况中8种活性化合物的MA-Transil和HSA-Transil结合。对于每一活性化合物，Transil板提供了一行12个孔。两个孔用作参比并且仅填充有pH7.4的缓冲液。五个其他的孔包含各种浓度递增的MA-Transil，五个剩余的孔包含各种浓度递增的HSA-Transil。

为测定活性化合物与Transil的结合，相对不含Transil的参比溶液，通过HPLC-MS联用(HPLC-MS=高效液相色谱/质谱法)量化含有Transil的孔的上清液。

以下是如何进行测定的各步骤：

从内部物质贮藏室，将活性化合物递送到96孔MTP中。该板被称为母板。每一孔包含在DMSO(二甲基亚砜)中的活性化合物的30μl的10mmol溶液。用在DMSO中的华法林的30μl的10mmol溶液填充在板的起点(孔A1)和终点(孔H12)的两个孔。华法林的膜亲和性以及对HAS的结合是已知的，其用于检测测量是否正确。将母板用于制备子板，所述子板含有使用比率为1+1的pH7.4缓冲液与DMSO的混合物的1-4000倍稀释液。每一孔的活性化合物浓度为2.5μmol/升，每一孔的体积为400μl。

使用Hamilton移液机械人Microlab STAR，将96个活性化合物从子板分配到总计12个Transil板上。从子板的每一孔移除12次20μl。Transil板的每一孔的浓度为0.25μmol/升，其相当于1至10倍的稀释。DMSO含量为5%。

将填充的Transil板各自再悬浮2分钟，然后允许在室温下静置至少2分钟，然后以600转/分钟离心5分钟。然后，用移液机械人从Transil板的每一孔移除20μl上清液并且将其转移至单独的微量滴定板。在此，在每一情况中，将4个Transil板的上清液合并在微量滴定板中，从而在最后存在3个合并的微量滴定板，其在每一情况中含有80μl溶液并且活性化合物浓度为62.5nM/孔。

在由HPLC-MS量化活性化合物之前，在通过单次注射子离子(daughter ion)的情况下必须对每一活性化合物进行优化，并且测定最佳电压。为此，移液机械人在单独微量滴定板中制备了在比率为8+2的乙腈/水混合物的1-10000000倍母板稀释液。

使用来自AB Sciex的软件Discovery Quant Optimize，由HPLC-MS测量该微量滴定板。使用来自AB Sciex的软件Discovery Quant Analyze，由HPLC-MS测量三个合并的微量滴定板。

色谱条件：

HPLC-MS系统： Agilent 1200 Rapid resolution HPLC

Sciex Triple Quad 5500质谱仪(来自AB Sciex)

PAL Autosampler DLW Option

软件： Analyst 1.4 (来自AB Sciex)

Discovery Quant Optimize (来自AB Sciex)

Discovery Quant Analyze (来自AB Sciex)

优化：

柱：毛细管

进样量： 5μl

流速： 0min ->80μl/min

0–0.19min ->80μl/min

0.20–0.65 min->30μl/min

0.66–0.7min ->150μl/min

流动相： A=乙腈+0.05%甲酸

B=水+0.05%甲酸

等度A:B8+2

分析：

柱： Poroshell 120 SB-C18 2.7μm 3×30 mm

进样量： 2μl

流速： 1ml/min

流动相：梯度

A=乙腈+0.05%甲酸

B=水+0.05%甲酸

0min ->95%A,5%B

0–1.0 min ->5%A,95%B，以线性方式增加

1.0–2.2min->5%A,95%B等度

2.21-2.3min->95%A,5%B等度

3.5通过平衡透析测定血浆蛋白结合

通过由特氟龙和半渗透膜(再生纤维素，MWCO12-14K)制成的Ht-透析装置(96孔)，由平衡透析来测定受试物质与血浆蛋白的结合。这分离了各自150μl的血浆侧和缓冲液侧(50mM磷酸盐缓冲液)。以2个浓度(通常3μM和0.3μM)向血浆侧添加受试物质并且与血浆蛋白结合。受试物质的未结合部分通过膜并且分布在任一层上，直至建立平衡(在37℃下，在约6-8h之后)。通过LC-MS分析测定在缓冲液侧和血浆侧上的物质浓度。对此，使两侧由缓冲液或血浆稀释成相同的基质(10%血浆)，然后用甲醇沉淀。由缓冲液和血浆浓度的商来计算游离(未结合)分数(fu)。与对照同时进行稳定性测试和回收测试。此外，用缓冲液透析缓冲液中的物质，从而检查与设备的非特异性结合以及平衡的建立。因为在孵育期间血浆蛋白的渗透压导致血浆的稀释(体积转移)，这种可能的误差由称重空白血浆样品来测定并包括在fu的计算中。平衡和血浆稳定性的建立应使值不低于80%并且回收应为至少30%。小于1%的游离部分被认为是高血浆蛋白结合，1-10%的游离部分被认为是中血浆蛋白结合，并且大于10%的游离部分被认为是低血浆蛋白结合。

