Substituierte 3-(Biphenyl-3-yl)-4-faydroxy-8-metfaoxy-l-azaspiro [4.5] dec-3-en-2-one
Die vorliegende Erfindung betrifft substituierte 3 -(Biphenyl-3 -yl)-4-hydroxy-8-methoxy- 1 - azaspiro[4.5]dec-3-en-2-one, insbesondere zu therapeutischen Zwecken, pharmazeutis che Mittel enthaltend die erfindungsgemäß en Verbindungen und deren Verwendung in der Therapie, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Acetyl-CoA Carboxylasen (ACCs) spielen eine Schlüsselrolle in der zellulären Fettsäure - Homöostase. ACCs sind Biotin-enthaltende Enzyme, die die Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA in einer ATPabhängigen Weise katalysieren (Kim, 1997; Harwood, 2005; Tong, 2005). Diese Reaktion, die als zwei halbe Reaktionen abläuft, eine Biotin-Carboxylase (BC) Reaktion und eine Carboxyltrans f eras e (CT) Reaktion, ist der erste einleitende Schritt in der Fettsäurebiosynthese und ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für den Pathway.
Es sind zwei humane ACC-Isoformen bekannt, ACCl und ACC2, die von zwei unterschiedlichen Genen codiert werden (LuTFI ABU-ELHEIGA et al, 1995, Jane WIDMER, et al. 1996). ACCl ist in lipogenem Gewebe exprimiert (Leber, Fettgewebe), im Zytosol lokalisiert, und füllt den Malonyl-CoA Pool, der als C2-Einheiten Donor für die de novo Synthese von langkettigen Fettsäuren durch FASN und anschließende Kettenverlängerung dient. ACC2 ist vor allem in oxidativen Geweben exprimiert (Leber, Herz, Skelettmuskel) (Bianchi et al., 1990; Kim, 1997), mit den Mitochondrien assoziiert, und reguliert einen zweiten Pool von Malonyl-CoA. Dieser steuert die Fettsäureoxidation durch die Hemmung der C arnitinpalmityltrans f eras e I, dem Enzym das den Eintritt langkettiger Fettsäuren in die Mitochondrien für die ß-Oxidation erleichtert (Milgraum LZ, et al.,1997, Widmer J. et al., 1996). Beide Enzyme zeigen eine sehr große S e quenzhomologie und sind ähnlich reguliert durch eine Kombination von transkriptionellen, translationellen und prosttranslationellen Mechanismen. In Menschen als auch in Tieren ist die ACC-Aktivität streng durch eine Reihe von diätätischen, hormonellen und anderen
physiologischen Mechanismen kontrolliert wie beispielsweise über eine vorwärts allosterische Aktivierung durch Citrat, eine Feedback- Inhibition durch langkettige Fettsäuren, reversible Phosphorylierung und/oder Inaktivierung bzw. Modulation der Enzymproduktion durch veränderte Genexpression.
ACCl Knockout-Mäuse sind embryonal letal (S Winnen, et al., 2006, Abu-Elheiga, et al. 2005). ACC2 Knockout-Mäuse zeigen reduzierte Malonyl-CoA-Spiegel in Skelett und Herzmuskel, erhöhte Fettsäureoxidation im Muskel, erniedrigte Leberfettlevel, erniedrigte Mengen an Gesamtkörperfett, erhöhte Level von UCP3 im Skelettmuskel (als Zeichen einer erhöhten
Energieaufwendung), ein erniedrigtes Körpergewicht, erniedrigte Spiegel von freien Fettsäuren im Plasma, erniedrigte Plasma-Glucose-Spiegel, erniedrigte Mengen an Glycogen im Gewebe, und sie
sind geschützt vor Nahrungs-induziertem Diabetes und Fettleibigkeit (Abu-Elheiga et al., 2001 , 2003; Oh et al., 2005).
Zusätzlich zur Beteiligung an der Fettsäuresynthese in lipogenen Geweben und der
Fettsäureoxidation in oxidativen Geweben, wurde eine Hochregulation von ACC und gesteigerte Lipogenese in vielen Tumorzellen beobachtet (Swinnen, et al., 2004, Heemers, et al., 2000, Swinnen, et al., 2002, Rossi, et al., 2003, Milgraum, et al., 1997, Yahagi, et al., 2005). Dieser Phenotyp trägt sehr wahrscheinlich zur Entwicklung und Progression von Tumoren bei, die regulatorischen Mechanismen hierfür müssen jedoch noch geklärt werden.
EP0454782 und US5759837 schützen die Verwendung von F etts äure synthe s einhibitoren zur Inhibierung von Tumorzellwachstum. Zyklische Ketoenole sind nicht offenbart.
Es wurde eine Reihe von Substanzen entdeckt, die in der Lage sind, Pflanzen und/oder Insekten- ACC zu inhibieren.
Die PCT Patent Applikation PCT/EP99/01787, publiziert als WO 99/48869, die dem europäischen Patent EP 1 066 258 B I entspricht, bezieht sich auf neue Arylphenyl-substituierte zyklische Ketoenole, zu einer Mehrheit der Prozesse für ihre Herstellung und ihre Nutzung als Pestizide und Herbizide.
Von 3 -Acyl-pyrrolidin-2,4-dionen sind pharmazeutische Eigenschaften vorbeschrieben (S. Suzuki et al. Chem. Pharm. Bull. 1 1 1 20 (1967)). Weiterhin wurden N-Phenylpyrrolidin-2,4-dione von R. Schmierer und H. Mildenberger (Liebigs Ann. Chem. 1985, 1095) synthetisiert. Eine biologische Wirksamkeit dieser Verbindungen wurde nicht beschrieben.
In EP-A-0 262 399 und GB-A-2 266 888 werden ähnlich strukturierte Verbindungen (3-Aryl-pyr- rolidin-2,4-dione) offenbart, von denen jedoch keine herbizide, Insektizide oder akarizide Wirkung bekannt geworden ist. Bekannt mit herbizider, insektizider oder akarizider Wirkung sind unsub- stituierte, bicyclische 3 -Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate (EP-A-355 599, EP-A-415 21 1 und JP-A-12-053 670) sowie substituierte monocyclische 3 -Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate (EP-A- 377 893 und EP-A-442 077).
Weiterhin bekannt sind polycyclische 3 -Arylpyrrolidin-2,4-dion-Derivate (EP-A-442 073) sowie 1 H-Arylpyrrolidin-dion-Derivate (EP-A-456 063, EP-A-521 334, EP-A-596 298, EP-A-613 884, EP-A-613 885, WO 95/01 971, WO 95/26 954, WO 95/20 572, EP-A-0 668 267, WO 96/25 395, WO 96/35 664, WO 97/01 535, WO 97/02 243, WO 97/36 868, WO 97/43275, WO 98/05638, WO 98/06721, WO 98/25928, WO 99/24437, WO 99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/23354, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 03/062244, WO 2004/007448,
WO 2004/024 688, WO 04/065366, WO 04/080962, WO 04/111042, WO 05/044791,
WO 05/044796, WO 05/048710, WO 05/049569, WO 05/066125, WO 05/092897,
WO 06/000355, WO 06/029799, WO 06/056281, WO 06/056282, WO 06/089633,
WO 07/048545, DEA 102 00505 9892, WO 07/073856, WO 07/096058, WO 07/121868, WO 07/140881, WO 08/067873, WO 08/067910, WO 08/067911, WO 08/138551,
WO 09/015801, WO 09/039975, WO 09/049851, WO 09/115262, WOlO/052161, WO 10/063378, WO 10/063670, WO 10/063380, WO10/066780, WO 10/102758, WO2010/135914,
WO2011/067131, WO2011/067135, WO2011/067203 und WO2011/067240. Außerdem sind ketalsubstituierte 1 -H-Arylpyrrolidin-2,4-dione aus WO 99/16748 und (spiro)- ketalsubstituierte N-Alkoxy-alkoxy-substituierte Aryl-pyrrolidindione aus JP-A-14 205 984 und Ito M. et al. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 67, 1230-1238, (2003) bekannt. Außerdem sind aus WO 06/024411 herbizide Mittel enthaltend Ketoenole bekannt. 4 '-Biphenyl-substituierte Tetronsäurederivate werden in WO 2008/022725 für die Therapie viraler Erkrankungen offenbart.
WO 2005/089118 und WO2007/039286 offenbaren generisch stickstoffhaltige bizyklische Strukturen für die Therapie, wobei 5 '-Biphenyl-substituierte zyklische Ketoenole nicht spezifisch genannt sind.
Den strukturell nächstliegenden Stand der Technik könnten Verbindungen darstellen, die anstelle einer Trifluormethylgruppe oder einer Methoxymethylgruppe in Position 8 des Azaspiro[4.5]dec- 3 -en-2-on-Ringsystems eine Methylgruppe besitzen. Derartige Verbindungen gehören teilweise zum Stand der Technik und sind zum Beispiel in der WO10/063378 offenbart.
Den strukturell nächstliegenden Stand der Technik könnten auch Verbindungen darstellen, die anstelle einer Methoxygruppe in Position 8 des Azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on-Ringsystems ein Wasserstoffatom besitzen. Derartige Verbindungen gehören teilweise zum Stand der Technik und sind zum Beispiel in der WO 07/048545 (Beispiel I-l-a-5) offenbart.
Die WO10/063378 und die WO 07/048545 betreffen dabei Erfindungen auf einem anderen Sachgebiet, nämlich auf dem Gebiet der Herbizide.
Die nahe gelegenen Strukturen des Standes der Technik sind ausnahmslos auf dem Gebiet der Herbizide, Insektizide oder Fungizide bekannt. Für diese Strukturen ist es zum einen nicht bekannt, zum anderen nicht vorhersehbar, ob sie humanes ACC inhibieren. Umso mehr ist es für diese
Strukturen unbekannt und unvorhersehbar, ob sie eine Selektivität gegen eine der humanen ACC- Isoformen besitzen.
Ausgehend von diesem Stand der Technik, ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Strukturen für die Therapie von menschlichen und tierischen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen.
Insbesondere sollen die erfindungsgemäßen Strukturen zur Prophylaxe und Therapie von
Tumorerkrankungen geeignet sein und Vorteile gegenüber im Stand der Technik bekannten Strukturen aufweisen.
Dabei sollen vor allem Strukturen für die Therapie von Erkrankungen zur Verfügung gestellt werden, die humanes ACCl stark inhibieren. Die gesuchten Strukturen sollen dabei humanes ACCl stärker inhibieren als humanes ACC2, d.h. eine Selektivität gegen humanes ACC2 besitzen.
Vorzugsweise sollen Strukturen für die Therapie von Erkrankungen zur Verfügung gestellt werden, die zusätzlich auch eine, besser mehrere oder am besten sogar alle der folgenden Eigenschaften besitzen: sie inhibieren humanes ACCl nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen mit einem IC50 von weniger als 300 nM, besser von weniger als 200 nM, noch besser von weniger als 100 nM im beschriebenen Assay, sie inhibieren humanes ACC2 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen mit einem IC50 von mehr als 0.5 μΜ, besser von mehr als 1.5 μΜ, noch besser von mehr als 2 μΜ im beschriebenen Assay, das Verhältnis des IC50 für die Inhibition von humanem ACC2 zum IC50 für die Inhibition von humanem ACCl nach Einf achme s sung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen beträgt mindestens einen Faktor 8, besser mindestens einen Faktor 15, noch besser mindestens einen Faktor 20, sie inhibieren die Tumorzellpro liferation von MCF7-Zelllinien nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen mit einem IC50 von weniger als 250 nM, besser weniger als 100 nM, noch besser weniger als 50 nM im beschriebenen Assay, sie besitzen einen logP/D-Wert von kleiner 3, besser kleiner 2.5 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen im beschriebenen Assay,
sie besitzen einen logMA-Wert von kleiner 3, besser kleiner 2.5, noch besser kleiner 2 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen im beschriebenen Assay, sie besitzen eine Proteinbindungskonstante an HSA von größer 1 μηιοΐ/ΐ nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen im beschriebenen Assay, sie haben bezüglich der Bindung an humanes Plasmaprotein eine freie Fraktion von mehr als 0.1%, besser von mehr als 0.2% nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen im beschriebenen Assay, sie haben ein Verhältnis der freien Fraktionen bezüglich der Bindung an Mäuseplasmaprotein und humanes Plasmaprotein von einem Faktor von weniger als 15, besser weniger als 10 nach Einfachmessung oder besser im Mittelwert aus mehreren Messungen, sie haben ein Verhältnis der freien Fraktionen bezüglich der Bindung an das Plasmaprotein verschiedener Spezies, welches zu einer akzeptablen, abgeschätzten Humandosis führt, sie haben pharmakokinetische Parameter, welche zu einer akzeptablen, abgeschätzten Humandosis führen und die Verabreichung als Medikament erlauben. sie haben eine niedrige Clearance. sie haben eine hohe Bioverfügbarkeit, sie haben ein moderate s bis hohes Verteilungsvolumen, sie haben eine akzeptable relative Bioverfügbarkeit, welche zu einer akzeptablen, abgeschätzten Humandosis führt und die Verabreichung als Medikament erlaubt, sie haben eine abgeschätzte humane Halbwertzeit von nicht mehr als zwei Wochen, sie haben eine in vivo Wirkung im PC3 -Xenograft-Maus-Modell, sie haben eine Wirkung im PC3 -Xenograft-Maus-Modell mit Plasmaspiegeln, die zu einer akzeptablen, abgeschätzten Humandosis führen, die für sie nach dem beschriebenen Verfahren abgeschätzte menschliche Tagesdosis liegt unter 2 g, besser unter 1 g pro Patient.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Verbindungen der Formel (I)
wobei
R1 für eine Trifluormethyl- oder Methoxymethylgruppe und
R■ für Wasserstoff oder Fluor steht
sowie deren Salze
besonders gut für die Therapie von Erkrankungen geeignet sind und die erfindungsgemäße Aufgabe lösen.
Dabei war nicht vorhersehbar, ob und welches der als Insektizide oder Herbizide bekannten Strukturen die erfindungsgemäße Aufgabe löst, nämlich eine Struktur darstellt, die bei der Therapie von menschlichen und/oder tierischen Erkrankungen eingesetzt werden kann. Umso weniger war es vorhersehbar, ob und welches der als Insektizide oder Herbizide bekannten Strukturen humanes ACC inhibiert, geschweige denn ob und welches eine Selektivität gegen eine der humanen Isoformen aufweist.
Aus der großen Gruppe der als Insektizide, Fungizide oder Herbizide bekannten zyklischen Ketoenole haben sich die Verbindungen der Formel (I) überraschenderweise durch eine gute Enzyminhibition des humanen ACCl hervorgehoben. Dabei weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine erhöhte Selektivität gegen humanes ACC2 auf und inhibieren vor allem ACCl . Diese Eigenschaft war nicht vorhersehbar und qualifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen für eine Therapie mit verringerten Nebenwirkungen. Unerwünschte Nebenwirkungen haben wahrscheinlich ihre Ursache in der gleichzeitigen Inhibition des humanen ACC2's, während die Wirkungen vor allem auf der Inhibition des humanen ACCl 's beruhen.
Die Selektivität gegen humanes ACC2 scheint dabei strukturell auf der trans -M ethoxy-Gruppe in Position 8 des Azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on-Ringsystems der erfindungsgemäßen Strukturen zu beruhen. Sofern diese trans-M ethoxy-Grupp e schon in verwandten Strukturen des Standes der Technik verwirklicht ist, war zum Zeitpunkt der Erfindung unbekannt, ob und mit welcher
Selektivität diese Strukturen humane ACC's inhibieren.
Ebenfalls als von der vorliegenden Erfindung als erfasst anzusehen ist die Verwendung der physiologisch verträglichen Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen.
Ebenfalls als von der vorliegenden Erfindung als erfasst anzusehen ist die Verwendung der tautomeren Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I), z.B.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäß en Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und
Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclo-hexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N- Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel enthaltend die
erfindungsgemäßen Verbindungen und mindestens einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten
Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster
Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magens aftre sistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophilisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines εβθ ΐίοηββϋΐιτίΐΐεβ geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikations formen u.a. Injektions- und
Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern. Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a.
Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder
Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikations formen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise
Natriumdodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon) , synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B.
Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die die erfindungsgemäßen Verbindungen, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genann- ten Zwecken.
Die Formulierung der erfindungsgemäßen Verbindungen zu pharmazeutischen Präparaten erfolgt
in an sich bekannter Weise, indem man den oder die Wirkstoffe mit den in der Galenik gebräuchlichen Hilfsstoffen in die gewünschte Applikationsform überführt.
Als Hilfsstoffe können dabei beispielsweise Trägersubstanzen, Füllstoffe, Sprengmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Gleitmittel, Ab- und Αά8θ ίϊοη8ηώΐ6ΐ, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Cosolventien, Emulgatoren, Lösungsvermittler, Geschmackskorrigentien, Färbemittel, Konservierungs-, Stabilisierangs-, Netzmittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer zum Einsatz kommen.
Dabei ist auf Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen.
Die pharmazeutischen Formulierangen können
in fester Form, zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Pillen, Suppositorien, Kapseln, transdermale Systeme oder
in halbfester Form , zum Beispiel als Salben, Cremes, Gele, Suppositorien, Emulsionen oder in flüssiger Form, zum Beispiel als Lösungen, Tinkturen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Hilfsstoffe im Sinne der Erfindung können beispielsweise Salze, Saccharide (Mono-, Di-, Tri-, Oligo-, und/oder Polysaccharide), Proteine, Aminosäuren, Peptide, Fette, Wachse, Öle,
Kohlenwasserstoffe sowie deren Derivate sein, wobei die Hilfsstoffe natürlichen Ursprungs sein können oder synthetisch bzw. partial synthetisch gewonnen werden können.
Für die orale oder perorale Applikation kommen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulate, Pastillen, Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen in Frage.
Für die parenterale Applikation kommen insbesondere Suspensionen, Emulsionen und vor allem Lösungen in Frage.
Die vorliegende Erfindung betrifft die erfindungsgemäß en Verbindungen.
