WO2012104428A1

WO2012104428A1 - (5s,8s)-3-(4'-chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on (verbindung a) zur therapie

Info

Publication number: WO2012104428A1
Application number: PCT/EP2012/051895
Authority: WO
Inventors: Ningshu Liu; Kai Thede; Philip Lienau; Arne Scholz; Christoph-Stephan Hilger; Ulf Bömer; Maher Najjar; Knut Eis; Reiner Fischer; Wahed Ahmed Moradi
Original assignee: Bayer Pharma Aktiengesellschaft
Priority date: 2011-02-06
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2012-08-09
Also published as: KR20140053844A; TW201240659A; MA34887B1; BR112013020015A2; EP2670408A1; AU2012213344A1; CN103533932A; CL2013002247A1; EA201391084A1; US9212140B2; AP2013007057A0; CA2826515A1; JP2014504624A; TN2013000336A1; AR085146A1; MX2013009065A; US20140031407A1; IL227804A0

Abstract

Die Erfindung betrifft (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zu therapeutischen Zwecken, Pharmazeutische Mittel und deren Verwendung in der Therapie, insbesondere zur Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen.

Description

(5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy- 8-methoxy- l -azaspiro|4.5|dec-3-en-2-on (Verbindung A)

zur Therapie Die vorliegende Erfindung betrifft (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyi-3-yl)-4-liydroxy-8- methoxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on (= Verbindung A) zu therapeutischen Zwecken,

Pharmazeutische Mittel enthaltend Verbindung A und deren Verwendung in der Therapie, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Acetyl-CoA Carboxylasen (ACCs) spielen eine Schlüsselrolle in der zellulären Fettsäure- Homöostase. ACCs sind Biotin-enthaltende Enzyme, die die Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA in einer ATPabhängigen Weise katalysieren (Kim, 1997; Harw ood. 2005; Tong. 2005). Diese Reaktion, die als zwei halbe Reaktionen abläuft, eine Biotin-Carboxylase (BC) Reaktion und eine Carboxyltransferase (CT) Reaktion, ist der erste einleitende Schritt in der Fettsäurebiosynthese und ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für den Pathway.

Es sind zwei humane ACC Isoformen bekannt. ACC1 und ACC2, die von zwei unterschiedlichen Genen codiert werden (LuTFI ABU-ELHEIGA et al, 1995, Jane WIDMER, et al. 1996). ACC I ist in lipogenem Gewebe exprimiert (Leber, Fettgewebe), im Zytosol lokalisiert, und füllt den Malonyl- CoA Pool, der als C2-Einheiten Donor für die de novo Synthese von langkettigen Fettsäuren durch FASN und anschließende Kettenverlängerung dient. ACC2 ist vor allem in oxidativen Geweben exprimiert (Leber, Herz, Skelettmuskel ) ( Bianchi et al .. 1990; Kim. 1997), mit den Mitochondrien assoziiert, und reguliert einen zweiten Pool von Malonyl-CoA. Dieser steuert die Fettsäureoxidation durch die Hemmung der Camitinpalmitylransferase I. dem Enzym das den Eintritt langkettiger Fettsäuren in die Mitochondrien für die ß-Oxidation erleichtert ( Milgraum LZ. et al.. 1 97. Widmer J. et al .. 1996). Beide Enzyme zeigen eine sehr große Sequenzhomologie und sind ähnlich reguliert durch eine Kombination von transkriptioneilen, translationeilen, und prosttranslationellen

Mechanismen. In Menschen als auch in Tieren ist die ACC Aktivität streng durch eine Reihe von diätätischen, hormonellen und anderen physiologischen Mechanismen kontroll iert wie beispielsweise über eine vorwärts allosterische Aktivierung durch Citrat. eine Feedback-Inhibition durch langkettige Fettsäuren, reversible Phosphorylierung und/oder Inaktivierung bzw. Modulation der

Enzymproduktion durch veränderte Genexpression.

ACC I Knockout-Mäuse sind embryonal letal (Swinnen, et al.. 2006, Abu-Elheiga. et al. 2005). ACC2 Knockout-Mäuse zeigen reduzierte Malonyl-CoA-Spiegel. in Skelett und Herzmuskel, erhöhte Fettsäureoxidation im Muskel, erniedrigte Leberfettievel, erniedrigte Mengen an Gesamtkörperfett, erhöhte Level von UCP3 im Skelettmuskel (als Zeichen einer erhöhten Energieaufwendung), ein erniedrigtes Körpergew icht, erniedrigte Spiegel von freien Fettsäuren im Plasma, erniedrigte Plasma- Glucose-Spiegel, erniedrigte Mengen an Glycogen im Gewebe und sie sind geschützt vor Nahrungs- induziertem Diabetes und Fettleibigkeit (Abu-Elheiga et al, 2001, 2003; Oh et al., 2005).

Zusätzlich zur Beteiligung an der Fettsäuresynthese in lipogenen Geweben und der

Fettsäureoxidation in oxidativen Geweben, wurde eine Hochregulation von ACC und gesteigerte

Lipogenese in vielen Tumorzellen beobachtet (Swinnen, et al, 2004, Heemers, et al., 2000, Swinnen, et al, 2002, Rossi. et al., 2003, Miigraum, et al, 1997, Yahagi, et al., 2005). Dieser Phenotyp trägt sehr wahrscheinlich zur Entwicklung und Progression von Tumoren bei, die regulatorischen

Mechanismen hierfür müssen jedoch noch geklärt werden.

EP0454782 und US5759837 schützen die Verwendung von Fettsäuresyntheseinhibitoren zur Inhibierung von Tumorzellwachstum. Zyklische Ketoenole sind nicht offenbart.

Es wurde eine Reihe von Substanzen entdeckt, die in der Lage sind, Pflanzen und/oder Insekten-ACC zu inhibieren.

Die PCT Patent Applikation PCT/EPP99/01787, publiziert als WO 99/48869, die dem europäischen Patent EP 1 066 258 B l entspricht, bezieht sich auf neue Arylphenyl-substituierte zyklische Ketoenole, zu einer Mehrheit der Prozesse für ihre Herstellung und ihre Nutzung als Pestizide und Herbizide.

Von 3-Acyl-pyrrolidin-2,4-dionen sind pharmazeutische Eigenschaften vorbeschrieben (S. Suzuki et al. Chem. Pharm. Bull. J_5 1 120 (1967)). Weiterhin wurden N-Phenylpyrrolidin-2,4-dione von R. Schmierer und H. Mildenberger (Liebigs Ann. Chem. 1985. 1095) synthetisiert. Eine biologische Wirksamkeit dieser Verbindungen wurde nicht beschrieben.

In EP-A-0 262 399 und GB-A-2 266 888 werden ähnlich strukturierte Verbindungen (3-Aryl-pyr- roiidin-2,4-dione) offenbart, von denen jedoch keine herbizide, Insektizide oder akarizide Wirkung bekannt geworden ist. Bekannt mit herbizider, insektizider oder akarizider Wirkung sind unsub- stituierte, bicyclische 3-Aryl-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate (EP-A-355 599, EP-A-415 21 1 und JP-A- 12-053 670) sowie substituierte monoeyclische 3-Aryi-pyrrolidin-2,4-dion-Derivate (EP-A-377 893 und EP-A-442 077).

Weiterhin bekannt sind polycyclische 3-Arylpyrrolidin-2,4-dion-Derivate (EP-A-442 073) sowie I H- Aiylpyrrolidin-dion-Derivate (EP-A-456 063, EP-A-521 334, EP-A-596 298, EP-A-613 884, EP-A- 613 885, WO 95/01 971, WO 95/26 954, WO 95/20 572, EP-A-0 668 267, WO 96/25 395, WO 96/35 664, WO 97/01 535, WO 97/02 243, WO 97/36 868, WO 97/43275, WO 98/05638, WO 98/06721, WO 98/25928, WO 99/24437, WO 99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673,

WO 01/17972, W 01/23354, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 03/062244, WO 2004/007448, WO 2004/024 688, WO 04/065366, WO 04/080962, WO 04/111042, WO 05/044791,

WO 05/044796, WO 05/048710, WO 05/049569, WO 05/066125, WO 05/092897,

WO 06/000355, WO 06/029799, W O 06/056281, WO 06/056282, WO 06/089633,

W O 07/048545, DEA 102 00505 9892, WO 07/073856, WO 07/096058, WO 07/121868,

WO 07/140881, WO 08/067873, W O 08/067910, WO 08/067911, WO 08/138551,

WO 09/015801, WO 09/039975. WO 09/049851, WO 09/ 1 15262. WO 10/052 161 . WO 10/063378,

WO 10/063670, WO10/063380, WO 10/066780 und WO 10/ 102758.

Außerdem sind ketalsubstituierte l-H-Arylpyrrolidin-2,4-dione aus WO 99/16748 und (spiro)-

Aryl-pyrroiidindione aus JP-A-14 205 984 und Ito M. et al. Bioscience. Biotechnology and Biochcmistry 67, 1230-1238, (2003) bekannt. Außerdem sind aus W O 06/02441 1 herbizide Mittel enthaltend ketoenole bekannt.

Es ist bekannt, dass bestimmte substituierte A^-Dihydrofuran-2-on-Derivate herbizide Eigenschaften besitzen (vgl. DE-A-4 014 420). Die Synthese der als Ausgangsverbindungen verwendeten

Tetronsäurederivate (wie z.B. 3-(2-Methyl-phenyl)-4-hydroxy-5-(4-fluoφhenyl)-Δ^-dihydrofuranon- (2)) ist ebenfalls in DE-A-4 014 420 beschrieben. Ähnlich strukturierte Verbindungen ohne Angabe einer Insektiziden und/oder akariziden Wirksamkeit sind aus der Publikation Campbell et al.. J.

Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1985. (8) 1567-76 bekannt. Weiterhin

Derivate mit herbiziden, akariziden und insektiziden Eigenschaften bekannt aus: EP-A-528 156, EP- A-647 637. WO 95/26 954. W O 96/20 196, WO 96/25 395.

W O 96/35 664. WO 97/01 535, WO 97/02 243. W O 97/36 868, W O 98/05 638, W O 98/06 72 1. WO 99/16 748, WO 98/25 928, WO 99/43 649. WO 99/48 869, WO 99/55 673. WO 01/23354,

WO 01/74 770, WO 01/17 972, WO 04/024 688, WO 04/080 962, WO 04/111 042, WO 05/092 897, WO 06/000 355, WO 06/029 799, WO 07/048545, WO 07/073856, WO 07/096058, WO 07/121868, WO 07/140881, WO 08/067911, WO 08/083950, WO 09/015801,WO09/039975 und PCT/EP2010/003020.

