KR20210040041A

KR20210040041A - 염증 치료에서의 만누론 이산 조성물의 용도

Info

Publication number: KR20210040041A
Application number: KR1020217001707A
Authority: KR
Inventors: 메이유 장; 시안리앙 신; 젠킹 장; 지안 딩
Original assignee: 상하이 그린벨리 파머수티컬 주식회사; 상하이 인스티튜트 오브 마테리아 메디카 차이니즈 아카데미 오브 싸이언시즈
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2021-04-12
Also published as: AU2019296419A1; JP2021529195A; US11406659B2; CN110652525A; US20210275570A1; EP3815693A4; WO2020001611A1; EP3815693A1

Abstract

본 발명은 염증 치료에서의 만누론 이산 올리고당 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

염증 치료에서의 만누론 디카르복실산 조성물의 용도

본 발명은 염증 치료에서의 생물학적 활성 스크리닝 방법에 의해 수득된 만누론 이산의 최적의 조성물의 용도에 관한 것이다.

염증은 외상(trauma), 출혈, 병원성 감염, 이물질 등에 의해 자극된 생물학적 조직의 생리적 반응을 의미한다. 염증 반응은 프로스타글란딘 및 류코트리엔과 같은 일부 특정 자기-활성(self-active) 물질 및 인터루킨과 같은 특정 염증성 사이토카인의 변화를 포함한다. 이물질 제거와 염증 발생에 의한 감염 제거 외에도 과도한 염증은 신체 자체의 물질을 손상시킬 수 있다. 현재, 적응증 제거를 위한 항생제 사용을 제외하고 일반적으로 사용되는 항염증제는 주로 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제이다.

만누론 이산은 이들의 잠재적인 약용 가치로 인해 광범위한 관심을 받아왔다. 만누론 이산은 일반적으로 알긴산을 원료로 여러 단계에 의해 제조된다.

원료 알긴산의 다당류 분자는 β-1,4-글루코시드 결합에 의해 연결된 D-만누론산으로 형성된 M 세그먼트, α-1,4-글루코시드 결합에 의해 연결된 L-굴루론산(guluronic acid)으로 형성된 G 세그먼트 및 두 개의 당류의 혼성에 의해 형성된 MG 세그먼트를 포함한다. D-만누론산 및 L-굴루론산의 구조식은 하기 화학식 (I)로 표시된다.

[화학식 I]

M 세그먼트와 G 세그먼트는 원료인 알긴산에서 분리될 수 있다. 일반적인 방법은 하기와 같이 간단하게 설명할 수 있다. 알긴산은 미리 분해되어 폴리만누론산과 폴리굴루론산의 혼합 다당류를 생성한다. 그 후 혼합된 다당류를 산성 침전시켜 그 안의 폴리굴루론산을 제거하고, 순도 90% 이상의 호모폴리만누론산(homopolymannuronic acid)(이하 "M 세그먼트 중간체"라고도 함)을 수득하기 위해 추가 정제를 수행한다. 예를 들어, 중국 특허 출원 번호 98806637.8 및 CN02823707.2에 개시된 방법을 참조한다.

올리고머 만누론산(oligomeric mannuronic acid)을 제조하기 위해, 상기에서 수득된 M 세그먼트 중간체를 산성 조건하에서 가열함으로써 추가 산분해(acidolysis)를 실시하여 원하는 분자량 범위를 갖는 작은 단편 만누론산 중합체를 수득한다. 또한, 분해 효율은 산화 분해(oxidative degradation) 방법에 의해 개선될 수 있다; 한편, 환원 말단은 개환된 당 이산(ring-opened saccharic diacid)으로 산화될 수 있다(구체적인 것은 Meiyu Geng 등의 중국 특허 출원 번호 200580009396.5(특허 문헌 1) 및 미국 특허 번호 8,835,403 B2(특허 문헌 2)를 참조한다). 설명의 편의를 위해, 특허 문헌 1 및 2는 이하에서 총괄하여 선행 문헌으로 지칭되며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

선행 문헌에 개시된 만누론 이산을 수득하기 위한 반응은 하기 반응식 (II)로 나타낼 수 있는데, 즉 올리고만누론산(oligomannuronic acid) 다당류의 환원 말단에 있는 만누론산의 C1 위치의 알데히드기가 카르복실기로 산화된다.

[반응식 II]

상기의 산화 전환(oxidative conversion) 공정에서 일반적으로 사용되는 산화제는 알칼리성 황산구리 용액, 즉 펠링(Fehling)의 시약이다. 선행 문헌은 이 산화 방법을 채택한다. 구체적으로 알칼리 조건하에서 반응 기질인 폴리만누론산, 즉 상기 M 세그먼트 중간체를 황산구리 용액에 첨가하고 끓는 수조에서 15분 내지 2시간 동안 반응시킨다. 이 방법은 산화제로서 Cu²⁺ 이온을 사용하여 알데히드기를 산화시키며, 반응에서 붉은 벽돌색의 산화구리(I)(cuprous oxide) 침전물이 생성된다. 이 반응은 종종 환원당을 식별하는 데 사용된다.

선행 문헌은 올리고만나르산(oligomannaric acid)은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 및 당뇨병(Diabetes Mellitus)에 영향을 미친다는 것을 개시한다. 알츠하이머병과 제2형 당뇨병(type 2 diabetes)의 발병 기전은 아밀로이드(β-아밀로이드 및 아밀린)와 밀접한 관련이 있다. 아밀로이드 단백질은 응집된 다음 단백질 올리고머를 생성하며, 이는 추가로 응집되어 섬유를 형성한다. 이러한 단백질 응집체는 세포독성을 갖고 세포에서 산화 반응을 유도하여 미토콘드리아를 손상시키고 염증 반응과 같은 단계적 연쇄반응을 유발하여 다수의 뉴런과 β 세포에 손상을 입히고 궁극적으로 알츠하이머병 및 제2형 당뇨병을 유발한다. 올리고만나르산은 아밀로이드 단백질을 표적으로 하고 아밀로이드 단백질에 의해 유발되는 단계적 연쇄반응을 길항하므로(antagonize) 알츠하이머병과 제2형 당뇨병을 예방하고 치료하는 효과가 있다.

선행 문헌 CN106344595A는 염증 치료에서 환원 말단의 위치 1에 카르복실기를 갖는 올리고만나르산의 적용 및 이의 유도체를 개시하고, 또한 염증 치료에서 사당류 내지 십당류 혼합물의 약력학적 활성을 개시한다.

본 발명의 목적은 염증 치료에 사용될 수 있는 만누론 이산 올리고당 조성물을 개발하는 것이다.

본 발명은 염증 치료에서 만누론 이산 올리고당(mannuronic diacid oligosaccharide) 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염증 치료를 위한 방법에 관한 것이고, 이는 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물은 화학식 (III)의 만누론 이산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:

[화학식 III]

여기서 n은 1 내지 9에서 선택된 정수이고, m은 0, 1 또는 2에서 선택되고, m'는 0 또는 1에서 선택되고,

여기서,

n = 1 내지 5인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 60% 이상을 차지하고;

n = 1 내지 2인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 60% 이하를 차지한다.

출원인은 특정 조성의 만누론 이산 올리고당 조성물이 염증 반응 치료에 유익한 효과를 나타내는 동시에 천연물 유래의 높은 안전성으로 인해 환자의 만성 또는 급성 통증 완화에 유리함을 발견하였다.