Sie können für die Prophylaxe und Therapie von menschlichen Erkrankungen eingesetzt werden, insbesondere von Tumorerkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können insbesondere verwendet werden, um die
Zellproliferation und/oder die Zellteilung zu inhibieren oder zu reduzieren und/oder Apoptosis zu induzieren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von hyper-proliferativen Erkrankungen wie beispielsweise
Psoriasis,
Keloide und andere Hyperplasien, die die Haut betreffen,
- gutartige Prostathyperplasien (BPH),
solide Tumore und
hämatologische Tumore.
Als solide Tumore sind erfindungsgemäß beispielsweise Tumore behandelbar der Brust, des Respirationstraktes, des Gehirns , der Fortpflanzungsorgane, des Magen-Darmtraktes, des Urogenitaltraktes, des Auges, der Leber, der Haut, des Kopfes und des Halses, der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Knochen sowie des Bindegewebes und Metastasen dieser Tumore.
Als hämatologische Tumore sind beispielsweise behandelbar
- multiple Myelome,
Lymphome oder
Leukämien.
Als Brusttumore sind beispielsweise behandelbar:
- Mammakarzinome mit positivem Hormorrrezeptorstatus
M ammakarzinome mit negativem Hormonrezeptorstatus
Her-2 positive Mammakarzinome
Hormonrezeptor- und Her-2 negative Mammakarzinome
BRC'A -assoziierte M ammakarzinome
- entzündliches Mammakarzinom.
Als Tumore des Re spirationstrakte s sind beispielsweise behandelbar
nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome und
kleinzellige Bronchialkarzinome .
Als Tumore des Gehirns sind beispielsweise behandelbar
Gliome,
Glioblastome,
Astrozytome,
- Meningiome und
Medulloblastome.
Als Tumore der männlichen Fortpflanzungsorgane sind beispielsweise behandelbar: Prostatakarzinome,
Maligne Hodentumore und
P eni skarzinome .
Als Tumore der weiblichen Fortpflanzungsorgane sind beispielsweise behandelbar:
Endometriumkarzinome
Z ervixkarzinome
Ovarialkarzinome
- Vaginalkarzimome
Vulvarkarzinome
Als Tumore des Magen-Darm-Traktes sind beispielsweise behandelbar:
Kolorektale Karzinome
- Analkarzinome
M agenkarzinome
P ankre askarzinome
Ösophaguskarzinome
Gallenblasenkarzinome
- Dünndarmkarzinome
Spei cheldrüs enkarzinome
Neuro endokrine Tumore
Gastrointestinale Stromatumore Als Tumore des Urogenital-Traktes sind beispielsweise behandelbar:
Harnblasenkarzinome
Nierenzellkarzinome
Karzinome des Nierenbeckens und der ableitenden Harnwege Als Tumore des Auges sind beispielsweise behandelbar:
Retinoblastome
Intraokulare Melanome
Als Tumore der Leber sind beispielsweise behandelbar:
- Hepatozelluläre Karzinome
Cholangiozelluläre Karzinome
Als Tumore der Haut sind beispielsweise behandelbar:
Maligne Melanome
Basaliome
Spinaliome
Kaposi-Sarkome
Merkelzellkarzinome
Als Tumore des Kopfes und Halses sind beispielsweise behandelbar:
Larynxkarzinome
Karzinome des Pharynx und der Mundhöhle
Als Sarkome sind beispielsweise behandelbar:
Weichteilsarkome
Osteosarkome
Als Lymphome sind beispielsweise behandelbar:
Non-Hodgkin-Lymphome
Hodgkin-Lymphome
Kutane Lymphome
Lymphome des zentralen Nervensystems
AIDS-assoziierte Lymphome
Als Leukämien sind beispielsweise behandelbar:
Akute myeloische Leukämien
Chronische myeloische Leukämien
Akute lymphatische Leukämien
Chronische lymphatische Leukämien
Haarzellleukämien
Vorteilhaft können die erfindungsgemäß en Verbindungen verwendet werden zur Prophylaxe und/oder Therapie von:
Mammakarzinomen, insbesondere von Hormonrezeptor-negativen, Hormonrezeptor-positiven oder BRCA-assoziierten Mammakarzinomen, sowie
Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinom, Kolorektalen Karzinomen und Prostatakarzinomen.
Besonders vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden zur Prophylaxe und/oder Therapie von M ammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Pro statakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen.
Diese Erkrankungen sind gut charakterisiert im Menschen, existieren aber auch bei anderen Säugetieren.
Ein Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I), insbesondere die Verbindungen:
- (5r,8r)-3 -(4'-Chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl) -4-hydroxy- 8 -methoxy- 8 - (methoxymethyl) - 1 - azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on
- (5r,8r)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-(methoxymethyl)-i- azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on
- (5r,8r)-3-(4'-Chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-(trifluormethyl)- 1 - azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on
- (5r,8r)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-(trifluormethyl)-l- azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von
Tumorerkrankungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen,
Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von M ammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor- positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endom etriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Pro statakarzinomen .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven M ammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgerrrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Prostatakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische Formulierungen in Form von Tabletten enthaltend eine der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht- Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen oder Prostatakarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische Formuli erungen in Form von Tabletten enthaltend eine der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Prophylaxe und/oder Therapie von M ammakarzinomen, insbesondere Hormonrezeptor-positiven Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Pro statakarzinomen, insbesondere Androgenrezeptor-negativen Prostatakarzinomen oder Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen, die mit proliferativen Prozessen einhergehen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie der zuvor genannten Erkrankungen.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit bekannten anti-hyperproliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Die Kombination der erfindungsgemäßen Verbindungen mit anderen für die Krebstherapie gebräuchlichen Substanzen oder auch mit der Strahlentherapie ist besonders angezeigt.
Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
Afinitor, Aldesleukin, Alendronsäure, Alfaferon, Alitretinoin, Allopurinol, Aloprim, Aloxi, Altretamin, Aminoglutethimid, Amifostin, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Anzmet, Aranesp, Arglabin, Arsentrioxid, Aromasin, 5-Azacytidin, Azathioprin, BCG oder tice-BCG, Be statin, Beta- methason-Acetat, Betamethason-Natriumphosphat, Bexaroten, Bleomycin-Sulfat, Broxuridin, Bortezomib, Busulfan, Calcitonin, Campath, Capecitabin, Carboplatin, Casodex, Cefeson, Celmoleukin, Cerubidin, Chlorambucil, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, DaunoXome, Decadron, Decadron-Phosphat, Delestrogen, Denileukin Diftitox, Depomedrol, Deslorelin, Dexrazoxan, Diethylstilbestrol, Diflucan, Docetaxel, Doxifluridin, Doxorubicin, Dronabinol, DW-166HC, Eligard, Elitek, Ellence, Emend, Epirubicin, Epoetin-alfa, Epogen, Eptaplatin, Ergamisol, Estrace, Estradiol, Estramustin-Natriumphosphat, Ethinylestradiol, Ethyol, Etidronsäure, Etopophos, Etoposid, Fadrozol, Farston, Filgrastim, Finasterid, Fligrastim, Floxuridin, Fluconazol, Fludarabin, 5 -Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5- Fluoruracil (5-FU), Fluoxymesteron, Flutamid, Forme stan, Fosteabin, Fotemustin, Fulvestrant,
Gammagard, Gemcitabin, Gemtuzumab, Gleevec, Gliadel, Goserelin, Granisetron-Hydrochlorid, Histrelin, Hycamtin, Hydrocorton, erythro-Hydroxynonyladenin, Hydroxyharnstoff, Ibritumomab Tiuxetan, Idarubicin, Ifosfamid, Interferon- alpha, Interferon-alpha-2, Interferon-alpha-2a, Interferon-alpha-2ß, Interferon- alpha-n 1 , Interferon-alpha-n3 , Interferon-beta, Interferon-gamma- la, Interleukin-2, Intron A, Iressa, Irinotecan, Kytril, Lapatinib, Lentinan-Sulfat, Letrozol,
Leucovorin, Leuprolid, Leupro lid-Acetat, Levamisol, Le vo folins äure -Calciums alz, Levothroid, Levoxyl, Lomustin, Lonidamin, Marinol, Mechlorethamin, Mecobalamin, M edroxyproge steron- Acetat, Megestrol-Acetat, Melphalan, Menest, 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Metvix, Miltefosin, Minocyclin, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Modrenal, Myocet, Nedaplatin, Neulas ta, Neumega, Neupogen, Nilutamid, Nolvadex, NSC-631570, OCT-43, Octreotid,
Ondansetron-Hydrochlorid, Orapred, Oxaliplatin, Paclitaxel, Pediapred, Pegaspargase, Pegasys, Pentostatin, Picibanil, Pilocarpin-Hydrochlorid, Pirarubicin, Plicamycin, Porfimer-Natrium, Prednimustin, Prednisolon, Prednison, Premarin, Procarbazin, Procrit, Raititrex ed, RDEA 1 1 . Rebif, Rhenium- 186- Etidronat, Rituximab, Roferon-A, Romurtid, Salagen, Sando statin, Sargramostim, Semustin, Sizofiran, Sobuzoxan, Solu-Medrol, Streptozocin, Strontium-89-chlorid, Synthroid, Tamoxifen, Tamsulosin, Tasonermin, Tastolacton, Taxoter, Teceleukin, Temozolomid, Teniposid, Testosteron-Propionat, Testred, Thioguanin, Thiotepa, Thyrotropin, Tiludronsäure, Topotecan, Toremifen, Tositumomab, Tastuzumab, Teosulfan, Tretinoin, Trexall,
Trimethylmelamin, Trimetrexat, Triptorelin-Acetat, Triptorelin-Pamoat, UFT, Uridin, Valrubicin, Vesnarinon, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinorelbin, Virulizin, Zinecard, Zinostatin- Stimalamer, Zofran; ABI-007, Acolbifen, Actimmun, Affinitak, Aminopterin, Arzoxifen, Asoprisnil, Atamestan, Atrasentan, BAY 43-9006 (Sorafenib), Avastin, CCI-779, CDC-501, Celebrex, Cetuximab, Crisnatol, Cyproteron- Ac etat, Decitabin, DN- 101, Doxorubicin-MTC, dSLIM, Dutasterid, Edotecarin, Eflornithin, Exatecan, Fenretinid, Histamin-Dihydrochlorid, Histrelin-Hydrogel-Implant, Holmium- 166-DOTMP, Ibandronsäure, Interferon-gamma, Intron- PEG, Ixabepilon, Keyhole Limpet-Hemocyanin, L-651582, Lanreotid, Lasofoxifen, Libra, Lona- farnib, Miproxifen, Minodronat, MS-209, liposomales MTP-PE, MX-6, Nafarelin, Nemorubicin, Neovastat, Nolatrexed, Oblimersen, Onko-TCS, Osidem, Paclitaxel-Polyglutamat, Pamidronat- Dinatrium, PN-401 , QS-21, Quazepam, R- 1 49. Raloxifen, Ranpirnas, 13 -cw-Retinsäure, Satra- platin, Seocalcitol, T- 138067, Tarceva, Taxoprexin, Thymosin-alpha- 1 , Tiazofurin, Tipifarnib, Tirapazamin, TLK-286, Toremifen, TransMID-107R, Valspodar, Vapreotid, Vatalanib, Verte- porfin, Vinflunin, Z-100, Zoledronsäure, sowie Kombinationen hiervon.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit anti- hyperproliferativen Agentien kombiniert werden, welche beispielhaft - ohne dass diese Aufzäh- lung abschließend wäre - sein können:
Aminoglutethimid, L-Asparaginase, Azathioprin, 5-Azacytidin, Bleomycin, Busulfan, Carboplatin, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Colaspase, Cyclophosphamid, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubicin, Diethylstilbestrol, 2',2'-Dif!uordeoxycytidin, Docetaxel, Doxoru- bicin (Adriamycin), Epirubicin, Epothilon und seine Derivate, erythro-Hydroxynonyladenin, Ethinylestradiol, Etoposid, Fludarabin-Phosphat, 5 -Fluordeoxyuridin, 5 -Fluordeoxyuridin-Mono- phosphat, 5-Fluoruracil, Fluoxymesteron, Flutamid, Hexamethylmelamin, Hydroxyharnstoff, Hydroxyprogesteron-Caproat, Idarubicin, Ifosfamid, Interferon, Irinotecan, Leucovorin, Lomustin, Mechlorethamin, Medroxyprogesteron-Acetat, Megestrol-Acetat, Melphalan, 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Paclitaxel, Pentostatin, iV-Phosphono- acetyl-L-aspartat (PALA), Plicamycin, Prednisolon, Prednison, Procarbazin, Raloxifen, Semustin, Streptozocin, Tamoxifen, Teniposid, Testosteron-Propionat, Thioguanin, Thiotepa, Topotecan, Trimethylmelamin, Uridin, Vinblastin, Vincristin, Vindesin und Vinorelbin.
In viel versprechender Weise lassen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen auch mit biologischen Therapeutika wie Antikörpern (z.B. Avastin, Rituxan, Erbitux, Herceptin) und rekombinan- ten Proteinen kombinieren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Kombination mit anderen, gegen die Angiogenese gerichteten Therapien positive Effekte erzielen, wie zum Beispiel mit Avastin, Axitinib, Regorafenib, Ree entin, Sorafenib oder Sunitinib. Kombinationen mit Inhibitoren des Proteasoms und von mTOR sowie Antihormone und steroidale metabolische Enzyminhibitoren sind wegen ihres günstigen Nebenwirkungsprofils besonders geeignet.
Generell können mit der Kombination der erfindungsgemäßen Verbindungen mit anderen, zytostatisch oder zytotoxisch wirksamen Agentien folgende Ziele verfolgt werden:
• eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Be- handlung mit einem einzelnen Wirkstoff;
• die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;
• die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe;
· die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;
• das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie;
• eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie .
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Verbindung mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
1. Syntheserouten für Verbindungen gemäß Formel (I)
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden
Syntheserouten A und/oder B.
Syntheseroute A
Ein Arylbromid-Derivat der Formel (II)
in welcher W die oben angegebene Bedeutung hat, wird in einer Suzuki-Kupplung umgesetzt mit Verbindungen der Formel (III)
in welcher R die oben angegebene Bedeutung hat und
A für -B(OH)2, einen Boronsäure -Ester, bevorzugt Boronsäurepinakolester, oder
steht.
Die Suzuki-Kupplungen erfolgen im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Katalysators, gegebenenfalls in Gegenwart eines Zusatzreagenzes, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 130 °C bei Normaldruck. Die Reaktionen können auch in einem geschlossenen Gefäß unter Erhitzen in der Mikrowelle durchgeführt werden.
Katalysatoren sind beispielsweise für Suzuki-Re aktionsb edingungen übliche Palladium- Katalysatoren, bevorzugt sind Katalysatoren wie z.B. Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium, Tetrakistriphenylphosphinpalladium(O), Palladium auf Kohle, Palladium(II)acetat,
Palladium(II)acetat/Triscyclohexylphosphin, Palladium(II)acetoacetonat/Tri-tert- butylphosphoniumtetrafluoroborat, Dichlor[ 1 , 1 '-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium-
Dichlormethan-Komplex oder Palladium(II)acetat mit einem Liganden wie Dicyclohexyl[2',4',6'- tri(propan-2-yl)biphenyl-2-yl]phosphan.
Zusatzreagenzien sind beispielsweise Kalium- oder Cäsiumacetat, Cäsium-, Kalium- oder Natrium- carbonat, Kalium-tert-butylat, Cäsiumfluorid, Kaliumphosphat oder Natrium- oder
Kaliumhydroxid, bevorzugt sind Zusatzreagenzien wie z.B. Cäsiumcarbonat und/oder wässrige Natriumhydroxid-Lösung.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1 ,2- Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder Toluol, oder Carbonsäureamide wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N-Methylpyrrolidon, oder Alkylsulfoxide wie Dimethylsulfoxid, oder Gemische der Lösungsmittel mit Alkoholen wie Methanol oder Ethanol und/oder Wasser, bevorzugt ist 1 ,2-Dimethoxyethan.
Die Verbindungen der Formel (II) können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (IV)
in welcher R1 die oben angegebene Bedeutung hat und
B für Ci-Ce-Alkyl, bevorzugt Ethyl oder Methyl, steht, unter Dieckmann-Kondensations-Bedingungen umsetzt.
Die Dieckmann-Kondensationen erfolgen im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 130 °C bei
Normaldruck.
Basen sind beispielsweise Alkali- oder Erdalkalialkoholate wie Natrium- oder Kalium-tert-butyl at, Natriummethanolat oder -ethanolat, bevorzugt ist Kalium-tert-butylat.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1 ,2- Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder Toluol, oder Carbonsäureamide wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N-M ethylpyrrolidon, oder Alkylsulfoxide wie Dimethylsulfoxid, oder Alkohole wie Methanol oder Ethanol, bevorzugt ist Dimethylformamid.
Die Verbindungen der Formel (IV) können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (V) oder ein Salz von Verbindungen der Formel (V)
i
in welcher R1 und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit der Verbindung der Formel (VI)
unter Amid-Kupplungs-Bedingungen umsetzt.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, indem die Verbindungen der Formel (VI) zunächst mit Thionylchlorid oder einem dem Fachmann bekannten äquivalenten Reagenz und in der zweiten Stufe mit Verbindungen der Formel (V) oder einem Salz der
Verbindungen der Formel (V) in Gegenwart einer Base wie z. B. Triethylamin oder
Kaliumcarbonat umgesetzt werden. in einem alternativen Verfahren kann die Umsetzung in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -30 °C bis 50 °C bei Normaldruck erfolgen.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol oder Toluol, Nitromethan, Tetrahydrofuran, 1 ,4- Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt sind Acetonitril, Dichlormethan, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Toluol.
Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat oder -hy- drogencarbonat oder organische Basen wie Trialkylamine, z.B. Triethylamin, N-M emylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Dii sopropylethylamin.