Auch 3-Aryl-A³-dihydrothiphen-on-Derivate sind bekannt aus (WO 95/26 345, 96/25 395,

W O 97/01 535, WO 97/02 243, W O 97/36 868, WO 98/05638, WO 98/25928, WO 99/16748, WO 99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673. WO 01/ I 7972. WO 01/23354, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 04/080 962. WO 04/1 1 1 042. WO 05/092897, WO 06/029799 und

WO 07/096058. Bestimmte, im Phenylring unsubstituierte Phenyl-pyron-Derivate sind bereits bekannt geworden (vgl. A.M. Chirazi, T. Kappe und E. Ziegler, Arch. Pharm. 309, 558 (1976) und K.-H. Boitze und K. Heidenbluth, Chem. Ber. 9J_. 2849). Im Phenylring substituierte Phenyl-pyron-Derivate mit herbiziden, akariziden und Insektiziden Eigenschaften sind in EP-A-588 137, WO 96/25 395, WO 96/35 664, W O 97/01 535, W O 97/02 243, WO 97/16 436, WO 97/19 941, WO 97/36 868, WO 98/05638, WO 99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 04/080 962, W O 04/1 1 1 042, WO 05/092897, WO 06/029799 und

W O 07/096058 beschrieben. Bestimmte, im Phenylring unsubstituierte 5-Phenyl-l,3-thiazin-Derivate sind bereits bekannt geworden (vgl. E. Ziegler und E. Steiner, Monatsh. 95. 147 (1964), R. Ketcham, T. Kappe und E. Ziegler. J. Heterocycl. Chem. J_0. 223 (1973)). Im Phenylring substituierte

Derivate mit herbizider, akarizider und insektizider Wirkung sind in W O 94/14 785,

W O 96/25 395, WO 96/35 664, WO 97/01 535, WO 97/02 243, WO 97/02 243, W O 97/36 868, WO 99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/74770, WO 03/013249, W O 04/080 962, WO 04/1 1 1 042, WO 05/092897, W O 06/029799 und WO 07/096058 beschrieben.

Es ist bekannt, dass bestimmte substituierte 2-Arylcyclopentandione. herbizide, Insektizide und akarizide Eigenschaften besitzen (vgl. z.B. (US-4 283 348; 4 338 122; 4 436 666; 4 526 723;

4 551 547; 4 632 698; WO 96/01 798; W O 96/03 366. W O 97/14 667 sowie WO 98/39281, WO 99/43649, W099/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/74770, WO 03/062244, WO 04/080962, WO04/1 1 1042, WO05/092897, WO06/029799, WO07/080066, WO07/096058 WO09/019005, WO09/019015, WO09/049851, WO 10/069834, WO 10/000773, WO 1 0/057880, WO 1 0/0 1 94. WO 10/089210, WO 1 0/ 102848 und WO 1 0/ 1 3232. Außerdem sind ähnlich substituierte Verbindungen bekannt; 3-Hydroxy-5,5-dimethyi-2-phenylcyclopent-2-en-l-on aus der Publikation Micklefield et al.. Tetrahedron, (1992), 7519-26 sowie der Naturstoff Involutin (-)-cis-5- (3 ,4-dihydroxyphenyl)-3 ,4-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-cyclopent-2-en-one aus der Publikation Edwards et al.. J. Chem. Soc. S, (1967), 405-9. Eine Insektizide oder akarizide Wirkung wird nicht beschrieben. Außerdem ist 2-(2,4,6-Trimethylphenyl)-l,3-indandion aus der Publikation J. Economic Entomology. 66, (1973), 584 und der Offenlegungsschrift DE-A 2 36 1 084 bekannt, mit Angabe von herbiziden und akariziden Wirkungen. Es ist bekannt, dass bestimmte substituierte 2-Arylcyclohexandione herbizide, Insektizide und akarizide Eigenschaften besitzen (US-4 175 135, 4 256 657, 4 256 658, 4 256 659, 4 257 858, 4 283 348, 4 303 669, 4 351 666, 4 409 153, 4 436 666, 4 526 723, 4 613 617, 4 659 372, DE-A 2 813 341, sowie Wheeler, T.N., J. Org. Chem. 44, 4906 (1979)), WO 99/43649,

WO 99/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 04/080 962, WO 04/1 1 1 042, WO 05/092897, WO 06/029799, WO 07/096058, WO 08/071405,

WO 08/1 10307, WO 08/1 10308, WO 09/074314, WO 08/145336, WO 09/015887, WO09/0743 14. WO 10/046194, WO 10/081755 , und WO 10/08921 1.

Es ist bekannt, dass bestimmte substituierte 4-Aryl-pyrazolidin-3,5-dione akarizide, msektizide und herbizide Eigenschaften besitzen (vgl. z.B. WO 92/16 510, EP-A-508 126, WO 96/1 1 574,

WO 96/21 652, WO 99/47525, WO 01/17 351, W O 01/17 352, W O 01/17 353, W O 01/17 972, WO 01/17 973, WO 03/028 466, WO 03/062 244. WO 04/080 962, WO 04/1 1 1 042,

WO 05/005428, WO 05/016873, WO 05/092897, WO 06/029799 und WO 07/096058. Es ist bekannt, dass bestimmte Tetrahydropyridone herbizide Eigenschaften besitzen (JP 0832530). Außerdem sind spezielle 4-Hvdroxytetrahydropyridone mit akariziden, insektiziden und herbiziden Eigenschaften bekannt (JP 1 1 152273). Weiterhin bekannt wurden 4-Hydro\yt et rahydropy ridone als Schädlingsbekämpfungsmittel und Herbizide in WO 01/79204 und

WO 07/096058. 4-Hydroxy-chinolone sind offenbart in WO 03/01045.

Es ist bekannt, dass bestimmte 5,6-Dihydropyron-Derivate als Proteaseinhibitoren antivirale Eigenschaften haben (WO 95/14012). Weiterhin ist das 4-Phenyl-6-(2-phenethyl)-5,6-dihydropyron aus der Synthese von Kawalakton-Derivaten bekannt (Kappe et al, Arch. Pharm. 309, 558-564 (1976). Außerdem sind 5,6-Dihydropyron-Derivate als Zwischenprodukte bekannt (White, J.D., Brenner, J.B., Deinsdale, M. J., J. Amer. Chem. Soc. 93, 281 - 282 (1971). 3-Phenyl-5,6- dihydropyron-Derivate mit Anwendungen im Pflanzenschutz sind in W O 01/98288 und

WO 07/09658 beschrieben.

4 -Biphenyl-substituierte Tetronsäurederivate werden in WO 2008/022725 für die Therapie viraler Erkrankungen offenbart.

WO 2005/0891 18 und WO2007/039286 offenbaren generisch stickstoffhaltige bizyklische

Strukturen für die Therapie, wobei 5 -Biphenyl-substituierte zyklische Ketoenole nicht spezifisch genannt sind. 4-Phenylsubstituierte [1.2]-Oxazin-3,5-dione sind als Herbizide erstmalig in WO 01/17972 beschrieben. Weiterhin wurden 4-Acyl-substituierte [1.2]-Oxazin-3,5-dione als Pestizide vor allem aber als Herbizide und Wachstumsregulatoren beschrieben z.B. in EP-A-39 48 89; WO 92/07837, US 5,728,831 sowie als Herbizide und Schädlingsbekämpfungsmittel in WO 03/048138.

Die Verbindung A ist spezifisch offenbart in WO2008/067910 (Tabelle 1, Seite 26, Zeile 4).

WO2008/067910 offenbart nicht die Eignung von Verbindung A zu therapeutischen Zwecken.

Die vorliegende Anmeldung begründet die Priorität für die therapeutische Verwendung von

Verbindung A. Zeitgleich zur vorliegenden prioritätsbegründenden Anmeldung, deren Gegenstand die therapeutische Verwendung nur von Verbindung A ist, wurde u.a. eine PCT-Anmeldung eingereicht, die zum Gegenstand die therapeutische Verwendung zahlreicher zyklischer Ketoenole hat und die die Priorität einer deutschen Anmeldung mit der Anmeldenummer DE 102010008644.4 in Anspruch nimmt. Verbindung A ist Beispiel I - 1 1 8 in der PCT-Anmeldung, war aber in der

DE 102010008644.4 noch nicht enthalten.

Den strukturell nächstliegenden Stand der Technik könnte das Beispiel l- l -a- 16 der W099/48869 bilden, das sich von der Verbindung A nur durch ein fehlendes Fluor- Atom am äußeren Phenylring des Biphenyls unterscheidet. Die therapeutische Verwendung von Beispiel l- l -a- 16 der W099/48869 ist auch ein Gegenstand in DE 102010008644.4 und der PCT-Anmeldung, die die Priorität von DE 102010008644.4 in Anspruch nimmt (Beispiel 1-2).

Den strukturell nächstliegenden Stand der Technik könnte aber auch das Beispiel I- l -a-31 der WO03/059065 bilden, das sich von der Verbindung A durch den Ersatz des Fluoratoms am äußeren Phenylring des Biphenyls durch ein Chloratom unterscheidet. Die therapeutische Verwendung von Beispiel I-l-a-31 der WO03/059065 ist auch ein Gegenstand in DE 102010008644.4 und der PCT- Anmeldung, die die Priorität von DE 102010008644.4 in Anspruch nimmt (Beispiel 1 -8 1 ).

Ausgehend von diesem Stand der Technik, ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine besonders effektive Struktur für die Therapie von Erkrankungen zur Verfügung zu stellen.

Insbesondere soll die erfindungsgemäße Struktur zur Prophylaxe und Therapie von

Tumorerkrankungen geeignet sein und Vorteile gegenüber im Stand der Technik bekannten

Strukturen aufweisen. Es wurde nun überras

besonders gut für die Therapie von Erkrankungen geeignet ist. Dabei war nicht vorhersehbar, ob und welches der als Insektizide oder Herbizide bekannten

Strukturen die erfindungsgemäße Aufgabe besonders gut löst, nämlich eine Struktur darstellt, die bei der Therapie von menschlichen Erkrankungen besonders gut eingesetzt werden können.

Die Verbindung A hat vergleichbare Enzyminhibitionsdaten wie das Beispiel I-l-a-16 der

W099/48869, das als strukturell nächstliegender Stand der Technik angesehen werden könnte. Überraschenderweise zeichnet sich die Verbindung A aber durch ein breiteres therapeutisches Fenster im M C F 7 - X eno ra 11 - M odel I aus als dieser Stand der Technik, welcher keine Effektivität in diesem Modell bei tolerierten Dosen hat. Die Verbindung A hat bessere Enzyminhibitionsdaten als das Beispiel I-l-a-3 1 der WO03/059065, das ebenfalls als der strukturell nächstliegende Stand der Technik angesehen werden könnte.

Aus der großen Gruppe der als Insektizide, Fungizide oder Herbizide bekannten zyklischen

Ketoenole hat sich die Verbindung A überraschenderweise durch bessere Enzyminhibition und/oder durch eine bessere in-vivo-Effektivität bei tolerierten Dosen hervorgehoben.

Ebenfalls als von der vorliegenden Erfindung als erfasst anzusehen ist die Verwendung der

physiologisch verträglichen Salze der Verbindung A. Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindung A umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen

Aminen mit I bis 16 (^'-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin. Diethylamin. Trietln lamin. Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclo-hexyiamin,

Dimctln laminocthanol. Prokain, Dibenzylamin. N-Methylmorpholin. Arginin. Lysin. Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel enthaltend Verbindung A und mindestens einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.

Verbindung A kann systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunetival, otisch oder als Implantat bzw. Stent. Für diese Applikationswege kann Verbindung A in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die Verbindung A abgebende Applikationsformen, die die Verbindung A in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophilisate, Kapseln

(beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver. Emulsionen. Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B.

intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und

Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen. Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a.

