MX2013009065A - (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)-4-hidroxi-8-me toxi-1-azaespiro[4,5]dec-3-en-2-ona (compuesto a) para tratamiento. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbif enil-3-iI)-4-hidroxi-8-metoxi-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-ona para propósitos terapéuticos, a composiciones farmacéuticas y a su uso en terapia, en particular para la profilaxis y terapia de enfermedades tumorales.

Description

(5S.8S)-3-(4,-CLORO-3'-FLUOR0^4-METILBIFENIL-3-IL)-4-HIDROXI-8-METOXI-1- AZAESPIROr4.51DEC-3-EN-2-ONA (COMPUESTO Al PARA TRATAMIENTO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)-4-hidroxi- 8-metoxi-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-ona (= compuesto A) para propósitos terapéuticos, a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto A y a su uso en terapia, en particular para la profilaxis y/o terapia de enfermedades tumorales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las acetil-CoA carboxilasas (ACC) tienen un papel clave en la homeostasis de los ácidos grasos celulares. Las ACC son enzimas que contienen biotina que catalizan la carboxilación de acétil-CoA a malonil-CoA de un modo dependiente de ATP (Kim, 1997; Harwood, 2005; Tong, 2005). Esta reacción, que procede como dos semirreacciones, una reacción de carboxilación de biotina (BC) y una reacción de carboxiltransferasa (CT), es el primer paso inicial en la biosíntesis de ácidos grasos y és el paso determinante de la velocidad de la vía. Se conocen dos isoformas de ACC humana, ACC y ACC2, que están codificadas por genes diferentes (LuTFI ABU-ELHEIGA eí al, 1995, Jane WIDMER, et al. 1996). ACC 1 se expresa en tejido lipogénico (hígado, tejido graso), se localiza en el citosol y aporta al conjunto de malonil-CoA el cual sirve como donante de unidades C2 para la síntesis de novo de ácidos' grasos de cadena larga por FASN y posterior elongación de cadena. ACC2 se expresa en particularen tejidos oxidativos (hígado, corazón, músculo esquelético) (Bianchi et al., 1990; Kim, 1997), está asociada con las mitocondrias, y regula un segundo conjunto de malonil-CoA. Esto regula la oxidación de ácidos grasos por inhibición de la carnitinapalmitoil transferasa I, la enzima que facilita la importación de ácidos grasos de cadena larga a las mitocondrias para ß-oxidación (Milgraum LZ, ef al., 1997, Widmer J. et al., 1996). Ambas enzimas tienen una homología de secuencia muy alta y están reguladas de; un modo similar por una combinación de mecanismos transcripcionales, traduccionales y postraducciónales. En humanos así como en animales, la actividad de la ACC está bajo un control estricto dé un número de mecanismos dietarios, hormonales y otros fisiológicos tal como, por ejemplo, por activación alostérica por precursor por citrato, inhibición por retroalimentación por ácidos grasos de cadena larga, fosforilación reversible y/o inactivación o modulación de la producción de enzima por expresión genética modificada.

Los ratones genéticamente carentes (knockout) de ACC1 son letales embrionariamente (Swinnen, et al. , 2006, Abu-Elheiga, ef al. 2005).

¦ ¦ Los ratones knockout de ACC2 muestran concentraciones reducidas de malonil-CoA en músculo esquelético y cardíaco, oxidación aumentada de ácidos grasos en el músculo, niveles reducidos de grasa hepática, cantidades reducidas de grasa corporal total, niveles aumentados de UCP3 en músculo esquelético (como un signo de salida de energía aumentada), peso corporal disminuido, concentraciones plasmáticas menores de ácidos grasos, niveles de glucosa plasmática reducidos, cantidades reducidas de glucógeno tisular, y están protegidos contra diabetes y obesidad inducidas por dieta (Ábu-ÍÉIheiga et al., 2001 , 2003; Oh eí al., 2005). ' [' Ademas de participar en la síntesis de ácidos grasos en tejidos lipogénicos y la oxidación de ácidos grasos en tejidos oxidativos, se observó un aumento de la regulación de ACC y una lipogénesis aumentada en muchas células tumorales (Swinnen, et al., 2004, Heemers, ef al., 2000, Swinnen, ef al., 2002, Rossi, et al., 2003, Milgraum, er a/., 1997, Yahagi, et al., 2005). Con alta probabilidad, este fenotipo contribuye al desarrollo y progresión de tumores; sin embargo, los mecanismos regulatorios . asociados aún tienen que ser dilucidados. . I! i: EP0454782 y US5759837 protegen el uso de inhibidores de la síntesis de ácidos grasos para inhibir el crecimiento celular de tumores. Los cetóenoles cíclicos no están expuestos.

Se ha encontrado un número de sustancias con capacidad de inhibir ACC vegetales y/o de insectos. . ! ! .. :! La solicitud de patente PCT, PCT/EPP99/01787, publicada como WO 99/48Í869, que corresponde a la patente europea EP 1 066 258 B1 , se relaciona con novedosos cetóenoles cíclicos arilfenilo-sustituidos, con una pluralidad de procesos para su preparación y con su uso como pésticidas y herbicidas.

Las propiedades farmacéuticas de 3— acilpirrolidin— 2,4— dionas han sido descriptas en al arte previo (S. Suzuki et al. Chem. Pharm. Bul). 15 1 120 (1967)). Adicionalmente, R. Schmierer y H. Mildenberger han sintetizado A/—fenilpi-rrolidin— 2,4— dionas (Liebigs Ann. Chem. 1985, 1095). No se ha descripto una actividad biológica de estos compuestos.

EP-A-0 262 399 y GB-A-2 266 888 describen compuestos de una estructura similar (3-arilpirrolidin-2,4-dionas); sin embargo, no se sabe si estos compuestos tienen alguna actividad herbicida, insecticida o acaricida. Se sabe que los derivados 3— arilpirrolidin— 2,4— diona bicíclicos no sustituidos tienen actividad herbicida, insecticida o acaricida (EP-A-355 599, EP-A-415 211 y JP-A-12-053 670), y también los derivados 3— arilpirrolidin— 2,4— diona monocíclicos sustituidos (EP--A-377 893 y EP-A-442 077).

También son conocidos los derivados de 3— arilpirrolidin— 2,4— diona policfclicos (EP-A-442 073) y también los derivados de 1 H-arilpirrolidindiona (EP-A-456 063, EP-A-521 334, EP-A-596 298, EP-A-613 884, EP-A-613 885, WO 95/01 971 , WO 95/26 954, WO 95/20 572, EP-A-0 668 267, WO 96/25 395, WO 96/35 564, WO 97/01 535, WO 97/02 243, WO 97/36 868, WO 97/43275, WO 98/05638, WO 98/06721 , WO 98/25928, WO 99/24437, WO 99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/23354, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 03/062244, WO 2004/007448, WO 2004/024 688, WO 04/065366, WO 04/080962, WO 04/1 11042, WO 05/044791 , WO 05/044796, WO 05/048710, WO 05/049569, WO 05/066125, WO 05/092897, WO 06/000355, WO 06/029799, WO' 06/056281 , WO 06/056282, WO 06/089633, WO 07/048545, DEA 102 00505 9892, WO 07/073856, WO 07/096058, WO 07/121868, WO 07/140881 , WO 08/067873, WO 08/067910, WO 08/06791 1 , WO 08/138551 , WO 09/015801 , WO 09/039975, WO 09/049851 , WO 09/1 15262, WO10/052161 , WO 10/063378, WO 10/063670, WO10/063380, WO10/066780 y WO10/102758. :: Además, las 1—H— arilpirrolidin— 2,4— dionas cetal-sustituidas son conocidas de WO 99/16748 y las arilpirrolidindionas N-alcoxialcoxi-sustituidas (espiro)-cetal-sustituidas son conocidas de JP-A14 205 984 e Ito M. eí al. Bioscience, Biotec nology and Biochemistry 67, 1230-1238, (2003), Además, WO 06/02441 1 describe composiciones herbicidas que comprenden cetoenoles.

Se sabe que ciertos derivados de A3-dihidrofuran-2-ona sustituidos tienen propiedades herbicida (comp. DE-A-4 014 420). La síntesis de derivados de ácido tetrónico usados como materiales de partida (tal como, por ejemplo, 3-(2-met¡lfenil)^ -hidroxi-5-(4-fluorofenil)-A3-dihidrofuranona-(2)) se describe del mismo modo en DE-A-4 014 420. Los compuestos de estructura similar sori conocidos de la publicación Campbell ef al., J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1 , 1985, (8) 1567-76, sin ser declarada ninguna actividad insecticida y/o acaricida. Los derivados 3-aril-A3-dihidrofuranona que tienen propiedades herbicidas, acaricidas e insecticidas además se conocen de: EP-A-528 156, EP-A-647 637, WO 95/26 954, WO 96/20 196, WO 96/25 395, WO 96/35 664, WO 97/01 535, WO 97/02 243, WO 97/36 868, WO 98/05 638, WO 98/06 721 , WO 99/16 748, WO 98/25 928, WO 99/43 649, WO 99/48 869, WO 99/55 673, WO 01/23354, WO 01/74 770, WO 01/17 972, WO 04/024 688, WO 04/080 962, WO 04/1 1 1 042, WO 05/092 897, WO 06/000 355, WO 06/029 799, WO 07/048545, WO 07/073856, WO 07/096058, WO 07/121868, WO 07/140881 , WO 08/067911 , WO 08/083950, WO 09/015801 , WO09/039975 y PCT/EP2010/003020.

Los derivados de 3-aril-A3-dihidrotiofenona son conocidos de WO 95/26 345, 96/25 395, WO 97/01 535, WO 97/02 243, WO 97/36 868, WO 98/05638, WO 98/25928, WO 99/16748, WO::99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673, WO 01/ 17972, WO 01/23354, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 04/080 962, WO 04/1 1 042, WO 05/092897, WO 06/029799 y WO 07/096058.

Ciertos derivados de fenilpirona que no están sustituidos en el anillo fenilo ya son conocidos (comp. A.M. Chirazi, T. Kappe y E. Ziegler, Arch. Pharm. 309, 558 (1976) y K.-H. . Boltze y K. Heidenbluth, Chem. Ber. 91 , 2849). Los derivados de fenilpirona que están sustituidos en el anillo fenilo y tienen propiedades herbicidas, acaricidas e insecticidas se describen en EP-A588 137, WÓ 96/25 395, WO 96/35 664, WO 97/01 535, WO 97/02 243, WO 97/16 436, WO 97/19 941 , WO 97/36 868, WO 98/05638, WO 99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 04/080 962, WO 04/11 1 042, WO 05/092897, WO 06/029799 y WO 07/096058.

