CN103396496A - 一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，特点是包括将嗜酸乳杆菌 水浴杀菌加入TritonX-100溶液反应后离心洗涤去除沉淀中的杂质后得到湿菌体的制备步骤；将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中反应后离心，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中反应后离心，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中反应后离心得到酶解破壁的菌体步骤；将酶解破壁的菌体洗涤脱脂后加入酶溶液Ⅳ去蛋白的步骤；将去脂去蛋白沉淀透析盐析，离心取沉淀透析后，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖的步骤；将嗜酸乳杆菌肽聚糖加入四甲基哌啶和NaBr及NaClO反应处理后，得到氧化修饰的嗜酸乳杆菌肽聚糖产物，优点是操作简单，反应时间短，且溶解性显著增加、抗氧化活性明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及肽聚糖的制备方法，尤其是涉及一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法。
背景技术
乳酸菌作为一种重要的肠道益生菌，在调节肠道微生物菌群、增强机体免疫力及预防肿瘤等疾病中具有重要作用。嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中重要一员，在调整肠道菌群平衡、降低血清胆固醇水平及刺激免疫系统、提高免疫功能等方面起着重要作用。嗜酸乳杆菌发挥免疫调节作用的原理主要是其肽聚糖通过诱导各种细胞因子的释放进而调节宿主的免疫功能。
肽聚糖（peptidoglycan,PG），是细菌细胞壁的主要组成成分之一，它的单体是由一个四肽尾和一个双糖单位构成。不同细菌的肽聚糖，其肽链的组成、长度及结构排列有很大变化，肽桥变化也甚多，溶解性和功能也不一样，具有多样性。如Reid G, Sakato Y等人在2003年37卷第2期《J Clin Gastroenterol》中对双歧杆菌肽聚糖进行了研究，发现肽聚糖是双歧杆菌发挥抗感染、抗肿瘤以及免疫活性等多种生理功能的主要成分；《中国微生态学杂志》1999年11卷第3期中，蓝景岗等发现PG能增强小鼠脾N K、LAK细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性；孙涛等在2007年《吉林农业大学学报》中初步研究发现嗜酸乳杆菌La2细胞壁肽聚糖能显著抑制荷瘤小鼠S-180肉瘤的生长，提高荷瘤小鼠的脾指数及肾上腺指数。尽管PG具有较好的医学价值，但目前国内外对其研究报道甚是少见，原因在于它本身溶解度低的特性，大大影响了其功效的发挥。现阶段人们采用溶菌酶水解PG，破坏PG的β-1,4糖苷键结构，使PG的分子结构由大分子变成小分子，提高PG的溶解性。但溶菌酶价格昂贵，耗时较长，酶活力不容易控制，且得到的PG分子结构发生变化较大，不利于PG功效的研究及工业化。因此，对PG分子结构进行修饰显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单，反应时间短，且溶解性显著增加、抗氧化活性明显提高的改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）湿菌体的制备
将嗜酸乳杆菌置于三角瓶中，于60-70℃水浴35-45min 加热杀死菌体，然后加入0.5%Triton X-100溶液，于80-90℃水浴0.5-1.5h，并不断连续搅拌，取出溶液置冰浴中立即冷却，于10000×g-15000×g离心8-12 min后弃上清，将沉淀再用双蒸水充分洗涤两次，再次于10000×g-15000×g离心8-12 min后弃上清，然后用甲醇-水、甲醇依次洗涤去除沉淀中的杂质后得到湿菌体；
（2）酶解破壁
将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中，于35-40℃水浴10-14 h，再于4℃、10000×g-15000×g离心30-50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于35-40℃水浴10-14 h，再于4℃、10000×g-15000×g离心30-50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于35-40℃水浴处理20min，再于4℃，10000×g-15000×g离心30-50min弃上清取沉淀；