Pulverinhalatoren. Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen. -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder

Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen. Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen. Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten. Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents. Die Verbindung A kann in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise

mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsuifat, Polyoxy- sorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise

Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die die Verbindung A, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Die Formulierung der Verbindung A zu pharmazeutischen Präparaten erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man den oder die Wirkstoffe mit den in der Galenik gebräuchlichen Hilfsstoffen in die gewünschte Applikationsform überführt.

Als Hilfsstoffe können dabei beispielsweise Trägersubstanzen, Füllstoffe, Sprengmittel, Bindemittel, Feuchthaitemittel, Gleitmittel, Ab- und Adsorptionsmittel. Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Cosolventien, Emulgatoren, Lösungsvermittier, Geschmackskorrigentien, Färbemittel,

Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer zum Einsatz kommen.

Dabei ist auf Remington^'s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, Fast Pennsylvania (1980) hinzuweisen. Die pharmazeutischen Formulierungen können

in fester Form, zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Pillen, Suppositoricn, Kapseln, transdermale Systeme oder

in halbfester Form , zum Beispiel als Salben. Cremes, Gele, Suppositoricn, Emulsionen oder in flüssiger Form, zum Beispiel als Lösungen. Tinkturen. Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.

Hilfsstoffe im Sinne der Erfindung können beispielsweise Salze, Saccharide (Mono-. Di-, Tri-. Oligo-, und/oder Polysaccharide), Proteine, Aminosäuren, Peptide, Fette, Wachse. Öle,

Kohlenwasserstoffe sowie deren Derivate sein, wobei die Hilfsstoffe natürlichen Ursprungs sein können oder synthetisch bzw. partial synthetisch gewonnen werden können. Für die orale oder perorale Applikation kommen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulate, Pastillen, Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen in Frage.

Für die parenterale Applikation kommen insbesondere Suspensionen, Emulsionen und vor allem Lösungen in Frage.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Verbindung A für die Prophylaxe und Therapie von menschlichen Erkrankungen, insbesondere von Tumorerkrankungen.

Die Verbindung A kann insbesondere verwendet werden, um die Zellproliferation und/oder die Zellteilung zu inhibieren oder zu reduzieren und/oder Apoptosis zu induzieren.

Die Verbindung A eignet sich insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von hyperproliferativen Erkrankungen wie beispielsweise

Psoriasis,

Keloide und andere Hyperplasien, die die Haut betreffen,

gutartige Prostathyperplasien (BPH),

solide Tumore und

hämatologische Tumore.

Als solide Tumore sind erfindungsgemäß beispielsweise Tumore behandelbar der Brust, des

Respirationstraktes, des Gehirns , der Fortpflanzungsorgane, des Magen-Darmtraktes, des Urogenitaltraktes, des Auges, der Leber, der Haut, des Kopfes und des Halses, der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Knochen sowie des Bindegewebes und Metastasen dieser Tumore.

Als hämatologische Tumore sind beispielsweise behandelbar

multiple Myelome,

Lymphome oder

Leukämien.

Als Brusttumore sind beispielsweise behandelbar:

Mammakarzinome mit positivem Hormon rezeptorstatus

Mammakarzinome mit negativem Hormonrezeptorstatus

Her-2 positive Mammakarzinome

Hormonrezeptor- und Her-2 negative Mammakarzinome

BRCA assoziierte Mammakarzinome - I I - entzündliches Mammakarzinom.

Als Tumore des Respirationstraktes sind beispielsweise behandelbar

nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome und

kleinzellige Bronchialkarzinome.

Als Tumore des Gehirns sind beispielsweise behandelbar

Gliome,

Glioblastome,

Astrozytome,

Meningiome und

Medulloblastome .

Als Tumore der männlichen Fortpflanzungsorgane sind beispielsweise behandelbar:

Prostatakarzinome,

Maligne Hodentumore und

Peniskarzinome.

Als Tumore der weiblichen Fortpflanzungsorgane sind beispielsweise behandelbar:

Endometriumkarzinome

Zervixkarzinome

Ovarialkarzinome

Vaginalkarzimome

Vulvarkarzinome

Als Tumore des Magen-Darm-Traktes sind beispielsweise behandelbar:

Kolorektale Karzinome

Analkarzinome

Magenkarzinome

Pankreaskarzinome

Ösophagukarzinome

Gallenblasenkarzinome

Dünndarmkarzinome

Speicheldrüsenkarzinome

Neuroendokrine Tumore

Gastrointestinale Stromatumore Als Tumore des Urogenital-Traktes sind beispielsweise behandelbar:

Hamblasenkarzinome

Nierenzellkarzinome

Karzinome des Nierenbeckens und der ableitenden Harnwege

Als Tumore des Auges sind beispielsweise behandelbar:

Retinoblastome

Intraokulare Melanome

Als Tumore des Leber sind beispielsweise behandelbar:

Hepatozelluläre Karzinome

Cholangiozelluläre Karzinome

Tumore der Haut sind beispielsweise behandelbar:

Maligne Melanome

Basaliome

Spinaliome

Kaposi-Sarkome

Merkelzellkarzinome

Als Tumore der Kopf und Halses sind beispielsweise behandelbar:

Larynxkarzinome

Karzinome des Pharynx und der Mundhöhle

Als Sarkome sind beispielsweise behandelbar:

Weichteilsarkome

Osteosarkome

Als Lymphome sind beispielsweise behandelbar:

- Non-Hodgkin-Lymphome

Hodgkin-Lymphome

Kutane Lymphome

Lymphome des zentralen Nervensystems

AIDS-assoziierte Lymphome Als Leukämien sind beispielsweise behandelbar:

Akute myeloische Leukämien

Chronische myeloische Leukämien

Akute lymphatische Leukämien

- Chronische lymphatische Leukämien

Haarzellleukämien

Vorteilhaft kann die Verbindung A verwendet werden zur Prophylaxe und/oder Therapie von:

Mammakarzinomen, insbesondere von Hormonrezeptor-negativen, Hormonrezeptor-positven oder BRCA assoziierten Mammakarzinomen, sowie

Pank easka rzi nomen . Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen. Besonders vorteilhaft kann die Verbindung A verwendet werden zur Prophylaxe und/oder Therapie von:

Mammakarzinomen, insbesondere von Hormonrezeptor-negativen und Hormonrezeptor-positven, sowie Pankreaskarzinomen, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen.

Diese Erkrankungen sind gut charakterisiert im Menschen, existieren aber auch bei anderen Säugetieren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verbindung A zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen,

Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen oder Prostatakarzinomen.

Ein vorteilhafter Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere von Hormonrezeptor-negativen und Hormonrezeptor-positven, sowie Pankreaskarzinomen, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Verbindung A zur Herstellung eines Arzneimittels.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung A zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen oder Prostatakarzinomen.

Ein vorteilhafter Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung A zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere von Hormonrezeptor-negativen und Hormonrezeptor-positven, sowie

Pankreaskarzinomen, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen,

Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen oder Prostatakarzinomen.

Ein vorteilhafter Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Verwendung der Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, insbesondere von Hormonrezeptor-negativen und Hormonrezeptor-positven. sowie Pankreaskarzinomen, Nicht-Kleinzelligen

Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische Formulierungen in Form von Tabletten enthaltend Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nierenzellkarzinomen, Hepatozellulären Karzinomen, Malignen Melanomen und anderen Hauttumoren, Nicht-Kleinzelligen, Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen oder Prostatakarzinomen. Ein vorteilhafter Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische Formulierungen in Form von Tabletten enthaltend Verbindung A zur Prophylaxe und/oder Therapie von

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Verbindung A zur Behandlung von Erkrankungen, die mit proliferativen Prozessen einhergehen.

Verbindung A kann allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschte und inakzeptablen Nebenwirkungen fuhrt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend Verbindung A und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Therapie der zuvor genannten Erkrankungen.

Beispielsweise kann Verbindung A mit bekannten anti-hyperproliferativen. zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Die Kombination der Verbindung A mit anderen für die Krebstherapie gebräuchlichen Substanzen oder auch mit der Strahlentherapie ist besonders angezeigt. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:

Afmitor. Aldesleukin, Alendronsäure, Alfaferon, Alitretinoin. Allopurinol. Aloprim. Aloxi, Altretamin, Aminoglutethimid. Amifostin, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozoi, Anzmet, Aranesp, Arglabin. Arsentrioxid, Aromasin. 5-Azacytidin, Azathioprin, BCG oder tice-BCG, Bestatin. Beta- methason-Acetat, Betamethason-Natriumphosphat, Bexaroten, Bleomycin-Sulfat, Broxuridin, Bortezomib. Busuifan, Calcitonin. Campath, Capecitabin, Carboplatin. Casodex, Cefeson,

Celmoleukin. Cerubidin, Chlorambucil, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Cyclophosphamid, Cytarabin. Dacarbazin, Dactinomycin. DaunoXome, Decadron. Decadron-Phosphat. Delest rogen. Denileukin Diftitox, Depomedrol, Deslorelin, Dexrazoxan, Diethylstilbestrol, Diflucan, Docetaxel, Doxifluridin, Doxorubicin, Dronabinol, DW- 166HC, Eligard, Elitek, Ellence, Einend, Epirubicin, Epoetin-alfa, Epogen, Eptaplatin. Ergamisol, Estrace, Estradiol, Estramustin-Natriumphosphat, Ethinylestradiol. Ethyol, Etidronsäure, Etopophos. Etoposid. Fadrozol, Farston, Filgrastim, Finasterid, Fligrastim, Floxuridin, Fluconazol, Fludarabin, 5-Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5- Fluoruracil (5-FU), Fluoxymesteron, I I utain id. Formestan, Fosteabin. Fotemustin. Fulvestrant, Gammagard, Gemcitabin, Gemtuzumab, Gleevec, Giiadel, Goserelin. G ra ni sei ron - H vdroch 1 o rid. Histrelin, Hycamtin, Hydrocorton, erythro-Hydroxynonyladcnin. Hydroxyhamstoff, Ibritumomab Tiuxetan, Idarubicin. Ifosfamid, Interferon-alpha, Interferon-alpha-2, Interferon-alpha-2a,

Interferon-a!pha-2ß, lnterferon-alpha-n 1. Interferon-alpha-n3, Interfcron-beta. Interferon-gamma-la, Interleukin-2, Intron A, Iressa. Irinotecan. Kytril, Lapatinib, Lentinan-Sulfat, Letrozol, Leucovorin, Leuprolid. Lcuprolid-Acetat. Levamisol. Levofolinsäure-Calciumsalz, Levothroid, Levoxyl, Lomustin, Lonidamin, Marinol, Mechlorethamin, Mccobalamin. Medroxyprogcstcron-Acetat, M egest rol - Acetat . Melphalan, Menest. 6-Mercaptopurin. Mesna, Methotrexat, Metvix, Miltefosin, Minocyclin, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Mod renal, Myocet, Ncdaplatin. Neulasta, Neumega, Neupogen. Nilutamid. Nolvadex, NSC-631570, OCT-43, Octreotid. Ondansetron- Hydrochlorid, Orapred. Oxaliplatin, Paclitaxel, Pcdiapred, Pcgaspargasc. Pegasys. Pcntostatin, Picibanil. Pilocarpin-Hydrochlorid. Pirarubicin. Plicamycin. Porfimer-Natrium, Prcdnimustin.

