CN103563846A - 一种快大型乌肤鸡品系的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快大型乌肤鸡品系的培育方法，属于分子育种技术领域。本发明采用分子辅助选择的方法鉴定鸡乌肤位点基因型，可以快速判定出该位点的基因型，克服了传统常规育种中测交繁琐、世代间隔长等缺点。采用本发明的方法生产基因型为FmFm的乌肤鸡品系，不仅避免了测交选育的繁琐，缩短了世代间隔，加快了育种进程，降低了培育成本；而且该品系乌肤性状均一，屠体更加美观；肉质细嫩，营养价值高。此外，该品系用作父本与快大型白羽肉鸡杂交配套，可生产出高生长性能的乌肤鸡。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种快大型乌肤鸡品系的培育方法，属于分子育种技术领域。
背景技术
乌骨鸡是闻名中外的药用家禽，1874年被国际上承认为标准品种，它具有特殊的药用、营养及观赏价值。而国外的快大型白羽肉鸡长速快。为了提高其生长性能，育种工作者在育种实践中往往要导入快大型肉鸡的血缘，这会使得乌肤性状发生分离。乌鸡的药用价值主要在于其黑色素的作用，乌肤性状是消费者对黑色素表达最直接的判定。为了能够在提供生长性能的同时又保持乌肤的性状，乌肤位点基因型的判定就显得非常重要。传统育种中常常采用测交的方法，依据杂交后代鸡的表型性状留种。即通过测交、繁殖扩群来淘汰隐性乌鸡群体里的乌肤杂合子个体。但是测交过程较为繁琐，周期长，且会受到扩群的大小的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种快大型乌肤鸡品系的培育方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种快大型乌肤鸡品系的培育方法，包括以下步骤：
（1）利用乌肤鸡品种作为父本与快大型白羽肉鸡品种作为母本进行杂交，生产出F1代鸡，选留F1代乌肤鸡；
（2）F1代自交得到F2代，选留F2代乌肤鸡；
（3）利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体的基因型，选留乌肤位点为FmFm基因型的个体，淘汰乌肤位点为Fmfm基因型的个体，得到乌肤位点为FmFm基因型的公母鸡；
（4）对得到的FmFm基因型个体进行横交和扩繁，按照家系选择和个体选择方法，提高生长速度，同时提纯和固定乌肤性状，经过4个世代以上的选育后，得到乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡品系。
所述步骤（1）中的乌肤鸡品种为丝羽乌骨鸡、江山乌骨鸡、金湖乌凤鸡、余干乌骨鸡、郧阳乌骨鸡、雪峰乌骨鸡、四川山地乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、腾冲雪鸡、略阳鸡（黑河乌鸡）、他留乌骨鸡、无量山乌骨鸡、盐津乌骨鸡等。
所述步骤（1）中的快大型白羽肉鸡品种为罗斯308、科宝、艾维茵、哈巴德、艾拔益加（AA)、海波罗、迪高等。
所述步骤（3）中利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体基因型的方法，包括以下步骤：以包含EDN3基因的待测鸡全血基因组DNA为模板，以引物对P为引物进行荧光定量PCR扩增，扩增片段的DNA序列如SEQ IDNo.3所示；
所述的引物对P为：
上游引物P-F：5’-CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’（如SEQ ID No.1所示），
下游引物P-R：5’-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’（如SEQ ID No.2所示）。
该扩增序列的全长为134bp，位于鸡乌肤位点EDN3基因上，能够检测鸡乌肤基因位点EDN3基因是否存在拷贝数变异。
所述的荧光定量PCR扩增反应体系为：荧光定量PCR2×缓冲液10μL，ddH2O7μL，P-F0.5μL，P-R0.5μL，DNA模板2μL。
所述的荧光定量PCR2×缓冲液的成分为：5U/μL Taq DNA Polymerase，10×Buffer，25mM MgCl2，2mM dNTPs，SYBR Green I。
所述的荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；40个循环：95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min；20℃保存。
具体的，所述步骤（3）中利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因拷贝数，确定F2代乌肤鸡基因型的方法，还包括以下步骤：利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数，根据其拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型。
所述的标准曲线的制作方法为：以白肤鸡全血基因组DNA作为荧光定量标准品，浓度分别为80，40，20，10，5，2.5ng/μL，以引物对P为引物进行荧光定量PCR扩增，以上述六个标准品的Ct值为纵坐标，以浓度的对数值为横坐标，建立标准曲线，求得标准曲线方程。
所述的利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数的方法为：荧光定量PCR扩增前，先将待测鸡的DNA稀释到同一浓度10ng/μL，再将待测鸡的Ct值代入标准曲线方程中，求出其对应的对数浓度，再转化为浓度，即为该待测鸡EDN3基因的相对拷贝数。
所述的根据拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型的方法为：当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为2时，该个体为乌肤纯合子（FmFm）；当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为1.5时，该个体为乌肤杂合子（Fmfm）；当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为1，该个体为非乌肤纯合子（fmfm）。
优选的，将步骤（4）得到的乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡作为父本与快大型白羽肉鸡品种杂交配套，生产出更高生长性能的乌肤鸡。
本发明的有益效果：
采用本发明的方法生产基因型为FmFm的乌肤鸡品系，不仅避免了测交选育的繁琐，缩短了世代间隔，加快了育种进程，降低了培育成本；而且该品系乌肤性状均一，屠体更加美观；肉质细嫩，营养价值高。此外，该品系用作父本与快大型白羽肉鸡杂交配套，可生产出高生长性能的乌肤鸡。
本发明采用分子辅助选择的方法鉴定鸡乌肤位点基因型，可以快速判定出该位点的基因型，缩短育种时间，提高育种效率，克服了传统常规育种中测交繁琐、世代间隔长等缺点。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中快大型乌肤鸡品系的培育方法，包括以下步骤：
（1）利用丝羽乌骨鸡纯系公鸡作为父本与罗斯308母鸡作为母本进行杂交，生产出F1代鸡，选留F1代乌肤鸡；
（2）F1代自交得到F2代，选留F2代乌肤鸡；
（3）利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体的基因型，具体包括以下步骤：
①样品的采集
对F2代选留的乌肤鸡翅静脉采血，加1/3抗凝剂，用蛋白酶K法提取血液DNA；
②DNA样品浓度调整
