CN102876606A - 一种高产肽聚糖的工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产肽聚糖的工程菌及其应用，高产肽聚糖的工程菌命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)hzsb，保藏号为CGMCCNO.6199；该菌株通过菌种驯化、诱变育种及基因重组技术手段构建；将所述嗜酸乳杆菌hzsb活化后接种至发酵培养基上进行发酵培养；取发酵液离心收集菌体；从菌体中提取肽聚糖，每1000ml发酵液中，可得25.89g肽聚糖，为原始菌株的4.53倍。

Description

一种高产肽聚糖的工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物发酵工程技术领域，具体涉及一种耐氧、耐高温、高产肽聚糖的工程菌及其应用。

背景技术

在发酵工艺过程中，发酵温度由于受外界环境、细胞代谢等因素影响，造成发酵体系温度升高，引起菌体内的脂肪酸、蛋白质等成分变化，影响细胞正常生理活动。然而提高发酵温度可大大减少工厂生产中冷却水的消耗，降低发酵成本；同时，发酵温度的提高可以减少杂菌污染的机会，减少倒灌几率，所以如何提高菌株的高温耐受性引起了许多国内外研究者的关注。

申请号为200910204295.3的中国发明专利公开了一株耐高温酿酒酵母菌及其应用，该发明的酿酒酵母菌是从米酒酒曲中筛选出来并通过高温驯化得到，该菌株耐受温度高达36～44℃、乙醇产率高、可发酵糖范围广；申请为201110419568.3的中国发明专利公开了一株耐高温、耐高糖的乳酸菌，该发明通过高温驯化、硫酸二乙酯(DES)诱变和亚硝基弧(NTG)诱变相结合的方法处理原始出发菌种，筛选得到在55℃下生长良好，耐受250g/L葡萄糖的工程菌；申请号为201110360406.7的中国发明专利公开了一株耐高温柠檬酸生产菌株，通过离子束注入诱变处理出发菌株及高温筛选，得到的菌株可耐受42℃的高温，且在高温条件下遗传性状稳定，产酸水平较高。

嗜酸乳杆菌是一类革兰氏阳性杆菌，其细胞形态呈多样性，一般形成链杆状或球杆状，无鞭毛、不运动、无芽孢。该菌属厌氧或兼性厌氧菌，最适生长温度为35～38℃，最高生长温度43～48℃，耐热性差，在微氧或无氧环境中生长良好，但在有氧条件下生长较缓慢。

肽聚糖(peptidoglycan，PG)，又称为粘肽(Mucopeptide)、糖肽(glycopeptide)是细菌尤其是G+菌细胞壁的主要组成成分。它是一种强免疫增强剂(Immunostimulants)，能通过诱导各种免疫调控物质的释放或表达来刺激免疫系统，提高机体免疫功能，发挥自稳调节和抗感染、抗肿瘤效应。Sekine等(1995)曾报道双歧杆菌完整PG能激活小鼠腹腔巨噬细胞，使其IL-1、IL-6及TNF-α的mRNA表达增强，他认为PG成分在双歧杆菌提高机体免疫监视功能方面可能起重要作用。马西艺等(2003)研究认为乳酸杆菌PG能激活NK细胞、腹腔巨噬细胞产生，IFN-γ、TNF和NO，其可能部分街道了它的抗肿瘤作用。而关于嗜酸乳杆菌细胞壁中PG的研究还鲜见报道，且肽聚糖作为功能性食品、新型药物或饲料添加剂，在国内研究与开发较少，目前尚无产品上市，更无厂家生产。

发明内容

本发明提供了一种耐氧、耐高温、高产肽聚糖的工程菌，以解决现有菌株肽聚糖产量不高、菌株生长缓慢和发酵成本过高的问题。

一种高产肽聚糖的工程菌，命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)hzsb，保藏号为CGMCC NO.6199。

该菌株已于2012年06月08日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.6199。

该菌株具有良好的耐氧、耐高温特性，在37～62℃条件下均具有较高的活性，使用MRS液体培养基有氧培养24h，37℃条件下，活菌数达到8.17×10⁹cfu/mL，为原始菌株LA₀的6.92倍；62℃条件下，活菌数可达5.89×10⁹cfu/mL；同时，该菌株每1000mL发酵液，可得肽聚糖25.89g，为原始菌株LA₀的4.53倍。

本发明还提供了一种利用所述工程菌生产肽聚糖的方法，包括：

(1)将所述嗜酸乳杆菌hzsb活化后接种至发酵培养基中进行发酵培养；

(2)取发酵液，离心收集菌体；

(3)从所述菌体中提取肽聚糖。

所述发酵培养基以MRS培养基为基础培养基，通过正交设计等方法分别进行初始pH、碳源、氮源、碳氮比例以及增值因子的优化。

以体积1L计，优化后的发酵培养基包含：葡萄糖4～16g、乳糖4～6g、蛋白胨14～16g、酵母粉9～11g、番茄汁145～155ml、胡萝卜汁115～125ml、啤酒55～65ml、吐温-80 0.9～1.1ml、乙酸钠4～6g、K₂HPO₄·3H₂O 2.6～2.7g、柠檬酸二胺1.8～2.2g、MgSO₄·7H₂O 0.18～0.22g、MnSO₄·H₂O 0.045～0.055g。

更优选为，以体积1L计，所述发酵培养基含有：葡萄糖15g、乳糖5g、蛋白胨15g、酵母粉10g、番茄汁150ml、胡萝卜汁120ml、啤酒60ml、吐温-801ml、乙酸钠5g、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g、柠檬酸二胺2g、MgSO₄·7H₂O0.2g、MnSO₄·H₂O 0.05g。

使用该最优化的培养基在37℃培养嗜酸乳杆菌hzsb菌株，10h达到对数生长期末期，pH值为4.01，活菌数达到6.24×10¹⁰cfu/mL。

所述胡萝卜汁和番茄汁的浓度均为1～1.5g/ml，优选为1g/ml。

优选地，所述发酵培养基的初始pH值为6.2～6.6，更优选为6.4，在该初始pH值条件下，按4％接种量，37℃培养24h，活菌数均在8.0×10⁹cfu/mL左右。

优选地，所述发酵培养的温度为37～62℃，更优选为37℃；所述发酵培养的时间为10～14h，更优选为12h；所述嗜酸乳杆菌hzsb在所述发酵培养基中的接种量为4％。

本发明的嗜酸乳杆菌hzsb在上述优化后的发酵培养基中发酵培养，当发酵培养基的初始pH值为6.4、培养温度为37℃、培养时间为12h时，每1000ml发酵液中，可得25.89g肽聚糖，为原始菌株的4.53倍。

就肽聚糖的提取方法而言，可以是现有技术中的提取方法，本发明所采用的提取肽聚糖的方法为：

(1)将所述菌体裂解，去除胞内物，得到破碎的菌体；

(2)对破碎的菌体进行脱脂、蛋白酶酶解处理，制得所述肽聚糖。

所述菌体裂解，去除胞内物的方法为：

将所述菌体悬浮于三氯乙酸溶液，水浴加热裂解菌体，完成后离心收集沉淀；

菌体与三氯乙酸的体积比一般在1∶10，三氯乙酸浓度达到10％，水浴温度选择为70℃，2h以上就可以完成裂解，离心转速为8000r/min，离心收集的沉淀最好有生理盐水清洗三次以上。

所述脱脂是指将沉淀溶于有机溶剂中，搅拌一定时间后离心分离，脱脂采用的有机溶剂选用乙酸钠、氯仿和甲醇混合液，体积比优选为4∶5∶10，沉淀与有机溶剂的重量体积比为1∶20，离心转速同样为8000r/min。

所述酶解为：将沉淀溶于含胰酶和碱性蛋白酶的磷酸缓冲液，37℃水浴振荡反应10h。

酶解完成后肽聚糖处于溶液状态，可以将酶解液离心，收集沉淀，沉淀经无菌水清洗后进行真空冷冻干燥，制得固态状的肽聚糖；离心转速选择为12000r/min，磷酸缓冲液的pH值一般为8.0。

本发明的有益效果：

本发明综合应用了传统的驯化育种、诱变育种及基因重组等手段构建一株具有明显的耐氧、耐高温性、生长周期短、遗传形状较稳定的高产肽聚糖工程菌株，并提供了实用性强、操作简单、周期短、步骤简便合理的肽聚糖提取方法，解决了嗜酸乳杆菌在有氧条件下生长缓慢的问题，有效提高了肽聚糖的产量，同时大大减少大规模发酵生产中冷却水的消耗，显著降低发酵成本，具有成本低、产率高、适宜规模化生产等优点。

附图说明

图1是不同碳源对hzsb菌株生长情况的影响图。

图2是不同氮源对hzsb菌株生长情况的影响图。

具体实施方式

以下实施例所使用的培养基组分及其浓度如下：

MRS培养基：葡萄糖20g、酵母粉5g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、吐温-801ml、乙酸钠5g、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g、柠檬酸二胺2g、MgSO₄·7H₂O0.2g、MnSO₄·H₂O 0.05g，加蒸馏水至1000ml，调pH6.4，固体培养基加入15g琼脂，120℃灭菌30min。

发酵培养基：葡萄糖15g、乳糖5g、蛋白胨15g、酵母粉10g、番茄汁150ml、胡萝卜汁120ml、啤酒60ml、吐温-801ml、乙酸钠5g、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g、柠檬酸二胺2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·H₂O0.05g，加蒸馏水至1000ml，调pH6.4，120℃灭菌30min。

再生培养基：基础培养基MRS(不含吐温-80)、明胶25.0g、MgCl₂5.0g、CaCl₂2.8g、蔗糖171.2g、胎牛血清(BSA)5.0mL、琼脂15～18g，调pH6.4，121℃灭菌20min。

高渗溶液：0.01mol/L Tris-HCl、20mmol/L MgCl₂、0.5mol/L蔗糖，去离子水配制，调pH7.0，121℃灭菌20min，4℃保存备用。

35％PEG溶液：PEG-600035g，用高渗溶液溶解，配成100mL PEG溶液。

溶菌酶酶溶液：称取1g溶菌酶(酶活＞20000U/mg)溶解在100mL高渗溶液中，配成终浓度为10mg/mL的酶溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。

实施例1：耐氧嗜酸乳杆菌的筛选

(1)菌株的活化与培养

嗜酸乳杆菌原始菌株(CGMCC 1.1878)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，接种于10％脱脂乳中，于37℃、24h活化2次，然后按4％接种量接入MRS液体培养基中进行继代培养24h后，备用。

(2)嗜酸乳杆菌的逐级有氧驯化

取活化的嗜酸乳杆菌LA₀为出发菌株，于MRS液体培养基中(CO₂17％)，37℃增菌培养24h，制得增菌液涂布于MRS琼脂平板，置CO₂17％厌氧培养箱中培养；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，进行微厌氧培养(CO₂15％+O₂ 2％)，制得菌液涂布于MRS琼脂平板，置CO₂15％+O₂5％环境中培养；重复以上步骤，逐渐使CO₂和O₂的含量接近于大气，筛选得到两株具有耐氧能力的嗜酸乳杆菌LA_n-1和LA_n-2。

将LA_n-1和LA_n-2接种于MRS培养基，37℃培养48h，可见菌落呈圆形、隆起、乳白色、光滑、直径1～2mm，与驯化前的菌落形态无差别。通过革兰氏染色验证为革兰氏阳性菌，电镜扫描观察细胞为链杆状或球杆状，约(0.6～0.9)×(1.5～6)μm，无鞭毛，不运动。

实施例2：耐高温嗜酸乳杆菌突变株的筛选

(1)⁶⁰Co-γ射线诱变育种

取生长至对数生长中后期的耐氧嗜乳酸杆菌LA_n-1菌液，6000r/min离心10min，用无菌生理盐水洗涤沉淀2次，收集菌体并悬浮于无菌生理盐水中，配成浓度为10⁸个/mL菌液用于诱变，诱变剂量1400Gy。

(2)化学诱变育种

用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)制备新鲜的耐氧嗜乳酸杆菌LA_n-2菌悬液，细胞浓度控制在10⁸个/mL左右，加入1.0％(v/v)硫酸二乙酯(DES)，混匀后在37℃下水浴40min，加入等体积的终止剂2％的硫代硫酸钠，终止诱变，6000r/min离心10min，再用磷酸缓冲液洗涤沉淀2次，最后用生理盐水将菌体稀释。

(3)突变株的筛选

经过⁶⁰Co-γ射线和DES诱变处理后的菌液涂布于MRS琼脂平板上，以出发菌为对照，于45、50、55、60、65、70℃条件下培养48h。将其中生长较快、菌落较大的菌株挑出，进行摇瓶复筛。最终筛选得到5株在55℃条件下生长周期较短、耐温性较好的突变菌株。

(4)基因组重组及筛选

将步骤(3)获得的5株突变菌株在55℃、MRS培养基中培养到对数生长中后期，各取5mL菌液混合后离心，用高渗溶液洗涤2次，重新收集菌体悬浮于8mL溶菌酶溶液中，37℃水浴处理45min制备原生质体。酶解结束后以5000r/min离心10min，高渗溶液洗涤沉淀2次，然后加入8mL 35％PEG溶液，37℃水浴保温2min，5000r/min离心10min，弃上清液，用2mL高渗溶液充分悬浮，然后涂布于再生培养基平板上，置于55～70℃条件下培养48h，将其中生长较快、菌落较大的菌株挑出，进行摇瓶复筛。筛选得到生长速度快、耐温性好的重组菌作为第一轮菌株F1，进行下一轮的原生质体制备、融合与筛选，所得重组菌株作为第二轮菌株F2，依次类推进行5轮改组。

(5)遗传稳定性检测

将步骤(4)中经过5轮改组后筛选得到的重组菌株，接种MRS液体培养基，连续传代10次，最终获得一株生长周期短、具有明显的耐高温性、遗传形状较稳定的重组菌株。该菌株在37～62℃条件下均具有较高的活性，其在MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，活菌数达到8.17×10⁹cfu/mL，为原始菌株LA₀的6.92倍；62℃条件下培养24h，活菌数达到5.89×10⁹cfu/mL。

通过形态学及生化特性鉴定表明，该菌株为革兰氏阳性杆菌，与原始菌株LA₀相比，菌落形态及菌体形态特征基本一致，但更为纤细，生化特性未发生改变，属嗜酸乳杆菌。

将该菌株于2012年06月08日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中，命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)hzsb，保藏编号：CGMCC NO.6199。

实施例3：发酵培养基(增菌培养基)的优化

(1)培养pH条件的确定

考虑到生产工艺要求培养基必须基于菌体产量高、容易分离收获细胞，因此选用易分离菌体的MRS培养基为基础发酵培养基，并在此基础上进行优化改良。

用无菌的HCl或NaOH溶液调节培养基的初始pH，得到一系列pH不同的培养基，按4％接种量，37℃培养24h，检测活菌数，最终确定培养基初始pH值为6.4。(见表1)

表1初始pH值对hzsb菌株活菌数的影响

初始pH值	活菌数(109cfu/mL)
		5.6	4.52
5.8	5.76
		6.0	6.83
6.2	7.98
		6.4	8.17
6.6	8.02
		6.8	6.86
7.0	4.65

(2)碳源、氮源的优化

固定MRS培养基中除葡萄糖以外的其它组分，分别考察2.0％的葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖对OD₆₀₀值的影响，4％接种量，37℃培养24h，测OD₆₀₀值进行比较。结果见图1，可知不同碳源对hzsb菌株生长情况的影响分别为：葡萄糖＞乳糖＞低聚果糖＞低聚异麦芽糖＞蔗糖，因此选择葡萄糖和乳糖作为最佳碳源。

同样的，固定MRS培养基中除蛋白胨、酵母粉、牛肉膏以外的其它组分，分别考察1.5％的牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨对OD₆₀₀值的影响。结果见图2，可知不同氮源对hzsb菌株生长情况的影响分别为：蛋白胨＞酵母粉＞大豆蛋白胨＞牛肉膏＞胰蛋白胨，因此选择酵母粉和蛋白胨作为最佳氮源。

为了进一步确定发酵培养基的最佳组合，以葡萄糖、乳糖、蛋白胨、酵母粉为考察因子，各取4水平，采用正交设计L₁₆(4⁴)进行分析(见表2)，筛选出最优组合，并经过试验验证，确定最佳配比为：葡萄糖1.5％、乳糖0.5％、蛋白胨1.5％、酵母粉1.0％。以此做为基础培养基，优化增殖因子的添加量。

表2碳氮源正交试验结果(L₁₆(4⁴))

(3)增殖因子的优化

选择番茄汁、胡萝卜汁和啤酒作为增殖因子，采用三因素三水平试验(L₉(3³))，考察它们对hzsb菌株生长情况的影响。由正交结果中筛选出最优组合，并经过验证试验，确定增殖因子的配比为番茄汁15％、胡萝卜汁12％和啤酒6％。(见表3)

番茄汁的制备：新鲜番茄→清洗→去皮→称重取500g→榨汁取汁液→加水定容至500mL汁→灭菌(90-95℃，20min)→迅速降温备用。

胡萝卜汁的制备：新鲜胡萝卜→清洗→去皮及根梢→称重取500g→切块→水煮(原料∶水＝1∶4，100℃，15-25min)→榨汁取汁液→加水定容至500mL汁→115℃灭菌15min→冷却备用。

表3增殖因子正交试验结果(L₉(3³))

最终确定hzsb菌株发酵培养基为：葡萄糖15g、乳糖5g、蛋白胨15g、酵母粉10g、番茄汁150ml、胡萝卜汁120ml、啤酒60ml、吐温-801ml、乙酸钠5g、K₂HPO₄·3H₂O 2.62g、柠檬酸二胺2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·H₂O 0.05g，加蒸馏水至1000ml。

使用该培养基37℃培养hzsb菌株，10h达到对数生长期末期，pH值为4.01，活菌数达到6.24×10¹⁰cfu/mL。

实施例4：肽聚糖的分离提取

(1)菌体的收集

经过活化的重组菌株hzsb接种于优化的发酵培养基中，接种量4％，培养基初始pH6.4，37℃培养12h，收集发酵培养液1000mL进行肽聚糖的分离提取试验；同样的，将活化的原始菌株LA₀接种于MRS液体培养基中，相同条件下培养，取1000mL发酵液进行对照试验。将发酵液置于6000r/min条件下离心10min，弃上清液收集菌泥，用含0.9％NaCl的无菌生理盐水离心洗涤至菌体发白。

(2)磷壁酸的去除

按1g重量的湿菌体比10mL体积的10％三氯乙酸(TCA)溶液比例混匀后，70℃水浴2h，冷却后8000r/min离心20min，收集沉淀，无菌生理盐水洗涤沉淀3次。

(3)脱脂方法

在上述沉淀中加入体积比为4∶5∶10混合的乙酸钠、氯仿和甲醇混合液，按1g沉淀比20mL混合液的比例进行混匀，室温搅拌24h，8000r/min离心20min，弃上清液，甲醇溶液清洗沉淀2次，收集沉淀。

(4)蛋白酶消化

pH8.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液离心洗涤沉淀1次，按固液比1∶10加入含胰酶和碱性蛋白酶的磷酸缓冲液中(酶活力单位为3000NFU)，37℃水浴振荡10h，12000r/min离心30min，收集沉淀，用无菌水清洗3次后进行真空冷冻干燥，得白色絮状粉末，即为肽聚糖成品。

使用上述方法，每1000mL hzsb菌株发酵液，可得肽聚糖25.89g，为原始菌株LA₀的4.53倍。

Claims (10)

1.一种高产肽聚糖的工程菌，其特征在于，命名为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)hzsb，保藏号为CGMCC NO.6199。

2.一种利用如权利要求1所述工程菌生产肽聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所述嗜酸乳杆菌hzsb活化后接种至发酵培养基中进行发酵培养；

(2)取发酵液，离心收集菌体；

(3)从所述菌体中提取肽聚糖。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以1L计，所述发酵培养基包含：葡萄糖4～16g、乳糖4～6g、蛋白胨14～16g、酵母粉9～11g、番茄汁145～155ml、胡萝卜汁115～125ml、啤酒55～65ml、吐温-800.9～1.1ml、乙酸钠4～6g、K₂HPO₄·3H₂O 2.6～2.7g、柠檬酸二胺1.8～2.2g、MgSO₄·7H₂O0.18～0.22g、MnSO₄·H₂O 0.045～0.055g。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的初始pH值为6.2～6.6。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为37～62℃。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为10～14h。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取肽聚糖的方法为：

(1)将所述菌体裂解，去除胞内物，得到破碎的菌体；

(2)对破碎的菌体进行脱脂、蛋白酶酶解处理，制得所述肽聚糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌体裂解的方法为：将所述菌体悬浮于三氯乙酸溶液，水浴加热裂解菌体，完成后离心收集沉淀。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脱脂采用的溶剂为乙酸钠、氯仿和甲醇的混合液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为胰酶和碱性蛋白酶的混合物。

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