Als Dehydratisierangsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. Ν,Ν'- Diethyl-, N,N, '-Dipropyl-, iV,Ar'-Diisopropyl-, 7V,A"-Dicyclohexylcarbodiimid, 7V-(3-Di- methylaminoisopropyl)-iV'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), iV-Cyclohexylcarbodiimid- V '- propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimida- zol, oder 1 ,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5 -phenyl- 1 ,2-oxazolium-3 -sulfat oder 2-t rt- Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy- 1 -ethoxy- carbonyl- 1 ,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3 -oxazolidinyl)-phosphorylchlorid, oder 0-(Benzotriazol- 1 -yl) -N, Ν,Ν', N'-tet - methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo- 1 -(2H)-pyridyl)- 1,1 ,3,3 -tetramethyluroni- umtetrafluoroborat (TPTU) oder 0-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-A?,iV, V',7V'-tetramethyl-uroniumhexa- fluorophosphat (HATU), oder 1 -Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol- 1 -yloxy- tris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder Benzotriazol- 1 -yloxytris(pyrro- lidino)-phosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP), oder iV-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen. Vorzugsweise wird die Kondensation mit PyBOP, TBTU oder mit EDC in Gegenwart von HOBt durchgeführt.
Das zuvor beschriebene Verfahren wird durch das folgende Syntheseschema veranschaulicht:
a): 1. SOCk, 80 °C, 2. Triethylamin, Dichlormethan, Raumtemperatur,
b): KOtBu, DM F. 80 °C;
c): cat. Dichlor[ 1 , 1 '-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium-Dichlormethan-Komplex, CS2CO3,
Rückfluss.
S ntheseroiite B
Alternativ können die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) hergestellt werden, indem man eine Verbindung der Formel (VII)
in welcher R! , R2 und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, unter den oben angegebenen Bedingungen in einer Dieckmann-Kondensation umsetzt.
Die Verbindungen der Formel (VII) können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (V) oder ein Salz von Verbindungen der Formel (V), in welcher R s und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit Verbindungen der Formel (VIII)
in welcher R2 die oben angegebene Bedeutung hat, unter den oben angegebenen Amid-Kupplungs- Bedingungen umsetzt.
Die Verbindungen der Formel (VIII) können hergestellt werden, indem man
die Verbindung der Formel (VI) in einer Suzuki-Reaktion unter den oben angegebenen
Bedingungen mit Verbindungen der Formel (III), in welcher R2 und A die oben angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt.
Das zuvor beschriebene Verfahren wird durch das folgende Syntheseschema veranschaulicht:
a) : cat. Palladium(II)acetylacetonat, cat. Tri-tert-butylphosphoniumtetrafluoroborat, NaOH,
THF/Wasser;
b) : 1. SOCl2, 80 °C, 2. K2CO3, Acetonitril, Raumtemperatur;
c) : KOtBu, DMF, Raumtemperatur.
Die für Syntheseroute A und B benötigten Verbindungen der Formel (V) oder Salze von Verbindungen der Formel (V), in welcher R1 und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (ΓΧ) oder ein Salz von Verbindungen der Formel (ΓΧ)
in welcher R1 die oben angegebene Bedeutung hat, nach bekannten Verfahren verestert, z.B. analog zu WO2002/02532 oder WO2010/063378.
Verbindungen der Formel (IX) oder Salze von Verbindungen der Formel (IX), in welcher R1 die oben angegebene Bedeutung hat, können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel
(X)
Ϊ
in welcher R1 die oben angegebene Bedeutung hat, nach bekannten Verfahren spaltet, z.B. analog zu WO2002/02532 oder WO2010/063378.
Verbindungen der Formel (X), in welcher Rs die oben angegebene Bedeutung hat, können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (XI)
(XI)
in welcher Rs die oben angegebene Bedeutung hat, nach bekannten Verfahren in einer Bucherer- Bergs-Reaktion umsetzt, z.B. analog zu WO2002/02532 oder WO2010/063378. Bei der Bildung des Hydantoins der Formel (X) bilden sich Isomerenmischungen aus dem cis-Isomer der Formel (X) und seinem trans-Isomer der Formel (X-a)
Die Abtrennung des trans-Isomers der Formel (X-a) kann bei diesem Syntheseschritt erfolgen. Alternativ kann die Isomerenmischung weiter umgesetzt werden und die Abtrennung der jeweiligen trans-isomeren Zwischenstufe bei einem der weiteren Syntheseschritte oder bei der Endstufe der Formel (I) erfolgen.
Alternativ lassen sich mit Hilfe der Strecker-Synthese nach bekannten Verfahren aus den Ketonen der Formel (XI) Aminonitrile herstellen, welche zu den Aminosäuren der Formel (ΓΧ) nach bekannten Verfahren hydrolysiert werden können. Verbindungen der Formel (XI), in welcher R ' die oben angegebene Bedeutung hat, können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (XII)
in welcher R 1 die oben angegebene Bedeutung hat, einer Ketalspaltung unterwirft (siehe Protective Croups in Organic Synthesis; Theodora W. Greene).
Verbindungen der Formel (XII), in welcher R s die oben angegebene Bedeutung hat, können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel (XIII)
(Xiii) ,
in welcher R1 die oben angegebene Bedeutung hat, nach bekannten Verfahren methyliert, z.B. analog zu WO2010/063378.
Das zuvor beschriebene Verfahren wird durch das folgende Syntheseschema veranschaulicht:
a): NaH, Methyliodid, THF, Raumtemperatur;
b): Toluolsulfonsäuremonohydrat, Aceton/Wasser;
c) : NaCN, (NH )2C03, Wasser/Ethanol, 60 °C;
d) : KOH oder NaOH, Wasser, Rückfluss;
e) : SOCl2, Methanol, 40 °C bis Rückfluss. Die Verbindung der Formel (XIII), in welcher Rs für eine Trifluormethylgruppe steht, kann hergestellt werden, indem man die Verbindung der Formel (XIV)
( iv) ,
mit (Trifluormethyl)trimethylsilan umsetzt.
Die Umsetzung des Kolons der Formel (XIV) mit (Trifluormethyl)trimethylsilan zu den
Verbindungen der Formel (XIII) erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Katalysators, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -20 °C bis 100 °C bei Normaldruck. Katalysatoren sind beispielsweise Alkali- oder Erdalkalicarbonate wie Natrium-, Kalium- oder Cäsiumcarbonat. Desweiteren können Alkali-, Erdalkalifluoride wie Lithium- und Cäsiumfluorid sowie Fluoridsalze organischer Basen wie zum Beispiel Tetraethylammoniumfluorid oder
Tetrabutylammoniumfluorid zur Katalyse der gewünschten Reaktion verwendet werden. Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1 ,2-Dimethoxyethan, oder Carbons äureamide wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder N-Methylpyrrolidon, oder Alkylsulfoxide wie Dimethylsulfoxid, bevorzugt ist Dimethylformamid. Die primär anfallenden Silylderivate der Formel (XIII) werden abschließend gemäß dem Fachmann bekannten Methoden (siehe Protective Croups in Qrganic Synthesis; Theodora W. Greene) abgespalten.
Die Verbindung der Formel (XIII), in welcher R1 für eine Methoxymethylgruppe steht, kann hergestellt werden, indem man das Epoxid der Formel (XV)
(XV) ,
nach bekannten Verfahren öffnet, z.B. analog zu Rodriguez, Benjamin; Torre, Maria C. de la; Perales, Aurea; Malakov, Peter Y.; Papanov, Y.; et al., Tetrahedron, 1994, Band 50, Seiten 5451 - 5468.
Das Epoxid der Formel (XV) ist bekannt und kann aus der Verbindung der Formel (XIV) hergestellt werden (Ciaccio, James A.; Drahus, Antoinette L.; Meis, Regina M.; Tingle, Carice T.; Smrtka, Michael; Geneste, Richard, Synthetic Communications, 2003, Band 33, Seiten 2135 - 2144).
Abkürzungen und Akronyme:
ca. circa
DMF Dimethylformamid
DM SO Dimethylsulfoxid
d. Th. der Theorie (bei Ausbeute)
ELSD Lichtstreudetektor
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
h Stunde(n)
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
IX - MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie
min Minute (n)
MS Massenspektrometrie
neg negativ
NMR Kernresonanzspektrometrie
pos positiv
RP Reversed-Phase (bei Chromatographie)
RT Raumtemperatur
Rt Retentionszeit (bei HPLC)
tert tertiär
TH F Tetrahydrofuran
UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography
LC-MS- und HPLC-Methodeo: Methode 1 (UPLC-MS):
Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001 ; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50x2.1mm; Eluent A: Wasser + 0.1% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-1.6 min 1- 99% B, 1.6-2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60 °C; Injektion: 2 μΐ; DAD scan: 210- 400 nM; ELSD.
Methode 2 (UPLC-MS):
Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50x2.1mm; Eluent A: Wasser + 0.05%> Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril + 0.05% Ameisensäure; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1.6-2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60 °C; Injektion: 2 μΐ; DAD scan: 210-400 nm; ELSD.
Methode 3 (UPLC-MS):
Instrument: Waters Acquity UPLC-MS ZQ4000; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50x2.1mm;
Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril + 0.05% Ameisensäure; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1.6-2.0 min 99% B; Fluss 0.8 inl/niin; Temperatur: 60 °C; Injektion: 2 μΐ; DAD scan: 210-400 nM
Herstellung der Vergleichs- und Ausführungsbeispiele
Ausgangsverbindungen und Intermediate:
Zu einer Lösung von 40.0 g (175 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure (EP 1791816 und WO 2006/29799) in einer Mischung aus 437 ml (437 mmol) entgaster IN wässriger Natriumhydroxid-Lösung, 160 ml entgastem Wasser und 160 ml entgastem Tetrahydrofuran wurden unter Argon 33.5 g (192 mmol) (4-Chlor-3 -fluorphenyl)boronsäure gegeben. Man rührte 10 Minuten, versetzte mit 507 mg (1.75 mmol) Tri-tert-butylphosphoniumtetrafluoroborat und 532 mg (1.75 mmol) Palladium(II)acetylacetonat und rührte 20 h bei Raumtemperatur. Anschließend gab man Toluol und Wasser hinzu, stellte mit konzentrierter, wässriger Hydrogenchlorid-Lösung einen pH-Wert von 1-2 ein, rührte 10 Minuten, trennte die Phasen, extrahierte zweimal mit Toluol, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Der Rückstand wurde in 300 ml einer 6/1 -Mischung aus n-Hexan/'tert-Butyl-methylether 30 Minuten gerührt, abgesaugt, mit n- Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 38.0 g (78% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 2.27 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 7.27 (d, 1H), 7.49 - 7.59 (m, 3H), 7.61 - 7.75 (m, 2H), 12.4 (s, 1H).
I -MS (Methode 1): Rt = 1.31 min; MS (ESIneg): m z = 277 [M H j .
Beispiel 2A
(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetylchlorid
5.00 g (19.18 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure (EP 2029531 AI und US 2009/298828 AI) wurden in 36.51 g (306.84 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde vier Stunden bei 80 °C gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung im Feinvakuum erhielt man 5.4 g (100% d. Th.) der Titelverbindung als bräunliches Öl.
Ή-NMR (300MHz, CDC13): δ [ppm] = 2.36 (s, 3H), 4.22 (s, 2H), 7.29 (d, 1H), 7.35 - 7.55 (m, 6H).
Beispiel 3A
(5 -Brom-2 -methylphenyl) ac etylchlorid
6.00 g (26.19 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure (EP 1791816 AI und WO 2006/29799 AI) wurden in 31.20 g (261.92 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde zwei Stunden bei 80 °C gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung im Feinvakuum erhielt man 6.29 g (97% d. Th.) der Titelverbindung als bräunliches Öl.
Ή-NMR (300MHz, CDCI3): δ [ppm] = 2.26 (s, 3H), 4.12 (s, 2H), 7.09 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.37 (dd, 1H).
Beispiel 4A
(4'-Chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl) ac etylchlorid
10.00 g (35.88 mmol) (4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure (Beispiel 1A) wurden in 24.33 g (204.51 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei 80 °C gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung im Feinvakuum erhielt man 10.54 g (99% d. Th.) der Titelverbindung als bräunliches Öl.
Ή-NMR (300MHz, CDCI3): δ [ppm] = 2.36 (s, 3H), 4.22 (s, 2H), 7.26 - 7.39 (m, 4H), 7.41 - 7.49 (m, 2H).
Beispiel 5A
Trimethyl{[8-(trifluormethyl)-l,4-dioxaspiro[4.5]dec-8-yl]oxy}silan
5.00 g (32.01 mmol) l,4-Dioxaspiro[4.5]decan-8-on wurden in 50 ml 1 ,2-Dimethoxyethan gelöst und mit 14.60 g (44.82 mmol) Cäsiumcarbonat versetzt. Zur resultierenden Suspension tropfte man bei einer Innentemperatur von weniger als 30 °C 36.42 g (256.11 mmol) Trimethyl(trifluormethyl) silan, gelöst in 100 ml 1 ,2-Dimethoxyethan, und rührte das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur. Zur Aufarbeitung wurden ca. 600 ml Wasser zum Ansatz getropft, und das Zielmolekül wurde mittels Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde wiederholt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung erhielt man 10.6 g (100% d. Th.) der Titelverbindung als bräunliches Öl.
Ή-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm] = O. I I (s, 9H), 1.57 - 1.78 (m, 8H), 3.85 (s, 4H). Beispiel 6A
l,7,10-Trioxadispiro[2.2.4.2]dodecan
Zu einer homogenen Mischung von 50.7 g (231 mmol) Trimethylsulfoxoniumiodid und 25.9 g (231 mmol) Kalium-tert-butylat wurde eine Lösung aus 30.0 g (192 mmol) 1 ,4- Cyclohexandionmonoethlenacetal in 750 ml Dichlormethan gegeben und die Reaktionsmischung eine Stunde bei Raumtemp eratur gerührt. Man versetzte mit Eiswasser, trennte die Phasen, extrahierte die wässrige Phase mehrfach mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mehrfach mit Wasser, trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 28.3 g (87% d. Th.) der Titelverbindung. Ή-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.41 - 1.52 (m, 2H), 1.65 - 1.76 (m, 6H), 2.61 (s, 2H), 3.88 (s, 4H).
Beisoici 7A
8-(Trifluormethyl)- 1 ,4-dioxaspiro[4.5]d(
12.20 g (40.89 mmol) Trimethyl{[8-(trifluormethyl)-l,4-dioxaspiro[4.5]dec-8-yl]oxy}silan (Beispiel 5A) wurden bei 0 °C in 164 ml 1 molarer Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung in Tetrahydrofuran gelöst und bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Zur Aufarbeitung wurden ca. 600 ml Wasser zum Ansatz gegeben, und das Zielmolekül wurde mittels Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde wiederholt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung erhielt man 9.33 g (100% d. Th.) der Titelverbindung als bräunliches Öl.
! H-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.49 - 1.58 (m, 2H), 1.59 - 1.77 (m, 6H), 3.83 (s, 4H), 5.78 (s, 1H).
Beispiel 8 A
8-(Methoxymethyl)-l,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-ol
4.56 g (26.8 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A wurden in 150 ml Methanol mit 75 ml einer 25%igen methanolischen Natriummethylat- Lösung versetzt und über Nacht bei 60 °C gerührt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch eingeengt, der Rückstand in gesättigter, wässriger Ammoniumchlorid-Lösung aufgenommen und mehrfach mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 3.23 g (60% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.37 - 1.47 (m, 4H), 1.50 - 1.63 (m, 2H), 1.68 - 1.80 (m, 2H), 3.10 (s, 2H), 3.25 (s, 3H), 3.82 (s, 4H), 4.24 (s, 1H).
Beispiel 9A
8-Metlioxy-8-(trifluormethyl)-l,4-dioxaspiro[4.5]decan
16.23 g (71.75 mmol) 8-(Trifluormethyl)-l,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-ol (Beispiel 7A) wurden bei 0 °C in 582 ml Tetrahydrofuran gelöst, portionsweise mit 5.74 g (143.50 mmol) Natriumhydrid (60%ig in Paraffmöl) versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Zur resultierenden Suspension wurden 50.92 g (358.76 mmol) Iodmethan getropft, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung goss man auf ca. 1 L Eiswasser und extrahierte das Produkt mit Dichlormethan. Die organische Phase wurde wiederholt mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung erhielt man 17.34 g (100% d. Th.) der Titelverbindung als bräunliches Öl.
'H-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.50 - 1.75 (m, 6H), 1.85 - 1.98 (m, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.84 (s, 411 ).
Beispiel
8-Methoxy-8-(methoxymethyl)-l,4-dioxaspiro[4.5]decan
3.40 g (16.8 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A wurden in 170 ml Tetrahydrofuran gelöst, mit 1.01 g (25.2 mmol) Natriumhydrid (60%ig in Paraffinöl) versetzt und 0.5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend gab man 3.58 g (25.2 mmol) Iodmethan hinzu und rührte das Reaktionsgemisch zwei Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend gab man 3.58 g (25.2 mmol) Iodmethan hinzu und rührte das Reaktionsgemisch zwei Stunden bei Raumtemperatur. Man versetzte mit Wasser, extrahierte mehrfach mit Essigsäureethylester, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 3.35 g (92% d. Th.) der Titelverbindung. Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.37 - 1.77 (m, 8H), 3.11 (s, 3H), 3.25 (s, 5H), 3.83 (s, 4H).
Beispiel I I A
4-Methoxy-4-(trifluormethyl)cyclohexanon
11.80 g (49.12 mmol) 8-Methoxy-8-(trifluormethyl)-l,4-dioxaspiro[4.5]decan (Beispiel 9A) wurden in 236 ml Aceton und 118 ml Wasser gelöst, mit 1.50 g (7.86 mmol) 4- Toluolsulfonsäuremonohydrat versetzt und über Nacht refluxiert. Anschließend wurde der Ansatz auf 1.2 L Wasser gegossen und das Produkt mit Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde im Vakuum destilliert (Siedepunkt: 106-110 °C bei 40 mbar). Man erhielt 6.86 g (71% d. Th.) der Titelverbindung als gelbliches Öl.