Prednisolon, Prednison, Premarin, Procarbazin, Procrit. Raltitrexed, RDEA1 19, Rebif. Rhenium- 186-Etidronat, Rituximab, Roferon-A. Ronuirtid. Salagen. Sandostatin, Sargramostim, Seniustin. Sizofiran, Sobuzoxan, Solu-Medrol, Streptozocin, Strontium-89-chlorid,

Tamoxifen,

Tamsulosin. Tasonermin. Tastolacton. Taxoter, Teceleukin. Temozolomid. Teniposid. Testosteron- Propionat. Test red. Thioguanin. Thiotepa, Thyrotropin. Ti ludronsäure. Topotecan. Torem ifen. Tositumomab, Tastuzumab, Teosulfan, Tretinoin, Trexall, Trimetlu Imekunin. Trimetrexat, Triptorelin-Acetat. Triptorelin-Pamoat. UFT, Uridin. Valrubicin. Vesnarinon. Vinblastin. Vincristin. Vindesin. Vinorelbin. Virulizin. Zinecard, Zinostatin-Stimalamer, Zofran; ABI-007, Acolbifen, Actimmun. Affinitak, Aminopterin. Arzoxifen, Asoprisnil. Atamestan. Atrasentan. BAY 43-9006 (Sorafenib), Avastin, CCI-779, CDC-501, Celebrex, Cetuximab, Crisnatol, Cyproteron-Acetat, Decitabin. DN-101, Doxorubicin-MTC. dSLIM, Dutasterid. Edotecarin. Eflornitliin. Exatecan, Fenretinid, Histamin-Dihydrochlorid, Histrelin-Hydrogei-Implant, Holmium- 166-DOTMP, Ibandronsäure. Interferon-gamma. Intron-PEG, Ixabepilon. Keyhole Limpet-Hemocyanin, L-

651582, Lanreotid, Lasofoxifen, Libra. Lonafarnib, Miproxifen. Minodronat. MS-209, iiposomales MTP-PE. M.X-6, Nafarelin. Nemorubicin. Neovastat, Nolatrexed. Oblimersen. Onko-TCS, Osidem. Pac I i taxel - Pol \ gl tamat , Pamidronat-Dinatrium, PN-401, QS-21, Quazepam, R- 1 49. Raloxi fen, Ranpirnas, 13 -eis -Retinsäure, Satraplatin, Seocalcitol, T- 1 38067. Tarceva, Taxoprexin, Thymosin- alpha- i . Tiazofurin, Tipifarnib, Tirapazamin, TLK-286, Toremi fen. TransMID-107R, Valspodar. Vapreotid. Vatalanib. Verteporfin. Vinflunin. Z- 100. Zoledronsäure. sowie Kombinationen hiervon.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsförm kann die Verbindung A mit anti-hyperproliferativen Agentien kombiniert werden, welche beispielhaft - ohne dass diese Aufzählung abschließend wäre - sein können: Aminoglutethimid, L-Asparaginase, Azathioprin,

Bleomycin, Busiilfan, Carboplatin, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Colaspase, Cyclophosphamid, Cytarabin. Dacarbazin.

Dactinomycin, Daunorubicin, Diethylstilbestrol, 2',2'-Difluordeoxycytidin, Docetaxel, Doxorubicin (Adriamycin), Epirubicin, Epothilon und seine Derivate. erythro-Hydroxynonyladenin. Ethinyl- estradiol, Etoposid, Fludarabin-Phosphat, 5 - Fl uordeoxyuridi n. 5-Fluordeoxyuridin-Monophosphat, 5-Fluoruracil, Fluoxymcsteron. Flutamid. Hexamethylmelamin, Hydroxyhamstoff, Hydroxy- progesteron-Caproat, Idarubicin. Ifosfamid, Interferon, Irinotecan. Leucovorin, Lomustin.

Mechlorethainin, Medroxyprogesteron-Acetat. Megestrol-Acetat, Melphalan. 6-Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Mitomycin C, Mitotan, Mitoxantron, Paclitaxel. Pcntostatin, .V-Phosphono- acetyl-L-aspartat (PALA). Plicamycin. Prednisolon. Prednison. Procarbazin, Raloxifen, Semustin, Streptozocin, Tamoxifen, Teniposid. Tcstosteron-Propionat. Thioguanin, Thiotepa, Topotecan. Tri- methylmelamin, Uridin, Vinblastin. Vincristin. Vindcsin und Vinorelbin.

In viel versprechender Weise lässt sich die Verbindung A auch mit biologischen Therapeutika wie Antikörpern (z.B. Avastin. Rituxan. Erbitux, Herceptin) und rekombinanten Proteinen kombinieren. Die Verbindung A kann auch in Kombination mit anderen, gegen die Angiogenese gerichteten

Therapien positive Effekte erzielen, wie zum Beispiel mit Avastin, Axitinib. Regorafenib, Recentin. Sorafenib oder Sunitinib. Kombinationen mit Inhibitoren des Proteasoms und von mTOR sowie Antihormone und steroidale metabolische Enzyminhibitoren sind wegen ihres günstigen

Nebenwirkungsprofils besonders geeignet. Generell können mit der Kombination von Verbindung A mit anderen, zytostatisch oder z\ totoxisch wirksamen Agentien folgende Ziele verfolgt werden:

• eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff;

· die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen;

• die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur

Einzelgabe;

• die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkrankungen;

· das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie;

• eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie. Darüber hinaus kann die Verbindung A auch in Verbindung mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.

Experimenteller Teil 1. Veroleichsbeispiele Tabelle V zeigt das Beispiel I-l-a-16 der W099/488691 und das Beispiel I-l-a-3 1 der

WO03/059065, welche die Anmelderin als den nächstliegenden Stand der Technik ansieht.

Tab. V

Methode 1 (UPLC-MS)

Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001 ; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 50x2. 1 mm; Eluent A: Wasser + 0.1% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1 .6-

2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60 °C; Injektion: 2 μΐ; DAD scan: 210-400 nM.

Methode 2 (UPLC-MS):

Instrument: Waters Acquity UPLC-MS ZQ4000; Säule: Acquity UPLC BEH C 18 1.7 50x2.1mm; Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril + 0.05% Ameisensäure; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1.6-2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60 °C; Injektion: 2 μΐ; DAD scan: 210-400 nM.

Methode 3 ( U PLC-MS):

Instrument: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001 ; Säule: Acquity UPLC BEH C 18 1.7 50x2.1mm; Eluent A: Wasser + 0.1% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1 .6-

2.0 min 99% B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60 °C; Injektion: 2 μΐ; DAD scan: 210-400 um.

Herstellung des Vergleichsbeispiels V.l.

a) Interniediate

Intermedia! V.l.l

(4'-Chlor-4-methylbiphenyi-3-yl)acetylchlorid

5.00 g (19.18 mmol) (4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3 - l »essigsaure (EP 2029531 A 1 und US

2009/298828 A I ) w urden in 36.51 g (306.84 mmol) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde vier Stunden bei 80 °C gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknung im Feinvakuum erhielt man 5.4 g (100% d. Th.) der Titelvcrbindung als bräunliches Öl. Ή-N M R (300MHz, CDCi₃): δ [ppm] = 2.36 (s, 3H), 4.22 (s, 2H), 7.29 (d, 1H), 7.35 - 7.55 (m, 6H).

Intermediat V.l.2

Mcthyl-cis- 1 - ! I (4'-chlor-4-methylbiphcnyl-3-\ 1 (acetyl ]amino J- -4-mcthoxycyclohcxancarboxylat

5.41 g (24.2 mmol) Methyl-cis-l-amino-4-methoxycyclohexancarboxylathydrochlorid (EP 1791816 A I und WO 2006/29799 AI), 14.8 mg (1.21 mmol ) DM AP und 8.4 ml (60.5 mmol ) Triethylamin wurden bei Raumtemperatur unter Stickstoff in 1 18 ml Dichlormetlian gelöst. Anschließend tropfte man eine Lösung von 6.75 g (24.2 mmol ) des Intermediates V. I . I in 60 ml Dichlormetlian hinzu. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zur

Aufarbeitung wurde mit Dichlormetlian verdünnt und die organische Phase mit wässnger. gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und wässriger, 5%iger Citronensäure gewaschen. Nach

Trocknung über Natriumsulfat wurde filtriert und eingeengt. Man erhielt 10.9 g der Titelverbindung, die durch Chromatographie an Kieseigel (Laufmittel: Hexan-Essigester-Gradient) weiter aufgereinigt wurden. ^lH-NMR (300MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 1.3 1 - 1.47 (m, 2H), 1.60 - 1.73 (m, 2H), 1.75 - 1.86 (m, 2H), 2.00 - 2.1 1 (in, 2H), 2.27 (s, 3H), 3.09 - 3.20 (m, 1H), 3.21 (s, 3H), 3.5 1 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 7.23 (d, 1H), 7.43 (dd, 1H), 7.46 - 7.54 (m, 3H), 7.61 - 7.68 (m, 2H), 8.31 (s, 1H).

LC-MS (Methode 1): R, = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 430 | M+H | . b) Endprodukt V.l

(5s,8s)-3-(4'-Chlor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on

Zu 8.87 g (20.6 mmol ) des Intermediates V. 1 .2 in 103 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden bei Raumtemperatur unter StickstofT 4.63 g (41.3 mmol ) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 60 Minuten bei 80 °C. Zur Aufarbeitung wurde das erkaltete Reaktionsgemisch auf I 1 Eiswasser gegossen, mit I N wässriger Hydrogenchlorid-Lösung auf ein pH-Wert von 3 eingestellt, drei Stunden gerührt, der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt w urde durch Verrühren in Diethylether über Nacht, Abfiltrieren und Trocknung weiter gereinigt. Man erhielt 7.75 g (94% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή-N M (300MHz, DMSO-d₆): δ [ppm j = 1.39 - 1 .62 (m, 4H), 1.84 - 2.05 (m, 4H), 2.18 (s, 3H), 3.07 - 3.20 (m, 1H), 3.26 (s, 3H), 7.30 (d, 1H), 7.34 (d, 1H), 7.45 - 7.53 (m, 3H), 7.62 - 7.68 (m, 2H), 8.18 (br. s, 1H), 10.82 (br. s, 1H). LC-MS (Methode 3 ): R, = 1 . 19 min; MS (ESIpos): m/z = 398 [M+Hf.

Vergleichsbeispiel V.2

Vergleichsbeispiel V.2 ist das Beispiel I- l -a-3 1 der WO03/059065.

Die therapeutische Verwendung von Beispiel l- l -a-31 der WO03/059065 ist auch ein Gegenstand in DE 1020 1 0008644.4 und der PCT-Anmeldung, die die Priorität von DE 1020 1 0008644.4 in

Anspruch nimmt (Beispiel 1 -8 1 ).