将待测样品的DNA利用微量分光光度仪进行浓度测定，根据所测浓度，将每一个待测样品DNA浓度加TE稀释至10ng/μL，稀释后用微量紫外分光光度计测定，4℃冰箱保存备用；
③标准品的制备
随机取一个白羽肉鸡的DNA样本，测定浓度后，将其稀释至80ng/μL，作为标准品母液，将母液倍比稀释为80，40，20，10，5，2.5ng/μL，作为制作标准曲线的6个标准品；
④引物设计
基因型鉴定所用到的引物对P的序列如下：
上游引物P-F：5’-CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’，
下游引物P-R：5’-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’；
⑤qPCR扩增
以引物对P为扩增引物，建立20μL体系：荧光定量PCR2×缓冲液（包括5U/μL Taq DNAPolymerase，10×Buffer，25mM MgCl2，2mM dNTPs，SYBR Green I）10μL，ddH2O7μL，P-F0.5μL，P-R0.5μL，DNA模板2μL；反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min；20℃保存；
⑥qPCR扩增数据处理和基因型结果的判定
以80、40、20、10、5、2.5ng/μL的6个标准品的Ct值为纵坐标，以浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，求出标准曲线的方程y=-0.285x+7.665，R2=0.9986和该反应的扩增效率92.72%；
将待测个体的Ct值带入方程，求出其对应的对数浓度，再转化为浓度，即为该待测个体EDN3基因的相对拷贝数；
将白肤个体的EDN3基因的相对拷贝数设为1，当待测个体的相对拷贝数为2时，该位点的基因型为FmFm；当待测个体的相对拷贝数为1.5时，该位点的基因型为Fmfm（由于待测样本DNA浓度标定和荧光定量PCR试验都会存在一定的试验误差，将此误差控制在20%之内即可，不影响对乌肤位点的判型）；
（4）根据基因型判定结果，选留乌肤位点为FmFm基因型的个体，淘汰乌肤位点为Fmfm基因型的个体；
（5）对得到的FmFm基因型个体进行横交和扩繁，按照家系选择和个体选择方法，提高生长速度，同时提纯和固定乌肤性状，经过4个世代以上的选育后，得到乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡品系；
（6）将得到的乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡作为父本与快大型白羽肉鸡品种杂交配套，生产出更高生长性能的乌肤鸡。
Claims (10)
1.一种快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）利用乌肤鸡品种作为父本与快大型白羽肉鸡品种作为母本进行杂交，生产出F1代鸡；
（2）F1代自交得到F2代，选留F2代乌肤鸡；
（3）利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体的基因型，选留乌肤位点为FmFm基因型的个体，淘汰乌肤位点为Fmfm基因型的个体；
（4）对得到的FmFm基因型个体进行横交和扩繁，按照家系选择和个体选择方法，提高生长速度，同时提纯和固定乌肤性状，经过4个世代以上的选育后，得到乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡品系。
2.根据权利要求1所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：所述步骤（1）中的乌肤鸡品种为丝羽乌骨鸡、江山乌骨鸡、金湖乌凤鸡、余干乌骨鸡、郧阳乌骨鸡、雪峰乌骨鸡、四川山地乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、腾冲雪鸡、略阳鸡、他留乌骨鸡、无量山乌骨鸡或盐津乌骨鸡。
3.根据权利要求1所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：所述步骤（1）中的快大型白羽肉鸡品种为罗斯308、科宝、艾维茵、哈巴德、艾拔益加、海波罗或迪高。
4.根据权利要求1所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：所述步骤（3）中利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡基因型的方法，包括以下步骤：以包含EDN3基因的待测鸡全血基因组DNA为模板，以引物对P为引物进行荧光定量PCR扩增，扩增片段的DNA序列如SEQ ID No.3所示；
所述的引物对P为：
上游引物P-F：5’-CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’，
下游引物P-R：5’-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。
5.根据权利要求4所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR扩增反应体系为：荧光定量PCR2×缓冲液10μL，ddH2O7μL，P-F0.5μL，P-R0.5μL，DNA模板2μL。
6.根据权利要求4所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min；40个循环：95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min；20℃保存。
7.根据权利要求4所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：所述步骤（3）中利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体基因型的方法，还包括以下步骤：利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数，根据其相对拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型。
8.根据权利要求7所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数的方法为：荧光定量PCR扩增前，先将待测鸡的DNA稀释到同一浓度10ng/μL，再将待测鸡的Ct值代入标准曲线方程中，求出其对应的对数浓度，再转化为浓度，即为该待测鸡EDN3基因的相对拷贝数。
9.根据权利要求7所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：所述的根据其相对拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型的方法为：当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为2时，该个体为乌肤纯合子；当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为1.5时，该个体为乌肤杂合子。
10.根据权利要求1所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于：将步骤（4）得到的乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡作为父本与快大型白羽肉鸡品种杂交配套，生产出更高生长性能的乌肤鸡。
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