Ή-NMR (300MHz, CDCb): δ [ppm] = 1.90 - 2.07 (m, 2H), 2.26 - 2.43 (m, 4H), 2.48 - 2.65 (m, 2H), 3.52 (s, 3H).
Beispiel 1 2A
4-Methoxy-4-(methoxymethyl)cyclohexanon
13.3 g (61.5 mmol) der Verbindung aus Beispiel 10A wurden in 200 ml Aceton und 100 ml Wasser gelöst, mit 1.87 g (9.84 mmol) 4-Toluolsulfonsäuremonohydrat versetzt und zwei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Aceton abdestilliert, der wässrige Rückstand durch Zugabe von Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit 23.2 g Natriumchlorid versetzt. Man extrahierte mehrfach mit Essigsäureethylester, wusch die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter, wässriger Natriumchlorid- Lösung, trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 10.3 g (97% d. Th.) der Titelverbindung. Ή-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.61 - 1.76 (m, 2H), 1.97 - 2.12 (m, 4H), 2.34 - 2.46 (m, 2H), 3.22 (s, 3H), 3.28 (s, 3H), 3.36 (s, 2H).
Beisoici 13A
8-Methoxy-8-rnethyl-l,3-diazaspiro[4.5]decan-2,4-dion
608 g (6.33 mol) Ammoniumc arbonat und 68.2 g (1.39 mmol) Natriumcyanid wurden in 2800 ml Wasser gelöst. Man tropfte 180 g (1.27 mmol) 4-Methoxy-4-methylcyclohexanon (beschrieben in WO 2010/063378) bei Raumtemperatur hinzu und rührte über Nacht bei 60 °C. Der Feststoff wurde abgesaugt und getrocknet. Man erhielt 169.6 g (19% d. Th.) der Titelverbindung als 4/1- trans/cis-Diastereomerenmischung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurde.
Beispiel I 4A
8-Methoxy-8-(trifluormethyl)-l,3-diazaspiro[4.5]decan-2,4-dion
8.80 g (44.86 mmol) 4-Methoxy-4-(trifluormethyl)cyclohexanon (Beispiel I IA), 4.40 g (89.72 mmol) Natriumcyanid und 17.24 g (179.44 mmol) Ammoniumc arbonat wurden in 102 ml Ethanol und 102 ml Wasser suspendiert. Die resultierende Suspension wurde 20 Stunden bei 60 °C gerührt. Das ausgeschiedene Produkt wurde ab filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 10.05 g (84% d. Th.) der Titelverbindung als weißes Pulver.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.38 - 2.20 (m, 8H), 3.31 (s, 3H), 7.87 (s, 0.25H), 8.70 (s, 0.75H), 10.64 (s, 1H).
Beispiel ISA
(5r,8r)-8-Methoxy-8-(methoxymethyl)-l,3-diazaspiro[4.5]decan-2,4-dion
28.6 g (298 mmol) Ammoniumc arbonat und 3.21 g (65.5 mmol) Natriumcyanid wurden in 130 ml Wasser gelöst. Man tropfte 10.3 g (59.5 mmol) der Verbindung aus Beispiel 12A bei Raumtemperatur hinzu und rührte über Nacht bei 60 °C. Der Feststoff wurde abgesaugt, mit wenig Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 8.67 g (60% d. Th.) der Titelverbindung. Ή-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.26 - 1.34 (m, 2H), 1.39 - 1.50 (m, 2H), 1.71 - 1.88 (m, 4H), 3.12 (s, 3H), 3.23 (s, 2H), 3.26 (s, 3H), 8.43 (s, 1H), 10.54 (s, 1H).
Beispiel 16A
8-Methoxy-8-(methoxymethyl)-l,3-diazaspiro[4.5]decan-2,4-dion
5.74 g (59.7 mmol) Ammoniumcarbonat und 1.46 g (29.8 mmol) Natriumcyanid wurden in 33 ml Wasser gelöst. Man tropfte 2.57 g (14.9 mmol) einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 12A in 33 ml Ethanol bei Raumtemperatur hinzu und rührte über Nacht bei 60 °C. Man engte die Reaktionsmischung auf ein Viertel des ursprünglichen Volumens ein, extrahierte mehrfach mit Dichlormethan und Essigsäureethylester, trocknete die organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 675 mg (19% d. Th.) der Titelverbindung als Diastereomerenmischung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurde.
Beispiel 17A
l-Amino-4-methoxy-4-methylcyclohexancarbonsäurehydrogenchlorid
169.5 g der Verbindung aus Beispiel 13A wurden in 970 ml 30%iger wässriger Kaliumhydroxid- Lösung 20 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Re aktionsgemis ch durch Zugabe von 670 ml konzentrierter, wässriger Hydrogenchlorid-Lösung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt, der Niederschlag abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Man erhielt 1 10.7 g eines Rohproduktes als Diastereomerenmischung, dass noch Salze enthält und ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurde.
Beispiel 1 8A
l-Amino-4-methoxy-4-(trifluormethyl)cyclohexancarbonsäure
10.00 g (37.56 mmol) 8-Methoxy-8-(trifluormethyl)-l,3-diazaspiro[4.5]decan-2,4-dion (Beispiel 14A) wurden in 125 ml 3 molarer wässriger Natriumhydroxid-Lösung suspendiert und 3 Tage unter Rückflussbedingungen gerührt. Anschließend wurde mit konzentrierter wässriger Salzsäure ein pH-Wert von 6 eingestellt, das ausgeschiedene Produkt abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 12.20 g (135% d. Th.; Produkt enthält anorganische Salze) der Titelverbindung als weißes Pulver. Ή-NMR (400MHz, Methanol-c ): δ [ppm] = 1.64 - 1.79 (m, 3.6H), 1.89 - 2.08 (m, 2.4H), 2.24 - 2.40 (m, 2H), 3.40 (q, 0.5H), 3.42 (q, 2.5H).
Beispiel 19A
trans- 1 - Amino-4-methoxy-4-(metto
8.67 g (35.8 mmol) der Verbindung aus Beispiel 15A wurden in 52 ml 30%iger wässriger Kaliumhydroxid-Lösung 36 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch auf ein Viertel des ursprünglichen Volumens eingeengt, durch Zugabe von konzentrierter, wässriger Hydrogenchlorid-Lösung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und komplett eingeengt. Man erhielt 40.4 g eines Rohproduktes, dass noch Salze enthält und ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurde.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.57 - 1.77 (m, 6H), 1.87 - 2.05 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.23 (s, 3H), 3.27 (s, 2H), 8.50 (s, 3H).
Beispiel 20 A
l-Amino-4-methoxy-4-(methoxymethyl)cyclohexancarbonsäurehydrogenchlorid
670 mg der Verbindung aus Beispiel 16A wurden in 4 ml 30%iger wässriger Kaliumhydroxi d- Lösung 18 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch auf ein Viertel des ursprünglichen Volumens eingeengt, durch Zugabe von konzentrierter, wässriger Hydrogenchlorid-Lösung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und eingeengt. Man erhielt 4.70 g eines Rohproduktes als Diastereomerenmischung, dass noch Salze enthält und ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurde.
Beispiel 21A
Methyl-trans-l-amino-4-methoxy
Zu 110.5 g der Verbindung aus Beispiel 17A in 2500 ml Methanol unter Stickstoff wurden bei 5 °C 172 ml (2.36 mol) Thionylchlorid getropft. Man rührte 30 Minuten bei 0 °C und 24 Stunden bei 40 °C. Nach dem Abkühlen saugte man den Feststoff ab, engte das Filtrat ein, rührte den Rückstand 10 Minuten in einer Mischung aus 1000 ml Methyl-tert-butylether und 300 ml Acetonitril und saugte den Feststoff ab. Man erhielt 37.1 g (12% d. Th. ausgehend von 4-Methoxy- 4-methylcyclohexanon aus Beispiel 13A) der Titelverbindung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurde.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.08 (s, 3H), 1.60 - 1.79 (m, 6H), 1.94 - 2.11 (m, 2H), 3.07 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 8.68 (s, 3H).
Beispiel 22 A
Methyl- 1 -amino-4-methoxy-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylat
12.20 g (entspricht ca. 37.58 mmol) l-Amino-4-methoxy-4-(trifluormethyl)cyclohexancarbonsäure (Beispiel 18A) wurden in 210 ml Methanol suspendiert und bei 0 °C mit 10.4 ml (142.80 mmol) Thionylchlorid versetzt. Man kochte 2 Stunden unter Rückfluss, kühlte ab, versetzte bei 0 °C erneut mit 10.4 ml (142.80 mmol) Thionylchlorid und kochte weitere 2 Stunden unter Rückfluss. Der Ansatz wurde abgekühlt, nochmals mit 10.4 ml (142.80 mmol) Thionylchlorid versetzt und refluxierte zur Vervollständigung der Umsetzung über Nacht. Zur Aufarbeitung wurden ca. 100 ml Methanol abdestilliert und das Konzentrat auf 1 L gesättigte, wässrige Natriumcarbonat-Lösung gegossen. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, und die organische Phase wurde über
Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Eindampfen erhielt man 7.01 g (73% d. Th.) der Titelverbindung als gelbliches Öl.
Ή-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.39 - 2.00 (m, 10H), 3.28 (q, 3H), 3.59 (s, 2.4H), 3.60 (s, 0.6H).
Beispiel 23A
Methyl-trans-l-amino-4-methoxy-4-(methoxymethyl)cyclohexancarboxylat
Zu 40.4 g der Verbindung aus Beispiel 19A in 400 ml Methanol wurden bei 0 °C 34.8 ml (478 mmol) Thionylchlorid getropft. Man rührte 0.5 Stunden bei 0 °C und 24 Stunden bei 40 °C. Nach dem Abkühlen engte man ein, nahm den Rückstand in Essigsäureethylester auf, wusch mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, extrahierte die wässrige Phase mehrfach mit Essigsäureethylester und Dichlormethan, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 7.16 g (87% d. Th. ausgehend von Beispiel 15A) der Titelverbindung. Ή-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.27 - 1.35 (m, 2H), 1.46 - 1.55 (m, 211 ), 1.58 - 1.72 (m, 4H), 1.74 - 1.84 (m, 2H), 3.09 (s, 3H), 3.23 (s, 2H), 3.25 (s, 3H), 3.60 (s, 3H).
Beispiel 24A
Methyl- 1 -amino-4-methoxy-4-(methoxymethyl)cyclohexancarboxylat
Zu 4.70 g der Verbindung aus Beispiel 20A in 50 ml Methanol wurden bei 0 °C 4.1 ml (55.60 mmol) Thionylchlorid getropft. Man rührte 0.5 Stunden bei 0 °C und über Nacht bei 40 °C. Nach
dem Abkühlen engte man ein, nahm den Rückstand in Essigsäureethylester auf, wusch mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, extrahierte die wässrige Phase mehrfach mit Essigsäureethylester, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 392 mg (61% d. Th. ausgehend von Beispiel 16A) der Titelverbindung als Diastereomerenmischung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurde.
Beispiel 2 SA
Methyl-trans-1 - { [(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3 -yl)acetyl]amino} -4-methoxy-4- methylcyclohexancarboxylat
8.08 g (31.0 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure (EP 2029531 AI und US 2009/298828 AI) wurden in 12.9 ml (428 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 80 °C gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde in 70 ml Acetonitril gelöst. 6.00 g (25.2 mmol) der Verbindung aus Beispiel 21A wurden mit Essigsäureethylester und gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung versetzt. Man trennte die Phasen, extrahierte die wässrige Phase mehrfach mit Essigsäureethylester, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Der Rückstand wurde in 120 ml Acetonitril mit 12.2 g (88.3 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man die Lösung des Säurechlorids hinzu und rührte zwei Tage bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, nahm den Rückstand in Wasser auf, extrahierte mehrfach mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mehrfach mit IN wässriger Hydrogenchlorid-Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Hexan/Essigsäureethylester-Gradient) gereinigt. Man erhielt 7.87 g (68% d. Th.) der Titelverbindung. Ι-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm]= 0.98 (s, 3H), 1.34 - 1.46 (m, 2H), 1.54 - 1.64 (m, 2H), 1.74 - 1.87 (m, 4H), 2.28 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 7.23 (d, 1H), 7.43 (dd, 1H), 7.47 - 7.53 (m, 2H), 7.55 (d, 1H), 7.61 - 7.68 (m, 2H), 8.23 (s, 1H).
IX - MS (Methode 2): Rt = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z = 444 [M+HJ
Beispiel 26A
Methyl-cis- 1 - { [(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4-
(trifluormethyl)cyclohexancarboxylat
5.00 g (19.09 mmol) Methyl-cis-l-amino-4-(trifluoniiethyl)cyclohexancarboxylathydrochlorid (EP 1220841 A2 und WO 2001/23354 A3), 4.83 g (47.73 mmol) Triethylamin und 117 mg (0.955 mmol) N,N-Dimethylaminopyridin wurden bei Raumtemperatur in 40 ml Dichlormethan gelöst. Anschließend tropfte man eine Lösung von 5.33 g (19.09 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3 - yl)acetylchlorid (Beispiel 2A) in 40 ml Dichlormethan zum Ansatz. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, 5%-iger Citronensäure gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Eluent: Hexan Ethylacetatgradient). Nach Eindampfen und Trocknen wurden 6.36 g (71% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
S H-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.35 - 1.80 (m, 611 ). 2.05 - 2.18 (m, 2H ), 2.24 (s, 3H), 2.25 - 2.40 (m, IH), 3.49 (s, 3H), 3.56 (s, 2H), 7.19 (d, IH), 7.40 (dd, IH), 7.42 - 7.52 (m, 3H), 7.56 - 7.65 (m, 2H), 8.34 (s, IH).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.50 min; MS (ESIpos): m/z = 468 [M+H]+.
Beispiel 27A
Methyl-8-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-l ,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-carboxylat
5.47 g (25.41 mmol) Methyl-8-amino- 1 ,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-carboxylat [T. Satoh et al., Tetrahedron 63 (2007), 4806 - 4813], 3.86 g (38.12 mmol) Triethylamin und 155 mg (1.27 mmol) Ν,Ν-Dimethyl aminopyridin wurden bei Raumtemp eratur in 45 ml Dichlormethan gelöst. Anschließend tropfte man eine Lösung von 6.29 g (25.41 mmol) (5-Brom-2- methylphenyl) ac etylchlorid (Beispiel 3A) in 45 ml Dichlormethan zum Ansatz. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Eluent: Hexan/Ethylacetatgradient/1% Triethylamin). Nach Eindampfen und Trocknen wurden 3.64 g (34% d. Th.) der Titelverbindung erhalten, die ohne weitere Charakterisierung in die Folgestufe eingesetzt wurde. Beispiel 28 A
Methyl-trans-1 - {[(4'-chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)acetyl]amino } -4-methoxy-4- methylcyclohexancarboxylat
20.9 g (75.0 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1A wurden in 31.2 ml (428 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 80 °C gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 ml Acetonitril gelöst. 16.0 g (67.3 mmol) der Verbindung aus Beispiel 21 A wurden mit Essigsäureethylester und gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung versetzt. Man trennte die Phasen, extrahierte die wässrige Phase mehrfach mit Essigsäureethylester, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Der Rückstand wurde in 250 ml Acetonitril mit 28.5 g (206 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man die Lösung des Säurechlorids hinzu und rührte über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, nahm den Rückstand in Wasser auf, extrahierte mehrfach mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mehrfach mit IN wässriger Hydrogenchlorid- Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung,
trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Zur weiteren Reinigung wurde erneut in Dichlormethan aufgenommen, mehrfach mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 23.6 g (76% d. Th.) der Titelverbindung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurden.
Ή-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 0.98 (s, 3H), 1.32 - 1.45 (m, 2H), 1.55 - 1.63 (m, 2H), 1.74 - 1.86 (m, 4H), 2.29 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 3.52 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 7.24 (d, 1H), 7.46 - 7.55 (m, 2H), 7.59 - 7.73 (m, 3H), 8.23 (s, 1H).
LC-MS (Methode 2): Rt = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 462 [M+H]+.
Beispiel 29A
Methyl-cis-l-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylat
10.00 g (38.22 mmol) Methyl-cis-i-amino-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylathydrochlorid (EP 1220841 A2 und WO 2001/23354 A3), 9.67 g (95.54 mmol) Triethylamin und 233 mg (1.91 mmol) N,N-Dimethylaminopyridin wurden bei Raumtemperatur in 95 ml Dichlormethan gelöst. Anschließend tropfte man eine Lösung von 9.46 g (38.22 mmol) (5-Brom-2- methylpheny 1) ac etylchlorid (Beispiel 3A) in 95 ml Dichlormethan zum Ansatz. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit wässriger, 5%-iger Citronensäure gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Eluent: Di chlormethan/M ethanolgradient) . Nach Eindampfen und Trocknen wurden 8.84 g (53% d. Th.) der Titelverbindung erhalten, die ohne weitere Charakterisierung in die Folgestufe eingesetzt wurde.
Beispiel 30A
Methyl-cis- 1 - { [(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3 -yl)acetyl]amino} -4- (methoxymethyi)cyclohexancarboxylat
28.3 g (1 19 mmol) Metliyl-cis-l-amino-4-(methoxymethyl)cyclohexancarboxylathydrochlorid (beschrieben in WO 2007/048545) wurden in 100 ml Wasser gelöst, mit 20.0 g (238 mmol) Natriumhydrogencarbonat versetzt und mehrfach mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 9.88 g Methyl-cis- 1 -amino-4-(methoxymethyl)cyclohexancarboxylat. 5.93 g (29.4 mmol) Methyl-cis-l-amino-4-(methoxymethyl)cyclohexancarboxylat in 50 ml Acetonitril wurden mit 7.46 g (54.0 mmol) Kaliumc arbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man eine Lösung aus 6.85 g (24.5 mmol) der Verbindung aus Beispiel 2A in 50 ml Acetonitril hinzu und rührte einen Tag bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, versetzte den Rückstand mit Wasser, extrahierte mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mit IN wässriger Hydrogenchlorid-Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete über M agne siumsulf at, filtrierte und engte ein. Man erhielt 10.5 g der Titelverbindung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurden.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm]= 1.05 - 1.25 (m, 2H), 1.44 - 1.65 (m, 5H), 2.01 - 2.12 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 3.04 (d, 2H), 3.17 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 7.23 (d, 1H), 7.43 (dd, 1H), 7.47 - 7.57 (m, 3H), 7.62 - 7.68 (m, 2H), 8.21 (s, 1H).