2. Verbindung A

Herstellung der Verbindung A

a) Intermediate

Intermediat A.l

(4'-Chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)essigsäure

Zu einer Lösung von 40.0 g (175 mmol) (5-Brom-2-methylphenyl)essigsäure (EP 1791816 und WO 2006/29799) in einer Mischung aus 437 ml (437 mmol) entgaster IN wässriger Natriumhydroxid- Lösung, 160 ml entgastem Wasser und 160 ml entgastem Tetrahydrofuran wurden unter Argon 33.5 g (192 mmol ) (4-Chlor-3-fluorphenyl)boronsäure gegeben. Man rührte 10 Minuten, versetzte mit 507 mg (1.75 mmol ) Tri-tert-butylphosphoniumtetrafluoroborat und 532 mg (1.75 mmol )

20 h bei Raumtemperatur. Anschließend gab man Toluol und Wasser hinzu, stellte mit konzentrierter, wässriger Hydrogenchlorid-Lösung einen pH-Wert von 1-2 ein, rührte 10 Minuten, trennte die Phasen, extrahierte zweimal mit Toluol, trocknete die vereinigten organischen Phasen über Natriumsulfat. filtrierte und engte ein. Der Rückstand wurde in 300 ml einer 6/1 -Mischung aus n-Hexan/tert-Butyl-methyiether 30 Minuten gerührt, abgesaugt, mit n-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 38.0 g (78% d. Th.) der Titelverbindung. Ή-N M R (300MHz, DMSO-d₆): δ | ppm |= 2.27 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 7.27 (d, 1H), 7.49 - 7.59 (m, 3H), 7.61 - 7.75 (m, 2H), 12.4 (s, 1H).

LC-MS (Methode 1): R, = 1.31 min; MS (ESIneg): m/z = 277 | M H | . Intermediat A.2

Methyl-cis- 1 - { [ (4'-chlor-3'-fliior-4-methvlbiphcnyl-3 -yl)acetyl]amino} -4- methoxycyclohexancarboxylat

10.0 g (35.9 mmol ) des Intermediates A. I wurden in 14.9 ml (205 mmol ) Thionylchlorid gelöst. Das Reaktionsgemisch w urde 1 h bei 90 °C gerührt und anschließend eingeengt. Man erhielt 10.8 g (100% d. Th. ) (4'-Chior-3'-fluor-4-methy!biphenyl-3-yl)acetylchlorid. 10.6 g (35.7 mmol ) (4'-Chlor- 3'-fluor-4-methylbiphenyi-3-yl)acetylchiorid w urden in 120 ml Acetonitril gelöst. 12.0 g (53.7 mmol) Methyl-cis-l-amino-4-methoxycyclohexancarboxylathydrochlorid (beschrieben in EP 1791816 und WO 2006/29799) wurden in Essigsäureethylester aufgenommen und mit gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung versetzt. Man trennte die Phasen und extrahierte die wässrige Phase zweimal mit Essigsäureethylester. Die vereinigten organischen Phasen wurden über

Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 8.50 g

methoxycyclohexancarboxylat. 8.02 g (42.8 mmol) Metin 1-cis- 1 -amino-4- methoxycyclohexancarboxylat in 120 ml Acetonitril wurden mit 17.3 g (125 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Unter Eiskühlung tropfte man die Lösung des Säurechlorids hinzu und rührte über Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend engte man ein, versetzte den Rückstand mit Wasser, extrahierte mit Dichlormethan. w usch die vereinigten organischen Phasen mit IN wässriger Hydrogenchlorid- Lösung und gesättigter, wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung, trocknete über Natriumsulfat, filtrierte und engte ein. Man erhielt 15.7 g (98% d. Th.) der Titelverbindung, die ohne weitere Aufreinigung umgesetzt wurden.

Ή-N M R (300MHz, DMSO-d₆): δ | ppm |= 1.30 - 1 .47 (m, 2H), 1.60 - 1 .74 (m, 2H), 1.75 - 1.85 (m, 2H), 1.99 - 2.1 1 (m, 2H), 2.28 (s, 3H), 3.09 - 3.20 (m, 1H), 3.21 (s, 3H), 3.52 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 7.24 (d, 1H), 7.46 - 7.55 (m, 2H), 7.57 (d, 1H), 7.61 - 7.72 (m, 2H), 8.30 (s, 1H). LC-MS (Methode 2): R, = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 448 | M+H | . b) Endprodukt Verbindung A

(5s,8s)-3-(4'-Chlor~3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en- 2-on

Zu 15.7 g (35.0 mmol) des Intermediates A.2 in 60 ml N,N-Dimethyiformamid wurden unter Stickstoff 4.32 g (38.5 mmol) Kalium-tert-butylat gegeben. Man rührte die Reaktion sm i sch ung 20

Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend gab man das Reaktionsgemisch auf Eiswasser, tropfte 160 ml IN wässrige Hydrogenchlorid-Lösung hinzu, rührte 30 Minuten, saugte ab, wusch mit Wasser und trocknete den Niederschlag. Man erhielt 14.2 g (97% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή-N M R (300MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 1.40 - 1.62 (m, 4H), 1.85 - 2.04 (m, 4H), 2.19 (s, 3H), 3.07 - 3.20 (m, 1H), 3.27 (s, 3H), 7.31 (d, 1H), 7.39 (d, 1H), 7.48 - 7.57 (m, 2H), 7.60 - 7.73 (m, 2H), 8.20 (s, 1H), 10.82 (s, 1H). LC-MS (Methode 1): R_t = 1.22 min; MS (ESIpos): m/z = 416 [M+HJ

3. Assays

Human ACCl-Enzymassay

Die ACC l-Inhibitionsdaten wurden mit zwei verschiedenen Assays erhoben (A I und B l)

Assay AI (=(A1))

Die inhibitorische Aktivität der Substanzen dieser Erfindung gegenüber Acetyl-CoA-Carboxylase 1 (ACC 1) wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen ACC 1 -Assay gemessen.

Grundprinzip des Assays ist die Messung des als Ko-Produkt gebildeten Adenosindiphoshats (ADP) mittels eines HTRF " -basierten, kompetitiven Immunoassays (HTRF = Homogeneous Time Resolved Fluorescence).

Ais Enzym wurde (^'-terminal FLAG-getagtes rekombinantes humanes ACC 1 (GenBank Acession Nr. NM 1 8834, Aminosäuren 39 - Ende), exprimiert in Baculovirus-transfizierten Insektenzellen (Hi ) und gereinigt durch Affinitäts-Chromatographie an Anti-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma- Aldrich). verwendet. Alternativ kann kommerziel erhältliches (^'-terminal Ffis-getagtes ACC I von BPS Biosciencc (San Diego, CA. Katalog- Nr. 50200. Aminosäuren 39 - Ende) verwendet werden. Für den Assay wurden 50 nl einer I OOfach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine schwarze low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One. Frickenhausen, Deutschland) pipettiert. 2 ul einer Lösung von ACC 1 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 1 2 mM Natriumhydrogencarbonat, 2 mM MgC^'h. 2 mM Kaliumeitrat. 0,005 % (w/v) bovines

Serumalbiimin ( BSA ) ] hinzugegeben und die Mischung fü 1 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann w urde die

Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 3 ul einer Lösung von Adenosintriphosphat ( ATP, 83,5 μΜ = > E ndkon zent rat ion in 5 ul Assay vol innen ist 50 μΜ, Amersham Pharmacia Biotech # 27- 2056-01) und Acctyl-CoA (33,4 μ M =>Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumen ist 20 μΜ, Roche Biosciencc # 10101893001) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 20 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des ACC I wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. ^'T ypische Konzentrationen lagen im Bereich von 2.5 ng/ul .

Die Reaktion wurde gestoppt durch aufeinanderfolgende Zugaben von 2,5 ul einer Lösung von d2- markiertem ADP (HTRF^® Transscreener™ ADP Kit, Cis biointernational, Marcoule, Frankreich) in dem EDTA-haltigen HTR F ' Transscreener™ ADP-Nachweispuffer (im HTRF ' Transscreener™ ADP Kit enthalten. 50 mM HEPES pH 7,0, 60 mM EDTA, 0, 1 % (w/v) BSA. 0,02 % Natriumazid, 400 niM Kaliumfluorid) und 2,5 μΐ einer Lösung von Europium-Kryptat-markierten anti-ADP- Antikörper (HTRF^® Transscreener™ ADP Kit) in HTRF^® Transscreener™ ADP-Nachweispuffer.

Die resultierende Mischung wurde 1 h bei 22°C inkubiert, um die Bindung des Europium-kryptat- markierten ant i - A D P- Antikörpers an das durch die Enzymreaktion gebildete ADP und das d2- markierte ADP zu ermöglichen. Anschließend wurde die Menge des Komplexes aus d2 -markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper bestimmt durch eine Messung des Resonanz-Energietransfers vom Europium-Kryptat zum d2. Hierzu wurden in einem HTRF- Meßgerät, z.B. einem Rubystar oder Pherastar (beide BMG Labtcchnologics. Offenburg,

Deutschland), die Fluoreszenz-Emissionen bei 620 tim and 665 nm nach Anregung bei 350 um gemessen. Das Verhältnis der Emissionen bei 665 nm und bei 622 nm wurde als Maß für die Menge des des Komplexes aus d2 -markiertem ADP und Europium-Kryptat-niarkiertem anti-ADP- Antikörper und damit indirekt als Maß für die Menge des in der Enzymreaktion gebildeten unmarkierten ADP genommen (höheres Verhältnis der Emissionen bei 665 nm und bei 622 nm mehr Komplex aus d2 -markiertem ADP und Europiuni-Kryptat-markiertem anti-A DP-Antikörper weniger ADP) . Die Daten wurden normalisiert ( Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0 % Inhibition, alle anderen Assaykomponenten aber kein Enzym = 100 % Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanzen auf derselben Mikrotiterplattcn bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 LI bis I nM (20 μΜ, 6.7 μΜ, 2.2 μΜ, 0,74 μΜ, 0,25 μΜ, 82 ηΜ, 27 ηΜ, 9,2 ηΜ, 3, 1 ηΜ und 1 nM. die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der lOOfach konzentrierten Lösung durch serielle 1 :3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC50-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Sof ware verwendet wurde. Assay Bl (=( B 1 ))

Die hACC I -inhibitorische Wirkung der Substanzen dieser Erfindung wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen hACC 1 -Assay gemessen.

Im Wesentlichen wird die Enzymaktivität gemessen durch Quantifizierung des als Nebenprodukt der Enzymreaktionen gebildeten Adenosin-di-phosphat (ADP) mittels des ADP-Glo™-Nachweissystems der Fi rm a Promega. Bei di esem wird zunächst das i n der Enzymreaktion n i cht verbrauchte Adenosin-tri-phosphat (ATP) mittels einer Adenylatzyclasc („ADP-GLO-Reagenz") quantitativ in cA M P überführt, di e Adenylatzyk lase dann gestoppt und anschließend ( .. K i nase Detecti on Reagenz") wird dann das gebildete ADP in ATP umgewandelt und dieses in einer luziferasebasierten Reaktion in ein Glow-Lumineszenzsignal umgesetzt. Als Enzym w urde rekombinantes C-terminal FLAG-getagtes humanes ACC 1 (Acetyl-Coenzym A Carboxylase alpha Transkript Variante 1) (Gen Bank Accession No. NM 198834) (Aminosäuren 39 Ende) verwendet, exprimiert in Baculovirus-infi zierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Anti-FLAG-Affinitätschromatographie.