3.6药代动力学参数

测定受试物质在大鼠和狗中的药代动力学参数

对此，将受试物质以溶解形式用于静脉内施用和胃内施用，其中以相容的量使用相容的增溶剂如PEG400和/或乙醇。

静脉内给药：

以0.1-1mg/kg的剂量施用受试物质。给药在雄性大鼠中为弹丸注射而在雌性狗中为输注(15min)。在弹丸注射之后的各个时点，以及在15分钟注射之前和之后的各个时点，通过导管从颈静脉(大鼠)或从隐静脉(狗)移除约100-150μl的血液样品。以抗凝剂形式向血液样品添加肝素锂并且将它们储藏在冷藏箱中，直至下一步处理需要时。在3000rpm离心样品15min之后，从上清液(血浆)采集100μl等分部分，并且通过添加400μl的冷ACN或甲醇(无水的)来沉淀。将沉淀的样品在20℃冻析(freeze out)过夜，然后在3000rpm再次离心15min，之后移除150μl澄清的上清液以测定浓度。通过具有连接的LCMS/MS检测的Agilent1200HPLC系统来进行分析。

PK参数的计算(使用PK计算软件，例如

)：CL血浆：受试物质的总血浆清除率(以l×kg/h计)；CL血液：受试物质的总血液清除率(以l×kg/h计)，其中(CL血液=CL血浆×Cp/Cb)；Vss：表观稳态分布容积(以l/kg计)；t1/2：规定间隔内的半衰期(在此：最终t的1/2，以h计)；AUCnorm：从0时点外推到无穷大的血浆浓度时间曲线下面积除以对体重而归一化的剂量(以kg×l/h计)；AUC(0-tn)norm：从0时点直至可测量血浆浓度的最后时点的血浆浓度时间曲线下积分面积除以对体重而归一化的剂量(以kg×l/h计)；Cmax：受试物质在血浆中的最大浓度(以μg/l计)；Cmax,norm：受试物质在血浆中的最大浓度除以对体重而归一化的剂量(以kg/l计)；Cb/Cp：血液与血浆浓度分布的比。

胃内给药：

使用饲管，将受试物质以0.3-1mg/kg剂量，以推注形式胃内给药至禁食的雄性大鼠或雌性狗。在给药之后的各个时点，通过导管从颈静脉(大鼠)或从隐静脉(狗)移除约100-150μl的血液样品。以抗凝剂形式向血液样品添加肝素锂并且将它们储藏在冷藏箱中，直至下一步处理需要时。在3000rpm离心样品15min之后，从上清液(血浆)采集100μl等分部分，并且通过添加400μl的冷ACN或甲醇(无水的)来沉淀。将沉淀的样品在-20℃冻析过夜，然后在3000rpm离心15min，之后移除150μl澄清的上清液以测定浓度。通过具有连接的LCMS/MS检测的Agilent1200HPLC系统来进行分析。

PK参数的计算(使用PK计算软件，例如

)：AUCnorm：从0时点外推到无穷大的血浆浓度时间曲线下面积除以对体重而归一化的剂量(以kg×l/h计)；AUC(0-tn)norm：从0时点直至可测量血浆浓度的最后时点的血浆浓度时间曲线下积分面积除以对体重而归一化的剂量(以kg×l/h计)；Cmax：受试物质在血浆中的最大浓度(以μg/l计)；Cmax,norm：受试物质在血浆中的最大浓度除以对体重而归一化的剂量(以kg/l计)；t1/2：规定间隔内的半衰期(在此：最终t的1/2，以h计)；Fobs%：所观察到的口服生物利用度，胃内给药之后的AUC(0-tn)norm除以静脉内给药之后的AUC(0-tn)norm；tmax：在血浆中测量到受试物质的最大浓度时的时点。

为计算受试物质的相对生物利用度，将微晶物质悬浮液的胃内给药后的AUC(0-tn)norm除以物质溶液的给药后的AUC(0-tn)norm。

3.7.体内活性

异种移植模型

在免疫抑制小鼠中的异种移植模型用于测定活体生物体中的抗肿瘤活性。

为此，首先使用下列方案来测定最大耐受剂量(MTD)：

在3周的时段内，向雌性裸小鼠(NMRI-裸(nu/nu)小鼠，Taconic M&BA/S)每天口服给药确定剂量的受试物质，并且每天观察小鼠的死亡率和体重。MTD定义为在没有任何动物在治疗阶段期间死亡的情况下以及在与初始体重相比没有任何大于10%的体重损失的情况下可给药的最高剂量。