Ciertos derivados de 5— fenil— 1 ,3— tiazina que no están sustituidos en el anillo fenilp ya son conocidos (comp. E. Ziegler y E. Steiner, Monatsh. 95, 147 (1964), R. Ketcham, T. Kappe y E. Ziegler, J. Heterocycl. Chem. 10, 223 (1973)). Los derivados de 5— fenil-1 ,3— tiazina que están sustituidos en el anillo fenilo y tienen propiedades herbicidas, acaricidas e insecticidas se describen en WO 94/14 785, WO 96/25 395, WO 96/35 664, WO 97/01 535, WO 97/02 243, WO 97/02 243, WO 97/36 .868, WO 99/43649, WO 99/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 04/080 962, WO 04/1 1 1 042, WO 05/092897, WO 06/029799 y WO 07/096058. . : I :; Se sabe que ciertas 2-arilciclopentanodionas sustituidas tienen propiedades Herbicidas, insecticidas y acaricidas (comp., por ejemplo, US-4 283 348; 4 338 122; 4 436 666; 4 526 723; 4 551 547; 4 632 698; WO 96/01 798; WO 96/03 366, WO 97/14 667 y también WO 98/39281 WO ¡99/43649, W099/48869, WO 99/55673, WO 01/17972, WO 01/74770, WO 03/062244, WO 04/080962, WO04/111042, WO05/092897, WO06/029799, WO07/080066, WO07/096058, WOÓ9/019005, WOQ9/019015, WO09/049851 , WO 10/069834, WO10/000773, WO10/057880, WCH 6/081894, WO10/089210, WO10/102848 y WO10/133232). Los compuestos que tienen sustituciones; similares también son conocidos; 3-hidroxi-5,5-dimetil-2-fenilciclopent-2-en-1-ona de la publicación Micklefield ef al., Tetrahedron, (1992), 7519-26 y también el compuesto natural involutina (-)-d's-5-(3,4-dihidroxifenil)-3,4-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)ciclopent-2-enona de la publicación Edwards^ ef al., J. Chem. Soc. S, (1967), 405-9. No se describe una acción insecticida o acaricida. Además," 2-(2,4,6-trimetilfenil)-1 ,3-indanediona se conoce de la publicación J. Economic Entomology, 66, (1973), 584 y la solicitud abierta a la inspección pública DE-A 2 361 084, con actividades herbicida y" acaricida declaradas.

Se sabe que ciertas 2-arilciclohexanodionas sustituidas tienen propiedades herbicidas, insecticidas y acaricidas (US^4 175 135, 4 256 657, 4 256 658, 4 256 659, 4 257 858, 4 283 348, 4 303 669, 4 351 666, 4 409 153, 4 436 666, 4 526 723, 4 613 617, 4 659 372, DE-A 2 813; 341 jj y también Wheeler, T.N., J. Org. Chem. 44, 4906 (1979)), WO 99/43649, WO 99/48869, WO¦ 99/55673, WO 01/17972, WO 01/74770, WO 03/013249, WO 04/080 962, WO 04/1 1 1 042, WO 05/095897, WO 06/029799, WO 07/096058, WO 08/071405.WO 08/110307, WO 08/1 10308, WO 09/074314, WO 08/145336, WO 09/015887, WO09/074314, WO10/046194, WO10/081755 y WO10/089211 ).

Se sabe que ciertas 4-arilpirazolidina-3,5-dionas sustituidas tienen propiedades acaricidas, insecticidas y herbicidas (cf., por ejemplo, WO 92/16 510, EP-A-508 126, WO 96/1 1 574, WO 96/21 652, WO 99/47525, WO 01/17 351 , WO 01/17 352, WO 01/17 353, WO 01/17 972, WO 01/17 973, WO 03/028 466, WO 03/062 244, WO 04/080 962, WO 04/111 042, WO 05/005428, WO 05/016873, WO 05/092897, WO 06/029799 y WO 07/096058).

Se sabe que ciertas tetrahidropiridonas tienen propiedades herbicidas (JP 0832530). También se conocen 4-hidroxitetrahidropiridonas específicas que tienen propiedades acaricidas, insecticidas y herbicidas (JP 1152273). Adicionalmente, las 4-hidroxitetrahidropiridonas han sido descriptas como pesticidas y herbicidas en WO 01/79204 y WO 07/096058. En WO 03/01045 se describen 4-hidroxiquinolonas.

Se sabe que ciertos derivados de 5,6-dihidropirona como inhibidores de proteasa tienen propiedades antivirales (WO 95/14012). Adicionalmente, se conoce 4-f e n i I— 6— ( 2-f e n e t i I )— 5 , 6— dihidropirona de la síntesis de derivados de kawalactona (Kappe et al., Arch. Pharm. 309, 558-564 (1976)). Además, los derivados de 5,6-dihidropirona se conocen como intermediarios (White, J.D., Brenner, J.B., Deinsdale, M. J., J. Amer. Chem. Soc. 93, 281 - 282 (1971 )). Los derivados de 3-fenil-5,6-dihidropirona con aplicaciones en la protección de cultivos se describen en WO 01/98288 y WO 07/09658. '· Los derivados de ácido tetrónico 4'— bifenil— sustituidos para la terapia de trastornos' virales se describen en WO 2008/022725.

WO 2005/089118 y WO2007/039286 describen, de un modo general, estructuras! bicíclicas nitrogenadas para terapia, sin ser mencionados específicamente cetoenoles cíclicos 5'— bifenil— sustituidos.

Las [1.2]-oxazina-3,5-dionas 4— fenil— sustituidas como herbicidas se describieron ¡nicialmente en WO 01/17972. Adicionalmente, las [1.2]-oxazina-3,5-dionas 4-acil-sustituidas como pesticidas, pero especialmente como herbicidas y reguladores del crecimiento, se describen, por ejemplo, en EP-A-39 48 89; WO 92/07837, US 5.728.831 , y como herbicidas y pesticidas en WO 03/048138. : ¡ . ,.

El compuesto A se describe específicamente en WO2008/067910 (tabla 1 , página 26,' línea 4). WO2008/067910 no describe la aplicabilidad del compuesto A para propósitos terapéuticos.

La presente solicitud establece la prioridad para el uso terapéutico del compuesto A.. ?? mismo tiempo que la solicitud que establece prioridad, cuyo tema es el uso terapéutico del compuesto A solo, se presentó una solicitud PCT, entre otras, cuyo tema es el uso terapéutico de numerosos cetoenoles cíclicos y la cual invoca prioridad de una solicitud alemana que tiene el número de solicitud DE 102010008644.4. El compuesto A es el ejemplo 1-118 en la solicitud PCT, pero no es parte de DE 102010008644.4. ;, El arte previo más cercano estructuralmente puede ser el ejemplo 1—1— a— 16 de W099/48869 el cual difiere del compuesto A sólo por un átomo de flúor faltante en el anillo fenilo externo del bifenilo El uso terapéutico del ejemplo 1—1— a— 16 de W099/48869 también forma parte del tema de DE 102010008644.4 y la solicitud PCT que invoca prioridad de DE 102010008644.4 (ejemp|o;1-2)jj Sin embargo, el arte previo estructuralmente más cercano también puede ser el ejemplo I— 1— a— 31 de WO03/059065 el cual difiere del compuesto A en que un átomo de flúor en el anillo fenilo más externo del bifenilo está reemplazado por un átomo de cloro. El uso terapéutico del ejemplo 1—1— a— 31 de WO03/059065 también forma parte del tema de DE102010008644.4 y la solicitud ; PpT, que invoca prioridad de DE 102010008644.4 (ejemplo 1-81 ).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En base a este arte previo, un objetivo de la presente invención fue proveer una iestructura particularmente eficaz para la terapia de trastornos.

La estructura de acuerdo a la invención debería ser adecuada en particular para la profilaxis y terapia de trastornos tumorales y tener ventajas en comparación con las estructuras conocidas del arte previo.

Sorprendentemente, en la actualidad se ha encontrado que el compuesto A es particularmente adecuado para la terapia de trastornos. , ., La invención particularmente se refiere a (5s,8s)-3-(4'-clorc— 3'— fluoro— 4— metilbifenil— 3— il)— 4— hidroxi-8-metoxi-1-azaesp¡ro[4.5]dec-3— en-2-ona para propósitos terapéuticos, a composiciones farmacéuticas y a su uso en terapia, en particular para la profilaxis y terapia de enfermedades tumorales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que muestra la expresión de ACC1 en tejido tumoral y el correspondiente tejido normal i ' 1 : tejido sano de mama (2 muestras) 2: tejido tumoral de mama (26 muestras) ' ' ! " :' 3: tejido sano de colon (30 muestras) ·· 4: tejido tumoral de colon (71 muestras) ;; 5: tejido sano de pulmón (27 muestras) ; 6: tejido tumoral de pulmón (40 muestras) :· 7: tejido sano de páncreas (22 muestras) j ¡ " ¡j La Figura 2 es una gráfica que muestra la eficacia terapéutica del ejemplo comparativo C.1 en el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MCF-7 dependiente de hormona. ¡ ¡¡ La Figura 3 es una gráfica que muestra la eficacia terapéutica del compuesto A en el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MCF-7 dependiente de hormona.

La Figura 4 es una gráfica que muestra la curva de liberación del compuesto A de los comprimidos DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente, fue impredecible si las estructuras conocidas como insecticidas o herbicidas, y cuáles, podrían alcanzar el objetivo de la invención con el mayor efecto, es decir proveer una estructura que se puede usar con el mayor efecto en la terapia trastornos en humanos.

El compuesto A tiene datos de inhibición de enzima comparables al ejemplo I— 1— a— 16 de W099/48869 que puede ser considerado como el arte previo estructuralmente más cercano. Sin embargo, sorprendentemente, el compuesto A se distingue por una ventana terapéutica más amplia en el modelo de xenoinjerto MCF7 que este arte previo, que es ineficaz en este modelo a dosis toleradas.

El compuesto A tiene mejores datos de inhibición de enzima que el ejemplo l-1^-a-31 de WO03/059065 que igualmente se puede considerar como el arte previo estructuralmente más cercano.

Del gran grupo de los cetoenoles cíclicos conocidos como insecticidas, fungicidás o herbicidas, el compuesto A es, sorprendentemente distinguido por mejor inhibición enzimática y/o mejor eficacia in vivo a dosis toleradas.

La presente invención asimismo abarca el uso de sales fisiológicamente aceptables del compuesto A. ' Las sales fisiológicamente aceptables del compuesto A también incluyen sales :;de bases convencionales, tales como, a modo de ejemplo y preferentemente, sales de metales alcalinos (por ejemplo sales de sodio y potasio), sales de metales alcalino térreos (por ejemplo sales de calcio y magnesio) y sales de amonio derivadas de amoníaco o aminas orgánicas que tienen entre 1 y 16 átomos de C, tales como, a modo de ejemplo preferentemente, etilamina, dietilamina, trietilamina, etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclohexilamina; dlmetilami-noetanol, pro-caína, dibencilamina, /V-metilmorfolino, arginina, lisina, etilenediamina y V— metiipiperidina. i i .: La presente invención además provee medicamentos que comprenden el compuesto A y al menos uno o más compuestos activos, en particular para la profilaxis y/o terapia de trastornos1 tumorales.

El compuesto A puede actuar sistémicamente y/o localmente. Para este propósito, sje pueden administrar de un modo adecuado, tal como, por ejemplo, por vía oral, parenteral, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, rectal, dérmica, transdérmica, conjuntival, ótica, o como un implante o dispositivo intraluminal de arterias.