Für den Assay wurden 50 nl einer lOOfach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine weiße low-volume

(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert. 2,5 μΐ einer Lösung von hACC I in Assaypuffer [50 inM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCl₂, 2 mM Kaliumeitrat. 12 mM NaHCCK 2 mM Di-thio-threitol (DTT), 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin ( BSA) | hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermögl ichen. Dann wurde die

Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 2,5 μΙ einer Lösung von Adenosin-tri-phosphat (ATP, 100 M = > F. ndkonzent rat i on in 5 μί Assayvolumen ist 50 μΜ) und Acetyl-CoA (20 μ M

=>Endkonzentration in 5 μΐ Assawolumen ist 10 μΜ) in Assaypuffer und die resultierende

Mischung für die Reaktionszeit von 45 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des hACC I wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 1.75 ng/μΐ. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 2.5 μΐ des„ADP-GLO-Reagenz" ( 1 : 1.5-fach verdünnt) und die

resultierende Mischung I h bei 22°C inkubiert, um das nicht umgesetzte ATP vollständig in cAMP zu überführen. Anschließend wurden 2.5 μ! des„Kinase Detection Reagenz" ( 1.2 fach konzentrierter als vom Hersteller angegeben) zugegeben, die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert und dann die Lumineszenz mit einem geeigneten Messgerät (Viewlux oder Topcount von Perkin-Elmer oder Pherastar von BMG Labtechnologies) gemessen. Die Menge des emittierten Lichtes wurde als aß für die Menge des gebildeten ADP und damit für die Enzymaktivität der hACC I genommen. Die Daten wurden normalisiert (Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0 % Inhibition, alle anderen

Assaykomponentc aber kein Enzym = 100 % Inhibition ). Üblicherweise wurden die Testsubstanz auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μΜ bis I nM (20 μΜ, 6.7 μΜ, 2.2 μΜ, 0.74 μΜ, 0.25 μΜ, 82 ηΜ, 27 ηΜ, 9.2 ηΜ, 3.1 nM and I nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der I OOfach konzentrierten Lösung durch serielle 1 :3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC50- Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhousc-Softwarc verwendet wurde. Human ACC2-Eozymassay

Die A C C 2 - 1 nh i bi t i on sdatcn w urden mit zwei verschiedenen Assays erhoben (A2 und B2) Assay A2 (=(A2))

Die inhibitorisc c Aktivität der Substanzen dieser Erfindung gegenüber Acetyl-CoA-Carboxylase 2 (ACC2) wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen ACC2 -Assay gemessen.

Grundprinzip des Assays ist die Messung des als Ko-Produkt gebildeten Adenosindiphoshats (ADP) mittels eines HTRF ^! -basierten kompetitiven Immunoassays (HTRF = Hpmogeneous Time Resolved Fluorescence).

Als Enzym w urde kommerziel erhältliches (^'-terminal His-getagtes ACC2 von BPS Bioscience (San Diego, CA, Katalog- Nr. 50201. Aminosäuren 39 - Ende, exprimiert in Baculovirus infizierten Sf9- insektenzellen und gereinigt mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie) verwendet.

Für den Assay wurden 50 nl einer lOOfach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DMSO in eine schwarze low-volume 384well-!V1ikrotiterplatte (Greiner Bio-One. Frickenhausen, Deutschland) pipettiert, 2 ul einer Lösung von ACC2 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 12 mM Natriumin drogencarbonat. 2 mM MgCL, 2 mM Kaliumeitrat. 0,005 % (w/v) bovines

Serumalbumin ( BSA ) | hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzymreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die

Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 3 ul einer Lösung von Adenosintriphosphat (ATP, 83,5 }iM = ^•Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumen ist 50 μΜ, Amersham Pharmacia Biotech # 27- 2056-01) und Acctyl-CoA (33,4 μ M =>Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumen ist 20 μΜ, Roche Bioscience # 10101893001) in Assaypuffer und die resultierende Mischung für die Reaktionszeit von 20 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des ACC2 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 0,6 ng/μΙ. Die Reaktion urde gestoppt durch aufeinanderfolgende Zugaben von 2.5 ul einer Lösung von d2- markiertem ADP (HTRF^® Transscreener™ ADP Kit, Cis biointemational. Marcoulc. Frankreich) in dem EDTA-haltigen HTRF^® Transscreener™ ADP-Nachweispuffer (im HTRF^® Transscreener™ ADP Kit enthalten. 50 mM HEPES pH 7,0, 60 mM EDTA. 0, 1 % (w/v) BSA, 0,02 % Natnumazid. 400 mM Kaliumfluorid) und 2.5 μΐ einer Lösung von Europium-Kryptat-markierten anti-ADP- Antikörper (HTRF^® Transscreener™ ADP Kit) in HTRF* Transscreener™ ADP-Nachweispuffer. Die resultierende Mischung wurde 1 h bei 22°C inkubiert, um die Bindung des Europium-Kryptat- markierten anti-ADP-Äntikörpers an das durch die Enzymreaktion gebildete ADP und das d2- markierte ADP zu ermöglichen. Anschließend wurde die Menge des Komplexes aus d2 -markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper bestimmt durch eine Messung des Resonanz-Energietransfers vom Europium-Kryptat zum d2. Hierzu wurden in einem HTRF- Meßgerät, z.B. einem Rubystar oder Pherastar (beide BMG Labtechnologies, Offenburg,

Deutschland), die Fluoreszenz-Emissionen bei 620 um and 665 nm nach Anregung bei 350 nm gemessen. Das Verhältnis der Emissionen bei 665 nm und bei 622 nm wurde als Maß für die Menge des des Komplexes aus d2 -markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP- Antikörper und damit indirekt als Maß für die Menge des in der Enzymreaktion gebildeten unmarkierten ADP genommen (höheres Verhältnis der Emissionen bei 665 nm und bei 622 nm mehr Komplex aus d2 -markiertem ADP und Europium-Kryptat-markiertem anti-ADP-Antikörper weniger ADP) . Die Daten wurden normalisiert (Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0 % Inhibition, alle anderen Assaykomponenten aber kein Enzym = 100 % Inhibition). Üblicherweise wurden die Testsubstanzen auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μΜ bis 1 nM (20 μΜ, 6,7 μΜ, 2,2 μΜ, 0,74 μΜ, 0,25 μΜ, 82 ηΜ, 27 ηΜ, 9,2 ηΜ, 3, 1 ηΜ und 1 nM, die Verdünnungsreihen wurden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der lOOfach konzentrierten Lösung durch serielle 1 :3 Verdünnungen) in Doppelwerten für jede Konzentration getestet und IC50-Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Softwa verwendet wurde.

Assay B2 (=( B2))

Die hACC2-inhibitorische Wirkung der Substanzen dieser Erfindung wurde in dem in den folgenden Absätzen beschriebenen hACC2-Assay gemessen.

Im Wesentlichen wird die Enzymaktivität gemessen durch Quantifizierung des als Nebenprodukt der Enzymreaktionen gebildeten Adenosin-di-phosphat (ADP) mittels des ADP-Glo™-Nachweissystems der Firma Promega. Bei diesem wird zunächst das in der Enzymreaktion nicht verbrauchte Adenosin-tri-phosphat (ATP) mittels einer Adenylatzyclase („ADP-GLO-Reagenz") quantitativ in cAMP überführt, die Adenylatzyklase dann gestoppt und anschließend („Kinase Detection Reagenz") wird dann das gebildete ADP in ATP umgewandelt und dieses in einer luziferasebasierten Reaktion in ein Glow-Lumineszenzsignal umgesetzt.

Als Enzym wurde rekombinantes C-terminal FLAG-getagtes humanes ACC2 (Acetyl-Coenzym A Carboxylase 2, Gen Bank Accession No. NP_001084) (Aminosäuren 27 - Ende) verwendet, exprimiert in Baculoviras-infizierten Insektenzellen (Hi5) und gereinigt durch Anti-FLAG- Affinitätschromatographie .

Für den Assay wurden 50 nl einer lOOfach konzentrierten Lösung der Testsubstanz in DM SO in eine weiße low-volume 384well-Mikrotiterplatte (Greiner Bio-One. Frickenhausen. Deutschland) pipettiert. 2.5 μ! einer Lösung von hACC2 in Assaypuffer [50 mM HEPES/NaOH pH 7.5. 2 m M MgCL. 2 mM Kaliumcitrat. 12 mM NaHC0₃, 2 mM Di-thio-threitol ( DTT). 0,005% (w/v) bovines Serumalbumin ( BSA ) | hinzugegeben und die Mischung für 15 min inkubiert, um eine Vorbindung der Substanzen an das Enzym vor der Enzyinreaktion zu ermöglichen. Dann wurde die

Enzymreaktion gestartet durch Zugabe von 2.5 μΐ einer Lösung von Adenosin-tri-phosphat (ATP, 100 μΜ =>Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumen ist 50 μΜ) und Acetyl-CoA (20 μΜ

=>Endkonzentration in 5 μΐ Assayvolumcn ist 10 μΜ ) in Assaypuffer und die resultierende

Mischung für die Reaktionszeit von 45 min bei 22°C inkubiert. Die Konzentration des hACC2 wurde an die jeweilige Aktivität des Enzyms angepasst und so eingestellt, dass der Assay im linearen Bereich arbeitete. Typische Konzentrationen lagen im Bereich von 2 ng/μί. Die Reaktion w urde gestoppt durch Zugabe von 2,5 μΐ des„ADP-GLO-Reagenz" (1 : 1,5 -fach verdünnt) und die resultierende Mischung I h bei 22°C inkubiert, um das nicht umgesetzte ATP vollständig in cAMP zu überfuhren. Anschließend wurden 2,5 μΐ des„Kinase Detection Reagenz" ( 1.2 fach konzentrierter als vom Hersteller angegeben) zugegeben, die resultierende Mischung 1 h bei 22°C inkubiert und dann die Lumineszenz mit einem geeigneten Messgerät (Viewlux oder Topcount von Perkin-Elmer oder Pherastar von BMG Labtechnologies) gemessen. Die Menge des emittierten Lichtes wurde als Maß f r die Menge des gebildeten ADP und damit für die Enzymaktivität der hACC 2 genommen. Die Daten w urden normalisiert ( Enzymreaktion ohne Inhibitor = 0 % Inhibition, alle anderen Assaykomponente aber kein Enzym = 100 % Inhibition). Üblicherweise w urden die Testsubstanz auf derselben Mikrotiterplatten bei 10 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 20 μΜ bis I nM (20 μΜ, 6.7 μΜ, 2.2 μΜ, 0.74 μΜ, 0.25 μΜ, 82 ηΜ, 27 ηΜ, 9.2 ηΜ, 3.1 nM and 1 nM, die Verdünnungsreihen w urden vor dem Assay hergestellt auf der Ebene der lOOfach konzentrierten Lösung durch serielle 1 :3 Verdünnungen) in Doppelw erten für jede Konzentration getestet und IC50- Werte wurden kalkuliert mit einem 4-Parameter-Fit, wofür eine inhouse-Software verwendet w urde. Non-human ACCase-Assay

Der Assay wurde bei Raumtemperatur in einer durchsichtigen 384-wel! Mikrotiterplatte

durchgeführt. Er bestimmt das aus ATP inder ACCase-Reaktion freigesetzte anorganische Phosphat.