然后将异种移植模型用于测定抗肿瘤活性，在所述异种移植模型中受试物质以其MTD给药，或者如果不能提前测定MTD则以可在标准载剂中配制的最高剂量(并且在某些情况下还以更低的剂量)给药。主要使用的是在雄性裸小鼠(NMRI-裸(nu/nu)小鼠，Taconic M&B A/S)中具有非激素依赖性人PC-3细胞的前列腺癌模型。为此，将3百万个肿瘤细胞(悬浮在培养基+Matrigel1:1中，最终0.1ml)皮下注入每一动物的患侧。当肿瘤扩散至20-30mm²的面积时，将小鼠随机分成治疗组，并且开始治疗。然后持续治疗，直至在仅给药受试物质的载剂的对照组中或者在一个治疗组中已经达到130-160mm²的平均肿瘤尺寸，并且每周2-3次测量肿瘤面积和体重。在该时点，在所有组中终止实验并且称重所准备的肿瘤。

使用对最终肿瘤重量的效应计算作为主要成功参数的T/C值：治疗组中的平均肿瘤重量除以载剂组中的肿瘤重量平均值。

4.结果

4.1.酶试验

表2总结了来自酶试验的实施例和比较例的结果。对于选择性的准确测定，将在每一情况中的对ACC1和ACC2的抑制的测量值(在每一情况中的IC50测定)与用于这两个试验的相同物质稀释系列的拷贝成对(pair bypair)比较。如果ACC1或ACC2的IC50测定由于不充足的数据品质而未评价，则放弃这两个测量值并且不列在表中。然后，测定ACC1的抑制对ACC2的抑制的选择性以作为在各测量中观察到的选择性的平均值。

表2

这些数据表明，没有反式-甲氧基的化合物对人ACC2具有显著较差的选择性。现有技术中在氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮环系统的8位具有反式-甲氧基的一些相关结构也强烈抑制ACC1并对ACC2有选择性。现有技术结构的这种性质是未知的、非显而易见的，并且在不付出超出常情的努力的情况下是不能被发现的。

4.2细胞试验

表3总结了来自实施例和比较例的细胞试验结果。

表3

4.3在肿瘤组织和正常组织中的ACC1表达

通过微阵列测定在肿瘤组织和相应的正常组织中的ACC1表达(图1)。与正常组织相比，在乳腺癌、结肠直肠癌、支气管癌和胰腺癌中，ACC1的表达显著上调。

4.4辛醇/水分布系数(logP/D)、膜亲和性(logMA)和蛋白质与人血清白蛋白的结合(K_d HSA)

表4示出所测定的logP/D、logMA和K_d HSA值。

使用Discovery Quant Analyze进行HPLC峰的评价。使用由Sovicell提供的Excel工作簿来计算结果(logMA和对HAS的结合常数K_d)。

表4

实施例	logP/D pH7.4	logMA	K_d HSA[μmol/l]
				1-1	2.44(2.4-2.5,n=5)	1.78(1.6-1.9,n=5)	1.73(1.32-2.16,n=5)
V.1-a	2.51(2.4-2.6,n=7)	1.4(0.9-1.7,n=7)	4.84(3.66-6.18,n=7)
				V.1-b	2.23(1.8-2.5,n=3)	2.38(2.0-2.7,n=4)	3.07(2.38-2.8,n=3)
V.1-c	1.6(n=1)	2.1(n=1)	6.9(n=1)
				1-2	2.45(2.4-2.5,n=2)	1.8(n=1)	1.79(n=1)
V.2-a	2.52(2.5-2.6,n=8)	1.67(1.2-1.9,n=6)	2.8(2.42-3.67,n=6)
				V.2-b	2.55(2.4-2.7,n=2)	2.55(2.4-2.7,n=2)	1.43(1.16-1.7,n=2)
V.2-c	1.3(n=1)	2.3(n=1)	1.38(n=1)
				1-3	2.3(n=1)	<1.0(n=1)	4.8(n=1)
V.3-a	2.51(2.4-2.6,n=7)	1.4(0.9-1.7,n=7)	4.84(3.66-6.18,n=7)

V.3-b	2.5(2.5,n=4)	2.08(1.9-2.3,n=4)	4.2(3.41-4.89,n=4)
				1-4	2.38(2.3-2.4,n=5)	1.14(0.9-1.3,n=5)	2.85(1.96-3.4,n=5)
V.4-a	2.52(2.5-2.6,n=8)	1.67(1.2-1.9,n=6)	2.8(2.42-3.67,n=6)
				V.4-b	2.57(2.5-2.6,n=3)	2.13(2.1-2.2,n=3)	3.64(2.48-5.18,n=3)

4.5通过平衡透析测定的血浆蛋白结合

表5示出通过平衡透析测定的与人、小鼠和大鼠的血浆蛋白的结合。

表5

4.6药代动力学参数

从大鼠获得的药代动力学参数

表6示出从大鼠获得的药代动力学参数。

表6

4.7体内功效

小鼠中的最大耐受剂量(MTD)

向雌性裸小鼠(NMRI nu/nu)给药实施例1-1、V.1-a/V.3-a、V.2-a/V.4-a和1-4。

剂量：参见表7

给药途径：口服

载剂： PEG400/乙醇/Solutol HS 15 (70/5/25, v/v/v)

(Solutol HS15：12-羟基硬脂酸的聚氧化乙烯酯)

给药体积： 10ml/kg

方案：参见表7

在治疗阶段之后是21天的观察阶段。在该时段内出现的死亡数和对体重的作用在表7中总结。

表7

因此，对于以下实施例，每天给药一次的21天治疗的MTD：

因此，实施例1-4的每天给药两次的21天治疗的MTD高于100mg/kg。

在小鼠的PC3异种移植模型中的体内功效

然后，向PC-3前列腺癌异种移植模型的雄性裸小鼠(NMRI nu/nu)给药实施例1-1、V.1-a/V.3-a、1-2、V.2-a/V.4-a和1-4。

表8

将治疗功效定义为T/C<=0.50。将良好的耐受性定义为最大体重变化<=-10%且受试动物100%存活。

因此，在80mg/kg给药且每天给药2次时，观察到实施例1-1的疗效和良好的耐受性。

因此，在100mg/kg给药且每天给药1次时，观察到实施例V.1-a/V.3-a的疗效和良好的耐受性，而在100mg/kg给药且每天给药2次时，观察到疗效但没有良好的耐受性。

因此，在40mg/kg和80mg/kg(在每一情况中每天给药2次)给药时，观察到实施例1-2的疗效和良好的耐受性。

因此，在80mg/kg给药且每天给药1次时，观察到实施例V.2-a/V.4-a的疗效和良好的耐受性，而在40mg/kg给药且每天给药1次时，没有观察到疗效，并且在80mg/kg给药且每天给药2次时，没有观察到良好的耐受性。

因此，在80mg/kg且每天2次给药时，观察到实施例1-4的疗效和良好的耐受性。

人药代动力学参数和人治疗剂量的预测

鉴于血浆的游离部分(fu)方面的种间差异，基于由大鼠获得的体内PK参数(单一种标度(single species scaling))预测人药代动力学(PK)参数(表9)。基于在小鼠(nu/nu小鼠)PC3肿瘤模型中测量的体内功效的血浆浓度时间曲线测定有效AUC(曲线下面积)。使用预测的人清除率(CL)，假设100%生物利用度(F=1)并根据下列公式使用动物模型中的有效AUC，从而测定人治疗剂量。

表9

ther.=治疗的

calc.=计算的

pred.=预测的(fu-修正)

附图：

图1：在肿瘤组织和相应的正常组织中的ACC1表达。

Claims

1.式(I)的化合物及其盐

其中

R¹表示三氟甲基或甲氧基甲基，并且

R²表示氢或氟。

2.化合物

3.如权利要求1或2所述的化合物，其用作药物。

4.如权利要求3所述的化合物，其用于预防和/或治疗肿瘤病症。

5.如权利要求4所述的化合物，其用于预防和/或治疗乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌或非小细胞支气管癌。

6.如权利要求5所述的化合物，其用于预防和/或治疗激素受体阳性乳腺癌或雄激素受体阴性前列腺癌。

7.如权利要求1所述的式(I)的化合物用于制备药物的用途。

8.如权利要求7所述的式(I)的化合物的用途，其用于制备预防和/或治疗肿瘤病症的药物。

9.如权利要求8所述的用途，其用于制备预防和/或治疗乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌或非小细胞支气管癌的药物。

10.如权利要求9所述的用途，其用于制备预防和/或治疗激素受体阳性乳腺癌或雄激素受体阴性前列腺癌的药物。

11.如权利要求1所述的式(I)的化合物用于预防和/或治疗人类或其它哺乳动物的病症的用途。

12.如权利要求11所述的用途，其用于预防和/或治疗肿瘤病症。

13.如权利要求12所述的用途，其用于预防和/或治疗乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌或非小细胞支气管癌。

14.如权利要求13所述的用途，其用于预防和/或治疗激素受体阳性乳腺癌或雄激素受体阴性前列腺癌。

15.如权利要求1所述的式(I)的化合物，其与其它活性化合物组合。

16.药物制剂，其包含如权利要求1所述的式(I)的化合物。