（3）去脂去蛋白
将步骤（2）所得沉淀依次经甲醇、甲醇-氯仿及氯仿洗涤脱脂，于10000×g-15000×g离心35-45min后弃上清，取脱脂后的沉淀加入一定量的酶溶液Ⅳ中，于35-40℃消化10-15h，再于4℃，10000×g-15000×g离心30-50min，取沉淀加入酶溶液Ⅳ进行消化离心重复3次弃上清，得到去脂去蛋白沉淀；
（4）纯化
将步骤（3）得到的去脂去蛋白沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5-3.5d后，经0.01 mol/L的硫酸溶液于85-95℃ 处理5min后，冰水浴中立即冷却，再于4℃ 、10000×g-15000×g离心25-35min弃上清, 取沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5-3.5d，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖；其中硫酸溶液与原料嗜酸乳杆菌的比例为2mL：3g；
（5）TEMPO-NaClO-NaBr选择性氧化修饰
在烧杯中加入一定量的嗜酸乳杆菌肽聚糖和适量的蒸馏水，再加入一定量的四甲基哌啶（TEMPO）和NaBr，用玻璃棒搅拌均匀，制得肽聚糖乳液，在肽聚糖乳液中加入一定量的NaClO，控制温度为4℃，调节pH为8.4-8.6，反应25-35min，加入Na2SO3还原未反应的微量氧化剂，加入少量乙醇终止反应，将反应液倒于过量的乙醇中，并不断搅拌，静置一段时间，抽滤得到滤饼，将滤饼用乙醇水溶液多次反复洗涤后，透析，冷冻干燥，得到氧化修饰的嗜酸乳杆菌肽聚糖产物。
所述的酶溶液Ⅰ配制方法如下：氯化镁0.1017 g ，胰蛋白酶50 mg ，DNase 5 mg，RNase 7.5 mg，溶解于50mL pH7.2 的Tris-HCl 溶液中，4 ℃ 保存；所述的酶溶液Ⅱ配制方法如下：α-糜蛋白酶25 mg ，胰蛋白酶25 mg ，溶解于50 ml pH 7.2 的Tris-HCl溶液中 ，4 ℃ 保存；所述的酶溶液Ⅲ配制方法如下：胃蛋白酶30 mg，溶解于30 mL 0.01 mol/L的盐酸溶液中，4 ℃ 保存；所述的酶溶液Ⅳ配制方法如下：蛋白酶E 80 mg，溶解于80 mL的pH 7.4的Tris-HCl溶液中，4℃ 保存。
所述的嗜酸乳杆菌与所述的Triton X-100溶液的混合比例为3g：10mL， 所述的嗜酸乳杆菌与所述的酶溶液Ⅰ的比例为3g：8mL，所述的酶溶液Ⅰ、所述的酶溶液Ⅱ、所述的酶溶液Ⅲ与所述的酶溶液Ⅳ的比例为2：2：1：1；所述的甲醇-水中甲醇与水的体积比为2：l； 所述的甲醇-氯仿中甲醇与氯仿的体积比为1:1。
所述的嗜酸乳杆菌肽聚糖、所述的蒸馏水、所述的四甲基哌啶、所述的NaBr和所述的NaClO的混合比例为200mg：20ml：5mg：48mg：0.3-0.5mmol，所述的乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为7：3。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，采用 TEMPO-NaClO-NaBr体系对肽聚糖进行选择性氧化修饰，使肽聚糖伯羟基氧化生成相应的羧酸盐，大大提高了肽聚糖的溶解性。本发明公开了改性前后肽聚糖的抗氧化活性，改性后肽聚糖抗氧化活性明显提高。该方法操作简单，反应时间短，且溶解性和抗氧化活力明显提高。
附图说明
图1为本发明嗜酸乳杆菌肽聚糖改性前后的红外光谱图；0：改性前嗜酸乳杆菌肽聚糖；1：NaClO添加量为0.5mmol/g ；2：NaClO添加量为1.0mmol/g ；3：NaClO添加量为1.5mmol/g ；4：NaClO添加量为2.0mmol/g ；5：NaClO添加量为2.5mmol/g，单位mmol/g指每克嗜酸乳杆菌肽聚糖中NaClO的添加量；
图2为本发明嗜酸乳杆菌肽聚糖改性前后的糖含量对比图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）湿菌体的制备
将3g嗜酸乳杆菌置于三角瓶中，于65℃水浴40min 加热杀死菌体，然后加入0.5%Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）溶液10mL，于85℃水浴1h，并不断连续搅拌，取出溶液置冰浴中立即冷却，于12000×g离心10 min后弃上清，将沉淀再用双蒸水充分洗涤两次，再次于12000×g离心8-12 min后弃上清，然后用甲醇-水（v:v=2:1）、甲醇依次洗涤去除沉淀中的杂质后得到湿菌体；
（2）酶解破壁