Para estas rutas de administración, el compuesto A puede ser administrado en formas de administración adecuadas. ! " Las formas de administración adecuadas para administración oral que funcionan de acuerdo al arte previo, que liberan compuesto A rápidamente y/o en forma modificada y que comprende compuesto A en forma cristalino y/o amorfa y/o disuelta, tal como, por ejemplo, comprimidos (comprimidos no recubiertos o recubiertos, por ejemplo recubiertos con recubrimientos entéricos, de disolución lenta o insolubles que controlan la liberación del compuesto de acuerdo a la invención), compriijiidps que se descomponen rápidamente en la cavidad oral o películas/obleas, películas/liofilizados; cápsulas (por ejemplo cápsulas de gelatina dura o cápsulas de gelatina blanda), comprimidos recubiertos con azúcar, gránulos, pellets, polvos, emulsiones, suspensiones, aerosoles o soluciones. La : administración parenteral puede tener lugar con elusión de un paso de absorción (por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intraespinal o intralumbar) o con participación de una absorción (por ejemplo intramuscular, subcutánea, intracutánea, percutánea o intraperitoneal). Para la administración parenteral, las formas de administración adecuada son, entre otras, preparaciones para inyección e infusión en la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, liofilizados o polvos estériles. ;; Para otras rutas de administración son adecuadas, por ejemplo, formas farmacéuticas para inhalación (entre otros inhaladores de polvos, nebulizadores), gotas nasales, soluciones nasales, aerosoles nasales; comprimidos, películas/obleas o cápsulas para ser aplicadas lingualmente, sublin-gualmente o bucalmente, supositorios, preparaciones para ojo u oído, cápsulas vaginales, suspensiones acuosas (lociones, lociones para agitar), suspensiones lipofílica, ungüentos, cremas, ¦ sistemas terapéuticos transdérmicos (tal como, por ejemplo, parches), leche, pastas, espumas, polvos para espolvorear, implantes o dispositivos intraluminales para arterias.

El compuesto A se puede convertir en las formas de administración mencionadas. Esto.se realiza de un modo conocido per se por mezcla con auxiliares no tóxicos, farmacéuticamente aceptables. Estos j ¡i auxiliares incluyen, entre otros, vehículos (por ejemplo celulosa microcristalina, lactosa,'' manitol), solventes (por ejemplo polietilenglicoles líquidos), emulsificantes y dispersantes o agentes humectantes (por ejemplo dodecilsulfato de sodio, oleato de polioxisorbitan), aglutinantes (por ejemplo polivinilpirrolidona), polímeros sintéticos y naturales (por ejemplo albúmina), estabilizantes (por ejemplo antioxidantes tales como, por ejemplo, ácido ascórbico), colorantes (por ejemplo pigmentois, inorgánicos tales como, por ejemplo, óxidos de hierro) y correctivos de sabor y/u olor.

La presente invención además provee medicamentos que comprenden el compuesto A, usualménte junto con uno o más auxiliares inertes no tóxicos, farmacéuticamente adecuados, y sus usos para los propósitos mencionados anteriormente. ! ' ? " !¡ La formulación del compuesto A para dar productos farmacéuticos tiene lugar ¡ dej; un modo conocido per se por conversión del o los ingredientes activos con los excipientes convencionales en la tecnología farmacéutica en la forma de administración deseada. ! ; i : ¡j Los excipientes que pueden ser empleados en este sentido son, por ejemplo, 'sustancias vehículo, rellenos, desintegrantes, aglutinantes, humectantes, lubricantes, absorbentes y¡ adsorbentes, diluyentes, solventes, cosolventes, emulsificantes, solubilizantes, saborizantes enmascaradores, colorantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, sales para alterar la presión osmótica o soluciones amortiguadoras.

En este sentido se debe hacer referencia a Remington's Pharmaceutical Science, 15ta ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980).

Las formulaciones farmacéuticas pueden estar en forma sólida, p.ej. como comprimidos, comprimidos recubiertos, pildoras, supositorios, cápsulas, sistemas transdérmicos o en forma semisólida, por ejemplo como ungüentos, cremas, geles, supositorios, emulsiones o en forma líquida, por ejemplo como soluciones, tinturas, suspensiones o emulsiones. . . : ,; Los excipientes en el contexto de la invención pueden ser, p.ej., sales, sacáridós (mpno-, di-, tri-, oligo-, y/o polisacáridos), proteínas, aminoácidos, péptidos, grasas, ceras, aceites, hidrocarburos y derivados de los mismos, en donde los excipientes pueden ser de origen natural o pueden ser. obtenidos por síntesis o síntesis parcial.

Para la administración oral o peroral son adecuadas en particular los comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, pastillas, suspensiones, emulsiones o soluciones. Para la administración parenteral en particular son adecuadas suspensiones, emulsiones y especialmente las soluciones. ', ". : i' La presente invención se relaciona con el uso del compuesto A para la profilaxis y ¡terapia de trastornos humanos, en particular de trastornos tumorales. ¡i El compuesto A se puede usar en particular para inhibir o reducir la proliferación celular y/o división celular y/o para inducir apoptosis. i! El compuesto A es adecuado en particular para la profilaxis y/o terapia, de ^trastornos hiperproliferativos tales como, por ejemplo, |j - psoriasis, - queloides y otras hiperplasias de la piel, - hiperplasias benignas de próstata (BPH), - tumores sólidos y [[ - tumores hematológicos.

Los tumores sólidos que pueden ser tratados de acuerdo con la invención son, por' ejemplo", tumores de mama, del tracto respiratorio, el cerebro, de los órganos reproductivos, del tracto gastrointestinal, del tracto urogenital, del ojo, del hígado, de la piel, de la cabeza y del cuello, de la glándula tiroides, de la glándula paratiroides, de los huesos y del tejido conectivo y metástasis de estos tumores.

Los tumores hematológicos que pueden ser tratados son, por ejemplo, - mielomas múltiples, - linfomas o - leucemias. ¡ Los tumores de mama que pueden ser tratados son, por ejemplo: > < - carcinomas de mama con estado positivo de receptor de hormona - carcinomas de mama estado negativo de receptor de hormona : 1 ! " - carcinomas de mama Her-2 positivos - carcinomas de mama negativos para receptor de hormona y Her-2 1 1 j - carcinomas de mama asociados a BRCA - carcinomas de mama inflamatorios. i ;, Los tumores del tracto respiratorio que pueden ser tratados son, por ejemplo, - carcinomas bronquiales de células no pequeñas y ¦ ' 1 'i - carcinomas bronquiales de células pequeñas. . . ', '·.

Los tumores de cerebro' que pueden ser tratados son, por ejemplo, - gliomas, - glioblastomas, | - - astrocitomas, - meningiomas y - meduloblastomas. ' ¡ Los tumores de los órganos reproductores masculinos que pueden ser tratados son, por ejemplo: - carcinomas de próstata, - tumores testiculares malignos y - carcinomas de pene. " Los tumores de los órganos reproductores femeninos que pueden ser tratados son, porejemplo: - carcinomas endometriales - carcinomas de cérvix ;, - carcinomas de ovario !¡ - carcinomas vaginales " - carcinomas vulvares ? i Los tumores del tracto gastrointestinal que pueden ser tratados son, por ejemplo: • ¦ í H - carcinomas colorrectales ' ' ! I " !! - carcinomas anales - carcinomas de estómago JJ - carcinomas de páncreas : : j 1 :: - carcinomas de esófago ü - carcinomas de vesícula biliar ! - carcinomas del intestino delgado : ? i i ¡i - carcinomas de glándulas salivales ; :; - tumores neuroendocrinos - tumores de estroma gastrointestinal ' : ? ;i Los tumores del tracto urogenital que pueden ser tratados son, por ejemplo: - carcinoma de vejiga urinaria - carcinoma de células renales - carcinomas de la pelvis renal y tracto urinario inferior Los tumores de ojo que pueden ser tratados son, por ejemplo: - retinoblastomas - melanomas intraoculares Los tumores de hígado que pueden ser tratados son, por ejemplo: - carcinomas hepatocelulares - carcinomas colangiocelulares Los tumores de la piel que pueden ser tratados son, por ejemplo: - melanomas malignos - basaliomas - espinaliomas - sarcomas de Kaposi - carcinomas de células de Merkel Los tumores de la cabeza y cuello que pueden ser tratados son, por ejemplo: - carcinomas de laringe - carcinomas de la faringe y la cavidad oral Los sarcomas que pueden ser tratados son, por ejemplo: - sarcomas de tejidos blandos - osteosarcomas Los linfomas que pueden ser tratados son, por ejemplo: - linfomas de no Hodgkin - linfomas de Hodgkin - linfomas cutáneos - linfomas del sistema nervioso central - linfomas asociados con SIDA Las leucemias que pueden ser tratadas son, por ejemplo: - leucemias mieloides agudas - leucemias mieloides crónicas - leucemias linfáticas agudas - leucemias linfáticas crónicas - leucemias de células pilosas Ventajosamente, el compuesto A se puede usar para la profilaxis y/o terapia de: carcinomas de mama, en particular negativos para receptor de hormona, positivos para receptor de hormona o carcinomas de mama asociados a BRCA, y también carcinomas de páncreas, ca homas de células renales, carcinomas de hepatocelulares, melanomas malignos y otros tumores de piel, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata.

En particular ventajosamente, el compuesto A puede ser usado para la profilaxis y/o terapia de: carcinomas de mama, en particular negativos para receptor de hormona y positivos para receptor de hormona, y también carcinomas de páncreas, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata.

Estos trastornos están bien caracterizados en el hombre, pero también existen' en otros mamíferos.

La presente solicitud además provee el compuesto A para uso como un medicamento en particular para la profilaxis y/o terapia de trastornos tumorales.

La presente solicitud además provee compuesto A para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, carcinomas de páncreas, carcinomas de células renales, carcinomas hepatocelulares, melanomas malignos y otros tumores de piel, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, i carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago o carcinomas de' próstata.

: '· La presente solicitud ventajosamente provee el compuesto A para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, en particular negativos para receptor de hormona y positivos para receptor de hormona, y también carcinomas de páncreas, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata.

: ; :: La invención además provee el uso del compuesto A para preparar un medicamento.

La presente solicitud además provee el uso del compuesto para preparar un medicamento para la profilaxis y/o terapia de trastornos tumorales.

. ; ; ., ;: La presente solicitud además provee el uso del compuesto A para preparar un medicamento para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, carcinomas de páncreas, carcinomas de células renales, carcinomas hepatocelulares, melanomas malignos y otros tumores de piel, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago o carcinomas de próstata. ; La presente solicitud ventajosamente provee el uso del compuesto A para preparar un medicamento para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, en particular negativos para receptor de hormona y positivos para receptor de hormona, y también carcinomas de páncreas,, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata.

La presente solicitud además provee el uso del compuesto para la profilaxis y/o ¡terapia de trastornos tumorales. ; ; :¡ La presente solicitud además provee el uso del compuesto A para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, carcinomas de páncreas, carcinomas de células renales, carcinomas hepatocelulares, melanomas malignos y otros tumores de piel, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago o carcinomas de próstata.

La presente solicitud ventajosamente provee el uso del compuesto A para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, en particular negativos para receptor de hormona y positivos para receptor de hormona, y también carcinomas de páncreas, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata.

La presente solicitud además provee formulaciones farmacéuticas en la forma de comprimidos que comprenden compuesto A para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, carcinomas de páncreas, carcinomas de células renales, carcinomas hepatocelulares, melanomas malignos y otros tumores de piel, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago o carcinomas de próstata. . „ La presente solicitud ventajosamente provee formulaciones farmacéuticas en la forma de comprimidos que comprenden compuesto A para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, en particular negativos para receptor de hormona y positivos para receptor de hormona, y también carcinomas de páncreas, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata.

La invención además provee el uso del compuesto A para tratar trastornos asócjados con procesos proliferativos.

El compuesto A puede ser empleado ellos solos o, si se requiere, en combinación cón iüno o más de otras sustancias farmacológicamente activas, siempre y cuando esta combinación no lleve a efectos secundarios no deseados e inaceptables. En consecuencia, la presenté invención ademas provee medicamentos que comprenden compuesto A y uno o más de otros compuestos activos; en particular para la profilaxis y/o terapia de las enfermedades mencionadas anteriormente.

Por ejemplo, el compuesto A puede ser combinado con sustancias antihiperproNferativas, citostáticas o citotóxicas conocidas para el tratamiento de trastornos de cáncer. En particular sé indica la combinación del compuesto A con otras sustancias convencionales para la terapia de cáncer o bien con radioterapia. ' ; Los compuestos activos adecuados para combinaciones que se pueden mencionar a modo de ejemplo son: afinitor, aldesleuquina, ácido alendrónico, alfaferona, alitretinoína, alopurinol, aloph'm, aloxi, altretamina, aminoglutetimida, amifostina, amrubicina, amsacrina, anastrozol, anzmet, ' aranesp, arglabina, trióxido de arsénico, aromasina, 5-azacitidina, azatioprina, BCG o tice-BCG, bestatina, acetato de betametasona, fosfato sódico de betametasona, bexaroteno, sulfato dé bleomicina, broxuridina, bortezomib, busulfán, calcitonina, campath, capecitabina, carboplatino, casodex, :!cefesona, celmoleuquina, cerubidina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, ácido clodrónico, cic ofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunoxoma, decadrón, fosfato de decadrón, délestrógeno, denileuquina diftitox, depomedrol, deslorelina, dexrazoxana, dietilstilbestrol, diflucan, docetaxel, doxifluridina, doxorubicina, dronabinol, DW-166HC, eligard, elitek, ellence, emend, epirubicina. epoetina-alfa, epogén, eptaplatino, ergamisol, estrace, estradiol, fosfato sódico de estramustina, etinilestradiol, etiol, ácido etidrónico, etopofos, etopósido, fadrozol, farstone, filgrastim, finasterida, fligrastim, floxuridina, fluconazol, fludarabina, monofosfato de 5-fluorodeoxiuridina, 5-fluoruracilo (5-FU), flupxirfiesterona, flutamida, formestano, fosteabina, fotemustina, fulvestrant, gammagard, gemcitabina:, geijituzumab, gleevec, gliadel, goserelina, clorhidrato de granisetrón, histrelina, hicamtina, hidrocortona etitrohidroxino-niladenina, hidroxiurea, ibritumomab tiuxetán, idarubicina, ifosfamida, interferón alfa, iriterferón-alfa 2, interferón alfa-2a, interferón alfa— 2ß, interferón alfa-n1 , interferón alfa-n3, interferón beta, ; interferón gamma-1a, interleuquina-2, Intron A, Iressa, irinotecán, Kytril, sulfato de lentinano, létrozbj.-lépcovorina, leuprolida, acetato de leuprolida, levamisol, sal de calcio del ácido levofolínico, Levothroid, Levoxyl, lomustina, lonidamina, Marinol, mecloretamina, mecobalamina, acetato de medroxiprogestérona, acetato de megestrol, melfalán, Menest, 6-mercaptopurina, Mesna, metotrexato, Metvix, miltefósiná, rninociclina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, Modrenal, Myocet, nedaplatino, Neulasta, Neumega; .Neupogen, nilutamida, Nolvadex, NSC-631570, OCT-43, octreotida, clorhidrato de ondansetrón, Orapred, oxaliplatino, paclitaxel, pediapred, pegaspargasa, Pegasys, pentostatina, Picibanil; clorhidrato de pilocarpina, pirarubicina, plicamicina, porfimero de sodio, prednimustina, prednisolpna, , pr dnisona, Premarin, procarbazina, Procrit, raltitrexed, RDEA1 19, rebif, etidronato de renio 186, rituximab^Roferon-A, romurtida, Salagen, sandostatina, sargramostim, semustina, sizofirano, sobuzoxano, solumedrol, estreptozocina, cloruro de estroncio 89, Synthroid, tamoxifeno, tamsulosina, tasonermina, tastolactona, Taxotere, teceleuquina, temozolomida, tenipósido, propionato de testosterona, Testred, tioguanina, tiotepa, tirotropina, ácido tiludrónico, topotecán, toremifeno, tositumomab, trastuzumab, tréosulfano, tretinoína, Trexall, trimetilmelamina, trimetrexato, acetato de triptorelina, pamoato de triptórelina, UFT, uridina, valrubicina, vesnarinona, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, Virulizín, ÍÍZinecard, zinostatina estimaláméro, Zofran, ABI-007, acolbifeno, Actimmune, Affinitak, aminopteríná, arzoxifeno, asoprisnil, atamestano, atrasentano, BAY 43-9006 (sorafenib), avastina, CCI-779, CDC-501 ,;;Celebrex, cetuximab, crisnatol, acetato de ciproterona, decitabina, DN-101 , doxorubicina^MTiQ; dSLIM, dutasterida, edotecarina, eflomitina, exatecan, fenretinida, diclorhidrato de histamina, implante de hidrogel de histrelina, holmic— 1 ,66 DOT P, ácido ibandrónico, interferón gamma, Infron-PEG, ixabepilona, hemocianina de lapa bocallave, L-651582, lanreotida, lasofoxifeno, Libra, lonafarnib, miproxifeno, minodronato, MS-209, MTP-PE liposómico, MX-6, nafarelina, nemorubicina, Ñeovastat, nolatrexed, oblimerseno, onco-TCS, Osidem, poliglutamato de paclitaxel, pamidronato de; disodio, PN-401 , QS-21 , quazepam, R-1549, raloxifeno, ranpirnasa, ácido 13-cis-retinoico, satrapiatino, seocalcitol, T-138067, Tarceva, Taxoprexin, timosina alfa 1 , tiazofurina, tipifarnib, tirapazamina, :'TLK-286, toremifeno, TransMID-107R, valspodar, vapreotida, vatalanib, verteporfina, vinfluniná, Z-100, ácido zoledrónico y combinaciones de estos.

En una forma de realización preferida, el compuesto A puede ser combinado con agentes antihiperproliferativos, los cuales pueden ser, a modo de ejemplo - sin que esta lista sea conclüyente: aminoglutetimida, L-asparaginasa, azatioprina, 5-azacitidina, bleomicina, busulfánó, ' cárboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, colaspasa, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dietilstilbestrol, 2',2'-difluorodeoxicitid¡na, docetaxel, doxorubicina ¡ (adriamicina), epirubicina, epotilona y sus derivados, eritrohidroxinonil adenina, etinilestradiol, etopósido, .fosfato de fludarabina, 5-fluorodesoxiuridina,. monofosfato de 5-fluorodesoxiuridina, 5-fluorouracilo, fluoxomesterona, flutamida, hexametilmelamina, hidroxiurea, caproato de hidroxiprogesterona, idarubicina, ifosfamida, interferón, irinotecan, leucovorin, lomustina, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán, 6-mercaptopur¡na, mesna, metotrexato, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, paclitaxel, pentostatino, /V-fosfonoacetil-L-aspartato (PALA), plicamicina, prednisolona, prednisona, procarbazina, raloxifeno, semustina, estreptozociria, tamoxifeno, tenipósido, propionato de testosterona, tioguanina, tiotepa, topotecan, trimetilmelamina, uridina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorrelbina.

El compuesto A también puede ser combinado de un modo muy prometedor con terapéuticos biológicos, tal como anticuerpos (por ejemplo avastin, rituxan, erbitux, herceptih) y proteínas recombinantes.

El compuesto A también puede provocar efectos positivos en combinación con otras terapias dirigidas contra angiogénesis, tal como, por ejemplo, con avastin, axitinib, regorafenib, recentín, sorafenib o sunitinib. Las combinaciones con inhibidores del proteasoma y de mTOR e inhibidores de enzima metabólica esteroidea son particularmente adecuadas debido a su perfil favorable de efectos secundarios.

En general, se pueden buscar los siguientes objetivos con la combinación del compuesto A con otros agentes que tienen una acción citostática o citotóxica: • una actividad mejorada para reducir la velocidad de crecimiento de un tumor, reducir su tamaño o incluso su completa eliminación en comparación con tratamiento con un compuesto activó individual; • la posibilidad de emplear los agentes quimioterapéuticos usados en una dosificación menor que en una monoterapia; • la posibilidad de una terapia más tolerable con pocos efectos secundarios en comparación con una administración individual; • la posibilidad de tratamiento de un espectro más amplio de enfermedades tumorales; • logro de una mayor velocidad de respuesta a la terapia; • un tiempo de sobrevida más largo del paciente en comparación con la terapia estándar actual.

El compuesto A además puede ser empleado en combinación con radioterapia y/o intervención quirúrgica.

Parte experimental 1. Ejemplos comparativos La tabla V muestra el ejemplo l-1-a-16 de W099/488691 y ejemplo 1—1— a— 31 de WO03/059065, en donde el solicitante considera que es el arte previo más cercano.

Tabla V Métodos de LC-MS v HPLC Método 1 (UPLC-MS) Instrumento: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001 ; columna: Acquity UPLC BEH C18::1 ,7 50x2, 1 mm; fase móvil A: agua + ácido fórmico 0, 1 %, fase móvil B: acetonitrilo; gradiente: entre 0 y 1,6 minutos entre 1 y 99% de B, entre 1 ,6 y 2,0 minutos 99% de B; velocidad de flujo 0,8 ml/min; temperatura: 60 °C, inyección: 2 µ?; barrido de DAD: entre 210 y 400 nm.

Método 2 (UPLC-MS) Instrumento: Waters Acquity UPLC-MS ZQ4000; columna: Acquity UPLC BEH C18 1 ,7 50x2, 1 mm; fase móvil A: agua + ácido fórmico 0,05%, fase móvil B: acetonitrilo + ácido fórmico 0,05%; gradiente: entre 0 y 1 ,6 minutos entre 1 y 99% de B, entre 1 ,6 y 2,0 minutos 99% de B; velocidad de flujo 0,8 ml/min; temperatura: 60 °C; inyección: 2 µ?; barrido de DAD: entre 210 y 400 nm.

Método 3 (UPLC-MS): Instrumento: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001 ; columna: Acquity UPLC BEH C18 í',7 50x2, 1 mm; fase móvil A: agua + ácido fórmico 0, 1 %, fase móvil B: acetonitrilo; gradiente: entre 0 y 1 j6 minutos entre 1 y 99% de B, entre 1 ,6 y 2,0 minutos 99% de B; velocidad de flujo 0,8 ml/min; temperatura: 60 °C; inyección: 2 µ?; barrido de DAD: entre 210 y 400 nm. i ;'! Preparación de intermediario de Ejemplo C.1. a) comparativo Intermediario C.1.1 Se disolvieron 5,00 g (19, 18 mmol) de ácido (4'-cloro-4-metilbifenil-3-il)acético (EP 2029531 A1 y US 2009/298828 A1 ) en 36,51 g (306,84 mmol) de cloruro de tionilo. La mezcla de reacción se agitó a 80°C durante cuatro horas y luego se concentró bajo presión reducida. El secado bajó delicado vacío dio 5,4 g (100% de teórico) del compuesto del título como un aceite amarronado.

H-RMN (300MHz, CDCI3): d [ppm] = 2,36 (s, 3H), 4,22 (s, 2H), 7,29 (d, 1 H), 7,35 - 7,55 (m, 6H).

Intermediario C.1.2 Met¡l-cis-1^[(4'-clorc^-metilbifenil-3-il)acet¡l]am¡no}^-metox¡c¡clohexanocarboxilato A temperatura ambiente, se disolvieron 5,41 g (24,2 mmol) de clorhidrato de metil-cis-1-amino-4-metoxiciclohexanocarboxilato (EP 1791816 A1 y WO 2006/29799 A1 ), 14,8 mg (1 ,21 mmóí) ;de DMAP y 8,4 mi (60,5 mmol) de trietilamina, bajo nitrógeno, en 118 mi de diclorometano. Luego se agregó por goteo una solución de 6,75 g (24,2 mmol) de intermediario C.1.1 en 60 mi de diclorometano. La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Para el aislamiento y purificación, la mezcla se diluyó con diclorometano y se lavó la fase orgánica con solución de bicarbonato de sodio saturado y ácido cítrico 5% de concentración acuoso. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio y luego se filtró y se concentró. Esto dio 10,9 g del compuesto del título que se purificaron adicionalmente por cromatografía sobre gel de sílice (fase móvil: gradiente hexano/acetato de etilo). 1H-RMN (300MHz, DMSO-d6): d [ppm] = 1 ,31-1 ,47 (m, 2H), 1 ,60-1 ,73 (m, 2H), 1 ,75-1 ,86 (m, 2H), 2,00-2, 1 1 (m, 2H), 2,27 (s, 3H), 3,09-3,20 (m, 1 H), 3,21 (s, 3H), 3,51 (s, 3H), (d, 1 H), 7,43 (dd, 1 H), 7,46-7,54 (m, 3H), 7,61-7,68 (m, 2H), 8,31 (s, 1 H).

LC-MS (método 1 ): Rt = 1 ,38 minutos; MS (ESlpos): m/z = 430 [M+H]+. : ¡ ¡! b) Producto final C.1 (5s,8s)-3-(4'-cloro^-metilbifenil-3-il)-4-hidroxi-8-metoxi-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-óna A temperatura ambiente y bajo nitrógeno, se agregaron 4,63 g (41 ,3 mmol); de tert-butóxido potasio a 8,87 g (20,6 mmol) de intermediario C.1.2 en 103 mi de A/,A/-dimetilformamida. La mezcla de reacción se agitó a 80°C durante 60 minutos. Para el aislamiento y purificación, la mezcla dé reacción enfriada se vertió en 1 litro de agua helada, se ajustó el pH 3 usando solución de cloruró de hidrógeno acuoso 1 N y se agitó durante tres horas, y el precipitado se filtró con succión, se lavó con agua y se secó. El producto en crudo se purificó adicionalmente por agitación con éter dietílico durante: la noche, filtración y secado. Esto dio 7,75 g (95% del teórico) del título del compuesto. 1H-RMN (300MHz, DMSO-d6): d [ppm] = 1 ,39-1 ,62 (m, 411 ), 1 ,84-2,05 (m, 411 ), 2, 18 (s, 3¾ 1 ), 3,07-3,20 (m, 111 ), 3,26 (s, 31 1 ), 7,30 (d, 1 11 ), 7,34 (d, 1 11 ), 7,45-7,53 (m, 311 ), 7,62-7,68 (m, 21 1 ), 8, 18 (br. s, 111 ), 10,82 (br. s, 1 1 1 ). ; LC-MS (método 3): Rt = 1 , 19 min; MS (ESlpos): m/z = 398 [M+H]+.

Ejemplo comparativo C.2 El ejemplo comparativo C.2 es el ejemplo l-1-a— 31 de WO03/059065.

El uso terapéutico del ejemplo 1—1— a— 31 de WO03/059065 también forma parte del tema de DE 102010008644.4 y la solicitud PCT que invoca prioridad de DE 102010008644.4 (Ejemplo 1^8 ). 2. Compuesto A Preparación de Compuesto A a) Intermediarios Intermediario A.1 Ácido (4'— cloro— 3'— fluoro-4-metilbifenil-3— il)acético Bajo argón, se agregaron 33,5 g (192 mmol) de ácido (4-cloro-3-fluorofenil)boróriico a una solución de 40,0 g (175 mmol) de ácido (5-bromo-2-metilfenil)acético (EP 1791816 y WO 2006/29799) en una mezcla de 437 mi (437 mmol) de solución de hidróxido de sodio 1 acuoso desgaseado, 160 mi de agua desgaseada y 160 mi de tetrahidrofurano desgaseado. La mezcla se agitó durante 10 minutos, se agregaron 507 mg (1 ,75 mmol) de tetrafluoroborato de tri— tert— butilfosfonio y se agregaron 532 mg (1 ,75 mmol) de acetilacetonato de paladio(ll) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Luego se agregaron tolueno y agua, el pH se ajustó a entre 1 y 2 usando solución concentrada de cloruro de hidrógeno acuoso 1 N, la mezcla se agitó durante 10 minutos, se separaron las cases, se extrajo la fase acuosa dos veces con tolueno y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron. El residuo se agitó en 300 mi de una mezcja 6/1 de n-hexano/tert-butil metil éter durante 30 minutos, se extrajo por filtración, se lavó con n-hexano„ y se secó bajo presión reducida. Esto dio 38,0 g (78% del teórico) del título del compuesto. ' 1H-RMN (300MHz, DMSO-d6): d [ppm] = 2,27 (s, 31 1 ), 3,67 (s, 211 ), 7,27 (d, 1 11 ), 7,49-7,59: (m, 311 ), 7,61-7,75 (m, 211 ), 12,4 (s, 1 11).

LC-MS (método 1 ): Rt = 1 ,31 minutos; MS (ESlneg): m/z = 277 [M+H]+.

Intermediario A.2 Metil-cis-1-{[(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)acetil]amino}--4-metoxiciclohexanocarbo Se disolvieron 10,0 g (35,9 mmol) de intermediario A.1 en 14,9 mi (205 mmol) de cloruro de tionilo. La mezcla de reacción se agitó a 90°C durante 1 hora t luego se concentró. Esto dio 10,8 g (100% del teórico) de cloruro de (4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)acetilo. Se disolvieron 10,6 g (35,7 mmol) de cloruro de (4'- cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)acetilo en 120 mi de acetonitrilo. Se tomáron 12,0 g (53,7 mmol) de clorhidrato de metil-c¡s-1-amino-4-metox¡ciclohexanocarboxilato (descripio en EP 1791816 y WO 2006/29799) en acetato de etilo, y se agregó solución saturada acuosa de bicarbonato de sodio. Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa dos veces con acetato de etilo. ;Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron. Esto dio 8,50 g de metil-cis-1-amino-4-metox¡ciclohexanocarbox¡lato. Se agregaron 17,3 g (125 mmol) de'carbonato de potasio a 8,02 g (42,8 mmol) de metil-cis-1-amino-4-metoxiciclohexanocarboxilato en ¡120 mi de acetonitrilo. Con enfriamiento con hielo, se agregó la solución del cloruro ácido por goteo y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Luego se concentró la mezcla, se ágreg'ó agua al residuo, se extrajo la mezcla con diclorometano y las fases orgánicas combinadas se layaron con solución de cloruro de hidrógeno acuoso 1N y solución saturada acuosa de bicarbonato de í sodio, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. Esto dio 15,7 g (98% del teórico) del compuesto del título que se hizo reaccionar sin purificación adicional. :: H-RMN (300MHz, DMSO-d6): d [ppm] = 1,30-1,47 (m, 211), 1,60-1,74 (m, 211), 1,75-1,85 (m, 211), 1,99-2,11 (m, 211), 2,28 (s, 311), 3,09-3,20 (m, 111), 3,21 (s, 311), 3,52 (s, 311), 3,58 (s, 211), 7,24 (d, 111), 7,46-7,55 (m, 211), 7,57 (d, 111), 7,61-7,72 (m, 211), 8,30 (s, 111). ¡, LC-MS (método 2): Rt = 1 ,36 minutos; MS (ESlpos): m/z = 448 [M+H]+. b) Producto final compuesto A (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fiuoro-4-metilbifen¡l-3-¡l)-4-htá^ Bajo nitrógeno, se agregaron 4,32 g (38,5 mmol) de tert-butóxido de potasio a 15¡7 g (35,0 mmol) de intermediario A.2 en 60 mi de A/,A/-dimetilformamida. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego se agregó la mezcla de reacción a agua elada, se agregaron por goteo 160 mi de solución de cloruro de hidrógeno acuoso 1 N, la mezcla se agitó durante 30 minutos y el precipitado se quitó por filtración con succión, se lavó con agua y se secó. Estojdio 14,2 g (97% del teórico) del título del compuesto. ii 1H-RMN (300MHz, DMSO-d6): d [ppm] = 1,40-1,62 (m, 411), 1,85-2,04 (m, 411), 2,19 (s, 3^1), 3,07- ! ¡I 3,20 (m, 111), 3,27 (s, 311), 7,31 (d, 111), 7,39 (d, 111), 7,48-7,57 (m, 211), 7,60-7,73 (m, 21 jf), 8,20 (s, 111), 10,82 (s, 111). ii LC-MS (método 1): Rt = 1,22 minutos; MS (ESlpos): m/z = 416 [M+H]+ " 3. Ensayos Ensayo de enzima ACC1 Humana Los datos de inhibición de ACC1 se obtuvieron usando dos ensayos diferentes (Al y Bl).

Ensayo A1 (=(A1 )) Se midió la actividad inhibitoria de las sustancias de esta invención respectó a a'cetil-CoA ! ' ' i¡ carboxilasa 1 (ACC 1 ) usando el ensayo de ACC1 descripto en los siguientes párrafos.' E principio básico del ensayo es la medición de adenosin difosfato (ADP), que se forma comp junij producto secundario, por medio de un inmunoensayo competitivo basado en HTRF® (HTRF = Fluórésdéncia con resolución temporal homogénea). ;! ; ¡ ! .: ¡i La enzima usada fue ACC1 humana recombinante marcada con FLAG en el extremo C terminal (no. de acceso al GenBank NM_198834, aminoácidos 39 - final), expresada en célülak' dé insecto ¦ ' i ! ' !l transfectadas con baculovirus (Hi5) y purificadas por cromatografía de afinidad sobre gel dé afinidad Anti-FLAG®M2 (Sigma-Aldrich). Como alternativa, es posible usar ACC1 marcada con H¡s erji ) extremo C terminal comercial de BPS Bioscience (San Diego, CA, no. de catálogo 50200, aminoácidos 3¡9 - final). Para el ensayo, se pipetearon 50 ni de una solución concentrada 100 veces en DMSO en una placa para microtitulación de 38 pocilios de bajo volumen Frickenhausen, Alemania), se agregaron 2 µ? de una solución de ACC 1 en solución amortiguadora de ensayo [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 12 mM bicarbonato de sodio, 2 mM MgCI2, ;2 ¡ rrÍM ¡jcitrato de potasio, 0,005% (peso en volumen) albúmina sérica bovina (BSA)] y la mezcla se incubo durante 15 minutos para permitir la preunión de las sustancias a la enzima antes de la reacción enzimática luego se inició por el agregado de 3 µ? de una solución de 83,5 µ? => la concentración final en 5 µ? de volumen de ensayo es 50 µ?, AmersHam f^harmacia • : ! \ t Biotech # 27-2056-01 ) y acetil-CoA (33,4 µ? => la concentración final en 5 µ? de volumen cíe ensayo es 20 µ?, Roche Bioscience #10101893001 ) en solución amortiguadora de ensayo, y la se incubó a 22 °C durante un tiempo de reacción de 20 minutos. La concentración de a la actividad respectiva de la enzima y se ajustó de modo que el ensayo se llevó a l lineal. Las concentraciones típicas estuvieron en el rango de 2,5 ng/µ?. : | : !; La reacción se detuvo por agregado sucesivo de 2,5 µ? de una solución de ADP marcado d2 (conjunto de componentes HTRF® Tránsscreener™ ADP, Cis biointernational, Marcoulej Francia) en solución amortiguadora de detección conteniendo EDTA HTRF Tránsscreener ADP (pontehida en el conjunto de componentes HTRF® Transscreener™ ADP, 50 mM HEPES pH 7,0, 60 mM EQTA, 0,1% (peso en volumen) BSA, 0,02% azida sódica, 400 mM fluoruro de potasio) y 2,5 µ? de una solución de anticuerpo anti-ADP marcado con criptato de europio (conjunto de componentes1 HTRF® Transscreener™ ADP) en solución de detección HTRF® Transscreener™ ADP.

La mezcla resultante se incubó a 22 °C durante 1 hora para permitir la unión del anticuerpo anti-ADP marcado con criptato de europio al ADP formado por la reacción enzimática y el ADP marcado con d2. La cantidad de complejo de ADP marcado con d2 y anticuerpo anti-ADP marcado con criptato de europio luego se determinó por medición de transferencia de energía de resonancia de criptato de europio a d2. Para tal fin, se midieron las emisiones de fluorescencia a 620 nm y 665 nm luego de la excitación a 350 nm en un instrumento de medición de HTRF, por ejemplo un Rubystar oi Pherastar (ambos de BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemania). La relación de las emisiones a 665 nm y a 622 nm se tomaron como una medida de la cantidad del complejo de ADP marcado con d2 y anticuerpo anti-ADP marcado con criptato de europio y por lo tanto indirectamente como una medida dé la cantidad de ADP no marcado formado en la reacción enzimática (cuanto mayor la relación de las emisioh0s¡a 665 nm y a 622 nm <? más complejo de ADP marcado con d2 y anticuerpo anti-ADP marcado cón criptato de europio <? menos ADP). Los datos se normalizaron (reacción enzimática sin inhibidor = 0% de:jnhibición, todos los otros componentes de ensayo pero sin enzima = 100% de inhibición). Las sustancias de ensayo se evaluaron usualmente en las mismas placas para microtitulación a 101 concentraciones diferentes en el rango entre 20 µ? y 1 nM (20 µ?, 6,7 µ?, 2,2 µ?, 0,74 µ?, 0,25 µ?, 82 ??, 27 ??, 9,2 ??, 3,1 nM y 1 nM, las series de diluciones se prepararon antes del ensayo a partir de uiiá solución i i II concentrada 100 veces por dilución serial 1 :3) por duplicado para cada concentración, y se calcularon los valores IC50 con un ajuste de 4 parámetros usando un programa de computación interno. ;; Ensayo B1 (=(B1 )) Se midió la acción inhibitoria de hACCl de las sustancias de la presente invención en el ensayo hACC 1 descripto en los siguientes párrafos. ¦ ¡¡ Esencialmente, la actividad enzimática se midió por cuantificación de adenosin difosfato (ADP) formado como producto secundario de las reacciones enzimáticas usando el sistema de detección ADP- Glo™ de Promega. En esta prueba, inicialmente el adenosin trifosfato (ATP) no consumido en la reacción enzimática se convierte cuantitativamente con una adenilato ciclasa ( "reactivo ADP- GLO") ¡:a cAMP, luego se detiene la adenilato ciclasa y ("reactivo de detección de quinasa") el ADP formado es posteriormente convertido a ATP, que es convertido en una reacción basada en luciferasa a una señal de luminiscencia brillante.

La enzima usada fue ACC1 humana recombinante marcada con FLAG en extremó C terminal : I !! ü (variante de transcripto 1 de acetil-coenzima A carboxilasa alfa) (no. de acceso a GenBárik NMM 98834) - (aminoácidos 39 - final) expresada en células de insecto infectadas con baculovirus (Hi5) y purificada por cromatografía de afinidad con anti-FLAG. ; ! ¡ !! ; ! i .: ¡i i | II Para el ensayo, se pipetearon 50 ni de una solución concentrada 100 veces de la sustancia de ensayo en DMSO en una placa para microtitulación de 384 pocilios de bajo volumen .blancas (Greiner ii Bio-One, Frickenhausen, Alemania), se agregaron 2,5 µ? de una solución de hACG éri| solución 1 v amortiguadora de ensayo [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCI2, 2 mM citrato de potasio, 12 mM NaHC03, 2 mM ditiotreitol (DTT), 0,005% (peso en volumen) albúmina sérica bovina (BSA)] 'y:!a mezcla se incubó durante 15 minutos para permitir la preunión de las sustancias a la enzima antes de la reacción enzimática. Luego se inició la reacción enzimática por agregado de 2,5 µ? de una solución de!adenosin trifosfato (ATP, 100 µ? => concentración final en 5 µ? de volumen de ensayo: 50 µ?) : y acet¡,lrCoA (20 µ? => concentración final en 5 µ? de volumen de ensayo: 10 µ?) en solución amortiguadora dé ensayo, y la mezcla resultante se incubó a 22°C durante el tiempo de reacción de 45 minutos. La concentración de la hACC1 se adaptó a la actividad respectiva de la enzima y se ajustó de modo tal que ¡él ensayo l¡ operara en el rango lineal. Las concentraciones típicas estuvieron en el rango de 1 ,75 ng µ?'. Lg reacción se detuvo por adición de 2,5 µ? del "reactivo ADP-GLO" (diluido 1 :1 ,5 veces), y. la se incubó a 22°C durante 1 hora para convertir el ATP sin reaccionar completamente en ;AMPc.¡¡Luego se agregaron 2,5 µ? del "reactivo de detección de quinasa" (1 ,2 veces más concentrado que Ip recomendado por el fabricante), la mezcla resultante se incubó a 22°C durante 1 hora y luego se midió la luminiscencia ; ; j ; ¡i usando un instrumento de medición adecuado (Viewlux o Topcount de Perkin-Elmer ó Phérastar de i i: . i .I i BMG Labtechnologies). La cantidad de luz emitida se tomó como una medida de la cantidad de ADP formado y por lo tanto de la actividad enzimática de la hACC1. Los datos se normalizaron (reacción enzimática sin inhibidor = 0% de inhibición, todos los otros componentes de ensayo pero sin enzima = 100% de inhibición). En general, las sustancias en prueba se ensayaron en las mismas placas para microtitulación en 10 concentraciones diferentes en el rango entre 20 µ? y 1 nM (20 µ?, 6,7 µ?, 2,2 µ?, 0,74 µ?, 0,25 µ?, 82 ??, 27 ??, 9,2 ??, 3,1 nM y 1 nM, las series de dilución se prepararon; antes del ensayo a partir de una solución concentrada 100 veces por diluciones seriales 1 :3) por duplicado de cada concentración, y se calcularon los valores de IC50 con un ajuste de 4 parámetros usando un programa de computación interno.

" Ensayo enzimático de ACC2 humana Se obtuvieron los datos de inhibición de ACC2 usando dos ensayos diferentes (A2 y B2) Ensayo A2 (=(A2)) Se midió la actividad inhibitoria de las sustancias de esta invención en relación a acetil-CoA carboxilasa 2 (ACC2) usando el ensayo ACC2 descripto en los siguientes párrafos. El principió básico del ensayo es la medición de adenosin difosfato (ADP), que se forma como un producto secundario, por medio de un inmunoensayo competitivo basado en HTRF® (HTRF = fluorescencia Con rjesolución temporal homogénea). ; , ¡ ;! La enzima usada fue ACC2 marcada con His en el extremo C terminal jisponible comercialmente de BPS Bioscience (San Diego, CA, no. de catálogo 50201 , aminoácidos 39 - final, expresada en células de insecto Sf9 transfectadas con baculovirus y purificada por cromatografía de afinidad con Ni-NTA). , l¡ ' i; Para el ensayo, se pipetearon 50 ni de una solución concentrada 100 veces de la sustancia de prueba en DMSO en una placa para microtitulación de 384 pocilios de bajo volumen negra (Greiner Bio- i: One, Frickenhausen, Alemania), se agregaron 2 µ? de una solución de ACC2 en solución amortiguadora de ensayo [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 12 mM bicarbonato de sodio, 2 mM MgCI2, 2 mM citrato de lineal. Las concentraciones típicas estuvieron en el rango de 0,6 ng/µ?.

La reacción se detuvo por agregado sucesivo de 2,5 µ? de una solución de ÁDP¡ marcado d2 (conjunto de componentes HTRF Transscreener ADP, Cis biointernational, Marcduíe, ' Fijáncia) en solución amortiguadora de detección conteniendo EDTA HTRF® Transscreener™ ADP1 (contenida en el conjunto de componentes HTRF® Transscreener™ ADP, 50 mM HEPES pH 7,0, 60 mM jÉbiTA, 0, 1 % (peso en volumen) BSA, 0,02% azida sódica, 400 mM fluoruro de potasio) y 2,5 µ? de¡ una¡SG)lución de anticuerpo anti-ADP marcado con criptato de europio (conjunto de compóriéritesj HTRF® I ' Transscreener™ ADP) en solución de detección HTRF® Transscreener™ ADP. ? ? 1 íi t -. ,| La mezcla ADP marcado con d2. La cantidad de complejo de ADP marcado con d2 y anticuerpo anti-ADP marcado con criptato de europio luego se determinó por medición de transferencia de energía europio a d2. Para tal fin, se midieron las emisiones de fluorescencia a excitación a 350 nm en un instrumento de medición de HTRF, por ejemplo un Rubyjstarj p ¡Pherastar y a 622 nm <? más complejo de ADP marcado con d2 y anticuerpo anti-ADP marcado con criptato de I I [ MI M I Mi europio <? menos ADP). Los datos se normalizaron (reacción enzimática sin inhibidor = 0% de inhibición, todos los otros componentes de ensayo pero sin enzima = 100% de inhibición). Las sustancias de ensayo se evaluaron usualmente en las mismas placas para microtitulación a 10 concentraciones diferentes en el rango entre 20 µ? y 1 nM (20 µ , 6,7 µ?, 2,2 µ , 0,74 µ?, 0,25 µ?, 82 ??, 27 ??, 9,2 ??, 3,1 nM y 1 nM, las series de diluciones se prepararon antes del ensayo a partir de una solución concentrada 100 veces por dilución serial 1 :3) por duplicado para cada concentración, y se calcularon los valores IC50 con un ajuste de 4 parámetros usando un programa de computación internó.

Ensayo B2 (=(B2)) La acción inhibitoria de hACC2 de las sustancias de la presente invención se midió en 'él ensayo hACC2 descripto en los siguientes párrafos.

Esencialmente, la actividad enzimática se midió por cuantificación de adenosin difosfato (ADP) formado como producto secundario de las reacciones enzimáticas usando el sistema de detección ADP— Glo™ de Promega. En esta prueba, inicialmente el adenosin trifosfato (ATP) no consumido en la reacción enzimática se convierte cuantitativamente con una adenilato ciclasa ( "reactivo ADP-GLO '): a cAMP, luego se detiene la adenilato ciclasa y ("reactivo de detección de quinasa") el ADP formado es posteriormente convertido a ATP, que es convertido en una reacción basada en luciferasa ja Lina señal de luminiscencia brillante. ' ' ; ' !! : ¡ La enzima usada fue ACC2 humana recombinante marcada con FLAG en extremo C terminal (acetil-coenzima A carboxilasa 2) (no. de acceso a GenBank NM_001084) (aminoácidos 27 - final) expresada en células de insecto infectadas con baculovirus (Hi5) y purificada por cromatografía de afinidad con anti-FLAG. ¡; Para el ensayo, se pipetearon 50 ni de una solución concentrada 100 veces de la sustancia de ensayo en DMSO en una placa para microtitulación de 384 pocilios de bajo volumen blancas (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania), se agregaron 2,5 µ? de una solución de hACC2 : en'; solución amortiguadora de ensayo [50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 2 mM MgCI2, 2 mM citrato dé potasió, 12 mM NaHC03, 2 mM ditiotreitol (DTT), 0,005% (peso en volumen) albúmina sérica bovina (BSA)] y la mezcla se incubó durante 15 minutos para permitir la preunión de las sustancias a la enzima antes de la reacción enzimática. Luego se inició la reacción enzimática por agregado de 2,5 µ? de una solución de iadenosin trifosfato (ATP, 100 µ? => concentración final en 5 µ? de volumen de ensayo: 50 µ?) y acétij-j-CoA (20 µ? => concentración final en 5 µ? de volumen de ensayo: 10 µ?) en solución amortiguadora de ensayo, y la mezcla resultante se incubó a 22°C durante el tiempo de reacción de 45 minutos. La concentración de la hACC2 se adaptó a la actividad respectiva de la enzima y se ajustó de modo tal que el ensayo operara en el rango lineal. Las concentraciones típicas estuvieron en el rango de 2 ng/µ?. La reacción se detuvo por adición de 2,5 µ? del "reactivo ADP-GLO" (diluido 1 : 1 ,5 veces), y la mezcla resultante se incubó a 22°C durante 1 hora para convertir el ATP sin reaccionar completamente en AMPc.1 Luego se agregaron 2,5 µ? del "reactivo de detección de quinasa" (1 ,2 veces más concentrado que lo recomendado por el fabricante), la mezcla resultante se incubó a 22°C durante 1 hora y luego se midió la luminiscencia usando un instrumento de medición adecuado (Viewlux o Topcount de Perkin-Elmer o Pherastar de BMG Labtechnologies). La cantidad de luz emitida se tomó como una medida de la cantidad de ADP formado y por lo tanto de la actividad enzimática de la hACC2. Los datos se normalizaron li(reacción enzimática sin inhibidor = 0% de inhibición, todos los otros componentes de ensayo pero sifTenzima = 100% de inhibición). En general, las sustancias en prueba se ensayaron en las mismas placas para microtitulación en 10 concentraciones diferentes en el rango entre 20 µ? y 1 nM (20 µ?, 6,7 µ?, 2,2 µ?, 0,74 µ?, 0,25 µ , 82 ??, 27 ??, 9,2 ??, 3,1 nM y 1 nM, las series de dilución se prepararon;;antes del ensayo a partir de una solución concentrada 100 veces por diluciones seriales 1 :3) por duplicado de cada concentración, y se calcularon los valores de IC50 con un ajuste de 4 parámetros usando ;un "programa de computación interno. ; i: Ensayo de ACCasa no humana Este ensayo se llevó a cabo a temperatura ambiente en una placa para microtitulación de 384 pocilios transparente. Se determinó el fosfato inorgánico liberado del ATP en la reacción: de ACfeasa.

La mezcla de ensayo contenía 50 mM Tris-HCI pH 8,3, 50 mM KCI, 2,5 mM MgCI2, 0,5;lmM ATP, 0,8 mM ditiotreitol (DTT), 30 mM NaHC03, 0,1 mM acetil-CoA, 0,04% albúmina sérica bovina y;0,4 pg de ? enzima ACCasa parcialmente purificada en un volumen final de 40 µ?. Luego de 45 minuto^ de incubación, se detuvo la reacción con 150 µ? de solución verde de malaquita, y se leyó la absorción a 620 luego de 30 minutos. ; ': ;i La solución de verde de malaquita (MG) se preparó por mezclado de 3 partes !dé ,solución de ! ! ' i! MG-HCI 0,6 mM en agua destilada con 1 parte de molibdato de amonio 8,5 mM en HCI. M. La solución se dejó reposar durante 30 minutos. Luego de la filtración a través de un filtro de 0,45 pm de politetrafluoroetileno (PTFE), se agregó 0, 1 parte de Tritón X-100 (1 ,5%) en agua destilada. ¡ ;; La enzima ACCasa se extrajo de plántulas de avena 9 días antes de la siembra y parcialmente purificada por precipitación con entre 0 y 40% de sulfato de amonio seguido por cromatografía de intercambio iónico en QSepharose. ' , ; L ü ; ¡ ; ¡j : i ! i i Experimento de modo de acción Antes de la determinación de la actividad en el modelo MCF-7, algunas de las sustancias en prueba se examinaron en un experimento "modo de acción". El principio que la aplicación a corto plazo de una sustancia en prueba con capacidad de en un organismo viviente luego de la administración oral reduce malonil-CoA en un tumor. Para ta fin, en el experimento se inyectaron 2 millones de células de cáncer de mama MCF-7 humano ¡en forma subcutánea en ratones atímicos hembra (ratones previamente a la administración de un pellet para la menos 60 días). Una vez que el tumor se extendió hasta un área de aproximadamente ehtíj 60 y 70 9.). : i !! Ensayos de células : : ! :: :! De acuerdo con la invención, las sustancias se ensayaron en ensayos basados en células para ? : 'i la capacidad de las sustancias de inhibir la proliferación celular del tumor luego de una incubación de 96 horas con la sustancia. La viabilidad celular se ensayó usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CelITiter-Glo® (Promega). Las células se sembraron con una densidad de entre 2000 y 5000 células/pocilio (dependiendo de la línea celular) en 100 µ? de medio de crecimiento en placas para microtitulación de 96 pocilios. Para cada línea celular examinada, se sembraron células en una placa separada para determinar la luminiscencia a t = 0 horas y t = 96 horas. Luego de incubación durante la noche a 37°C, se determinaron los valores de luminiscencia para las muestras t = 0. Las placas de dosificación para los puntos de t = 96 horas en el tiempo se trataron con sustancias diluidas con medio de crecimiento. Las células luego se incubaron a 37°C durante 96 horas, y luego se determinaron los valores de luminiscencia para muestras t = 96 horas. Para el análisis de datos, se restaron los valores t = 0 de los valores t = 96 horas para muestras tratadas y no tratadas. Las diferencias en luminiscencia en porcentaje entre muestras tratadas con sustancia y valores control se usaron para determinar la inhibición del crecimiento en porcentaje.

Las sustancias se ensayaron en las siguientes lineas celulares que representan las indicaciones declaradas de un modo ejemplificativo: Modelo de xenoinjerto Los modelos de xenoinjerto en ratones inmunosuprimidos se usaron para determinar la actividad antitumoral en organismos vivientes.

Para tal fin, inicialmente se determinó la dosis tolerable máxima (MTD) usando el siguiente protocolo: Durante un período de 1 , 2 ó 3 semanas, se administró oralmente una dosis definida de la sustancia de ensayo a ratones atímicos hembra (ratones RMNI-nude (nu/nu), Taconic M&B A/S), y los ratones se observaron diariamente para la mortalidad y peso corporal. La MTD se definió como la dosis más alta que podía ser administrada sin que ningún animal muriese durante la fase de tratamiento y la fase de observación de 7 días adicionales, y sin ninguna pérdida de peso corporal de más del 10% en comparación con el peso inicial.

Diferentes modelos de xenoinjertos en los cuales se administraron las sustancias de ensayo en sus MTD y en dosis menores, luego se usaron para determinar la actividad antitumoral. Además de los otros diferentes modelos, se hizo uso principalmente del modelo de cáncer de mama con células MCF7 human dependiente de hormona en ratones atímicos hembra (ratones RMNI-nude (nu/nu), Taconic M&B AIS). Para tal fin, en el día previo a la implantación de las células tumorales, se administró un pellet para liberar estrógeno (17 -estradiol 0,36 mg, liberado durante 60 días) subcutáneamente a los ratones. El día siguiente, se inyectaron 2 millones de células tumorales (suspendidas en medio + Matrigel) 1 :1 , 0, 1 mi final) subcutáneamente en el lateral de cada animal. Cuando los tumores se extendieron hasta un área de entre 20 y 25 mm2, los ratones se aleatorizaron en grupos de terapia y se inició la terapia. La terapia luego se continuó hasta que se había alcanzado un tamaño de tumor promedio de 120 mm2 en el grupo control, el cual sólo había recibido el vehículo de la sustancia de ensayo, o en uno de los grupos de tratamiento, con el área de tumor y peso corporal siendo medido entre 2 y 3 veces por semana. En este punto en el tiempo, el experimento se terminó en todos los grupos y se pesaron los tumores extraídos.

El valor T/C se calculó como parámetro de éxito principal usando el efecto sobre el peso del tumor o usando el efecto sobre el área del tumor: media del peso/área del tumor en el grupo de tratamiento dividido por la media del peso/área del tumor en el grupo vehículo.

Análisis de la expresión de ACC1 en tejido tumoral y tejido normal Se determinó la expresión de ACC1 usando un microarreglo. Para este fin, se aisló el ARN de diferentes tejidos tumorales y el correspondiente tejido normal. El método hizo uso del reactivo para extracción de ARN Trizol (Invitrogen) y posterior purificación usando el miniconjunto de componentes RNeasy (Qiagen).

Además, se realizó una digestión con DNase I (Qiagen) para eliminar el ADN genómico. Para control de calidad, se analizó el ARN total con la ayuda de un LabChip para ARN en un Agilent Bioarialyzer 2100 Platform (Agilent Technologies), y se determinó la concentración de ARN usando el sistema Peqlab NanoDrop. Para la hibridación, se usó el ensayo de mareaje de blanco eucariótico en un ciclo de Affymetrix, y luego se leyó el arreglo en un escáner AffymetrixGeneChip 3000 (Affymetrix). Se realizó la evaluación y control de calidad usando el programa de computación Expressionist Pro 4.0 Refiner (GeneData). 4. Resultados: 4.1. Ensayo enzimático La tabla 1 resume los resultados para el compuesto A y los ejemplos comparativos de los ensayos enzimáticos.

Tabla 1 Estos valores muestran que el compuesto A y el ejemplo comparativo C.1 inhiben las enzimas de un modo comparativamente fuerte, mientras que el ejemplo comparativo C.2 es inferior. 4.2 Ensayos celulares La tabla 2 resume los resultados de los ensayos celulares respecto al compuesto A y los ejemplos comparativos.

Tabla 2 4.3 Dosis tolerada máxima (MTD) Ejemplo comparativo C.1 Se administró el ejemplo comparativo C.1 a ratones atímicos hembra (RMNI nu/nu): Dosis: véase tabla 3 Modo de administración: oral Vehículo: PEG400/etanol/Solutol HS 15(70/5/25, v/v/v)(Solutol HS15: polioxietilen-éster de ácido 12-hidroxiestearico) Volumen de administración: 10 ml/kg Esquema: véase tabla 3 La fase de tratamiento se siguió durante una fase de observación de 7 días. Las muertes que ocurrieron durante este período y los efectos sobre el peso corporal se resumen en la tabla 3.

Tabla 3 En consecuencia, la MTD para un tratamiento de 14 días con 2 administraciones por día fue menor que 10 mg/kg.

En consecuencia, la MTD para un tratamiento de 21 días con 1 administración por día fue menor que 15 mg/kg.

Dado que las muertes y la pérdida de peso corporal ocurrieron en todos los grupos, no fue posible determinar la MTD.

El ejemplo comparativo C.1 se administró posteriormente a ratones atímicos hembra (RMNI nu/nu) en el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MCF-7: Dosis: 7,5 mg/kg Modo de administración: oral Vehículo: PEG400/etanol/Solutol HS 15(70/5/25, v/v/v) Volumen de administración: 10 ml/kg Esquema: 27 días, 2 veces por día (2qd) Ratones: 10 Hasta el día 37 del experimento, esta dosis se toleró relativamente bien (baja pérdida de peso corporal, murió 1 de 10 animales). En este grupo de dosis, no se pudo observar una eficacia terapéutica, definida como un valor T/C menor o igual a 0,5, en comparación con el control de vehículo (valor T/C basado en el área de tumor = 0,86) La figura 2 muestra el área de tumor como una función del número de días luego de la implantación de las células tumorales.

El tratamiento de los animales remanentes se continuó con 10 mg/kg 2qd o 12,5 mg/kg 2qd hasta el día 43. Sin embargo, estos dos esquemas de dosificación más altas se toleraron pobremente (1 de 4 ó 4 de 5 muertes respectivamente).

Para resumir: la ventana terapéutica del ejemplo comparativo C.1 , si está presente, tiene que ser asumida como muy pequeña Compuesto A Se administró el compuesto A a ratones atímicos hembra (RMNI nu/nu): Dosis: véase tabla 4 Modo de administración: oral Vehículo: PEG400/etanol/Solutol HS 15(70/5/25, v/v/v) Volumen de administración: 10 ml/kg Esquema: véase tabla 4 La fase de tratamiento se siguió durante la fase de observación de 7 días. Las muertes que ocurrieron durante este período y el efecto sobre el peso corporal se resumen en la tabla 4.

Tabla 4 En consecuencia, la MTD para un tratamiento de 21 días con 1 administración por día fue menor de 40 mg/kg y por encima de 30 mg/kg.

El compuesto A se administró posteriormente a ratones atímicos hembra (RMNI nu/nu) en el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MCF-7: Dosis: véase tabla 5 Modo de administración: oral Vehículo: PEG400/etanol/Solutol HS 15(70/5/25, v/v/v) Volumen de administración: 10 ml/kg Esquema: 30 días, una vez por día (qd) Ratones por grupo de dosis: entre 10 y 13 Tabla 5 Para la evaluación estadística del experimento, se usó la prueba de ANOVA no paramétrica para los valores T/C en base al área del tumor, ya que no hubo distribución normal de los valores medidos. Todos los grupos de terapia luego se compararon contra el grupo de vehículo usando la post-prueba de Dunns. Los valores p resultantes se muestran en la tabla (ns: no significativo= p> 0,05). Debido a que para los valores T/C en base al peso del tumor hubo distribución normal, para el análisis se usó la prueba de ANOVA para valores paramétricos. Todos los grupos de terapia luego se compararon contra el grupo de vehículo usando la post-prueba de Bonferroni. Los valores p resultantes se muestran en la tabla 5.

Debido a que todos los grupos de dosis usados alcanzaron el valor blanco de un T/C (en base al peso del tumor) de menor de 0,5 en este experimento, el experimento se evaluó estadísticamente, siendo los resultados de la evaluación también mostrados en la tabla 5. El compuesto A inhibió de una manera estadísticamente significativa el crecimiento del tumor (en base al peso del tumor y el área del tumor) por encima de una dosis de 25 mg/kg cuando se administró una vez por día. En base al peso del tumor, este efecto fue estadísticamente significativo incluso a partir de una dosis de 20 mg/kg, administrada una vez por día.

La figura 3 muestra el área del tumor como una función del número de días luego de la implantación de las células tumorales.

En consecuencia, la comparación del ejemplo comparativo C.1 y el compuesto A muestra que el ejemplo comparativo C.1 no mostró eficacia antitumoral incluso a una dosis que no es bien tolerada, a la vez que se encontraron efectos antitumorales biológicamente significativos y significantes para el compuesto A en un rango de dosis tolerada de entre 20 mg/kg qd y 35 mg/kg qd.

Expresión de ACC1 en tejido tumoral y normal La expresión de ACC1 en tejido tumoral y el correspondiente normal se determinó por microarreglo (figura 1 ). En carcinoma de mama, carcinoma colorrectal, carcinoma bronquial y carcinoma de páncreas, la expresión de ACC 1 fue significativamente aumentada en comparación a tejido normal. 5. Formulación Comprimidos que comprenden compuesto A a) Preparación de la formulación farmacéutica por formación directa de comprimidos Se prepararon los comprimidos de acuerdo a la composición de la tabla 6 que comprende compuesto A por formación directa de comprimidos.

Tabla 6 La formulación farmacéutica puede ser preparada por procesos adecuados, en particular por mezclado de polvo y formación directa de comprimidos, en cualquier escala.

Para preparar 50 comprimidos, se premezclaron 3,351 g de manitol, secado por aspersión 2,004 g de celulosa, microcristalina 0,499 g de Na-croscarmelosa y 3,992 g del compuesto ejemplificativo 1-1 18 en un mortero por molido cuidadoso. La mezcla se transfirió a un tupo con tapa a rosca de 100 mi y se homogeneizó en un mezclador Turbula durante 10 minutos. Luego de la adición de 0,149 g de estearato de magnesio, la mezcla se mezcló en el mezclador Turbula durante otro 1 minuto.

El material moldeable obtenido de este modo se moldeó en forma de comprimido en una prensa de comprimidos excéntrica (Korsch EK 2) para dar comprimidos biconvexos de un diámetro de 8 mm y una curvatura de 12 mm. b) Fuerza de ruptura Se ensayó la fuerza de ruptura (usando un evaluador de fuerza de ruptura Sc leuniger), masa y tiempo de desintegración en agua a 37 °C (usando el aparato descripto en la monografía 2.9.1 de la Farmacopea Europea) de los comprimidos obtenidos al inicio, en la mitad y al final del proceso de formación de comprimidos.

Fuerza de ruptura Masa Tiempo de desintegración Inicio 81 N 198,7 mg 1 :28 min mitad 95N 196,8 mg 1 :28 min. final 97N 199,0 mg 1 :32 min. media 91 N 198,2 mg 1 :29 min. c) Disolución in vitro La liberación in vitro del compuesto A desde los comprimidos preparados se determinó usando el equipo 2 (método de paletas) de acuerdo a USP. La prueba de liberación se llevó a cabo en cada caso en 900 mi de diferentes medios a 37°C y con una velocidad de agitación de 75 rotaciones por minuto. Cada determinación se llevó a cabo por triplicado. El contenido se determinó por HPLC. Los resultados se muestran en la tabla 7 y Figura 4.

Tabla 7 *SDS = lauriisulfato sódico (añadido, ya que la solubilidad a pH 1 y pH 6,8 no es suficiente) d) Estabilidad a corto plazo de la formulación farmacéutica Los comprimidos terminados se sometieron a un ensayo de estabilidad a corto plazo de 1 mes a 25°C/60% de humedad relativa y a 40°C/75% de humedad relativa. Bajo cualquiera de las dos condiciones, los comprimidos fueron estables en su contenido y productos de degradación, según se constató por HPLC.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1 . Uso de (5s,8s)-3-(4'^lorc 3'-fluoro-^-met¡lb¡fen¡l-3-¡l)^-h¡droxi-8-metox¡-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-ona para preparar un medicamento.

2. Uso de acuerdo a la reivindicación 1 para preparar un medicamento para la profilaxis y/o terapia de trastornos tumorales.

3. Uso de acuerdo a la reivindicación 2 para preparar un medicamento para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, carcinomas de páncreas, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago, y carcinomas de próstata.

4. Uso de (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)-4-hidroxi-8-metoxi-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-ona para la profilaxis y/o terapia de trastornos de humanos o de otro mamífero.

5. Uso de acuerdo a la reivindicación 4 para la profilaxis y/o terapia de trastornos tumorales.

6. Uso de acuerdo a la reivindicación 5, para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, carcinomas de páncreas, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata.

7. (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)-4-hidroxi-8-metox¡-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-ona para uso como un medicamento.

8. (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)-4-hidroxi-8-metoxi-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-ona para la profilaxis y/o terapia de trastornos tumorales.

9. (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-ilM-hidroxi-8--metoxi-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-ona para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, carcinomas de páncreas, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata.

10. Formulación farmacéutica en forma de comprimido, que comprende (5s,8s)-3-(4 -cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)^-hidroxi-8-metoxi-1-azaespiro[4.5]dec-3-en-2-ona para la profilaxis y/o terapia de carcinomas de mama, carcinomas de páncreas, carcinomas bronquiales de células no pequeñas, carcinomas endometriales, carcinomas colorrectales, carcinomas de estómago y carcinomas de próstata. 1 1 . (5s,8s)-3-(4'-cloro-3'-fluoro-4-metilbifenil-3-il)-4-hidroxi-8-metoxi-1-azaespiro[4.5Jdec-3-en-2-ona en combinación con otro compuesto activo.