LI -MS (Methode 1): R, = 1.43 min; MS (ESIpos): m/z = 444 [M+H]+
Beispiel 31 A
Methyl-cis-l-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-4-(methoxyme
55.3 g (232 mmol) Methyl-cis-l-amino-4-(methoxymethyl)cyclohexancarboxylathydrochlorid (beschrieben in WO 2007/048545, Seite 144) wurden in 200 ml Wasser gelöst, mit 39.0 g (465 mmol) Natriumhydrogencarbonat versetzt und mehrfach mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 17.2 g Methyl-cis- 1 -amino-4-(methoxymethyl)cyclohexancarboxylat. 1.90 g (8.30 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure (beschrieben in EP 1791816 und WO 2006/29799) wurden in 3.5 ml (47.3 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 80 °C gerührt und anschließend eingeengt. Man löste den Rückstand in 15 ml Acetonitril. 2.00 g (9.94 mmol) Methyl-cis-l-amino-4-(methoxymethyl)cyclohexancarboxylat in 20 ml Acetonitril wurden mit 2.52 g (18.2 mmol) Kaliumc arbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man die Lösung des Säure chlorids hinzu und rührte 24 h bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, versetzte den Rückstand mit Wasser, extrahierte mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mit IN wässriger Hydrogenchlorid-Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete über M agne siumsulf at, filtrierte und engte ein. Man erhielt 3.11 g (91% d. Th.) der Titelverbindung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurden.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 1.07 - 1.29 (m, 2H), 1.47 - 1.66 (m, 511 ), 2.01 - 2.12 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 3.13 (d, 2H), 3.22 (s, 3H), 3. 1 (s, 2H), 3.54 (s, 3H), 7.10 (d, IH), 7.30 (dd, IH), 7.41 (d, IH), 8.22 (s, IH).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.25 min; MS (ESIpos): m z = 412 [M+H]+.
Beispiel 32 A
Methyl- 1 - {[(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4-methoxy-4- (trifluormethyl)cyclohexancarboxylat
3.94 g (15.44 mmol) Methyl- l -amino-4-methoxy-4-(triiluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 22A) und 1.56 g (15.44 mmol) Triethylamin wurden in 56 ml Dichiormethan gelöst. Zu dieser Lösung tropfte man 3.92 g (14.03 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3 -yl) acetylchlorid (Beispiel 2A), gelöst in 56 ml Dichiormethan, und rührte das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichiormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit wässriger, 1 %iger Citronensäure gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 6.81 g (97% d. Th.) der Titelverbindung als weißes Pulver.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.51 min; MS (ESIpos): m/z = 498 [M+H]+. Beispiel 33A
Methyl- 1 - {[(4'-chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)acetyl] amino } -4-methoxy-4- (trifluormethyl)cyclohexancarboxylat
20.50 g (80.32 mmol) Methyl- 1 -amino-4-methoxy-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 22A) und 8.13 g (80.32 mmol) Triethylamin wurden in 280 ml Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung tropfte man 21.70 g (73.02 mmol) (4'-Chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 - yl)acetylchlorid (Beispiel 4A), gelöst in 280 ml Dichlormethan, und rührte das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit wässriger, 1 %iger Citronensäure gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 37.05 g (98% d. Th.) der Titelverbindung als beiges Pulver. LC-MS (Methode 1): Rt = 1.51 min; MS (ESIpos): m/z = 516 [M+H]+. Beispiel 34A
Methyl-trans-1 - {[(4'-chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)acetyl]amino } -4-methoxy-4- (methoxymethyl)cyclohexancarboxylat
4.48 g (16.1 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1A wurden in 5.6 ml (76.4 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 80 °C gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde in 20 ml Acetonitril gelöst. 3.10 g (13.4 mmol) der Verbindung aus Beispiel 23 A in 30 ml Acetonitril wurden mit 6.48 g (46.9 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man die Lösung des Säurechlorids hinzu und rührte über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend gab man auf Eiswasser, extrahierte mehrfach mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mehrfach mit IN wässriger Hydrogenchlorid-Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 6.59 g (96% d. Th.) der Titelverbindung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurden.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm]= 1.32 - 1.49 (m, 2H), 1.54 - 1.66 (m, 2H), 1.70 - 1.91 (m, 4H), 2.29 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 3.14 (s, 2H), 3.20 (s, 3H), 3.52 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 7.24 (d, 1H), 7.46 - 7.56 (m, 2H), 7.58 - 7.74 (m, 3H), 8.27 (s, 1H).
LC-MS (Methode 2): R = 1.38 min; MS (ESIpos): m z = 492 [M+Hf.
Beispiel 35A
Methyl- 1 - {[(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4-methoxy-4-
(methoxymethyl)cyclohexancarboxylat
574 mg (2.20 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)essigsäure (EP 2029531 AI und US 2009/298828 AI) wurden in 0.9 ml (12.5 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 80 °C gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde in 5 ml Acetonitril gelöst. 390 mg (1.69 mmol) der Verbindung aus Beispiel 24 A in 10 ml Acetonitril wurden mit 816 mg (5.90 mmol) Kaliumc arbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man die Lösung des Säure chlorids hinzu und rührte über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, nahm in Eiswasser auf, extrahierte mehrfach mit Dichlormethan, wusch die vereinigten organischen Phasen mehrfach mit IN wässriger Hydrogenchlorid-Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 570 mg der Titelverbindung als Diastereomerenmischung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurden.
LC-MS (Methode 2): Rt = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 474 [M+H]+.
Beispiel 36A
Methyl- 1 -{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-4-methoxy-4- (trifluormethyl)cyclohexancarboxylat
3.00 g (11.75 mmol) Methyl- 1 -amino-4-methoxy-4-(trifluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 22A) und 1.19 g (11.75 mmol) Triethylamin wurden in 40 ml Dichlormethan gelöst. Zu dieser
Lösung tropfte man 2.65 g (10.69 mmol) (5 -Brom-2 -methylphenyl) ac etylchlorid (Beispiel 3A), gelöst in 40 ml Dichlormethan, und rührte das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur. Zur Aufarbeitung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit wässriger, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit wässriger, l%iger Citronensäure gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde eingedampft und getrocknet. Man erhielt 4.79 g (87% d. Th.) der Titelverbindung als beiges Pulver.
LC-MS (Methode 1): R, = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 468 [M+Hf.
Beispiel 37A
(5s,8s)-3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4-hydroxy-8-(trifluormethyl)-l-azaspiro[4.5]d(
Zu 8.80 g (20.17 mmol) Methyl-cis-l-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-4- (trifluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 29A) in 100 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 4.53 g (40.34 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 60 Minuten bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf 800 ml Eiswasser gegossen und mit wässriger Salzsäure angesäuert. Das Rohprodukt wurde ab filtriert und durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Eluent: Hexan/'Ethylacetatgradient). Nach Trocknen erhielt man 5.23 g (64% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.40 - 1.50 (m, 2H), 1.58 - 1.72 (m, 2H), 1.77 - 1.86 (m, 2H), 1.86 - 1.96 (m, 2H), 2.07 (s, 3H), 2.12 - 2.28 (m, 1H), 7.14 (d, 1H), 7.19 (d, 1H), 7.33 (dd, 1H), 8.33 (s, 1H), 11.01 (s, 1H).
LC-MS (Methode 3): Rt = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z = 406 [M+H]+.
Beispiel 38A
11 -(5 -Brom-2-methylphenyl)- 12-hydroxy- 1 ,4-dioxa-9-azadispiro[4.2.4.2]tetradec-l l-en-10-οη
Zu 3.64 g (8.54 mmol) Methyl-8- { [(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino} -1 ,4- dioxaspiro [4.5 ] de c an- 8 -c arboxylat (Beispiel 27A) in 43 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 1.92 g (17.08 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 30 Minuten bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf 500 ml Eiswasser gegossen und mit wässriger Salzsäure auf pH = 4 angesäuert. Das Rohprodukt wurde abfiltriert. Nach Trocknen erhielt man 2.49 g (74% d. Th.) der Titelverbindung, die ohne weitere Charakterisierung in die Folgestufe eingesetzt wurde.
Beispiel 39A
3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4-hydroxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2,8-dion
Zu 2.49 g (6.32 mmol) 11 -(5-Brom-2-methylphenyl)- 12-hydroxy- 1 ,4-dioxa-9-azadispiro [4.2.4.2]tetradec-l l-en-10-οη (Beispiel 38A) in 26 ml Aceton und 13 ml Wasser wurden 192 mg (1.01 mmol) 4-Toluolsulfonsäuremonohydrat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung über Nacht bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und Aceton am Rotationsverdampfer abgezogen. Das ausgeschiedene Rohprodukt wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Nach Trocknen erhielt man 1.97 g (89% d. Th.) der Titel Verbindung .
Ή-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.68 - 1.78 (m, 2H), 2.09 (s, 3H), 2.21 - 2.34 (m, 4H), 2.64 - 2.78 (m, 2H), 7.15 (d, 1H), 7.23 (d, 1H), 7.35 (dd, 1H), 8.53 (s, 1H), 11.12 (s, 1H).
LC-MS (Methode 3): Rt = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 352 [M+H]+.
Beispiel 40A
(5r,8r)-3-(5-Broni-2-methylphenyl)-4,8-dihydroxy-8-(lxifluormethyl)-l-az
Zu 400 mg (1.14 mmol) 3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4-hydroxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2,8-dion (Beispiel 39A) in 8.3 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 521 mg (1.60 mmol) Cäsiumcarbonat und 975 mg (6.85 mmol) (Trifluormethyl)trimetliylsilan gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung drei Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wurde mit Wasser verdünnt, mit wässriger Zitronensäure auf pH = 4.5 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst, mit 1 ml 4N wässriger Salzsäure versetzt, eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Wasser verdünnt. Das Rohprodukt wurde mit Ethylacetat extrahiert, und die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde nach Eindampfen im Vakuum durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Eluent: Hexan/Ethylacetatgradient). Nach Eindampfen und Trocknen erhielt man 367 mg (76% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (400MHz, Methanol-d»): δ [ppm] = 1.39 - 1.50 (m, 2H), 1.84 - 1.98 (m, 4H), 2.15 (s, 3H), 2.30 - 2.43 (m, 2H), 7.15 (d, 1H), 7.27 (d, 1H), 7.34 (dd, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.96 min; MS (ESIpos): m/z = 420 [M+Hf.
Beispiel 41 A
(5s,8s)-3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4-hydroxy-8-(methoxymethyl)-l-azaspiro[4.5]di
Zu 3.11 g (7.54 mmol) der Verbindung aus Beispiel 31A in 11 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 1.69 g (15.1 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Die Re aktionsmis chung wurde 15 Minuten bei 80 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen engte man ein, nahm den Rückstand in Wasser auf, tropfte IN wässrige Hydrogenchlorid-Lösung hinzu und rührte 0.5 h. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 2.83 g (96% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
Ή-NMR (300MHz, DMSOde): δ [ppm]= 1.22 - 1 .44 (m, 4H), 1.46 - 1.63 (m, 1H), 1.65 - 1.75 (m, 2H), 1.80 - 1.85 (m, 2H), 2.11 (s, 3H), 3.15 (d, 2H), 3.23 (s, 3H), 7.17 (d, 1H), 7.22 (d, 1H), 7.36 (dd, 1H), 8.16 (s, 1H), 10.89 (s, 1H). LC-MS (Methode 1): Rt = 1.05 min; MS (ESIpos): m/z = 380 [M+H]+.
Beispiel 42A
3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-(trifluormethyl)-l-azaspiro[4.5]di
Zu 4.70 g (10.08 mmol) Methyl-l-{[(5-brom-2-methylphenyl)acetyl]amino}-4-methoxy-4- (trifluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 36A) in 50 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 2.26 g (20.16 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 60 Minuten bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf 800 ml Eiswasser gegossen und mit wässriger Salzsäure angesäuert. Das Rohprodukt wurde ab filtriert und getrocknet. Man erhielt 3.68 g (84% d. Th.) der Titelverbindung als beiges Pulver.
Ή-NMR (400MHz, Methanol-d»): δ [ppm] = 1.39 - 2.45 (m, 1 1H), 3.42 - 3.46 (m, 3H), 7.12 - 7.18 (m, 1H), 7.25 - 7.29 (m, 1H), 7.32 - 7.38 (m, 1H).
für Ansfiihrnngsbeispiel 1-1
V. l-a ( = Verbindung aus Tabelle 1, Zeile 20, S. 40 der WO10/063378)
(5r,8r)-3-(4'-Chlor-4-memylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-memyl-l-azaspiro[4.5]dec-3- en-2-οη
Zu 7.83 g (17.6 mmol) der Verbindung aus Beispiel 25A in 75 ml N,N-Dimethylformamid wurden unter Stickstoff 2.18 g (19.4 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, nahm den Rückstand in Eiswasser auf, säuerte mit IN wässriger Hydrogenchlorid-Lösung an, rührte 30 Minuten, saugte ab, wusch mit Wasser und trocknete den Niederschlag. Zur weiteren Reinigung wurde das Produkt in IN wässriger Natriumhydroxidlösung gelöst, filtriert, durch Ansäuern des Filtrats mit wässriger 1 N Salzsäure ausgefällt, mit Wasser gewaschen, abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 4.78 g (65% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (400MHz, DMSO-de): δ [ppm]= 1.09 (s, 3H), 1.12 - 1.20 (m, 2H), 1.60 - 1.71 (m, 2H), 1.71 - 1.80 (m, 2H), 2.04 - 2.14 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 7.30 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.46 - 7.52 (m, 3H), 7.62 - 7.68 (m, 2H), 8.15 (s, 1H), 10.79 (s, 1H).
LC-MS (Methode 2): Rt = 1.23 min; MS (ESIpos): m/z = 412 [M+H]+.
V.l-b
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-(trifluormethyl)-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-
2-on
l
Zu 6.36 g (13.59 mmol) Methyl-cis-l-{[(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)acetyl]amino}-4- (trifluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 26A) in 68 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 3.05 g (27.18 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 60 Minuten bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf 800 ml Eiswasser gegossen und mit wässriger Salzsäure angesäuert. Das Rohprodukt wurde abfiltriert, getrocknet und durch Chromatographie an Kieselgel (Hexan/Ethylacetatgradient) gereinigt. Nach Eindampfen erhielt man 4.1 g (69% d. Th.) der Titelverbindung. Ι-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.40 - 1.55 (m, 2H), 1.58 - 1.77 (m, 2H), 1.78 - 2.02 (m, 4H), 2.15 (s, 3H), 2.17 - 2.30 (m, 1H), 7.27 (d, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.42 - 7.51 (m, 3H), 7.58 - 7.66 (m, 2H), 8.29 (s, 1H), 10.90 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 436 [M+H]+. VJ-c
(5r,8r)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4,8-dihydroxy-8-(trifluormethyl)-l-azaspiro[4.5]dec-3- cn-2-οη
Zu 125 mg (0.30 mmol) (5r,8r)-3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4,8-dihydroxy-8-(trifluormethyl)-l- azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on (Beispiel 40A) in 13 ml entgastem 1 ,2-Dimethoxyethan wurden unter Argon 24 mg (0.030 mmol) Dichlor[ 1 , 1 '-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium- Dichlormethan-Komplex gegeben. Man rührte 5 Minuten bei Raumtemperatur und setzte anschließend 70 mg (0.45 mmol) (4-Chlorphenyl)boronsäure und eine Lösung von 339 mg (1.04 mmol) Cäsiumcarbonat in 815 μΐ entgastem Wasser hinzu. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten bei 150 °C im geschlossenen Gefäß unter Mikrowellenbestrahlung erhitzt. Nach dem Abkühlen gab man 100 μΐ konzentrierte, wässrige Hydrogenchlorid-Lösung zum Ansatz und dampfte im Vakuum ein. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen, mit wässriger, 5%-iger Zitronensäure (pH = 4.0 - 4.5) und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man reinigte das Rohprodukt durch Chromatographie
an Kieselgel (Eluent: Hexan/Ethylacetatgradient) sowie durch HPLC -Chromatographie (C18- Phase, Eluent: Wasser/Acetonitrilgradient/0.1 % Ameisensäure) und erhielt 17.4 mg (13% d. Th.) der Titelverbindung. Ή-NMR (400MHz, Methanol-d,): δ [ppm] = 1.41 - 1.53 (m, 2H), 1.85 - 2.01 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.33 - 2.46 (m, 2H), 7.32 (d, 1H), 7.35 - 7.42 (m, 3H), 7.46 (dd, 1H), 7.58 ("d", 2H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.19 min; MS (ESIpos): m/z = 452 [M+H]+. für Ausführungsbeispiel 1-2
V.2-a ( = Verbindung aus Tabelle 2, Zeile 10, S. 45 der WO10/063378)
(5r,8r)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-methyl-l- azaspiro [4.5]dec-3-en-2 -on
Zu 23.5 g (50.4 mmol) der Verbindung aus Beispiel 28A in 250 ml N,N-Dimethylformamid wurden unter Stickstoff 6.22 g (55.4 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung i 5 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, nahm den Rückstand in Wasser auf, säuerte mit IN wässriger Hydrogenchlorid-Lösung an, rührte 30 Minuten, saugte ab, wusch mit Wasser und trocknete den Niederschlag. Man erhielt 21.4 g (ca. 90% Reinheit, 89% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm]= 1.08 (s, 3H), 1.10 - 1.22 (m, 2H), 1.56 - 1.81 (m, 4H ). 1.99 - 2.14 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 7.29 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.46 - 7.56 (m, 2H), 7.60 - 7.72 (m, 2H), 8.05 (s, 1H), 10.86 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): R = 1.25 min; MS (ESIpos): m z = 430 [M+H]+.