Der Testansatz enthielt 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCL. 0.5 m M ATP. 0.8 mM Dithiothreitol ( DTT). 30 mM NaHCCk 0.1 mM Acetyl-CoA, 0.04% Rinderserumalbumin und 0.4 μg partiell gereinigtes ACCase-Enzym in einem finalen Volumen v on 40 ul. Nach 45 Minuten Inkubation wurde die Reaktion mit 150 μΐ Malachitgrün-Lösung abgestoppt und die Extinktion bei 620 nach 30 Minuten ausgelesen.

Die Malachitgrün(MG)-Lösung w urde durch Mischen von 3 Teilen 0.6 mM MG-HCl-Lösung in desti lliertem Wasser mit I Teil 8.5 mM A m m on i u m m oK bdat in 4 M HCl hergestellt. Die Lösung wurde 30 Minuten stehen gelassen. Nach Filtration durch einen 0.45 μιη

Pol tetrafluorethylen(PTFE)-Filter wurden 0.1 Teile Triton X- 1 00 (1.5%) in destilliertem Wasser hinzugegeben.

ACCase-Enzym wurde aus 9 Tage nach der Aussaat geernteten Haferkeimlingen extrahiert und partiell aufgereinigt durch 0 - 40% Ammoniiimsulfat-Fällung gefolgt von einer lonenaustaiisch- Chromatographie an Q-Sepharose.

Mode-of-action- Versuch

Vor der Bestimmung der Wirksamkeit im MCF-7 Modell wurde ein Teil der Testsubstanzen in einem„Mode of action"-Experiment untersucht. Prinzip dieses Experiments ist, dass die kurzzeitige Applikation einer Testsubstanz, die dazu in der Lage ist ACC I und/oder ACC2 im lebenden

Organismus nach oraler Applikation zu inhibieren, im Tumor zu einer Verringerung von Malonvl- CoA führt. Experimentell wurden hierfür 2 Mio humane MCF-7 Brustkrebszelien in weibliche Nacktmäuse (N M RI-nude (nu/nu) mice. Taconic M&B A/S. I Tag zuvor Applikation eines Pellets zur Freisetzung von Östrogen über einen Zeitraum von mindestens 60 Tagen) subcutan injiziert. Sobald der Tumor eine Fläche von ca. 60-70 mm² erreicht hatte, erfolgte die orale Applikation der Testsubstanz über einen Zeitraum von 1-3 Tagen, anschließend wurde zu definierten Zeitpunkten der intratumorale Gehalt an Malonyl-CoA bestimmt und mit der Vehikelkontrolle verglichen. Die Methode ist beschrieben in Anal Chem. 2008 Aug l ;80(15):5736-42. Epub 2008 Jul 9.). Ce!l-Assays

In Übereinstimmung mit der Erfindung, wurden die Substanzen in Zell -basierten Assays getestet, das bedeutet die Fähigkeit der Substanzen die Tumorzellproliferation nach einer 96stündigen

Substanzinkubation zu hemmen. Die ZelK iabilität wurde mittels dem CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) getestet. Die Zellen wurden in einer Dichte von 2000-5000

Zellen/Well (abhängig von der Zelllinic) in ΙΟΟμΙ Wachstumsmedium auf 96well Microtiterplatten ausgesät. Für jede untersuchte Zelllinic. w urden Zellen auf eine separate Platte zur Bestimmung der Lumineszenz an t=0 Stunden und t=96 Stunden ausgesät. Nach einer Übemachtinkubation bei 37°C, w urden die Lumineszenzwerte für die t=0 Proben bestimmt. Die Dosis-Platten für die t=96 Stunden Zeitpunkte wurden mit in Wachstumsmedium verdünnten Substanzen behandelt. Die Zellen w urden dann für 96 Stunden bei 37°C inkubiert, anschließend die Lumineszenzwerte für die t=96-Stunden Proben bestimmt. Für die Datenanalyse w urden die t=0 Werte von den t=96 Stunden Werte abgezogen für behandelte und unbehandelte Proben. Die prozentualen Unterschiede in der

Luminescenz zwischen mit Substanz behandelten und Kontroliwerten wurden benutzt um die prozentuale Wachstumshemmung zu bestimmen.

Die Substanzen wurden in folgenden Zelllinien untersucht, die beispielhaft die angegebenen

Indikationen vertreten:

Zelllinie Quelle Indikation

MCF7 ATCC Hormonrezeptor-positives Mammakarzinom

PC3 ATCC Prostatakarzinom

Du 145 NCI Prostatakarzinom

FCC 1 ATCC Endom etri um karzi nom

K M 1 2 NCI Kolorektales Karzinom

HEC 1A ATCC Endometriumkarzinom

DNA-G CLS Pankreaskarzinom

BxPC3 ATCC Pankre askarzinom

H460 ATCC Nicht-kleinzelliges Bonchia! karzi nom

CA L- 1 20 ATCC Hormonrezeptor-negatives Mammakarzinom

BT-20 ATCC Hormonrezeptor-negatives Mammakarzinom

SNU16 ATCC Magenkarzinom

LNCaP ATCC Prostatakarzinom Xenograft Modell

Zur Bestimmung der antitumoralen Wirksamkeit im lebenden Organismus wurden Xenograft- Modelle in immunsupprimierten Mäusen verwendet.

Zunächst wurde hierzu die maximal tolerierbare Dosis (MTD) nach folgendem Protokoll ermittelt: Weibliche Nacktmäuse (NMRI-nude (nu/nu) mice, Taconic M&B A/S) erhielten über einen Zeitraum von 1, 2 oder 3 Wochen täglich oral eine definierte Dosis der Testsubstanz und wurden täglich bezüglich Sterblichkeit und Körpergew icht beobachtet. Als MTD definiert wurde die höchste verabreichbare Dosis, bei der w ährend der Behandlungsphase und in der Vtägigen

Nachbeobachtungszeit kein Tier starb und es nicht zu einem mehr als 10% Abfall des

Körpergew ichts im Vergleich zum Ausgangsgewicht kam.

Zur Bestimmung der antitumoralen Wirksamkeit wurden dann verschiedene Xenograftmodellc verwendet, in denen die Testsubstanzen an ihrer MTD sowie in niedrigeren Dosierungen gegeben wurden. Neben verschiedenen anderen Modellen w urde primär das Brustkrebsmodell mit hormonabhängigen humanen MCF-7 Zellen in weiblichen Nacktmäusen (NMRI-nude (nu nu) mice, Taconic M&B A/S) verwendet. Hierfür wurden diesen Mäusen am Tag vor der Tu mo rzel 1 i m pl an tati on ein Pellet zur Freisetzung von Östrogen (17ß-Estradiol 0.36mg, Freisetzung über 60 Tage) subcutan appliziert. Pro Tier wurden dann am nächsten Tag 2 io Tumorzellen (suspendiert in Medium + Matrigel) 1 : 1, final 0, 1 ml) in die Flanke subcutan injiziert. Wenn die Tumore 20-25 mm²

Tumorfläche erreicht hatten, w urden die Mäuse in die Therapiegruppen randomisiert und mit der Therapie begonnen. Die Therapie wurde dann unter 2-3-mal wöchentlicher Messung von

Tumorfläche und Körpergew icht fortgesetzt, bis die durchschnittliche Tumorgröße in der

Kontrollgruppe, die nur den Vehikel der Testsubstanz erhalten hatte, oder in einer der

Behandlungsgruppen 120mm² erreicht hatte. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Versuch in allen Gruppen abgebrochen und die präparierten Tumore gewogen.

Als primärer Erfolgsparameter w urde der T/C-Wert kalkuliert entw eder anhand des Effektes auf das Tumorgewicht oder auf die Tumorfläche errechnet: Mittelwert der Tiimorge ichte/flächen in der Behandlungsgruppe dividiert durch den Mittelwert der Tumorgewichte/flächen in der Vehikelgruppe. Analyse der ACC1 Expression in Tumor- and Normalgewebe

Die ACC I Expression w urde mittels eines Microrrays bestimmt. Dafür wurde die RNA aus verschiedenen Tumorgeweben und den korrespondierenden Normalgew eben isoliert. Methodisch w urde Trizol RNA extraction Reagenz (Invitrogen) verwendet und eine Aufreinigung mittels des RNeasy Mini Kit (Qiagen) angeschlossen. Ausserdem w urde ein DNase I (Qiagen) Verdau durchgeführt, um genomische DNA zu eliminieren. Zur Qualitätskontrolle wurde eine Analyse der totalen RNA mittels eines RNA LabChip auf einer Agilent Bioanalyzer 2100 Platform (Agilent Technologies) durchgeführt und die RNA Konzentration mittels des Peqlab NanoDrop Systems bestimmt. Zur Hybridisierung w urde der„one-cycle eukaryotic target labeling assay" von

Affymetrix verwendet und der Array anschliessend auf einem AffymetrixGeneChip 3000 Scanner (Affymetrix) ausgelesen. Auswertung und Qualitätskontrolle erfolgten unter Verwendung der Expressionist Pro 4.0 Refiner (Gene-Data) Software. 4. Ergebnisse:

4.1. Enzymassay

Die Tabelle 1 fasst die Ergebnisse in Bezug auf Verbindung A und der Vergleichsbeispiele aus den Enzymassays zusammen.

Tab. 1

Diese Werte zeigen, dass die Verbindung A und das Vergleichsbeispiel V. I die Enzyme vergleichbar stark inhibieren, während das Vergleichsbeispiel V.2 unterlegen ist.

4.2 Cellassays

Die Tabelle 2 fasst die Ergebnisse in Bezug auf Verbindung A und der Vergleichsbeispieie aus den Cellassays zusammen. Tab. 2

4.3 Maximal tolerierbare Dosis (MTD)

Vergleichsbeispiel V.l

Vergleiclisbeispiel V.1 w urde weiblichen Nacktmäusen (NMRI nu/nu) appliziert:

Dosis: s. Tab. 3

Applikationsart: per os

Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15(70/5/25, v/v/v)

(Solutol HS 15 : Polyoxyethylenester der

Applikationsvolumcn: 10ml/kg

Schema: s. Tab. 3

Der Behandlungsphase folgte eine Beobachtungsphase von 7 Tagen. Die dabei aufgetretenen Todes falle sow ie die Wirkung auf das Körpergew icht sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Tab. 3

Substanz Dosis (mg/kg) Schema Körpergewicht (%) Todesfälle

V. l 10 14 Tage. 2mal täglich minus 1 2 1 von 3

V. 1 20 14 Tage, 2mal täglich minus 29 2 von 3

V. l 30 14 Tage, 2 mal täglich minus 1 1 2 von 3

Vehikel 2 1 Tage. l mal täglich plus 1 5 0 von 5

V. l 15 21 Tage, lmal täglich minus 1 1 von 5

V. l 20 21 Tage, lmal täglich minus 2 1 von 5 V. l. 25 21 Tage, 1 mal täglich minus 3 1 von 5

Demzufolge liegt die MTD für eine 14tägige Behandlung bei 2mal täglicher Gabe unterhalb von 10mg/kg.

Demzufolge liegt die MTD für eine 2 1 tägigc Behandlung bei I mal täglicher Gabe unterhalb von 15mg/kg.

Da es in allen Gruppen zu Todesfällen und einem Körpergewichtsverlust kam, konnte die MTD nicht bestimmt werden.

Vergleichsbeispiel V.1 wurde nachfolgend im MCF-7 Brustkrebs-Xenograft-Modell weiblichen Nacktmäusen (NMR! nu/nu) appliziert:

Dosis: 7.5mg/kg

Applikationsart: per os

Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15 70/5/25, v/v/v)

Applikationsvolumen: 10ml/kg

Schema: 27 Tage, 2mal täglich (2qd)

Mäuse: 10

Diese Dosis w urde bis zum Tag 37 des Experiments relativ gut vertragen (kein Körpergewichts- verlust, 1 von 10 Tieren gestorben). Eine therapeutische Wirksamkeit definiert als T/C-Wert von <= 0.5 konnte in dieser Dosisgruppe im Vergleich zur Vehikelkontrolle nicht beobachtet werden (T/C- Wert basierend auf Tumorfläche = 0,86).

Figur 2 zeigt die Tumorfläche in Abhängigkeit von der Anzahl der Tage nach Implantation der Tumorzellen

Die verbleibenden Tiere wurden mit 10mg/kg 2qd oder 12.5mg/kg 2qd bis zum Tag 43

weiterbehandelt. Diese beiden höheren Dosierungsschemata wurden jedoch schlecht vertragen (1 von 4 bzw. 4 von 5 Todesfälle)

Zusammenfassend ist das therapeutische Fenster des Vergleichsbeispiels V. l, sofern überhaupt vorhanden, als sehr klein anzunehmen.

Verbindung A

Verbindung A wurde weiblichen Nacktmäusen (NMR! nu/nu) appliziert:

Dosis: s. Tab. 4

Applikationsart: per os

Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15 70/5/25, v/v/v) Applikationsvolumen: 10ml/kg

Schema: s. Tab. 4

Der Behandlungsphase folgte eine Beobachtungsphase von 7 Tagen. Die dabei aufgetretenen Todesfälle sowie die Wirkung auf das Körpergewicht sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Tab. 4

Demzufolge liegt die MTD für eine 2 Itägige Behandlung bei I mal täglicher Gabe unterhalb 40mg/kg und oberhalb von 30 mg/kg.

Verbindung A wurde nachfolgend im MCF-7 Brustkrebs-Xenograft-Modell weiblichen Nacktmäusen (N M R! nii/nu) appliziert:

Dosis: s. Tab. 5

Applikationsart: per os

Vehikel: PEG400/Ethanol/Solutol HS 15 70/5/25, v/v/v)

Applikationsvolumen: 10ml/kg

Schema: 30 Tage, I mal täglich (qd)

Mäuse pro Dosisgruppe: 10-13

Tab. 5

Substanz Dosis (mg/kg) T/C T/C

(basierend auf (basierend auf Tumorflächc) Tumorgewicht)

Vehikel 1.00 1.00

Verbindung A 20 0.56 (ns) 0.42 (p=0.003)

Verbindung A 25 0.51 (p<0.05) 0.37 (p<0.001)

Verbindung A 30 0.49 (p<0.05) 0.35 (p<0.001)

Verbindung A 35 0.44 (p<0.05) 0.31 (p<0.001) Zur statistischen Evaluierung des Experiments wurde für die auf der Tumorfläche basierenden T/C- Werte der nicht-parametrische ANOVA-Test verwendet, da keine Normalverteilung der Messwerte vorlag. Anschließend erfolgte der Vergleich aller Therapiegruppen versus der Vehikelgruppe mittels des Dürrns Posttest. Die resultierenden p-Werte sind in der Tabelle gezeigt (ns: nicht signifikant = p>0.05). Da für die auf dem Tumorgewicht basierenden T/C -Werte eine Normalverteilung vorlag, wurde zur Analyse der ANOVA-Test für parametrische Werte verwendet. Anschließend erfolgte der Vergleich aller Therapiegruppen versus der Vehikelgruppe mittels des Bonferroni Posttest. Die resultierenden p-Werte sind in der Tabelle 5 gezeigt.

Da in diesem Experiment alle verwendeten Dosisgruppen den Zielwert einer T/C (basierend auf dem Tumorgewicht) von < 0.5 erreichten, wurde eine statistische Evaluierung des Experiments durchgeführt, deren Ergebnisse ebenfalls in der Tabelle 5 gezeigt werden. Die Verbindung A inhibierte statistisch signifikant das Tumorwachstum (basierend sowohl auf Tumorgewicht und Tumorfläche) ab einer Dosis von 25 mg/kg bei lmal täglicher Gabe. Basierend auf dem

Tumorgewicht war dieser Effekt bereits statistisch signifikant ab einer Dosis von 20 mg/kg bei I mal täglicher Gabe.

Figur 3 zeigt die Tumorfläche in Abhängigkeit von der Anzahl der Tage nach Implantation der Tumorzellen.

Der Vergleich zwischen Vergleichsbeispiel V.1 und der Verbindung A zeigt demnach, dass für das Vergleichsbeispiel V.1 selbst bei einer nicht gut tolerierten Dosis keine antitumorale Wirksamkeit zu beobachten ist, während biologisch bedeutsame und signifikante antitumorale Effekte für die Verbindung A in einem tolerierbaren Dosisbereich von 20 mg/kg qd bis 35 mg/kg qd festzustellen sind.

ACC1 Expression in Tumor- und Normalgewebe

Die ACC 1 Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe wurde mittels Microarray bestimmt (Figur 1). Die Expression von ACC1 war signifikant hochreguliert im Vergleich zum Normalgewebe in Mammakarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Bronchialkarzinomen und

Pankreaskarziomen. 5. Formulierung

Tabletten enthaltend Verbindung A a) Herstellung einer Pharmazeutischen Formulierung durch Direkttablettierung

Es wurden Tabletten gemäß der Zusammensetzung aus Tabelle 6 enthaltend die Verbindung mitteis einer Direkttablettierung hergestellt.

Tab. 6

Die pharmazeutische Formulierung kann durch geeignete Verfahren, insbesondere Pulvermischung und Direkttablettierung in beliebigem Scale hergestellt werden.

Für die Herstelluung von 50 Tabletten wanden in einer Fantaschale

3,351 g Mannitol, sprühgetrocknet

2,004 g Cellulose, mikrokristallin

0,499 g N a-C rosca rmel 1 ose und

3,992 g Beispielverbindung 1-1 18

durch vorsichtiges Verreiben vorgemischt. Die Mischung wurde in ein 100ml Schraubdeckelgl; überführt und 10 Minuten in einem Turbula-Mischer homogenisiert. Nach Hinzufügung von 0, 149 g Magnesiumstearat w urde erneut für I min im Turbula-Mischer gemischt.

Die so erhaltene Pressmasse w urde mittels einer Exzenter-Tablettenpresse (Kersch EK 2) zu bikonvexen Tabletten mit einem Durchmesser von 8 mm und einem Wölbungsradius von 1 2 mm verpresst. b) Bruchfestigkeit

Die Bruchfestigkeit (mittels Schleuniger Bruchfestigkeitstester), Masse und Zerfallszeit in Wasser bei 37°C (mittels der in der Monographie 2.9.1 Europäischen Pharmakopoe beschriebenen Apparatur) der erhaltenen Tabletten wurde zu Anfang, Mitte und Ende des Tablettierprozesses geprüft.

Bruchfestigkeit Masse Zerfallszeit

Anfang 8 IN 198,7 mg 1 :28 min

Mitte 95 N 196,8 mg 1 :28 min.

Ende 97N 199,0 mg 1 :32 min.

Mittel 9 IN 198,2 mg 1 :29 min. c) In- vitro Dissolution

Die in-vitro-Freisetzung der Verbindung A aus den hergestellten Tabletten wurde mittels Apparatiis

2 (Paddle-Methode) gemäß USP bestimmt. Der Freisetzungstest wurde jeweils in 900 mL unterschiedlicher Medien bei 37°C und mit einer Rührgeschwindigkeit von 75 Undrehungen pro Minute durchgeführt. Jede Bestimmung wurde dreifach durchgeführt. Die Gehaltsbestimmung erfolgte per HPLC. Tabelle 7 und Figur 4 zeigen die Ergebnisse.

Tab. 7

* SDS = Natriumlaurylsulfat (zugesetzt, da Löslichkeit bei pH 1 und pH 6,8 nicht ausreichend ist) d) Kurzzeit-Stabilität der Pharmazeutische Formulierung

Die hergestellten Tabletten wurden einer Kurzzeit-Stabilitätsprüfung für 1 Monat bei 25°C/60% relative Feuchte und bei 40°C/75% relative Feuchte unterzogen. Die Tabletten waren unter beiden Bedingungen stabil hinsichtlich Gehalt und Abbauprodukten, untersucht mittels HPLC. Figuren:

ACC 1 Expression in Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe

1 : gesundes Brustgewebe (2 Proben)

2: Brusttumorgewebe (26 Proben)

3 : gesundes Kolongewebe (30 Proben)

4: Kolontumorgewebe ( 7 1 Proben)

5 : gesundes Lungengewebe (27 Proben)

6: Lungentumorgewebe (40 Proben)

7: gesundes Pankreasgewebe (22 Proben)

8: Pankreastumorgewebe (19 Proben)

Therapeutische Wirksamkeit von Vergleichsbeispiel V.1 in Hormon-abhängigen MCF-7 Brustkrebs-Xenograft-Modell.

Therapeutische Wirksamkeit von Verbindung A in Hormon-abhängigen MCF-7

Brustkrebs-Xenograft-Modell.

Freisetzungskurve von Verbindung A aus Tabletten

Claims

Patentansprüche

1. Verwendung von (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-metliy!biphenyl-3-yl)-44iydroxy- 8-methoxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Herstellung eines Medikamentes.

2. Verwendung gemäß Anspruch I zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe

und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.

3. Verwendung gemäß Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe

und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nicht-Kleinzelligen

Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen,

Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen.

4. Verwendung von (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy- 8-methoxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Prophylaxe und/oder Therapie von

Erkrankungen des Menschen oder eines anderen Säugetiers.

5. Verwendung gemäß Anspruch 4 zur Prophylaxe und/oder Therapie von

Tumorerkrankungen.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen.

7. (5 s, 8s)-3 -(4'-Chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)-4-hydroxy-8-methoxy- l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Verwendung als Arzneimittel.

8. (5 s, 8s)-3 -(4'-Chlor-3 '-fluor-4-methyibiphenyl-3 -yi)-4-hydroxy-8-methoxy- l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.

9. (5 s, 8s)-3 -(4'-Chlor-3 '-fluor-4-methylbiphenyl-3 -yl)-4-hydroxy-8-methoxy- 1 - azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen.

10. Pharmazeutische Formulierung in Form einer Tablette enthaltend (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'- fluor-4-methylbiphenyl-3-yl)-4-hydroxy-8-methoxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on zur Prophylaxe und/oder Therapie von Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen, Nicht- Kleinzelligen Bronchialkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Kolorektalen Karzinomen, Magenkarzinomen und Prostatakarzinomen.

1 1. (5s,8s)-3-(4'-Chlor-3'-fluor-4-methylbiphenyl-3-yi)-4-hydroxy- 8-methoxy-l-azaspiro[4.5]dec-3-en-2-on in Kombination m it einem weiteren Wirkstolf