도 1은 생성물 A에서 이당류, 삼당류 및 사당류의 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 2는 생성물 A에서 오당류, 육당류 및 칠당류의 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 3은 생성물 A에서 팔당류, 구당류 및 십당류의 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 4는 Aβ로 유도된 신경염에 대한 단일 중합도를 갖는 올리고만나르 산의 억제 효과를 보여준다.
도 5a 및 5b는 생쥐의 류마티스 관절염에 대한 본 발명의 올리고당 조성물 및 육당류의 치료 효과를 보여준다; 도 5b의 가로좌표 숫자에 해당하는 시료는 하기와 같다. i: 대조군; ii: 모델군; iii: 생성물 A; iv: 생성물 B; v: 생성물 C; vi: 생성물 D; vii: 비교 실험 시료; viii: 육당류.
도 6a 및 6b는 생쥐의 다발성 경화증에 대한 본 발명의 올리고당 조성물 및 육당류의 치료 효과를 나타낸다; 도 6b의 가로좌표에 있는 기호는 도 5b의 기호와 동일하다.
도 7a 및 7b는 생쥐의 전신홍반루푸스에 대한 본 발명의 올리고당 조성물 및 육당류의 치료 효과를 보여준다. 도 7b의 가로좌표에 있는 기호는 도 5b의 기호와 동일하다.
도 8a 및 8b는 생쥐의 염증성 장염에 대한 본 발명의 올리고당 조성물 및 육당류의 치료 효과를 보여준다. 그림 8b의 가로좌표에 있는 기호는 도 5b의 기호와 동일하다.

이하, 본 발명의 다양한 측면을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 특정 실시예에 제한되지 않는다. 당업자는 하기의 실질적인 개시에 따라 본 발명에 대해 약간의 수정 및 조정을 할 수 있으며, 이러한 조정은 또한 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명은 염증 치료에서 만누론 이산 올리고당 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염증 치료 방법에 관한 것이고, 이는 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물은 화학식 (III)의 만누론 이산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

[화학식 III]

여기서,

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물에서, m + m'= 1 또는 2인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 50% 이상, 바람직하게는 60 내지 90%, 더 바람직하게는 70 내지 90%이다. 특히, 만누론 이산 올리고당 조성물에서, m + m'= 1인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 10% 이상, 바람직하게는 30 내지 40%이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 만누론 이산 올리고당 조성물에서, m + m'= 2인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 10% 이상, 바람직하게는 30 내지 50%이다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물에서, n = 1 내지 5인 만누론 이산 올리고당의 총 중량은 조성물의 총 중량의 80 내지 95%를 차지한다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물에서, n = 1 내지 2인 만누론 이산 올리고당의 총 중량은 조성물의 총 중량의 10 내지 50%, 보다 바람직하게는 30 내지 50%를 차지한다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물에서, n = 1 내지 3인 만누론 이산 올리고당의 총 중량은 조성물의 총 중량의 20 내지 70%를 차지한다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물에서, n = 1 내지 3인 만누론 이산의 총 중량 대 n = 4 내지 7인 만누론 이산의 총 중량의 비는 1.0 내지 3.5, 바람직하게는 1.0 내지 3.0이다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물에서, 상기 조성물에서 중합도 각각에 따른 만누론 이산의 중량% 함량은 이당류 5 내지 25%, 삼당류 15 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 5 내지 25%, 육당류 2 내지 20%, 칠당류(heptsaccharide) 2 내지 20%, 팔당류(octasaccharide) 2 내지 20%, 구당류(nonasaccharide) 2 내지 20%, 십당류(decasaccharide) 2 내지 20%이다. 특히, 조성물에서, 상기 조성물에서의 올리고당의 중량% 함량은 이당류 5 내지 25%, 삼당류 15 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 10 내지 20%, 육당류 5 내지 15%, 칠당류 3 내지 10%, 팔당류 2 내지 5%, 구당류 1 내지 5%, 십당류 1 내지 5%이다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물에서 올리고당의 중량% 함량은 이당류 10 내지 20%, 삼당류 18 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 15 내지 20%, 육당류 5 내지 10%, 칠당류 3 내지 5%, 팔당류 2 내지 5%, 구당류 1 내지 3%, 십당류 1 내지 3%이다.

본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물에서, 이의 약학적으로 허용되는 염은 나트륨 염 또는 칼륨 염이다.

본 특허 출원의 발명자들은 새로운 구조를 갖는 상기 9개의 올리고당을 일정 비율로 배합하면 고-활성 올리고당 조성물을 수득할 수 있고, 이는 가장 활성이 높은 육당류보다 활성이 높다는 것을 발견하였다. 특히, 일정 비율의 이당류와 삼당류를 첨가한 조성물은 이당류와 삼당류가 없는 조성물보다 활성이 높다. 고-활성 올리고당 조성물에서 각 올리고당의 비율은 하기 비율에 따라 조합되어야 한다.

조성물에서 n = 1 내지 5인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 60% 이상, 바람직하게는 80 내지 95%를 차지한다. n = 1 내지 2인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 60% 이하, 바람직하게는 10 내지 50%, 더 바람직하게는 30 내지 50%를 차지한다. n = 1 내지 3인 만누론 이산 올리고당의 총 중량은 조성물의 총 중량의 20 내지 70%를 차지한다. n = 1 내지 3인 만누론 이산 올리고당의 총 중량 대 n = 4 내지 7인 만누론 이산 올리고당의 총 중량의 비는 1.0 내지 3.5, 바람직하게는 1.0 내지 3.0이다.

본 발명의 염증 치료용 약제는 화학식 (III)을 갖는 만누론 이산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 만누론 이산 올리고당 조성물을 포함한다. 본 발명의 약제는 경구 또는 비경구 투여를 위한 정제, 경질 캡슐, 연질 캡슐, 장용성 캡슐(enteric capsule), 마이크로 캡슐, 과립, 시럽, 주사제, 과립, 에멀젼(emulsion), 현탁액, 용액 및 서방형 제제의 제형일 수 있다.

본 발명의 약학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 공지된 약학적으로 허용되는 담체를 의미한다. 본 발명의 약학적으로 허용되는 담체는 충전제, 습윤제, 결합제, 붕해제(disintegrant), 윤활제, 접착제, 활택제(glidant), 맛 차폐제(taste masking agent), 계면활성제, 방부제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 충전제는 락토스, 미정질 셀룰로스, 전분, 당류 분말, 덱스트린, 만니톨, 황산 칼슘 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 습윤제 및 결합제는 카르복시메틸셀룰로스나트륨(sodium carboxymethylcellulose), 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 젤라틴, 수크로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 붕해제는 카르복시메틸스타치나트륨(sodium carboxymethyl starch), 가교(crosslinked) 폴리비닐피롤리돈, 가교 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 저치환 히드록시프로필 셀룰로스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 윤활제는 스테아르산마그네슘, 실리카겔, 미세 분말, 활석, 수소 첨가(hydrogenated) 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘라우릴설페이트(magnesium lauryl sulfate) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 접착제에는 아라비아검, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로스칼슘(calcium carboxymethylcellulose), 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 글루코스 결합제, 덱스트린, 덱스트로스, 에틸 셀룰로스, 젤라틴, 액체 글루코스, 구아검, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 마그네슘알루미늄실리케이트(magnesium aluminum silicate), 말토덱스트린, 메틸셀룰로스, 폴리메타크릴산에스테르, 폴리비닐피롤리돈, 알파전분(pregelatinized starch), 알긴산나트륨, 소르비톨, 전분, 시럽 및 트라가칸트 고무 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 활택제는 콜로이드 규산, 분말 셀룰로스, 삼규산마그네슘(magnesium trisilicate), 이산화규소 및 활석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 맛 차폐제는 아스파탐, 스테비오사이드, 프럭토스, 글루코스, 시럽, 꿀, 자일리톨, 만니톨, 락토스, 소르비톨, 말티톨 및 글리시리진을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 계면 활성제는 트윈팔십(Tween-80) 및 폴록사머(poloxamer)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 방부제는 파라벤, 벤조산나트륨, 소르빈산칼륨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일부 실시예에서, 본 발명은 또한 염증 치료용 만누론 이산 올리고당 조성물에 관한 것이고, 이는 화학식 (III)의 만누론 이산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:

[화학식 III]

여기서,

n = 1 내지 5인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 60% 이상을 차지하고,

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물에서, 상기 조성물에서 각각의 중합도를 갖는 만누론 이산의 중량% 함량은 이당류 5 내지 25%, 삼당류 15 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 5 내지 25%, 육당류 2 내지 20%, 칠당류 2 내지 20%, 팔당류 2 내지 20%, 구당류 2 내지 20%, 십당류 2 내지 20%이다. 특히, 상기 조성물에서 올리고당의 중량% 함량은 이당류 5 내지 25%, 삼당류 15 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 10 내지 20%, 육당류 5 내지 15%, 칠당류 3 내지 10%, 팔당류 2 내지 5%, 구당류 1 내지 5%, 십당류 1 내지 5%이다. 보다 바람직하게는, 상기 조성물에서 올리고당의 중량% 함량은 이당류 10 내지 20%, 삼당류 18 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 15 내지 20%, 육당류 5 내지 10%, 칠당류 3 내지 5%, 팔당류 2 내지 5%, 구당류 1 내지 3%, 십당류 1 내지 3%이다.

본 발명에서 언급된 염증은 급성 염증(acute inflammation), 만성 염증(chronic inflammation), 혈관 염증(vascular inflammation), 신경 염증(neuroinflammation), 중추 신경계 염증(central nervous system inflammation)(예: 뇌척수염(encephalomyelitis) 등을 포함한 다발성 경화증(multiple sclerosis)), 말초 신경 염증(peripheral nerve inflammation), 관절염(arthritis)(예: 골관절염(osteoarthritis), 천장관절염(sacroiliitis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 등), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)(예: 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)), 염증성 당뇨성 궤양(inflammatory diabetic ulcers), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus), 염증성 피부병(inflammatory skin disease)(예: 건선(psoriasis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 습진(eczema)) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "치료(treatment)"는 일반적으로 원하는 약리학적(pharmacological) 및/또는 생리학적 효과를 달성하는 것을 의미한다. 이 효과는 질병이나 그 증상의 전체 또는 부분적 예방에 따라 예방적일 수 있고/있거나; 질병 또는 질병으로 인한 부작용의 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치유에 따라 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 하기를 포함하여 환자의 질병에 대한 모든 치료를 포함한다. (a) 질병 또는 증상에 민감하지만 아직 질병으로 진단되지 않은 환자에게 발생하는 질병 또는 증상의 예방; (b) 질병의 증상 억제, 즉 발병 예방; 또는 (c) 질병의 증상, 즉 질병 또는 증상의 악화 유발을 완화.

만누론 이산 올리고당 조성물

본 발명의 염증 치료용 만누론 이산 올리고당 조성물은 화학식 (III)의 만누론 이산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:

[화학식 III]

여기서,

본 발명의 만누론 이산 올리고당 조성물은 중합도가 상이한 만누론 이산의 혼합물이며, 이의 주성분은 중합도가 2 내지 10인 만누론 이산 올리고당이다. 만누론 이산에서 가장 활성이 높은 당류는 사당류 내지 십당류, 특히 육당류이다. 그러나, 본 발명자들은 연구를 통해 일정 비율의 덜 활성적인 이당류 및 삼당류를 가장 활성적인 사당류 내지 십당류에 첨가하는 것이 생물학적 활성을 감소시키지 않고 오히려 동일한 질량 투여량(administration dosage in mass)하에서 활성을 증가시키는 것을 발견하였다. 이것은 저분자량의 이당류와 삼당류가 홀로 작용될 수 없지만 다른 올리고당과 혼합되었을 때의 시너지 효과로 인한 것일 수 있다. 그러나, 이당류와 삼당류의 비율이 너무 높으면 조성물의 전체적인 활성이 감소될 것이다. 따라서 조성물에서 이당류와 삼당류의 비율은 일정 범위 내에서 조절되어야 한다.

실제 제조 과정에서는 산화 분해 반응(oxidative degradation reaction)에서 일정량의 이당류와 삼당류가 생성되며, 일반적으로 낮은 활성으로 인해 생성물의 약학적 효과에 영향을 미치지 않도록 분리 후 생성물에서 제거된다. 그러나, 본 발명자들의 상기 발견에 따르면, 산화 분해 생성물에서 이당류와 삼당류를 분리하여 제거할 필요가 없을 수 있으며, 산화 분해 반응의 조건만 조절하여 이당류와 삼당류의 비율을 특정 범위 내에서 조절하면 된다. 생성된 조성물의 활성은 선행 출원에 개시된 조성물의 활성에 도달하거나 심지어 더 우수할 수 있다. 더욱이, 이당류와 삼당류는 제거할 불순물로 간주되지 않기 때문에 이론상 생성물 수율도 선행 출원에 개시된 것보다 상당히 높다. 따라서 생산 비용을 크게 줄이고 폐기물 배출량을 줄임으로써 실제 생산에서 실현하는 것과 산업적 대규모 생산을 실현하는 것이 더 용이해진다.

일 실시예에서, 염증 치료용 만누론 이산 올리고당 조성물의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다.

(1) 만누론 이산 생성물의 제조.

M 세그먼트 중간체 제조. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 원료 M 세그먼트 중간체는 종래 기술 분야에서 공지된 방법, 예를 들어 중국 특허 출원 번호 98806637.8 및 CN02823707.2에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적인 방법은 하기와 같이 간단하게 설명될 수 있다. 알긴산을 미리 분해하여 폴리만누론산(polymannuronic acid)과 폴리굴루론산(polyguluronic acid)의 혼합 다당류를 생성한다; 그런 다음 혼합 다당류를 산성 침전시켜 그 안의 폴리굴루론산을 제거하고 추가 정제를 수행하여 순도 90% 이상의 호모폴리만누론산(homopolymannuronic acid), 즉 M 세그먼트 중간체를 수득한다.

오존 산화 분해(ozone oxidative degradation). M 세그먼트 중간체를 적절한 양의 물에 용해시키고 실온 또는 가열 조건에서 교반한다. 오존이 지속적으로 유입되면 반응이 시작된다. 반응의 pH값은 묽은 염산 또는 묽은 NaOH 용액을 한 방울씩(dropwise) 첨가하여 3 내지 13, 바람직하게는 4 내지 10, 더 바람직하게는 6 내지 8로 조정할 수 있다. 온도는 바람직하게는 0 내지 70℃, 보다 바람직하게는 10 내지 45℃이다. 반응 완료 후 오존 유입을 중단하고 pH를 중성으로 조정한다.

막 분리 및 정제. 상기에서 수득한 반응 생성물은 약 10% 농도의 용액으로 제형화되고 분자 분획막(molecular cut-off membrane)으로 분리되어 단당류 아래(below monosaccharide)의 분해 생성물을 제거한다. 불투과성 액체(retentate)가 수집된다. 사용된 분자 분획막의 MWCO는 1000 내지 3000Da, 바람직하게는 2000Da이다. 수집된 액체를 회전 증발기에서 농축하고 진공하에서 건조하여 올리고만누론 이산(oligomannuronic diacid) 혼합물을 수득하였다. 분석 결과, 이들 생성물은 모두 함량이 일정 비율 범위 내에 있는 이당류 내지 십당류에 이르는 올리고당의 조성물임이 밝혀졌다. 일부 조성물에서 올리고당의 비율 및 구조의 확인을 위해서 실시예 1 내지 3을 참조한다.

(2) 단일 중합도를 갖는 올리고당의 제조

단계 (1)에서 수득한 올리고당 혼합물을 약 10%의 농도로 용해시키고 P6 겔 크로마토그래피 칼럼(P6 gel chromatographic column)에서 분리하고 자외선 검출을 하여 각 용출액(effluent) 성분을 수집한다. 동일한 중합도를 갖는 성분이 조합된다. 이당류 내지 십당류의 9가지 성분을 수집하고, G10 겔 칼럼 크로마토그래피(G10 gel column chromatography)로 탈염하고, 회전 증발기로 농축하고 진공에서 건조시켰다. 구체적인 정제 및 제조 공정이 실시예 4에 나타나 있다. 칼럼 크로마토그래피, 탈염 및 건조와 같은 작업은 당업자에게 공지되어 있다.

항-염증성 세포 모델을 사용하여 단일 중합도를 갖는 이들 9개의 올리고당의 각각의 약리학적 활성을 평가하였고, 육당류가 최고의 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

(3) 올리고당 조성물의 치료적 활성 비교

본 발명의 조성물은 정제에서 수득된 육당류와 약리학적 활성을 비교한다. 결과는 본 발명의 올리고당 조성물이 단일 중합도를 갖는 올리고당에서 가장 활성이 높은 육당류보다 우수한 반면, 더 높은 비율의 이당류 및 삼당류를 포함하는 조성물의 활성이 육당류의 활성보다 약간 낮은 것을 보여준다. 어느 이론에도 얽매이지 않고, 일정 범위의 올리고당 조성물에서 이당류와 삼당류의 함량%가 시너지 효과를 발휘할 수 있다고 추측된다. 조성물에서 이당류 내지 육당류의 비율이 60% 이상이고 이당류와 삼당류의 비율이 60% 이하일 때, 조성물의 총 활성이 더 높다. 그러나 이당류와 삼당류의 비율이 60% 이상일 때 조성물의 총 활성이 감소할 것이다.

약력학적 활성 평가를 위한 동물 모델 및 단계

1. 신경 염증 모델 - 미세아교세포(microglia)에서 Aβ 자극된 염증 인자 분비 모델

1차 미세아교세포를 48 웰 플레이트에 시드(seed)하고 24시간 동안 배양하였다. 30분 동안 약물로 전처리한 후 1nM의 숙성된 Aβ1-42 올리고머를 첨가하여 6시간 동안 자극하였다. 처리된 미세아교세포를 취하여 RT-PCR용 RNA를 추출하여 염증 인자 IL-1β의 발현을 감지하고 이를 통해 Aβ 자극으로 인한 신경 염증 반응을 반영할 수 있다.

2. 류마티스 관절염 모델 - 생쥐의 콜라겐-유도 관절염 모델

체중이 18 내지 22g인 수컷 DBA/1 생쥐를 취하고 무작위로 하기 군으로 나눈다: 블랭크 대조군(blank control group), 모델군 및 투여군, 각 군의 생쥐는 8마리이다. 블랭크 대조군을 제외하고 나머지 동물은 10mg/kg의 소 유형 II 콜라겐-완전프로인트항원보강제(bovine type II collagen-complete Freund's adjuvant)(CII-CFA) 에멀션을 0일에 꼬리 뿌리(tail root)에 피하 주사하여 감작(sensitize)한다. 23일에는 1.5mg/kg의 지질다당류(LPS)는 복강 내 주사하였다. 투여는 28일에 시작되었다. 블랭크 대조군과 모델군은 경구로 식염수를 투여하고 다른 군들은 해당 약물을 투여하였다(연속 14일 동안 1일 1회). LPS 주사 후, 생쥐는 질병 상태에 대해 매일 관찰된다. 생쥐가 질병(관절염의 임상 증상 발생)이 발생하기 시작하면 질병의 상이한 정도(발적(redness), 관절 변형)에 따라 0 내지 4점 기준에 근거하여 임상적 점수평가(clinical scoring)를 수행하여 질병 진행의 정도를 반영한다. 0은 홍반(erythema)과 종창(swelling)이 없음을 의미한다. 1은 족근골(tarsal bone) 또는 발목(ankle) 또는 중족골(metatarsal bone) 근처에서 홍반 또는 경미한 종창이 발생하고 한 개의 발가락의 발적 및 부종을 의미한다. 2는 발목 관절과 중족골의 약간의 홍반과 종창, 또는 두 개 이상의 발가락의 발적과 종창을 의미한다. 3은 발목, 손목 관절(wrist joint) 및 중족골의 중등도 홍반과 종창이다. 4는 모든 발목, 손목 관절, 중족골 및 발가락의 심한 발적 및 종창이다. 각 사지의 최고 점수는 4점이며 각 동물의 최고 점수는 16점이다.

3. 다발성 경화증 모델 - 생쥐의 MOG-유도 다발성 경화증 모델

17 내지 20g 무게의 암컷 C57BL/6 생쥐를 취하고 그 중 5마리를 무작위로 블랭크 대조군으로 선택한다. 나머지 동물은 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질-완전프로인트항원보강제(myelin oligodendrocyte glycoprotein-complete Freund's adjuvant, MOG-CFA) 에멀션을 0일에 등에 피하 주사(10mg/kg MOG, 20mg/kg CFA)하여 감작하고, 0일 및 2일에는 10μg/kg의 백일해 독소가 복강 내로 주입된다. 그리고 투여는 1일째에 시작된다. 블랭크 대조군과 모델군은 경구로 식염수를 투여하고 다른 군들은 해당 약물을 투여한다(연속 24일 동안 1일 1회). 면역화 약 12일 후, 면역화된 생쥐는 증상을 나타낼 것이며 이들의 체중과 임상 점수를 면밀히 관찰하고 매일 기록한다. 질병 진행 정도를 반영하기 위해 0 내지 4점을 사용하여 상이한 정도를 나타낸다. 0은 명백한 질병 징후가 없는 정상적인 모습이다. 1은 꼬리 처짐 쇠약(tail drooping weakness), 뒷다리 쇠약; 2는 꼬리 처짐 쇠약, 양쪽 뒷다리 쇠약 및 갈짓자걸음(staggering gait)이다. 3점은 한쪽 뒷다리의 쇠약과 마비이다. 4는 양쪽 뒷다리의 쇠약과 마비이다.

4. 전신홍반루푸스 모델 - 생쥐의 MRL/lpr 홍반루푸스 모델

Faslpr 유전자의 동형 접합적(homozygous) 돌연변이를 갖는 MRL/lpr 형질전환 생쥐는 자발적으로 림프 조직 과다형성(hyperplasia)을 형성할 수 있다. 생쥐는 약 10 내지 14주령에 전신홍반루푸스 증상이 나타나기 시작한다. 암컷 MRL/lpr 형질전환 생쥐(9주령)를 무작위로 하기 군으로 나눈다: 블랭크 대조군, 투여군, 각 군에 8마리의 생쥐. 블랭크 대조군은 식염수를 경구로 투여하고 다른 군들은 해당 약물을 투여한다(4주 연속 1일 1회). 림프절 점수평가는 일주일에 1회 수행된다. 0 내지 6점은 상이한 정도를 나타낸다. 0은 정상이다. 1은 양쪽의 한 지점에서 직경이 1cm 미만이다. 2는 양쪽의 두 지점에서 직경이 1cm 미만이다. 3은 양쪽의 세 지점에서 직경이 1cm 미만이다. 4는 양쪽의 한 지점에서 직경이 1cm 초과이고 양쪽의 다른 두 지점은 직경이 1cm 이하다. 5는 양쪽의 두 지점에서 직경이 1cm 초과이고 양쪽의 다른 지점에서는 1cm 미만이다. 6은 양쪽의 세 지점에서 직경이 1cm 초과이다.

5. 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD) 모델 - 생쥐의 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS)-유도 대장염(colitis) 모델

18 내지 20g 무게의 암컷 C57 생쥐(7 내지 8주령)를 취하고 무작위로 하기 군으로 나눈다: 블랭크 대조군, 모델군 및 투여군, 각 군에 8마리의 생쥐. 모델군 및 투여군의 생쥐에 2.5%의 고-분자량 폴리머 덱스트란 설페이트 소듐(DSS)을 1 내지 7일에 음용수 형태로 제공하고 투여는 1일에 시작한다. 대조군과 모델군은 식염수를 경구로 투여하고 다른 군들은 해당 약물을 투여하였다(연속 30일 동안 1일 1회). 31일째에 생쥐는 자궁경부 탈구로 사망하였고 복강이 열리고 장간막이 분리되었다. 각 생쥐의 회맹(ileocecal) 영역의 시작부터 항문 끝까지의 부분을 취한다. 각 군은 순차적으로 샘플링된다. 결장의 길이를 측정하였다.

본 발명의 이점은 하기 비제한적인 실시예에서 추가로 설명된다. 그러나, 실시예에서 사용된 구체적인 물질 및 그 양 및 기타 실험 조건이 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 달리 명시하지 않는 한, 본 발명에서 부, 비율, 백분율 등은 모두 질량으로 계산된다.

실시예

실시예 1

단계 1): 만누론 이산 올리고당 혼합물의 제조

M 세그먼트 중간체는 선행 특허에 개시된 방법으로 제조되었다. 구체적인 작업은 하기에 간략하게 설명되어 있다. 5kg의 알긴산나트륨을 약 10%의 용액으로 제형화하고 묽은 염산을 첨가하여 pH를 약 3.0으로 조정하였다. 용액을 80℃로 가열하고 교반하였다. 가열이 중단되기 전에 10시간 동안 반응시켰다. 상온으로 냉각한 후 NaOH를 첨가하여 pH를 9.0으로 조정하고 묽은 염산을 첨가하여 2.85로 추가로 조정하였다. 용액을 10분 동안 5000rpm에서 원심 분리하였다. 상청액을 수집하고 HCl을 첨가하여 pH 1.0으로 조정하였다. 원심 분리 후 침전물을 수집하고 회전 증발기로 농축하고 진공 건조하여 M 세그먼트 중간체 1500g을 수득하였다. 500g의 M 세그먼트 중간체를 칭량하고 증류수에 용해하여 5L 부피의 용액을 제조하였다. 용액을 NaOH로 pH 6.5로 조절하고 수조에서 가열하여 반응 온도를 75℃로 조절하였다. 산소 실린더 출구의 가스 유량과 오존 발생기의 동력은 반응 용액에 오존이 8g/hr의 질량 농도 유량으로 공급되도록 조정되었다. 반응 4시간 후 오존 공급을 중단하고 물을 적당량 첨가하여 용액의 농도를 약 10%로 조절하였다. 용액을 분획분자량(Molecular weight cut-off)이 2,000Da인 한외여과 막을 통해 여과하여 투석유물을 수집하였다. 수집된 액체를 회전 증발기에서 농축하고 진공하에서 건조하여 350g의 만누론 이산 생성물 A를 수득하였다.

단계 2) 만누론 이산 생성물 A에서 다양한 중합도를 갖는 올리고당의 비율 및 구조 분석

상기 건조된 만누론 이산 생성물 A 100mg을 정확하게 칭량하고 물에 10mg/mL의 농도가 될 때까지 용해하고 0.22μm의 필터 막(filter membrane)에 통과시켜 시험 시료 용액을 수득하였다. 조성물에서 중합도가 상이한 올리고당의 비율은 Superdex 펩타이드 분자 배제 크로마토그래피(GE Co.)로 다각도 레이저 광 산란(multi-angle laser light scattering, MALS, Wyatt Co.)과 조합하여 결정하였다. 실험 조건은 하기와 같다:

크로마토그래피 칼럼: Superdex 펩타이드 10/300G1

이동상: 0.1 mol/L NaCl

주입 부피: 10 μL

유속: 0.3 mL/min

테스트 결과: 이당류에서 십당류까지 각각 dp2 내지 dp10으로 표시되었으며, dp2는 19%, dp3은 25%, dp4는 22%, dp5는 13%, dp6는 9%, dp7은 6%, dp8은 3%, dp9는 2%이고 dp10은 1%이다.

단계 3) 만누론 이산 생성물 A에서 다양한 중합도를 갖는 올리고당 구조의 LC-MS 분석

실험 조건:

크로마토그래피 칼럼: Superdex 펩타이드 10/300G1

이동상: 20% 메탄올 + 80% 80mmol/L NH₄Ac

유속: 0.1 mL/min

칼럼 온도: 25℃±0.8℃

질량 분석 조건: Agilent 6540 QTOF; 이온 소스: ESI 충돌 전압 120V; 음이온 모드. 수득된 신호의 폭(m/z)은 100 내지 1000이다.

다양한 중합도를 갖는 올리고당의 질량 스펙트럼(mass spectra)은 도 1 내지 3에 나타나있다. 질량 스펙트럼의 다양한 신호 피크를 지정하여 생성물 A의 모든 올리고당의 분자 구조, 즉 일반식 (III)에 표시된 구조를 확인하였다. 신호 지정 및 신호에 해당하는 구조는 하기 표 1을 참조한다.

상기 질량 분석법의 구조 분석으로부터 생성물 A의 당 사슬의 환원 말단에 있는 만누론산이 당 이산 구조(구조에 대해서는 일반식 III 참조)로 산화되었으며, 이는 함량이 약 10 내지 30%인 6개의 탄소 원자(m+m'=3)를 포함하는 만누론 이산, 또는 만나르 이산(mannaric diacid)의 탈탄산 생성물, 즉 5개의 탄소를 포함하는 당 이산(m+m'=2)(30 내지 50%) 및 4개의 탄소를 가지는 당 이산(m+m'=1)(30 내지 40%)일 수 있다.

실시예 2

실시예 1의 M 세그먼트 중간체 100g을 칭량하고 증류수에 용해시켜 0.8L 부피의 용액을 제조하였다. 용액을 NaOH로 pH 4.0으로 조절하고 실온(25℃)에서 반응을 수행하였다. 산소 실린더 출구의 가스 유량과 오존 발생기의 동력은 반응 용액에 오존이 1g/hr의 질량 농도 유량으로 공급되도록 조정되었다. 반응 10시간 후 오존 공급을 중단하고 물을 적당량 첨가하여 용액의 농도를 약 15%로 조절하였다. 용액을 분획분자량 1,000Da의 한외여과막을 통해 여과하여 투석유물을 수집하였다. 수집된 액체를 회전 증발기에서 농축하고 진공하에서 건조하여 80g의 만누론 이산 생성물 B를 수득하였다.

B에서 다양한 중합도를 갖는 올리고당 성분의 비율은 Superdex 펩타이드 분자 배제 크로마토그래피(GE Co.)로 다각도 레이저 광 산란(multi-angle laser light scattering, MALS, Wyatt Co.)과 조합하여 결정하였다. 측정 방법은 실시예 1의 관련 부분과 동일하였다. 시험 결과: 이당류에서 십당류까지 각각 dp2 내지 dp10으로 표시하였으며, dp2는 20%, dp3은 25%, dp4는 19%, dp5는 12%, dp6은 9%, dp7은 5%, dp8은 5%, dp9는 3%, dp10은 2%이었다.

실시예 3

실시예 1의 M 세그먼트 중간체 100g을 칭량하고 증류수에 용해시켜 1.5L 부피의 용액을 제조하였다. 용액을 NaOH로 pH 9.0으로 조정하고, 45℃ 수조에서 반응을 수행하였다. 산소 실린더 출구의 가스 유량과 오존 발생기의 동력은 반응 용액에 오존이 3g/hr의 질량 농도 유량으로 공급되도록 조정되었다. 반응 2시간 후 오존 공급을 중단하고 물을 적당량 첨가하여 용액의 농도를 약 5%로 조절하였다. 용액을 3,000Da의 분획분자량를 갖는 한외여과막을 통해 여과하여 투석유물을 수집하였다. 수집된 액체를 회전 증발기에서 농축하고 진공하에서 건조하여 60g의 만누론 이산 생성물 C를 수득하였다.

C에서 다양한 중합도를 갖는 올리고당의 비율은 다각도 레이저 광 산란(MALS, Wyatt Co.)과 조합하여 Superdex 펩타이드 분자배제 크로마토그래피(GE Co.)에 의해 결정되었다. 측정 방법은 실시예 1의 관련 부분과 동일하였다. 시험 결과: 이당류에서 십당류까지 각각 dp2 내지 dp10으로 표시하였으며, dp2는 8%, dp3은 20%, dp4는 28%, dp5는 19%, dp6은 13%, dp7은 6%, dp8은 3%, dp9는 2%, dp10은 1%이었다.

실시예 4

단계 1) 단일 중합도를 갖는 만누론 이산 올리고당의 제조, 이는 하기와 같다.

1. 시료 제조: 실시예 1에서 제조된 만누론 이산 생성물 A 300g을 칭량하여 물에 용해시켜 1000mL의 농축 용액으로 제조하고 4℃ 냉장고에 넣어 사용하였다. 사용시마다 50mL를 꺼내 물로 1:2 희석한 후 0.22μm 한외여과막을 통해 흡입 여과하였다.

2. 크로마토그래피 분리(Chromatographic separation) 조건: 크로마토그래피는 UV 검출기와 자동 수집기가 장착된 AKTA pure 150(GE Co.에서 구입)이었다. 분리 크로마토그래피 칼럼: 1.2kg의 BioGel P6(Bio-Rad Co.에서 구입)을 탈이온수와 혼합하고 진공 탈기하고 유리 칼럼(내경: 10cm)에 수동으로 채우고 10칼럼 부피의 순수로 헹구었다. 크로마토그래피 칼럼 베드(bed)는 안정적이었고 높이는 1.0m이었다. 그런 다음 이동상을 0.02M NaCl 용액으로 변화시키고 10칼럼 부피로 평형화한 후 시료 로딩을 시작하였다.

3. 시료 로딩(sample loading) 및 분리: 펌프의 유속은 1mL/min으로 설정되었다. 100mL의 시료 용액을 크로마토그래프 자체 펌프를 통해 칼럼 상단으로 펌핑한 후 이동상으로 전환하고 5mL/min의 유속으로 용리하였다. 사수량(dead water volume)이 유출된 후, 자동 수집이 시작되고 관(tube)당 50mL가 수집되었다.

4. 시료 로딩을 반복하고, 20회 반복 제조 후 동일한 분획을 조합하고 회전 증발기로 농축하고 동결 건조하여 이당류에서 십당류까지 단일 중합도를 갖는 총 9개의 올리고당을 수득하였다.

단계 2) 약리학적 활성 평가

단일 중합도를 갖는 디만노올리고당산 올리고당(dimannoligosaccharic acid oligosaccharide)의 약리학적 활성 평가 절차는 하기와 같다.

1. 단일 중합도를 가진 올리고당이 Aβ-유발 신경염증에 미치는 영향

이당류 내지 십당류를 각각 10g씩 취하였다. 실험 과정은“Aβ-유발 신경염증”의 방법에 따라 수행되었다.

Aβ 자극 후 미세아교세포에서 주요 기능성 염증 인자 IL-1β의 발현을 측정하여 약물의 신경염증에 대한 억제 효과를 반영하고 각 올리고당의 효능을 비교하였다. 결과는 Aβ 모델군이 블랭크 대조군에 비해 신경염증이 현저하게 증가하였음을 보여주었다. 단일 중합도를 갖는 모든 올리고당은 신경염증을 감소시키는 경향이 있으며, 단일 중합도 4 내지 10을 갖는 디만올리고당산 올리고당은 모두 IL-1β의 발현을 현저하게 감소시킬 수 있다. 5 내지 8의 4개의 중합도를 갖는 올리고당의 효과는 특히 효과적이었다. 육당류의 활성이 가장 높은 반면 이당류와 삼당류의 효과는 미약하였다(도 4 참조).

실시예 5

조성물과 육당류 사이의 약리학적 활성 평가를 수행하여 조성물 내 상이한 중합도를 갖는 올리고당과 올리고당의 비율 범위의 시너지 효과를 조사하였다.

시료 제조:

(1) 조성물 생성물 D

실시예 4에서 제조된 단일 중합도를 갖는 만누론 이산 올리고당을 중합도에 따라 이당류에서 십당류까지 정확하게 칭량하였다. 취출한 각 당류의 중량은 하기와 같다. 이당류 3.0g, 삼당류 3.0g, 사당류 1.5g, 오당류 1.5g, 육당류 0.4g, 칠당류 0.2g, 팔당류 0.2g, 구당류 0.1g, 및 십당류 0.1g. 이들을 균일하게 혼합하여 10g의 조성 생성물 D를 수득하였다.

(2) 비교 실험 시료의 제조

선행 특허 문헌 CN106344592A의 실시예 1 및 2에 개시된 방법을 참조하여 사당류 내지 십당류 함유 혼합물을 제조하였다.

1g의 폴리만누로네이트나트륨(sodium polymannuronate)(중량 평균 분자량 8235Da, Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co., Ltd. 제공)을 칭량하고 적절한 양의 증류수를 첨가하여 1%(중량%) 폴리만누로네이트나트륨 수용액을 제조하였다. 1% 폴리만누로네이트나트륨 수용액의 pH값을 염산으로 4로 조정한 다음, 수용액을 오토클레이브에 투입하였다. 반응을 110℃에서 4시간 동안 가열하였다. 반응 용액을 오토클레이브에서 제거하고 냉각시켰다. 냉각 후 반응 용액의 pH값을 NaOH 용액으로 조정하여 중성 액체를 수득하였다. 교반 조건하에서 중성 액체를 액체 부피의 4배 부피의 에탄올에 천천히 첨가하였다. 알코올 침전을 수행하고 용액을 밤새 방치하였다. 알코올 침전으로 수득한 고체 물질을 여과 분리하고, 여과 및 분리 과정에서 여과 및 분리를 통해 수득한 고체 물질을 무수에탄올(absolute ethanol)로 세척하였다. 마침내 백색의 여과 케이크가 생산되었다. 여과 케이크를 60℃ 오븐에서 여과하여 조 알지네이트 올리고당(crude alginate oligosaccharide)을 수득하였다.

5g의 조 알지네이트 올리고당을 5%(중량%) 수용액으로 제조하였다. 5%(중량%) 황산구리 용액 25ml를 10%(중량%) 수산화나트륨 용액 50ml에 첨가하고 즉시 혼합하여 새로운 산화제(oxidant) 수산화구리를 제조하였다. 새로운 산화제 수산화구리를 상기의 5%(중량%) 알지네이트 올리고당 용액 40ml에 즉시 첨가하고, 붉은 벽돌색의 침전물이 더 이상 생성되지 않을 때까지 끓는 수조에서 가열하였다. 반응계를 원심 분리하여 침전물을 제거하여 상청액을 수득하였다. 약간의 상층액을 산화제에 다시 첨가하여 붉은 벽돌색의 침전물이 여전히 생성되는지 확인하였다. 붉은 벽돌색의 침전물이 여전히 생성되면 원심 분리에서 수득한 모든 상층액은 붉은 벽돌색의 침전물이 생성되지 않았음이 확인될 때까지 산화제의 다른 부분과 계속 반응시켰다. 최종 반응계를 원심 분리하여 상청액을 수득하였다. 95% 에탄올 부피의 4배를 알코올 침전을 위해 상청액에 첨가하고, 용액을 밤새 방치하였다. 알코올 침전에 의해 수득된 고체 물질을 여과 및 분리하고, 고체 물질을 무수에탄올로 세척하였다. 수득된 고체 물질을 60℃ 오븐에 넣고 건조시켜 화학식 (II)로 표시되는 조 알지네이트 올리고당을 수득하였다.

조 알지네이트 올리고당 1g을 10%(중량%) 수용액으로 조제하고 95% 에탄올 용액을 사용하여 다시 알코올 침전을 수행하였다. 다시 알코올 침전으로 수득한 침전물을 여과 및 분리한 다음, 임의로 무수에탄올로 세척하였다. 침전물을 분리하고 건조하여 고체 물질을 수득하였다. 고체 물질은 5%(중량%) 수용액으로 제조되었다. 수용액을 3μm 기공 크기의 막으로 여과하고 여과액을 수집하였다. 여과액을 용리하고 분자배제 크로마토그래피 Bio-Gel-P6 겔 칼럼(1.6x180cm, Bio-Rad Company에서 구입 가능)에서 분리하였다. 이동상으로서 용리액(eluent)은 0.2mol L-1NH₄HCO₃이었다. 칼럼 크로마토그래피에서 수득한 용출액(eluate)을 복수의 5ml의 시험관에 순차적으로 수집한 다음, 각 시험관의 용출액의 당 함량을 황산-카르바졸법(sulfuric acid-carbazole method)을 사용하여 측정하였다. 검출 결과에 따라, 분자량이 상이한 알지네이트 올리고당 성분을 함유하는 용출액을 각각 수집하였다. 분자량이 상이한 알지네이트 올리고당 성분을 함유하는 용출액을 각각 감압 농축하고 동결 건조하였다. 성분 1을 버리고, 분자량이 상이한 화학식(II)(n은 각각 0 내지 10의 값을 가짐)에 나타난 알지네이트 올리고당 성분 2 내지 12를 수득하고, n = 2 내지 8을 갖는 화학식 (II)에 나타난 알지네이트 올리고당 용리액을 수집하고, 조합하고 건조시켰다. n = 2 내지 8을 갖는 화학식 (II)에 나타난 알지네이트 올리고당 혼합물(사당류 내지 십당류 혼합물)을 비교 실험 시료로 제조하였다.

비교 실험 시료에서 다양한 중합도를 갖는 올리고당 성분의 비율은 다각 레이저 산란(MALS, Wyatt)과 조합된 Superdex 펩타이드(GE Co.) 분자배제 크로마토그래피를 사용하여 검출되었다. 결정 방법은 실시예 1의 관련 부분과 동일하다. 시험 결과: 사당류 내지 십당류는 dp4 내지 dp10으로 표시되며, 이는 각각 10% dp4, 12% dp5, 13% dp6, 14% dp7, 15% dp8, 19% dp9 및 17% dp10이다.

실시예 1, 2 및 3에서 각각 제조된 생성물 A, B 및 C, 본 실시예에서의 생성물 D 및 비교 실험 시료에서의 올리고당 비율은 하기 표 2에 나타나있다.

상기 4개의 시료 A, B, C 및 D 각각 10g을 취하였다. 이들 조성물, 육탄당(6T) 및 비교 실험 시료의 약리학적 활성은 "항-염증 약력학적 평가를 위한 동물 모델"에 기술된 방법에 따라 비교되었다.

1. 생쥐에서의 콜라겐-유도 관절염 모델

실험에서 정상 대조군에 비해 모델군은 발목, 손목 관절 및 중족골의 중등도 홍반 및 종창과 같은 명백한 관절염 증상을 보였다. 임상 점수는 6점에 도달하여 관절염 모델이 성공적으로 확립되었음을 나타낸다. 모델군과 비교하여 각 투여군의 이환율(morbidity)은 상이한 정도로 감소하였다. 도 5a 및 5b에서 생성물 A, B 및 C는 단일 중합도를 갖는 비교 실험 시료 및 육당류에 비해 생쥐의 발병 시간(onset time)을 현저하게 지연시켰고, 임상 점수도 비교 실험 시료 및 육당류에 비해 낮음을 알 수 있었다. 생성물 A, B 및 C의 약력학적 활성은 비교 실험 시료의 약력학적 활성보다 우수하고 단일 중합도를 갖는 가장 활성적인 육당류의 약력학적 활성보다 우수하다는 것을 보여주었다. 그러나 생성물 D의 발병이 더 빨랐고 임상 점수가 더 높았는데 이는 생성물 D의 활성이 육당류보다 약한 것을 반영하는 것이다. 조성물에서 올리고당의 비율이 중요하며 일정 비율의 이당류와 삼당류를 첨가하는 것이 시너지 효과가 있음을 나타내었다. 그러나 이당류와 삼당류의 비율이 너무 높으면 조성물의 활성이 감소한다.

2. 생쥐에서의 MOG-유도 다발성 경화증 모델

실험에서 정상 대조군과 비교하여 모델군의 대부분의 생쥐는 양쪽 뒷다리에서 쇠약과 마비를 보였다. 모델군의 평균 임상 점수는 3점에 도달하였고, 이는 다발성 경화증 모델이 성공적으로 수립되었음을 나타낸다. 모델군과 비교하여 각 투여군의 염증 진행이 상이한 정도로 감소하였다. 도 6a 및 6b에서, 전체 실험동안 말단 부위에서 생성물 A, B 및 C의 임상 점수가 단일 중합도를 갖는 비교 실험 시료 및 육당류보다 낮음을 알 수 있었다. 전체 실험동안 말단 부위에서 생성물 D의 임상 점수는 약간 높았고 항-염증 활성이 가장 약하였다.

3. 생쥐에서의 MRL/lpr 홍반루푸스 모델

10주차부터 시작하여, 유전자 변형 생쥐는 림프절 종창과 같은 증상이 발생하기 시작하였고 림프절 점수는 시간이 지남에 따라 계속 증가하였으며, 이는 모델군이 질병을 성공적으로 발생시켰고 질병이 빠르게 진행되었음을 나타낸다. 모델군과 비교하여 각 투여군의 질병 진행은 상이한 정도로 감소하였다. 도 7a 및 7b에서 생성물 A, B 및 C는 단일 중합도를 갖는 비교 실험 시료 및 육당류에 비해 생쥐의 발병 시간을 명확하게 지연시켰으며 림프절 점수 또한 비교 실험 시료 및 육당류의 것보다 낮음을 알 수 있다. 그러나 생성물 D의 발병 시간이 더 빨랐고 림프절 점수가 더 높았기 때문에 생성물 D의 활성은 육당류보다 약했다. 어느 이론에도 얽매이지 않고, 상기의 다른 실험 결과와 조합하여, 조성물에 적절한 양의 이당류 및 삼당류가 존재하는 것이 성분 간의 시너지 효과를 발휘하는 데 유익하다고 추측되었다.

4. 생쥐에서의 덱스트란 설페이트 소듐(DSS)-유도 대장염 모델

실험 종료 후, 정상 대조군에 비해 모델군의 결장은 염증으로 인해 현저히 짧아졌고 대부분의 생쥐는 체중이 줄었다. 모델군에 속한 동물의 거의 절반이 나중에 사망하였고, 이는 장 염증이 매우 심각하였음을 나타낸다. 모델군과 비교하여 각 투여군의 장 염증이 다양한 정도로 감소하였으며, 이는 결장 길이 회복 및 생존율 향상에 반영되었다. 도 8a 및 8b로부터, 생성물 A, B 및 C는 단일 중합도를 갖는 비교 실험 시료 및 육당류보다 생쥐의 결장 길이 및 동물 생존율을 더 높였음을 알 수 있다. 그러나 생성물 D는 결장 길이가 더 짧고 생존율이 약간 낮았으며, 이는 생성물 D의 활성이 육당류보다 약하다는 것을 나타낸다. 유사하게, 실험 결과는 이전 실험과 일치하였고, 이는 조성물에서 이당류 및 삼당류의 함량과 각 성분의 중량%가 약물의 효능에 시너지 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 이처럼 일정 비율의 이당류와 삼당류를 첨가하는 것은 시너지 효과를 가진다. 그러나 이당류와 삼당류의 비율이 너무 높으면 조성물의 활성이 감소한다.

Claims

염증 및 염증으로 인한 통증 치료용 의약 제조에서의 만누론 이산 올리고당 조성물의 용도로서, 상기 만누론 이산 올리고당 조성물은 화학식 (III)의 만누론 이산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 조성물의 용도:
[화학식 III]

여기서 n은 1 내지 9에서 선택되는 정수이고, m은 0, 1 또는 2에서 선택되고, m'는 0 또는 1에서 선택되고;
여기서,
n = 1 내지 5인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 60% 이상을 차지하고;
n = 1 내지 2인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 60% 이하를 차지한다.
제1항에 있어서, 상기 염증은 혈관 염증, 신경 염증, 관절염, 강직성 척추염, 염증성 장 질환, 염증성 당뇨성 궤양, 염증성 피부 질환 또는 전신홍반루푸스인 용도.
제1항에 있어서, 상기 만누론 이산 올리고당 조성물에서, n = 1 내지 2인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 10 내지 50%, 보다 바람직하게는 30 내지 50%를 차지하는 용도.
제1항에 있어서, 상기 만누론 이산 올리고당 조성물에서, n = 1 내지 3인 만누론 이산의 총 중량 대 n = 4 내지 7인 만누론 이산의 총 중량의 비는 1.0 내지 3.5인 용도.
제1항에 있어서, 상기 만누론 이산 올리고당 조성물에서, m + m'= 1 또는 2인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 50% 이상, 바람직하게는 60 내지 90%, 더 바람직하게는 70 내지 90%인 용도.
제5항에 있어서, m + m'= 1인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 10% 이상, 바람직하게는 30 내지 40%인 용도.
제5항에 있어서, m + m'= 2인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 10% 이상, 바람직하게는 30 내지 50%인 용도.
제1항에 있어서, n = 1 내지 5인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 80 내지 95%를 차지하는 용도.
제1항에 있어서, n = 1 내지 3인 만누론 이산의 총 중량은 조성물의 총 중량의 20 내지 70%를 차지하는 용도.
제4항에 있어서, n = 1 내지 3인 만누론 이산의 총 중량 대 n = 4 내지 7인 만누론 이산의 총 중량의 비는 1.0 내지 3.0인 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서 각각의 중합도를 갖는 만누론 이산의 중량% 함량은 이당류 5 내지 25%, 삼당류 15 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 5 내지 25%, 육당류 2 내지 20%, 칠당류 2 내지 20%, 팔당류 2 내지 20%, 구당류 2 내지 20%, 십당류 2 내지 20%인 용도.
제11항에 있어서, 상기 조성물에서 각각의 중합도를 갖는 만누론 이산의 중량% 함량은 이당류 5 내지 25%, 삼당류 15 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 10 내지 20%, 육당류 5 내지 15%, 칠당류 3 내지 10%, 팔당류 2 내지 5%, 구당류 1 내지 5%, 십당류 1 내지 5%인 용도.
제12항에 있어서, 상기 조성물에서 각각의 중합도를 갖는 만누론 이산의 중량% 함량은 이당류 10 내지 20%, 삼당류 18 내지 30%, 사당류 15 내지 28%, 오당류 15 내지 20%, 육당류 5 내지 10%, 칠당류 3 내지 5%, 팔당류 2 내지 5%, 구당류 1 내지 3%, 십당류 1 내지 3%인 용도.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 염은 나트륨 염 또는 칼륨 염인 용도.
유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 만누론 이산 올리고당 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법.