V_2J_
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)-4-hydroxy-8-(trifluo
azaspiro [4.5]dec-3-en-2-o
Zu 5.00 g (12.4 mmol) der Verbindung aus Beispiel 37A in 500 ml entgastem 1 ,2-Dimethoxyethan wurden unter Argon 1.01 g (1.24 mmol) Dichlor[ 1 , 1 '-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium- Dichlormethan-Komplex gegeben. Man rührte 5 Minuten bei Raumtemperatur und setzte anschließend 3.24 g (18.5 mmol) (4-Chlor-3 -fluorphenyl)boronsäure und eine Lösung von 14.1 g (43.3 mmol) Cäsiumcarbonat in 30 ml entgastem Wasser hinzu. Die Re aktionsmi schung wurde 2 h unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen gab man 10 ml konzentrierte, wässrige Hydrogenchlorid-Lösung hinzu, trennte die wässrige Phase ab, versetzte mit Magnesiumsulfat, filtrierte über Kieselgel ab, wusch mit Essigsäureethylester nach und engte ein. Nach der Reinigung des Rohproduktes durch Chromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Hexan/Essigsäureethylester-Gradient) und durch Kristallisation aus Essigsäureethylester erhielt man 2.48 g (44% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm]= 1.45 - 1.57 (m, 2H), 1.62 - 1.79 (m, 2H), 1.81 - 2.05 (m, 4H), 2.19 (s, 3H), 2.20 - 2.33 (m, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.49 - 7.58 (m, 2H), 7.64 (t, 1H), 7.70 (dd, 1H), 8.33 (s, 1H), 10.95 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 454 [M+H]+.
(5r,8r)-3 -(4'-Chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)-4,8-dihydroxy-8-(trifluormethyl)- 1 - azaspiro [4.5]dec-3-en-2 -on
Zu 125 mg (0.30 mmol) (5r,8r)-3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4,8-dihydroxy-8-(trifluormethyl)-l- azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on (Beispiel 40A) in 13 ml entgastem 1,2-Dimethoxyethan wurden unter Argon 24 mg (0.030 mmol) Dichlor[ 1 , 1 '-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium- Dichlormethan-Komplex gegeben. Man rührte 5 Minuten bei Raumtemperatur und setzte anschließend 78 mg (0.45 mmol) (4-Chlor-3-fluorphenyl)boronsäure und eine Lösung von 340 mg (1.04 mmol) Cäsiumcarbonat in 815 μΐ entgastem Wasser hinzu. Die Re aktionsmis chung wurde 10 Minuten bei 150 °C im geschlossenen Gefäß unter Mikrowellenbestrahlung erhitzt. Nach dem Abkühlen gab man 100 μΐ konzentrierte, wässrige Hydrogenchlorid-Lösung zum Ansatz und dampfte im Vakuum ein. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen, mit wässriger, 5%-iger Zitronensäure (pH = 4.0 - 4.5) und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man reinigte das Rohprodukt durch Chromatographie an Kieselgel (Eluent: Hexan/Ethylacetatgradient) und erhielt 68 mg (49% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (300MHz, Methanol^): δ [ppm] = 1.41 - 1.56 (m, 2H), 1.85 - 1.99 (m, 4H), 2.25 (s, 3H), 2.32 - 2.48 (m, 2H), 7.10 - 7.25 (m, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.40 (dd, 1H), 7.43 - 7.56 (m, 3H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.19 min; MS (ESIpos): m/z = 470 [M+H]+. für Ausführungsbeispiel 1-3
V.3-a ( =V.l-a) = Verbindung aus Tabelle 1, Zeile 20, S. 40 der WO10/063378
Y )
-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-(methoxymethyl)-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-
Zu 10.4 g (23.4 mmol) der Verbindung aus Beispiel 30A in 35 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 5.26 g (46.9 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Die Re aktionsmis chung wurde 15 Minuten bei 80 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen engte man ein, nahm den Rückstand in Wasser auf und tropfte
in 2N wässrige Hydrogenchlorid-Lösung. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 9.3 g der Titelverbindung.
Ή-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 1.21 - 1.47 (m, 4H), 1.48 - 1.64 (m, 1H), 1.65 - 1.78 (m, 2H), 1.81 - 1.97 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 3.16 (d, 2H), 3.24 (s, 3H), 7.30 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.44 - 7.53 (m, 3H), 7.61 - 7.68 (m, 2H), 8.13 (s, 1H), 10.77 (s, 1H).
LC-MS (Methode 3): Rt = 1.25 min; MS (ESIpos): m/z = 412 [M+H]+.
Die Substanz wurde als Isomerengemisch als Beispiel 1- 1 -a-5 der WO 07/048545 offenbart. für Ausführungsbeispiel 1-4
V.4-a ( =V.2-a) = Verbindung aus Tabelle 2, Zeile 10, S. 45 der WO10/063378)
(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl) -4-hydroxy- 8 -(methoxymethyl) - 1 - azaspiro [4.5]dec-3-en-2 -on
Zu 2.00 g (5.26 mmol) der Verbindung aus Beispiel 41 A und 215 mg (0.26 mmol) Dichlor[ 1,1'- bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium-Dichlormethan-Komplex in 213 ml entgastem 1 ,2- Dimethoxyethan wurden unter Argon 1.10 g (6.31 mmol) (4-Chlor-3-fluorphenyl)boronsäure und eine Lösung von 6.00 g (18.4 mmol) Cäsiumcarbonat in 13 ml entgastem Wasser gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen gab man 2.5 ml konzentrierte, wässrige Hydrogenchlorid-Lösung und Natriumsulfat hinzu, filtrierte über Kieselgel und Natriumsulfat ab, wusch mit Essigsäureethylester nach und engte ein. Man reinigte das Rohprodukt durch Chromatographie an Kieselgel (Eluent: Hexan/Essigsäureethylester-Gradient). Anschließend wurde mit wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung verrührt, mit konzentrierter, wässriger Hydrogenchlorid-Lösung sauer gestellt, abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 1.50 g (65% d. Th.) der Titelverbindung.
Tl-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 1.21 - 1.47 (m, 4H), 1.48 - 1.64 (m, IH), 1.65 - 1.78 (m, 2H), 1.81 - 1.97 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 3.16 (d, 2H), 3.24 (s, 3H), 7.31 (d, IH), 7.40 (d, IH), 7.48 - 7.57 (m, 2H), 7.60 - 7.74 (m, 2 H l, 8.13 (s, IH), 10.79 (s, IH).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.26 min; MS (ESIpos): m/z = 430 [M+H]+.
Tabelle V zeigen die Vergleichsbeispiele, welche die Anmelderin als den nächstliegenden Stand der Technik ansieht in der Übersicht.
Ausführungshdspiclc:
Beispiel 1-1
(5r,8r)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphe
azaspiro [4.5]dec-3-en-2 -on
Zu 6.80 g (13.66 mmol) Methyl-1 - { [(4'-chlor-4-methylbiphenyl-3 -yl)acetyl]amino} -4-methoxy-4- (trifluormethyl)cyclohexancarboxylat (Beispiel 32A) in 68 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 3.07 g (27.31 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 60 Minuten bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf 1500 ml Eiswasser gegossen und mit wässriger Salzsäure angesäuert. Das Rohprodukt wurde ab filtriert, getrocknet und durch Chromatographie (Säule: Chiralpak LA 5μπι, 250x30mm; Hexan/Ethanol-Gradient in Gegenwart von 0.1% Ameisensäure) vorgereinigt. Man erhielt nach Eindampfen und Kristallisation aus Diethylether 3.57 g (56% d. Th.) der Titelverbindung .
Ή-NMR (300MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.25 - 1.41 (m, 2H), 1.83 - 1.99 (m, 4H), 2.00 - 2.14 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 3.34 (s, 3H), 7.28 (d, 1H), 7.32 (d, 1H), 7.42 - 7.51 (m, 3H), 7.58 - 7.67 (m, 2H), 8.41 (s, 1H), 10.98 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 466 [M+H]+.
Beispiel 1-2
(5r,8r)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-(tri
azaspiro [4.5]dec-3-en-2 -on
Zu 300.00 mg (0.69 mmol) 3-(5-Brom-2-methylphenyl)-4-hydi'oxy-8-methoxy-8-(trifluormethyl)- l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on (Beispiel 42A) in 28 ml entgastem 1 ,2-Dimethoxyethan wurden unter Argon 67.70 mg (0.083 mmol) Dichlor[ 1 , 1 '-bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium- Dichlormethan-Komplex gegeben. Man rührte 5 Minuten bei Raumtemperatur und setzte anschließend 216.83 mg (1.24 mmol)
und eine Lösung von 945.40 mg (2.90 mmol) Cäsiumcarbonat in 1 ml entgastem Wasser hinzu. Die Reaktionsmischung wurde 40 min in der Mikrowelle auf 150 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen gab man 0.4 ml konzentrierte, wässrige Hydrogenchlorid-Lösung hinzu, filtrierte, wusch den Niederschlag mit Dichlormethan sowie mit Methanol und dampfte die vereinigten organischen Phasen im Vakuum ein. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie an Kieselgel (Laufmittel: Hexan/Essigsäureethylester-Gradient) vorgereinigt. Die Endreinigung geschah durch RP- Chromatographie (Laufmittel: Wasser/Ameisensäure/Acetonitril-Gradient). Man erhielt 43 mg (13% d. Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 1.27 - 1.39 (m, 2H), 1.85 - 1.99 (m, 4H), 2.00 - 2.13 (m, 2H), 2.16 (s, 3H), 3.34 (s, 3H), 7.29 (d, 1H), 7.38 (d, 1H), 7.45 - 7.54 (m, 2H), 7.57 - 7.70 (m, 2H), 8.36 (s, 1H), 10.97 (s, 1H).
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 484 [M+H]+.
Alternativ konnte die Zielstruktur wie folgt hergestellt werden:
Zu 35.00 g (67.84 mmol) Methyl- 1 - { [(4'-chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)acetyl]amino} -4- methoxy-4-(trifluormethyl)cyciohexancarboxylat (Beispiel 33A) in 350 ml N,N- Dimethylformamid wurden 15.22 g (135.68 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 30 Minuten bei Raumtemperatur. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete
Reaktionsgemisch auf 8000 ml Eiswasser gegossen und mit wässriger Salzsäure angesäuert. Das Rohprodukt wurde abfiltriert, getrocknet und durch Kieselgel-Chromatographie (Dichlormethan/Ethylacetat-Gradient) vorgereinigt. Der erhaltene Feststoff wurde aus Diethylether kristallisiert. Man erhielt 9.33 g (28% d. Th.) der Titelverbindung.
Beispiel 1-3
(5r,8r)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-(methoxymethyl)-l- azaspiro [4.5]dec-3-en-2 -on
Zu 570 mg (1.20 mmol) der Verbindung aus Beispiel 35 A in 5 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden unter Stickstoff 148 mg (1.32 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung ! 5 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, nahm den Rückstand in Eiswasser auf, säuerte mit IN wässriger Hydrogenchlorid-Lösung an, rührte 30 Minuten, saugte ab, wusch mit Wasser und trocknete den Niederschlag. Durch zweimalige präparative HPLC [1. Säule: Chromatorex C18, 10 μπι, 125 mm x 30 mm; Eluent: Wasser/Acetonitril-Gradient unter Zusatz von 0.1% Ameisensäure; 2. Säule: Chiralpak IC, 5 μπι, 250 mm x 20 mm; Eluent: Hexan/Ethanol = 80/20 unter Zusatz von 0.1% Ameisensäure; Fluss: 25 ml/min; Temperatur: RT ] wurden die Diastereomere getrennt. Man erhielt 105 mg (20% d. Th.) der Titelverbindung.
!H-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 1.12 - 1.27 (m, 2H), 1.48 - 1 .65 (m, 2H), 1.75 - 1.88 (m, 2H), 1.99 - 2.14 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 3.28 (m, 5H), 7.30 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.44 - 7.54 (m, 3H), 7.61 - 7.69 (m, 2H), 8.10 (s, 1H), 10.83 (s, 1H).
LC-MS (Methode 2): Rt = 1.19 min; MS (ESIpos): m/z = 442 [M+H]+.
Beispiel 1 -4
(5r,8r)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-8-(m
azaspiro [4.5]dec-3-en-2 -on
Zu 6.55 g (13.3 mmol) der Verbindung aus Beispiel 34A in 60 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden unter Stickstoff 1.64 g (14.7 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend gab man das Reaktionsgemisch auf Eiswasser, tropfte IN wässrige Hydrogenchlorid-Lösung bis zu einem pH- Wert von 1 -2 hinzu, rührte 30 Minuten, saugte ab, wusch mit Wasser und trocknete den Niederschlag. Zur weiteren Reinigung wurde das Produkt in IN wässriger Natriumhydroxid- Lösung gelöst, durch Ansäuern mit wässriger 1 N Salzsäure ausgefällt, 30 Minuten gerührt, mit Wasser gewaschen, abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 6.00 g (98% d. Th.) der Titelverbindung .
Ή-NMR (300MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 1.12 - 1.26 (m, 2H), 1.50 - 1.65 (m, 2H), 1.76 - 1.89 (m, 2H), 1.98 - 2. 15 (m, 2H), 2.19 (s, 3H), 3.1 (s, 3H), 3.28 (s, 5H), 7.31 (d, 1H), 7.39 (d, 1H), 7.49 - 7.57 (m, 2H), 7.64 (t, 1H), 7.69 (dd, 1H), 8.14 (s, 1H), 10.82 (s, 1H).
IX - MS (Methode 2): R, = 1.21 min; MS (ESIpos): m/z = 460 [M+H]+.
Assavs
3.1 Human ACC-Enzymassays Die ACCl - und ACC2- Inhibitionsdaten wurden mit beiden im folgenden beschriebenen Assays erhoben. Normalerweise wurde für beide Messungen eine gemeinsame serielle Verdünnungsreihe der Testsubstanzen erstellt und von dieser Verdünnungsreihe dann mit einem 384well-50-nl- Kapillarpipettor (Hummingbird™ von Genomics Solutions) mehrere Substanzplattenkopien erstellt. Diese wurden dann jeweils in dem ACCl - und dem ACC2-Assay verwendet, so dass für eine optimale Vergleichbarkeit beide Enzyminhibitionsmessungen mit Kopien derselben
Substanzverdünnungsreihe durchgeführt wurden.
Human ACCl Enzymassay Die hACC 1 -inhibitorische Wirkung der Substanzen dieser Erfindung wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen hACCl-Assay gemessen.
Im Wesentlichen wird die Enzymaktivität gemessen durch Quantifizierung des als Nebenprodukt der Enzymre aktionen gebildeten Adenosin-di-phosphat (ADP) mittels des ADP-Glo™- Nachweissy stems der Firma Promega. Bei diesem wird zunächst das in der Enzymreaktion nicht verbrauchte Adenosin-tri-phosphat (ATP) mittels einer Adenylatzyclase („ADP-GLO-Reagenz") quantitativ in cAMP überführt, die Adenylatzyklase dann gestoppt und anschließend („Kinase Detection Reagenz") wird dann das gebildete ADP in ATP umgewandelt und dieses in einer luziferasebasierten Reaktion in ein Glow-Lumineszenzsignal umgesetzt.
Als Enzym wurde rekombinantes C -terminal FLAG-getagtes humanes ACCl (Acetyl-Coenzym A Carboxylase alpha Transkript Variante 1) (GenBank Accession No. NM___198834) (Aminosäuren 39 - Ende) verwendet, exprimiert in Baculovirus-infizierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Anti-FLAG- Affinitätschromatographie .
Für den Assay wurden 50 nl einer lOOfach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine weiße low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert, 2,5 μΐ einer Lösung von hACCl in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 mM Kaliumeitrat, 12 mM NaHCOs, 2 mM Di-thio-threitol (DTT), 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA)] hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die
Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 2,5 μΐ einer Lösung von Adenosin-tri-phosphat (ATP, 100 μΜ =>Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumen ist 50 μΜ) und Acetyl-CoA (20 μΜ
=>Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumen ist 10 μΜ) in Assaypuffer und die resultierende
Mischung für die Reaktionszeit von 45 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des hACCl wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 1,75 ng/μΐ. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 2,5 μΐ des„ADP-GLO-Reagenz" (l: l,5-fach verdünnt) und die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert, um das nicht umgesetzte ATP vollständig in cAMP zu überführen. Anschließend wurden 2,5 μΐ des„Kinase Detection Reagenz" (l,2fach konzentrierter als vom Hersteller angegeben) zugegeben, die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert und dann die Lumineszenz mit einem geeigneten Messgerät (Viewlux oder Topcount von Perkin-Elmer oder Pherastar von BMG Labtechnologies) gemessen. Die Menge des emittierten Lichtes wurde als Maß für die Menge des gebildeten ADP und damit für die Enzym aktivität der hACCl genommen. Die Daten wurden normalisiert (Enzymr e aktion ohne Inhibitor = 0 %
Inhibition, alle anderen Assaykomponente aber kein Enzym = 100 % Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanz auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μΜ bis 1 nM (20 μΜ, 6.7 μΜ, 2.2 μΜ, 0.74 μΜ, 0.25 μΜ, 82 ηΜ, 27 ηΜ, 9.2 ηΜ, 3.1 nM and 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der lOOfach konzentrierten Lösung durch serielle 1:3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und ICso-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet wurde. Human ACC2 Enzymassay
Die hACC2-inhibitorische Wirkung der Substanzen dieser Erfindung wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen hACC2 -Assay gemessen.