将湿菌体加入8mL酶溶液Ⅰ中，于37℃水浴12 h，再于4℃、12000×g离心40min弃上清，取沉淀加入8mL酶溶液Ⅱ中，于37℃水浴12h，再于4℃、12000×g离心40min弃上清，取沉淀加入4mL酶溶液Ⅲ中，于37℃水浴处理20min，再于4℃、12000×g离心40min弃上清取沉淀；
（3）去脂去蛋白
将步骤（2）所得沉淀依次经甲醇、甲醇-氯仿（v:v=1:1）及氯仿洗涤脱脂，于12000×g离心40min后弃上清，取脱脂后的沉淀加入4mL酶溶液Ⅳ中，于37℃消化12h ，取沉淀加入酶溶液Ⅳ进行消化离心重复3次弃上清，得到去脂去蛋白沉淀；
（4）纯化
将步骤（3）得到的去脂去蛋白沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析3d后，经2mL 0.01 mol/L的硫酸溶液于90℃处理5min后，冰水浴中立即冷却，再于4℃ 、12000×g离心30min弃上清，取沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析3d，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖；
（5）TEMPO-NaClO-NaBr选择性氧化修饰
在烧杯中加入200mg的嗜酸乳杆菌肽聚糖和20ml蒸馏水，再加入5mg的四甲基哌啶（TEMPO采用分析纯级别，购于SIGMA-ALORICH）和48mgNaBr，用玻璃棒搅拌均匀，制得肽聚糖乳液，在肽聚糖乳液中加入0.5mmol的NaClO(NaClO溶液为化学纯500ml(约583g)，活性氯含量大约等于5.2%，微黄色，有氯味)，控制温度为4℃，调节pH为8.5，反应30min，加入Na2SO3还原未反应的微量氧化剂，加入0.5ml乙醇终止反应，将反应液倒于过量的乙醇中，并不断搅拌，静置一段时间，抽滤得到滤饼，将滤饼用乙醇水溶液（v:v=7:3）多次反复洗涤后，透析，冷冻干燥，得到氧化修饰的嗜酸乳杆菌肽聚糖产物。
在此具体实施例中，酶溶液Ⅰ配制方法如下：氯化镁0.1017 g ，胰蛋白酶50 mg ，DNase 5 mg，RNase 7.5 mg，溶解于50mL pH7.2 的Tris-HCl 溶液中，4 ℃ 保存；所述的酶溶液Ⅱ配制方法如下：α-糜蛋白酶25 mg ，胰蛋白酶25 mg ，溶解于50 ml pH 7.2 的Tris-HCl溶液中 ，4 ℃ 保存；所述的酶溶液Ⅲ配制方法如下：胃蛋白酶30 mg，溶解于30 mL 0.01 mol/L的盐酸溶液中，4 ℃ 保存；所述的酶溶液Ⅳ配制方法如下：蛋白酶E 80 mg，溶解于80 mL的pH 7.4的Tris-HCl溶液中，4℃ 保存。
实施例2
同实施例1，其区别在于：
步骤（1）中：将嗜酸乳杆菌置于三角瓶中，于60℃水浴45min，然后加入0.5%Triton X-100溶液，于80℃水浴1.5h，并不断连续搅拌，取出溶液置冰浴中立即冷却，于10000×g离心12 min后弃上清，将沉淀再用双蒸水充分洗涤两次，再次于10000×g离心12 min后弃上清。
步骤（2）中：将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中，于35℃水浴14 h，再于4℃、10000×g离心50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于35℃水浴14 h，再于4℃、10000×g离心50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于35℃水浴 处理20min，再于4℃、10000×g离心50min弃上清取沉淀。
步骤（3）中：于10000×g离心45min后弃上清，取脱脂后的沉淀加入酶溶液Ⅳ中，于35℃消化15h后，于4℃、10000×g离心50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅳ进行消化离心重复3次弃上清，得到去脂去蛋白沉淀。
步骤（4）中：去脂去蛋白沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5d后，经硫酸溶液于85℃处理5min后，冰浴冷却，再于4℃ 、10000×g离心35min弃上清, 取沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5d，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖。
步骤（5）中：NaClO的添加量为2.0mmol每克嗜酸乳杆菌肽聚糖，调节pH为8.4，反应25min。
实施例3
同实施例1，其区别在于：
步骤（1）中：将嗜酸乳杆菌置于三角瓶中，于70℃水浴35min，然后加入0.5%Triton X-100溶液，于90℃水浴0.5h，并不断连续搅拌，取出溶液置冰浴中立即冷却，于15000×g离心8 min后弃上清，将沉淀再用双蒸水充分洗涤两次，再次于15000×g离心8min后弃上清。
步骤（2）中：将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中，于40℃水浴10h，再于4℃、15000×g离心30min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于40℃水浴10h，再于4℃、15000×g离心30min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于40℃水浴 处理20min，再于4℃、15000×g离心30min弃上清取沉淀。
步骤（3）中：于15000×g离心35min后弃上清，取脱脂后的沉淀加入酶溶液Ⅳ中，于35℃消化15h后，于4℃、15000×g离心30min，取沉淀加入酶溶液Ⅳ进行消化离心重复3次弃上清，得到去脂去蛋白沉淀。
步骤（4）中：去脂去蛋白沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析3.5d后，经硫酸溶液于95℃处理5min后，冰浴冷却，再于4℃ 、15000×g离心25min弃上清, 取沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析3.5d，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖。
步骤（5）中：NaClO的添加量为1.5mmol每克嗜酸乳杆菌肽聚糖，调节pH为8.6，反应35min。
二、对比试验
对上述实施例1中得到的改性前后的嗜酸乳杆菌肽聚糖采用红外光谱进行结构分析(FTIR)，结果如图1所示，改性前嗜酸乳杆菌肽聚糖和不同氧化程度的改性后嗜酸乳杆菌肽聚糖的FTIR分析结果，改性前嗜酸乳杆菌肽聚糖的谱图在3595.87cm-1处，有-OH伸缩振动，在2948.46cm-1处，是C-H伸缩振动，在1366.43cm-1也有峰，这些均为糖类物质的特征峰；1648.01cm-1处有强吸收峰，为酰胺键C=O伸缩振动；1559.77cm-1为N-H键的变角振动；1079.22cm-1处有C-O-H伸缩振动；此外，可以明显观察到经改性后嗜酸乳杆菌肽聚糖在1648.01cm-1处的吸收峰强度随着NaClO用量的增加而加强，而此处的吸收峰恰为羰基特征吸收峰，并且C2-C3位置上的-OH未发生变化，因此只有C6位的伯羟基发生氧化生成-COOH，在碱性条件下-COOH以-COONa的形式存在，正因为如此，在3300-2500cm-1未出现宽而强的羧基的吸收峰，通过以上分析可以推断，TEMPO-NaClO-NaBr催化氧化体系对嗜酸乳杆菌肽聚糖具有很强的选择性氧化作用，且氧化作用发生在空间位阻较小的C6位伯羟基上。
对上述实施例1方法生产得到的改性前后嗜酸乳杆菌肽聚糖采用苯酚-硫酸化法测定糖含量: 分别准确称取干燥恒重的改性前后嗜酸乳杆菌肽聚糖100mg，相应的用蒸馏水准确定容至100ml，配成1mg/l的PG溶液，摇匀后准确吸取1ml该溶液于试管中，在冰水浴中加入0.5ml 6%苯酚液，振荡摇匀后缓慢逐滴加入浓硫酸3ml，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水浴放置20min，取出用凉水冷却10min，根据标准计算公式y=10107x+0.253（R2 =0.9928）计算出糖含量，实验结果如图2所示，由图2可知，改性后嗜酸乳杆菌肽聚糖的糖含量远远高于改性前嗜酸乳杆菌肽聚糖的糖含量，且改性后嗜酸乳杆菌肽聚糖的糖含量都达到70%以上。
对上述实施例1方法生产得到的改性前后嗜酸乳杆菌肽聚糖的总抗氧化能力试验：以小鼠为对象，将小鼠随机均分成三组，正常对照组、改性前嗜酸乳杆菌肽聚糖及改性后嗜酸乳杆菌肽聚糖，每组7只。分别用生理盐水、改性前后的PG对小鼠进行灌胃处理，7d后眼球取血1 ml左右，分离出血清。测定血清中SOD的含量，操作方法根据南京建成公司总抗氧化能力（T-SOD）试剂盒说明书。结果如表1所示，改性后嗜酸乳杆菌肽聚糖的总抗氧化能力达到332.65±14.10U/ml，显著高于改性前嗜酸乳杆菌肽聚糖的总抗氧化能力296.25±39.13U/ml。
表1 对小鼠血清SOD 的影响( x±s)
| 组别 | 动物数(只) | SOD（U/ml） |
| 正常对照组 | 7 | 246.98± 9.97 |
| 改性前PG | 7 | 296.25± 39.13* |
| 改性后PG | 7 | 332.65± 14.10**# |
（注：改性后PG与正常对照组比较， *P<0.01，**P<0.05； 改性后PG与改性前PG比较 ， #P<0.05）。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）湿菌体的制备
将嗜酸乳杆菌置于三角瓶中，于60-70℃水浴35-45min 加热杀死菌体，然后加入0.5%Triton X-100溶液，于80-90℃水浴0.5-1.5h，并不断连续搅拌，取出溶液置冰浴中立即冷却，于10000×g-15000×g离心8-12 min后弃上清，将沉淀再用双蒸水充分洗涤两次，再次于10000×g-15000×g离心8-12 min后弃上清，然后用甲醇-水、甲醇依次洗涤去除沉淀中的杂质后得到湿菌体；
（2）酶解破壁
将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中，于35-40℃水浴10-14 h，再于4℃、10000×g-15000×g离心30-50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于35-40℃水浴10-14 h，再于4℃、10000×g-15000×g离心30-50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于35-40℃水浴处理20min，再于4℃，10000×g-15000×g离心30-50min弃上清取沉淀；
（3）去脂去蛋白
将步骤（2）所得沉淀依次经甲醇、甲醇-氯仿及氯仿洗涤脱脂，于10000×g-15000×g离心35-45min后弃上清，取脱脂后的沉淀加入一定量的酶溶液Ⅳ中，于35-40℃消化10-15h，再于4℃，10000×g-15000×g离心30-50min，取沉淀加入酶溶液Ⅳ进行消化离心重复3次弃上清，得到去脂去蛋白沉淀；
（4）纯化
将步骤（3）得到的去脂去蛋白沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5-3.5d后，经0.01 mol/L的硫酸溶液于85-95℃ 处理5min后，冰水浴中立即冷却，再于4℃ 、10000×g-15000×g离心25-35min弃上清, 取沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5-3.5d，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖；其中硫酸溶液与原料嗜酸乳杆菌的比例为2mL：3g；
（5）TEMPO-NaClO-NaBr选择性氧化修饰
在烧杯中加入一定量的嗜酸乳杆菌肽聚糖和适量的蒸馏水，再加入一定量的四甲基哌啶（TEMPO）和NaBr，用玻璃棒搅拌均匀，制得肽聚糖乳液，在肽聚糖乳液中加入一定量的NaClO，控制温度为4℃，调节pH为8.4-8.6，反应25-35min，加入Na2SO3还原未反应的微量氧化剂，加入少量乙醇终止反应，将反应液倒于过量的乙醇中，并不断搅拌，静置一段时间，抽滤得到滤饼，将滤饼用乙醇水溶液多次反复洗涤后，透析，冷冻干燥，得到氧化修饰的嗜酸乳杆菌肽聚糖产物。
2.根据权利要求1所述的一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于：所述的酶溶液Ⅰ配制方法如下：氯化镁0.1017 g ，胰蛋白酶50 mg ，DNase 5 mg，RNase 7.5mg，溶解于50mL pH7.2 的Tris-HCl溶液中；所述的酶溶液Ⅱ配制方法如下：α-糜蛋白酶25mg ，胰蛋白酶25mg ，溶解于50ml pH 7.2 的Tris-HCl溶液中；所述的酶溶液Ⅲ配制方法如下：胃蛋白酶30 mg，溶解于30mL 0.01 mol/L的盐酸溶液中；所述的酶溶液Ⅳ配制方法如下：蛋白酶E 80 mg，溶解于80mL的pH 7.4的Tris-HCl溶液中。
3.根据权利要求2所述的一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于：所述的嗜酸乳杆菌与所述的Triton X-100溶液的混合比例为3g：10mL， 所述的嗜酸乳杆菌与所述的酶溶液Ⅰ的比例为3g：8mL，所述的酶溶液Ⅰ、所述的酶溶液Ⅱ、所述的酶溶液Ⅲ与所述的酶溶液Ⅳ的比例为2：2：1：1；所述的甲醇-水中甲醇与水的体积比为2：l； 所述的甲醇-氯仿中甲醇与氯仿的体积比为1:1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于：所述的嗜酸乳杆菌肽聚糖、所述的蒸馏水、所述的四甲基哌啶、所述的NaBr和所述的NaClO的混合比例为200mg：20ml：5mg：48mg：0.3-0.5mmol，所述的乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为7：3。
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