Im Wesentlichen wird die Enzymaktivität gemessen durch Quantifizierung des als Nebenprodukt der Enzymre aktionen gebildeten Adenosin-di-phosphat (ADP) mittels des ADP-Glo™- Nachweissystems der Firma Promega. Bei diesem wird zunächst das in der Enzymreaktion nicht verbrauchte Adenosin-tri-phosphat (ATP) mittels einer Adenylatzyclase („ADP-GLO-Reagenz") quantitativ in cAMP überführt, die Adenylatzyklase dann gestoppt und anschließend („Kinase Detection Reagenz") wird dann das gebildete ADP in ATP umgewandelt und dieses in einer luziferasebasierten Reaktion in ein Glow-Lumineszenzsignal umgesetzt.
Als Enzym wurde rekombinantes C -terminal FLAG-getagtes humanes ACC2 (Acetyl-Coenzym A Carboxylase 2, GenBank Accession No. NP__001084) (Aminosäuren 27 - Ende) verwendet, exprimiert in Baculovirus-infizierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Anti-FLAG- Affinitätschromatographie .
Für den Assay wurden 50 nl einer lOOfach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine weiße low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland)
pipettiert, 2,5 μΐ einer Lösung von hACC2 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 mM Kaliumeitrat, 12 mM NaHCOs, 2 mM Di-thio-threitol (DTT), 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin (BSA)] hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die
Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 2,5 μΐ einer Lösung von Adenosin-tri-phosphat (ATP, 100 μΜ =>Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumen ist 50 μΜ) und Acetyl-CoA (20 μΜ
=>Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumen ist 10 μΜ) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 45 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des hACC2 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 2 ng/'μΐ. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 2,5 μΐ des„ADP-GLO-Reagenz" (l: l,5-fach verdünnt) und die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert, um das nicht umgesetzte ATP vollständig in cAMP zu überführen. Anschließend wurden 2,5 μΐ des„Kinase Detection Reagenz" (l,2fach konzentrierter als vom Hersteller angegeben) zugegeben, die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert und dann die Lumineszenz mit einem geeigneten Messgerät (Viewlux oder Topcount von Perkin-Elmer oder Pherastar von BMG Labtechnologies) gemessen. Die Menge des emittierten Lichtes wurde als Maß für die Menge des gebildeten ADP und damit für die Enzym aktivität der hACC2 genommen. Die Daten wurden normalisiert (Enzymre aktion ohne Inhibitor = 0 %
Inhibition, alle anderen Assaykomponente aber kein Enzym = 100 % Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanz auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μΜ bis 1 nM (20 μΜ, 6.7 μΜ, 2.2 μΜ, 0.74 μΜ, 0.25 μΜ, 82 ηΜ, 27 ηΜ, 9.2 ηΜ,
3.1 η Μ and 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der lOOfach konzentrierten Lösung durch serielle 1:3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und ICso-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet wurde.
3.2 Zeü-Assays
In Übereinstimmung mit der Erfindung, wurden die Substanzen in Zell-basierten Assays getestet, das bedeutet die Fähigkeit der Substanzen die Tumorzellproliferation nach einer 96stündigen
Substanzinkubation zu hemmen. Die Zellviabilität wurde mittels dem CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) getestet. Die Zellen wurden in einer Dichte von 2000-5000 Zellen/Well (abhängig von der Zelllinie) in ΙΟΟμΙ Wachstumsmedium auf 96well Microtiterplatten ausgesät. Für j ede untersuchte Zelllinie, wurden Zellen auf eine separate Platte zur Bestimmung der Lumineszenz an t=0 Stunden und t=96 Stunden ausgesät. Nach einer Übernachtinkubation bei 37°C, wurden die Lumineszenzwerte für die t=0 Proben bestimmt. Die Dosis-Platten für die t=96 Stunden Zeitpunkte wurden mit in Wachstumsmedium verdünnten Substanzen behandelt. Die
Zellen wurden dann für 96 Stunden bei 37°C inkubiert, anschließend die Lumineszenzwerte für die t=96-Stunden Proben bestimmt. Für die Datenanalyse wurden die t=0 Werte von den t=96 Stunden W orte abgezogen für behandelte und unbehandelte Proben. Die prozentualen Unterschiede in der Luminescenz zwischen mit Substanz behandelten und Kontrollwerten wurden benutzt um die prozentuale Wachstumshemmung zu bestimmen.
Die Substanzen wurden in folgenden Zelllinien untersucht, die beispielhaft die angegebenen Indikationen vertreten:
ATCC: American Type Culture Collection
NCI: National Cancer Institute
DMSZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 3.3 Analyse der ACC1 Expression in Tumor- and Normalgewebe
Die ACCi Expression wurde mittels eines Microrrays bestimmt. Dafür wurde die RNA aus verschiedenen Tumorgeweben und den korrespondierenden Normalgeweben isoliert. Methodisch wurde Trizol R NA extraction Reagenz (Invitrogen) verwendet und eine Aufreinigung mittels des RNeasy Mini Kit (Qiagen) angeschlossen. Ausserdem wurde ein DNase I (Qiagen) Verdau durchgeführt, um genomische DNA zu eliminieren. Zur Qualitätskontrolle wurde eine Analyse der totalen RNA mittels eines RNA LabChip auf einer Agilent Bioanalyzer 2100 Platform (Agilent Technologies) durchgeführt und die RNA Konzentration mittels des Peqlab NanoDrop Systems bestimmt. Zur Hybridisierung wurde der„one-cycle eukaryotic target labeling assay" von Affymetrix verwendet und der Array anschliessend auf einem AffymetrixGeneChip 3000 Scanner (Affymetrix) ausgelesen. Auswertung und Qualitätskontrolle erfolgten unter Verwendung der Expressionist Pro 4.0 Reflner (GeneData) Software.
3.4 Assays zur Bestimmung des Oktanol-Wasser-Verteüungskoeffizienten (logP/D) der Membranaff tät (logMA) und
der Proteinbindung an humanes Serum Albumin (Kj USA)
Assay zur Bestimmung des Oktanoi- Wasser- Verteüungskoeffizienten (!ogP/D):
Der Verteilungskoeffizient Oktanol/Wasser P bzw. D ist ein Schlüsselparameter zur Abschätzung von Membran-Penetration und Permeabilität. Er ist definiert als Verhältnis der Gleichgewichtskonzentrationen einer Substanz im Zwei-Phasensystem Oktanol/Wasser.
CWasser
P = Partition (engl. Verteilung)
D = Distribution (engl. Verteilung)
cOktanol = Konzentration der Substanz in der Oktanol-Phase
cWasser = Konzentration der Substanz in der wässrigen Phase
Er wird üblicherweise in Form des dekadischen Logarithmus (logP bzw. logD) angegeben. Der logP beschreibt das Verteilungsverhalten einer Substanz, die ausschließlich in ihrer neutralen Form vorliegt. Der logD beschreibt das Verteilungsverhalten einer Substanz bei einem bestimmten pH-Wert; in Abhängigkeit von der Ionisierungskonstante pKa des Substanz, kann dabei ein Teil der Substanz in ionischer, ein Teil in neutraler Form vorliegen. Der logP/D-Wert der Wirkstoffe wurde mit einer isokratischen HPLC-Methode (HPLC = High Performance liquid chromatography) bestimmt (Literatur: OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 117). Die Methode basiert auf der Korrelation der HPLC-Retentionszeit der Testsubstanz mit der von Referenzsubstanzen mit bekannten Verteilungskoeffizienten. Die Testsubstanz wurde als 10 mM-DMSO-Lösung (DMSO = Dimethylsulfoxid) eingesetzt. 10 μΐ dieser Lösung wurden mit einem Methanol-Wasser-Gemisch im Verhältnis 7 + 3 auf 100 μί aufgefüllt.
Die neun Referenzsubstanzen wurden einzeln in Methanol gelöst. Die Konzentration ist der Tabelle 1 zu entnehmen. Es wurden je ΙΟΟμΙ der Stammlösungen zusammen in ein HPLC-Vial gegeben und mit 300μ1 Wasser gemischt.
Tab. 1
Zur Bestimmung der Totzeit wurde eine Formamid-Lösung eingesetzt. Dazu wurden 7 mg Formamid in 10 ml Methanol gelöst. ΙΟΟμΙ dieser Stammlösung wurden mit 50()μ1 Methanol und 200μ1 Wasser gemischt.
Alle Lösungen wurden mit einem Fluss von l.OOml/min chromatographiert.
Chromatographische Bedingungen:
HPLC-Anlage Waters Alliance HT 2790
UV-Detektor DAD Waters 996
MS-Detektor MS Micromass ZQ
HPLC Software MassLynx 4.1 der Firma Waters
Säule Spherisorb ODS 3μπι 4,6 x 60 mm
Laufmittel Methanol + Wasser mit 0.01M Ammoniumac etat (0.77g/Liter)
75 + 25, pH 7.0
Einspritzvolumina:
Formamid 5μ1
Referenzen 5μ1
Testsubstanz 15μ1
Inj ektionsschema:
Formamid, Referenzen, Testsubstanz 1, Testsubstanz 2, Formamid, Referenzen.
Die Auswertung der Retentionszeiten erfolgte im Diodenarray-Detektor (DAD) bei 200-400nm. Mit dem nachgeschalteten Massenspektrometer wurde über die Molekülmasse die Identität der Testsubstanz überprüft. Der HPLC-Lauf wurde mit der Waters-Software Masslynx 4.1 ausgewertet.
Die LogP/D Werte wurden mit der Software "POW Determination" (proprietäre Entwicklung) berechnet.
Assays zur Bestimmung der Membr anaf finita t logMA und der Proteinbindung an humanes Serum Albumin (HS A):
Die Bestimmung der Membranaffinität und der Proteinbindung an humanes Serum Albumin (HSA) erfolgte über die Transil-Technologie (Literatur: A. Loidl- Stahlhofen, A. Eckert, T. Hartmann, M. Schöttner J Pharm Sei 90, 599-606 (2001). Bei Transil® (vertrieben von der Firma Sovicell in Leipzig) handelt es sich um Glaskügelchen (Durchmesser 10 - 12 μπι), auf denen eine doppelschichtige Membran aus Phosphatidylcholin (MA-Transil) oder kovalent gebundenes humanes Serum Albumin (HSA-Transil) aufgebracht ist.
Zur Bestimmung des logMA und der Proteinbindungskonstante an HSA wurde das kommerziell verfügbare TRANSIL Intestinal Absorption & HSA Binding Combined Assay Kit verwendet. Dabei handelt es sich um eine 96 well Mikrotiterplatte (96 well-MTP), gefüllt mit Transil, mit der für jeweils acht Wirkstoffe die Bindung an MA-Transil und HSA-Transil bestimmt werden kann. Für jeden Wirkstoff steht eine Reihe mit 12 wells auf der Transil-Platte zur Verfügung. Zwei Wells dienen als Referenz und sind nur mit Puffer pH 7.4 be füllt. Fünf weitere Wells enthalten MA-Transil in unterschiedlicher ansteigender Konzentration, die fünf restlichen wells enthalten HSA-Transil in unterschiedlicher ansteigender Konzentration.
Um die Bindung eines Wirkstoffs an Transil zu ermitteln, wurde der Überstand der wells mit Transil gegen die Referenzlösung ohne Transil über HPLC-MS-Kopplung (HPLC-MS = Highp erformanc e liquid chromatography-mas s spectrometry) quantifiziert.
Die Durchführung des Assays im Einzelnen:
Vom internen Substanzlager wurden die Wirkstoffe in einer 96 well-MTP geliefert. Diese Platte wird als Mutterplatte bezeichnet. Pro well waren 30μ1 einer 10 mmol Wirkstofflösung in DMSO (Dimethylsulfoxid) enthalten. Zwei wells am Anfang (well AI) und am Ende der Platte (well Hl 2) wurden mit 30μ1 10 mmol Warfarinlösung in DMSO befüllt. Warfarin, dessen M embranaffinität und Bindung an HSA bekannt ist, dient zur Überprüfung der Richtigkeit der Messung. Aus der
Mutterplatte wurde eine Tochterplatte mit der Verdünnung 1 zu 4000 mit einem Gemisch Puffer pH 7.4 und DMSO im Verhältnis 1+1 hergestellt. Die Wirkstoffkonzentration pro well betrug 2.5 μπιοΙ/Liter, das Volumen pro well betrug 400 μΐ.
Mit einem Hamilton-Pipettierroboter Microlab STAR wurden die 96 Wirkstoffe aus der Tochterplatte auf insgesamt 12 Transil-Platten verteilt. Pro well der Tochterplatte wurden 12 mal 20μ1 entnommen. Die Konzentration je well in der Transil-Platte betrug 0.25μηιο1/Όί6Γ, einer Verdünnung 1 zu 10 entsprechend. Der Gehalt an DMSO lag bei 5%.
Die befüllten Transil-Platten wurden j e zwei Minuten resuspendiert, anschließend mindestens zwei Minuten bei Raumtemp eratur stehen gelassen und dann bei 600 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde vom Pipettierroboter 20 μΐ Überstand aus jedem Well der Transil-Platte abgenommen und in eine separate Mikrotiterplatte überführt. Dabei wurden jeweils die Überstände von vier Transil-Platten in einer Mikrotiterplatte vereinigt („gepoolt"), so dass am Ende drei gepoolte Mikrotiterplatten mit je 80μ1 Lösung und einer Wirkstoffkonzentration von 62.5 nM pro Well vorlagen.
Bevor die Wirkstoffe mittels HPLC-MS quantifiziert werden können, muss für jeden Wirkstoff eine Optimierung durchgeführt werden, bei der durch einmalige Injektion Tochterion sowie optimale elektrische Spannungen ermittelt werden. Da/u fertigte der Pipettierroboter von der Mutterplatte eine Verdünnung von 1 zu 10 000 000 in einem Acetonitril-Wasser Gemisch im Verhältnis 8 + 2 in einer separaten Mikrotiterplatte an.
Diese Mikrotiterplatte wurde mit der Software Discovery Quant Optimize der Firma AB Sciex an der HPLC-MS vermessen. Die drei gepoolten Mikrotiterplatten wurden mit der Software Discovery Quant Analyze der Firma AB Sciex an der HPLC-MS vermessen.
Chromatographische Bedingungen:
HPLC-MS-System: Agilent 1200 Rapid resolution HPLC
Sciex Triple Quad 5500 Massenspektrometer (Firma AB Sciex) PAL Autosampier DLW Option
Software: Analyst 1.4 (Firma AB Sciex)
Discovery Quant Optimize (Firma AB Sciex)
Discovery Quant Analyze (Firma AB Sciex)
Optimierung:
Säule: Kapillare
Inj ektionsvolumen: 5 μΐ
Flussrate: 0 min -> 80μ1/ιηϊη
0.20 - 0.65 min-> 30μ1/πύη
0.66 0.7 min -> 150μ1/πύη
Fließmittel: A = Acetonitril + 0.05% Ameisensäure
B = Wasser + 0.05% Ameisensäure
Isokratisch A:B 8 + 2
Analyse:
Säule: Poroshell 120 SB-C18 2.7μm 3 x 30 mm
Inj ektionsvolumen: 2 μΐ
Flussrate: 1 ml/min
Fließmittel: Gradient
A = Acetonitril + 0.05% Ameisensäure
B = Wasser + 0.05% Ameisensäure
0 min -> 95% A, 5% B
0 - 1.0 min -> 5%A, 95%B linear steigend
1.0 - 2.2 min -> 5% A, 95%B isokratisch
2.21 -2.3 min -> 95 %A, 5% B isokratisch
3.5 Bestimmung der Plasmaprotcinhindung durch Gleichgewichtsdialyse Die Bestimmung der Bindung von Prüfsubstanzen an Plasmaproteine erfolgt durch Gleichgewichtsdialyse mit Hilfe der Ht-Dialysis Apparatur (96well) aus Teflon und einer semipermeablen Membran (regenerierte Cellulose, MWCO 12-14K). Diese trennt j e 150 μΐ einer Plasma- und einer Pufferseite (50 mM Phosphatpuffer) . Die Prüfsubstanz wird in 2 Konzentrationen (üblicherweise 3 und 0.3 μΜ) zur Plasmaseite hinzugefügt und bindet an Plasmaproteine. Der ungebundene Anteil der Prüfsubstanz passiert die Membran passieren und verteilt sich auf beide Seiten bis ein Gleichgewicht eingestellt ist (ca. nach 6- 8h bei 37°C). Die Substanzkonzentration auf Puffer- und Plasmaseite durch LC-MS-Analytik ermittelt. Dafür werden beide Seiten durch Verdünnung mit Puffer oder Plasma auf die gleiche Matrix (10% Plasma) gebracht und anschließend mit Methanol gefällt. Aus dem Quotienten der Puffer- und Plasma- konzentration berechnet sich die freie (ungebundene) Fraktion (fu). Als Kontrollen werden Stabilitätsproben, Wiederfmdungsproben mitgeführt. Zusätzlich wird die Substanz in Puffer gegen Puffer dialysiert, um die unspezifische Bindung an Apparatur und Membran und die Einstellung des Gleichgewichtes zu überprüfen. Da es während der Inkubation durch den osmotischen Druck der Plasmaproteine zu einer Verdünnung des Plasmas kommt (Volumenshift), wird dieser mögliche Fehler durch Auswiegen von Leerplasmaproben ermittelt und in die Berechnung der fu einbezogen. Die Gleichgewichtseinstellung und Plasmastabilität sollte einen Wert von 80% nicht unterschreiten und die Recovery mindestens 30% betragen. Eine freie Fraktion von <1% wird als hohe, zwischen 1 und 10% als moderate und von >10% als niedrige Plasmaproteinbindung bezeichnet.
3.6 Pharmakokinetische Parameter
Bestimmung der pharmakokinetischen Parameter einer Prüfsubstanz in der Ratte und im Hund
Hierzu wurden die Prüfsubstanzen sowohl für die intravenöse als auch für die intragastrale Applikation in gelöster Form appliziert, wobei verträgliche Lösungsvermittler wie PEG400 und/oder Ethanol in verträglicher Menge verwendet wurden. Intravenöse Applikation:
Die Prüf Substanzen wurden bei einer Dosis von 0.1 -1 mg kg appliziert. Die Applikation erfolgte in der männlichen Ratte als bolus Inj ektion, im weiblichen Hund als Infusion (15 Min). Dabei wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach bolus Injektion bzw, vor und nach der 15-minütiger Infusion ca. 100-150μΕ Blutproben über einen Katheter aus der Vena jugularis (Ratte) oder aus der vena saphena (Hund) entnommen. Die Blutproben wurden mit Lithium-Heparin als Antikoagulanz versetzt und bis zur weiteren Aufarbeitung gekühlt aufbewahrt. Nach dem Zentrifugieren der Proben für 15min bei 3000Upm wurde ein Aliquot von ΙΟΟμΕ dem Überstand (Plasma) entnommen und durch Zugabe von 400 μΙ< kaltem ACN oder Methanol (absolut) gefällt. Die gefällten Proben wurden über Nacht bei 20°C ausgefroren, danach wiederum für 15min bei 3000 UpM zentrifugiert, bevor 150μΙ_, des klaren Überstandes zur Konzentrationsbestimmung abgenommen wurde. Die Analytik erfolgte durch ein Agilent 1200 HPLC- System mit angeschlossener LCMS/'MS Detektion. Berechnung der PK Parameter (via PK Berechnungssoftware, z.B. WinNonLin®): CLplasma: Gesamtplasma-Clearance der Prüfsubstanz (in L*kg/h); CLblood: Gesamtblut-Clearance der Prüfsubstanz (in L*kg/h), wobei (CLblood = CLplasma*Cp/Cb); Vss: Apparentes Verteilungsvolumen im steady State (in L/kg); tl/2: Halbwertszeit innerhalb eines spezifizierten Intervalls (hier: terminale tl/2, in h); AUCnorm: Fläche unter dem Plasmakonzentrationszeitprofil vom Zeitpunkt Null bis zur Unendlichkeit extrapoliert geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg*L/h); AUC(0-tn)norm: Integrierte Fläche unter dem Plasmakonzentrationszeitprofil vom Zeitpunkt Null bis zum letzten Zeitpunkt, zu dem eine Plasmakonzentration messbar war, geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg*L/h); Cmax: Maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma (in μ^υ>; Cmax,norm: Maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma geteilt durch die kö ergewichtsnormalisierte Dosis (in kg/L); Cb/Cp: Verhältnis der Blut zu Plasma Konzentrationsverteilung.
Intragastrale Applikation:
Die Prüfsubstanzen wurden bei einer Dosis von 0.3 -1 mg/kg mittels einer Sonde intragastral als Bolus an nüchterne männliche Ratten oder weibliche Hunde appliziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation wurden ca. 100 - 150μΙ^ Blutproben über einen Katheter aus der Vena jugularis (Ratte) oder aus der Vena saphena (Hund) entnommen. Die Blutproben wurden mit Lithium-Heparin als Antikoagulanz versetzt und bis zur weiteren Aufarbeitung gekühlt aufbewahrt (Kühlschrank). Nach dem Zentrifugieren der Proben für 15min bei 3000Upm wurde ein Aliquot von ΙΟΟμΕ dem Überstand (Plasma) entnommen und durch Zugabe von 400μΙ^ kaltem ACN oder Methanol (absolut) gefällt. Die gefällten Proben wurden über Nacht bei -20°C ausgefroren, danach für 15min bei 3000UpM zentrifugiert bevor 150μΕ des klaren Überstandes zur Konzentrationsbestimmung abgenommen wurde. Die Analytik erfolgte durch ein Agilent 1200 HPLC-System mit angeschlossener LCMS/MS Detektion Berechnung der PK Parameter (via PK Berechnungssoftware, z.B. WinNonLin®):
AUCnorm: Fläche unter dem Plasmakonzentrationszeitprofil vom Zeitpunkt Null bis zur Unendlichkeit extrapoliert geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg*L/h); AUC(0-tn)norm: Integrierte Fläche unter dem Plasmakonzentrationszeitprofil vom Zeitpunkt Null bis zum letzten Zeitpunkt, zu dem eine Plasmakonzentration messbar war, geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg*L/h); Cmax: Maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma (in μg/L); Cmax,norm: Maximale Konzentration der Prüfsubstanz im Plasma geteilt durch die körpergewichtsnormalisierte Dosis (in kg/'L); tl/2: Halbwertszeit innerhalb eines spezifizierten Intervalls (hier: terminale tl/2, in h); Fobs%: beobachtete orale Bioverfügbarkeit, AUC(0-tn)norm nach i.g. Gabe geteilt durch AUC(0-tn)norm nach i.v. Gabe, tmax: Zeitpunkt, zudem die maximale Konzentration der Prüf Substanz im Plasma gemessen wird.
Zur Berechnung der relativen Bioverfügbarkeit einer Testsubstanz wird die AUC(0-tn)norm nach i.g. Gabe einer mikrokristallinen Substanz- Suspension geteilt durch die AUC(0-tn)norm nach Gabe einer Substanz-Lösung.
3.7. in-vivo-Wirksamkeit
Xenograft Modell Zur Bestimmung der antitumoralen Wirksamkeit im lebenden Organismus wurden Xenograft- Modelle in immunsupprimierten Mäusen verwendet.
Zunächst wurde hierzu die maximal tolerierbare Dosis (MTD) nach folgendem Protokoll ermittelt: Weibliche Nacktmäuse (NMRI-nude (nu/nu) mice, Taconic M&B A/S) erhielten über einen Zeitraum von 3 Wochen täglich oral eine definierte Dosis der Testsubstanz und wurden täglich bezüglich Sterblichkeit und Körpergewicht beobachtet. Als MTD definiert wurde die höchste verabreichbare Dosis, bei der während der Behandlungsphase kein Tier starb und es nicht zu einem mehr als 10% Abfall des Körpergewichts im Vergleich zum Ausgangsgewicht kam. Zur Bestimmung der antitumoralen Wirksamkeit wurden dann Xenograftmodelle verwendet, in denen die Testsubstanzen an ihrer MTD oder, falls diese zuvor nicht zu ermitteln war, an der im Standard-Vehikel höchsten formulierbaren Dosis sowie zum Teil auch in niedrigeren Dosierungen gegeben wurden. Es wurde primär ein Prostatakarzinommodell mit hormon-unabhängigen humanen PC -3 Zellen in männlichen Nacktmäusen (NMRI-nude (numu) mice, Taconic M&B A/S) verwendet. Hierfür wurden pro Tier 3 Mio Tumorzellen (suspendiert in Medium + Matrigel) 1: 1, final 0,1 ml) in die Flanke subcutan injiziert. Wenn die Tumore 20-30 mm2 Tumorfläche erreicht hatten, wurden die Mäuse in die Therapiegruppen randomisiert und mit der Therapie begonnen. Die Therapie wurde dann unter 2-3 -mal wöchentlicher Messung von Tumorfläche und
Körpergewicht fortgesetzt, bis die durchschnittliche Tumorgröße in der Kontrollgruppe, die nur den Vehikel der Testsubstanz erhalten hatte, oder in einer der Behandlungsgruppen 130-160 mm2 erreicht hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Versuch in allen Gruppen abgebrochen und die präparierten Tumore gewogen.
Als primärer Erfolgsparameter wurde der T/C-Wert kalkuliert anhand des Effektes auf das finale Tumorgewicht errechnet: Mittelwert der Tumorgewichte in der B ehandlungsgrupp e dividiert durch den Mittelwert der Tumorgewichte in der Vehikelgruppe.
4, Ergebnisse:
4.1. Enzymassay
Die Tabelle 2 fasst die Ergebnisse in Bezug auf die Ausführungs- und Vergleichsbeispiele aus den Enzym assays zusammen. Für die genaue Bestimmung der Selektivität wurden j eweils die Messungen der Inhibition von ACCl und ACC2 (jeweils IC50-Bestimmungen) paarweise miteinander verglichen, bei denen in beiden Assays Kopien derselben Substanzverdünnungsreihe verwendet wurden. Wenn entweder die die ACCl - oder die ACC2 -IC50 -B e Stimmung aufgrund mangelnder Datenqualität nicht ausgewertet wurde, blieben j eweils beide Messungen unberücksichtigt und wurden nicht in der Tabelle aufgeführt. Die Selektivität der Hemmung von ACCl gegenüber der Hemmung von ACC2 wurde dann bestimmt als Mittelwert der in den einzelnen Messungen beobachteten Selektivitäten.
Tab. 2
Diese Daten zeigen, dass die Verbindungen ohne trans-Methoxy-gruppe eine deutlich schlechtere Selektivität gegen humanes ACC2 besitzen. Einige verwandte Strukturen des Standes der Technik mit trans-Methoxy-Gruppe in Position 8 des Azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on-Ringsystems inhibieren ACCl auch stark und sind selektiv gegen ACC2. Diese Eigenschaft der Strukturen des Standes der Technik war unbekannt, nicht nahegelegt und nicht ohne unzumutbaren Aufwand auffindbar.
4.2 Zeü-Assays
Die Tabelle 3 fasst die Ergebnisse in Bezug auf die Ausführungs- und Vergleichsbeispiele aus den Cellassays zusammen.
Tab. 3
4.3 ACCl Expression in Tumor- und Normalgewebe
Die ACCl Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe wurde mittels Microarray bestimmt (Figur 1). Die Expression von ACCl war signifikant hochreguliert im Vergleich zum Normalgewebe in Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen,
Bronchialkarzinomen und Pankreaskarzinomen.
4.4 Oktanol-NVasscr- Verteilungskoeffizienten (logP/D), Membranaffinität (logMA) und Proteinbindimg an humanes Serum Albumin (Kd USA)
Tabelle 4 zeigt die ermittelten logP/D, logMAund Kd HSA-Werte.
Die Auswertung der HPLC-Peaks erfolgte über Discovery Quant Analyze. Die Berechnung der Ergebnisse (logMA bzw. Bindungskonstante an USA Kd) erfolgte über ein von der Firma Sovicell bereitgestelltes Excelworkbook. Tab. 4
Beispiel logP/D pH7.4 logMA Kd HSA [μmol/l]
1-1 2.44 (2.4-2.5, n=5) 1.78 (1.6-1.9, n=5) 1.73 (1.32-2.16, n=5)
V. l-a 2.51 (2.4-2.6, n=7) 1.4 (0.9-1.7, n=7) 4.84 (3.66-6.18, n=7)
V.l -b 2.23 (1.8-2.5, n=3) 2.38 (2.0-2.7, n=4) 3.07 (2.38-2.8, n=3)
V. l-c 1.6 (n=l) 2.1 (n=l) 6.9 (n=l)
1 -2 2.45 (2.4-2.5, n=2) 1.8 (n=l) 1.79 (n=l)
V.2-a 2.52 (2.5-2.6, n=8) 1.67 (1.2-1.9, n=6) 2.8 (2.42-3.67, n=6)
V.2-b 2.55 (2.4-2.7, n=2) 2.55 (2.4-2.7, n=2) 1.43 (1.16-1.7, n=2)
V.2 1.3 (n=l) 2.3 (n=l) 1.38 (n=l)
1-3 2.3 (n=l) <1.0 (n=l) 4.8 (n=l)
V.3-a 2.51 (2.4-2.6, n=7) 1.4 (0.9-1.7, n=7) 4.84 (3.66-6.18, n=7)
V.3-b 2.5 (2.5, n=4) 2.08 (1.9-2.3, n=4) 4.2 (3.41-4.89, n=4)
1-4 2.38 (2.3-2.4, n=5) 1.14 (0.9-1.3, n=5) 2.85 (1.96-3.4, n=5)
V.4-a 2.52 (2.5-2.6, n=8) 1.67 (1.2-1.9, n=6) 2.8 (2.42-3.67, n=6)
V.4-b 2.57 (2.5-2.6, n=3) 2.13 (2.1-2.2, n=3) 3.64 (2.48-5.18, n=3)
4.5 Plasmaproteirabindung durch Gleichgewichtsdialyse
Tabelle 5 zeigt die durch Gleichgewichtsanalyse ermittelte Bindung an Plasmaprotei Menschen, der Maus und der Ratte.
Tab.5
Beispiel fu [%] (human) fu [%] (Maus) fu [%] (Ratte) fu (Maus) / fu (human)
0.2 0.82
i-i - 4
(0.18-0.23, n=2) (0.75-0.88, n=2)
0.38 2.49 0.23
V. l-a 7
(0.33-0.44, n=2) (2.35-2.62, n=2) (n=l)
0.07 2.41
V.l-b - 34
(n=i) (n=l)
V. l-c - - - -
0.26 1.4
1-2 - 5
(n=l) (1.29-1.51, n=2)
0.39 2.8 0.23
V.2-a 7
(n=l) (n=l) (0.22-0.25, n=2)
0.05 1.9
V.2-b - 39
(n=l) (n=l)
V.2 - - - -
0.41 3.8
1-3 - 9
(0.40-0.42, n=2) (3.57-4.02, n=2)
0.38 2.49 0.23
V.3-a 7
(0.33-0.44, n=2) (2.35-2.62, n=2) (n=l)
0.36 10.87 7.79
V.3-b 30
(0.35-0.38, n=2) (10.4-11.3, n=2) 7.25-8.33 (n=2)
0.37 2.17 0.21
1 -4 6
(0.37-0.38, n=2) (2.06-2.28, n=2) (n=2)
0.39 2.8 0.23
V.4-a 7
(n=i) (n=l) (0.22-0.25, n=2)
1.41 1.76 0.11
V.4-b 1
(n=l) (n=l) (n=l)
4.6 Pharmakokinetische Parameter
Pharmakokinetische Parameter ans der Ratte. Tabelle 6 zeigt die pharmakokinetischen Parameter aus der Ratte.
Tab. 6
4.7 in-vivo-Wirksamkeit
Maximai tolerierbare Dosis (MTD) in der .Maus
Die Beispiele 1-1, V. l-a/V.3-a, V.2-a V.4-a und 1 -4 wurden weiblichen Nacktmäusen (NMRI nu/'nu) appliziert:
Dosis: s. Tab. 7
Applikations art: per os
Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15(70/5/25, v/v/v)
(Solutol HS15: Polyoxyethylenester der 12 -Hydroxy ste arins äure) Applikationsvolumen : 10ml/kg
Schema: s. Tab. 7
Der Behandlungsphase folgte eine Beobachtungsphase von 21 Tagen. Die dabei aufgetretenen Todesfälle sowie die Wirkung auf das Körpergewicht sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tab. 7
Demzufolge liegt die MTD für eine 21tägige Behandlung bei lmal täglicher Gabe für die Beispiele
1-1 : ob erhalb von 100 mg/kg
V. l-a/V.3-a: oberhalb von 100 mg/kg
V.2-a/V.4-a: oberhalb von 80 mg/kg
1-4: oberhalb von 100 mg/kg
Demzufolge liegt die MTD für eine 21tägige Behandlung bei 2mal täglicher Gabe von Beispiel 1-4 oberhalb von 100 mg/kg. In vivo Wirksamkeit im PC3-Xenograft-Modell in der Maus
Die Beispiele 1-1, V. l-a/V.3-a, i-2, V.2-a/V.4-a und 1 -4 wurden nachfolgend im PC -3
Prostatakarzinom-Xenograft-Modell männlichen Nacktmäusen ( M R! nu/'nu) appliziert:
Dosis: s. Tab. 8
Applikations art: per os
Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15 (70/5/25, v/v/v)
Applikationsvolumen : 10ml/kg
Schema: s. Tab. 8
Anzahl der Mäuse: s. Tab. Tab. 8
Therapeutische Wirksamkeit wurde definiert als T/C-Wert von <= 0,50. Gute Verträglichkeit wurde definiert als maximale Körpergewichtsveränderung von <= minus 10% und 100%
Überleben der Versuchstiere.
Demzufolge zeigte Beispiel 1-1 bei 80 mg/kg und 2mal täglicher Gabe therapeutische Wirksamkeit und gute Verträglichkeit.
Demzufolge zeigte Beispiel V.i-a/V.3-a bei 100 mg/kg und lmal täglicher Gabe therapeutische Wirksamkeit und gute Verträglichkeit, währenddessen 100 mg kg und 2mal tägliche Gabe therapeutische Wirksamkeit aber keine gute Verträglichkeit zeigte.
Demzufolge zeigte Beispiel 1 -2 bei 40 mg/kg und 80 mg/kg (jeweils 2mal täglicher Gabe) therapeutische Wirksamkeit und gute Verträglichkeit.
Demzufolge zeigte Beispiel V.2-a/V.4-a bei 80 mg kg und lmal täglicher Gabe therapeutische Wirksamkeit und gute Verträglichkeit, währenddessen 40 mg/kg und lmal tägliche Gabe keine therapeutische Wirksamkeit und 80 mg kg und 2mal tägliche Gabe keine gute Verträglichkeit zeigten.
Demzufolge zeigte Beispiel 1-4 bei 80 mg/kg und 2mal täglicher Gabe therapeutische Wirksamkeit und gute Verträglichkeit.
Vorhersage humaner pharmakokinetischer Parameter und humaner therapeutischer Dosis
Die Vorhersage der humanen pharmakokinetischen (PK) Parameter (Tabelle 9) erfolgte auf Basis der in vivo PK Parameter, die für die Ratte erhoben wurden (single species scaling) unter Berücksichtigung von Spezies-Unterschieden in der freien Fraktion (fu) im Plasma. Die wirksame AUC (area under curve) wurde basierend auf dem gemessenen Plasma Konzentrationszeitprofil bei in vivo Wirksamkeit im PC3 -Tumormodell der Maus (nu/'nu Maus) bestimmt. Die Ermittlung der therapeutischen Humandosis erfolgte mittels vorhergesagter humaner Clearance (CL), der Annahme einer 100% igen Bioverfügbarkeit (F=l) und der wirksamen AUC im Tiermodell nach folgender Formel:
Dosis = A UC X x— .
fU
Tab. 9
ther. = therapeutisch
ber. = berechnet
vorh. = vorhergesagt (fu-korrigiert)
Figuren:
Fig. 1 : ACCl Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe