WO2007069468A1 - サイトカイン分泌促進剤 - Google Patents

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WO2007069468A1
WO2007069468A1 PCT/JP2006/323989 JP2006323989W WO2007069468A1 WO 2007069468 A1 WO2007069468 A1 WO 2007069468A1 JP 2006323989 W JP2006323989 W JP 2006323989W WO 2007069468 A1 WO2007069468 A1 WO 2007069468A1
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WO
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alginic acid
secretion
oligomer
acid oligomer
agent
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Application number
PCT/JP2006/323989
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsuya Oda
Takuji Nakajima
Original Assignee
Nagasaki University
Japan Science And Technology Agency
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/734Alginic acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06Antianaemics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08LCOMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/04Alginic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a use of an alginic acid oligomer based on a site force in secretion promoting action of an alginic acid oligomer.
  • G-CSF Granulocyte-colony stimulating factor
  • CSF colony stimulating factor
  • Macrophage Inflammatory Protein— 1 alpha (referred to as ⁇ ⁇ r MIP— 1) and Regulated upon Activation of Normal T cell Expressed and Secreted (hereinafter referred to as RANTES), which are a type of chemokine, are monocytes and lymphatics. It acts on various effector cells including spheres and rod-shaped cells and exhibits migratory activity, thereby contributing to the immune reaction in many ways (see Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Immunotherapy currently being clinically applied or being studied for clinical application includes treatment using non-specific immunostimulators and treatment using cytoforce-in.
  • Non-specific immunostimulants such as picibanil, krestin, and lentinan are formulated, and G-CSF and tumor necrosis factor (hereinafter referred to as TNF) ⁇ are formulated and used as site force-in.
  • TNF tumor necrosis factor
  • aplastic anemia myelodysplastic syndrome (MDS) and It is also expected to be effective against chronic neutropenia such as acquired immune syndrome (AIDS).
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • AIDS acquired immune syndrome
  • these preparations are generally expensive, and serious side effects such as interstitial pneumonia due to overdose have been reported. Accordingly, there is a demand for the development of a highly safe drug that can increase the patient's own ability to secrete site force.
  • Alginic acid exists as a cell wall-constituting polysaccharide or intercellular packing material of brown algae, and functions as a cell protective agent.
  • Alginic acid is composed of two types of uronic acid, ⁇ -D-mannuronic acid (hereinafter referred to as)) and ex-L guluronic acid (hereinafter referred to as G). It is a linear polyuronide polysaccharide linked in proportion.
  • Alginate is composed of poly-13-D mannuronic acid sites (hereinafter referred to as ⁇ ), poly a L-guluronic acid sites (hereinafter referred to as PG), and M and G alternating in the molecule. It has an arrayed segment site (hereinafter referred to as MG random) and a structure in which these three domains are mixed.
  • alginic acid gels with calcium-added powder alginic acid gel is widely used as a fixing agent for living cells, a carrier for sustained-release pharmaceuticals, and the like.
  • Alginic acid itself is used in a wide range of applications such as food thickeners, cosmetics and textile processing.
  • alginic acid As physiological functions of alginic acid, intestinal regulating action, blood cholesterol level lowering action, hypertension preventing action and the like are generally known. However, these functions are related to “alginic acid as a polymer” and are related to the physiological function of “alginic acid oligomer”! There was hardly any known.
  • Physiological activities related to the cytodynamic force of alginic acid include that a sample with alginate stimulates human monocytes and TNF-a, interleukin (hereinafter referred to as IL) 1 ⁇ 8 and IL 6 (see Non-Patent Document 4), and alginic acid with a high proportion of mannuronic acid residues may function as an inducer of cytodynamic in secretion by macrophages (see Non-Patent Document 5) ) Is reported.
  • purified PG and PM have no effect on human mononuclear cells, while high molecular weight of alginic acid has a molecular weight of 50,000 or more for macrophages to induce TNF release from macrophages. Some research reports indicate that this is necessary.
  • the inventors have It was clarified that acid oligomers promote TNF-a secretion of monocytes (macrophages), and their utility as oligomers was found (see Patent Document IV).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-145885
  • Non-Patent Document 1 Anal.Biochem.l95,38,1991
  • Non-Patent Document 2 Blood 100, 2195-2202, 2002
  • Non-Patent Document 4 J. Immunother., 10, 286-291, 1991
  • Non-Patent Document 5 Infect. Immun., 61, 1917-1925, 1993
  • An object of the present invention is to provide an inexpensive and highly safe agent, medicine, and the like used for site force-in therapy or infectious disease prevention.
  • the alginic acid oligomer obtained by enzymatic degradation activates cells and promotes the secretion of cytodynamic force-in.
  • the headline and the present invention were completed.
  • the present invention is as follows.
  • An agent for promoting secretion of cytodynamic force comprising an alginic acid oligomer.
  • the site force in is selected from the group consisting of a colony stimulating factor, a chemokine, an interleukin and an interferon.
  • Interleukin is IL-1 ⁇ , IL-1j8, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 (p70) IL-12 (p40), IL-13, IL-17, and the interferon is IFN- ⁇ .
  • alginic acid oligomer is an enzymatic degradation product of alginic acid or a purified product thereof.
  • a method for promoting secretion of cytokines other than TNF- ⁇ comprising a step of taking the agent according to any one of (1) to (7).
  • a method for promoting the secretion of cyto force-in excluding TNF-a which comprises the step of administering the pharmaceutical according to any one of (8) to (11) to a subject in need thereof.
  • the site force inca The method according to (13) or (14), which is selected from the group consisting of a colony stimulating factor and a chemokine.
  • the medicament according to any one of (8) to (11), and the medicament is used for preventing or treating a condition caused by decreased secretion of a colony stimulating factor or chemokine.
  • a commercial package that includes a statement that describes what the drug can be or should be used for.
  • the agent for promoting secretion of cytoforce-in of the present invention acts on effector cells and can secrete cytoforce-ins from the cells efficiently and dose-dependently.
  • the agent of the present invention can be used not only for humans but also for various animals, and can enhance its immunity.
  • the medicament of the present invention can promote the secretion of cytodynamic force-in by using it alone or in combination with other drugs for patients who require cytodynamic force therapy.
  • the medicament of the present invention is also useful as an infectious disease preventive and therapeutic agent for improving resistance to various infectious diseases and the like for animals with reduced immunity.
  • an alginate oligomer By using an alginate oligomer, it is possible to promote secretion of cytodynamic force, particularly CSF or chemokine, and thus a method for preventing and Z or treating a disorder or disease caused by decreased secretion of CSF or chemokine Can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing a method for preparing a mannuronic acid polymer and a guluronic acid polymer.
  • FIG. 2 is a view showing a chart obtained by gel filtration of an enzyme-digested alginic acid oligomer (hereinafter referred to as an enzyme-treated alginic acid oligomer).
  • FIG. 3 is a diagram showing a comparison of G-CSF secretion promoting activity between an enzyme-treated alginic acid oligomer mixture and an acid-hydrolyzed alginic acid oligomer mixture.
  • FIG. 4 is a graph showing changes with time of G-CSF secretion promoting activity by intraperitoneal administration of alginate oligomer mixture (black circle) and alginic acid polymer (white circle) to mice.
  • FIG. 5 is a graph showing dose-dependent G-CSF secretion promoting activity by intraperitoneal administration of an alginic acid oligomer mixture to mice.
  • FIG. 6-1 is a graph showing changes with time of various site force-in secretion promoting activities by intraperitoneal administration of an alginic acid oligomer mixture to mice.
  • FIG. 6-2 is a graph showing changes over time in various site-force-inducing activity by intraperitoneal administration of an alginic acid oligomer mixture to mice.
  • FIG. 6-3 is a graph showing time-dependent changes in various site force-in secretion promoting activities by intraperitoneal administration of an alginic acid oligomer mixture to mice.
  • FIG. 7 is a graph showing the G-CSF secretion promoting activity of alginic acid oligomers on macrophages.
  • FIG. 8 is a graph showing the MIP-1a secretion promoting activity of alginic acid oligomers on macrophages.
  • FIG. 9 is a graph showing the RANTES secretion promoting activity of alginic acid oligomers on macrophages.
  • FIG. 10-1 is a graph showing various site force insecretion activities of alginic acid oligomers against macrophages.
  • FIG. 10-2 is a diagram showing various site force insecretion activities of alginic acid oligomers against macrophages.
  • FIG. 11 is a graph showing the G-CSF secretion promoting activity of alginic acid oligomers on mouse intraperitoneal macrophages.
  • FIG. 12 is a graph showing G-CSF secretion promoting activity by intraperitoneal administration of an alginate oligomer in mice.
  • FIG. 13 is a graph showing concentration-dependent activity of promoting G-CSF secretion by intraperitoneal administration of an alginate oligomer in mice.
  • site force-in means a group of humoral factors that are responsible for the transmission of information between cells in the immune system, hematopoietic system, etc., and known site force-in, such as interleukin (IL), Only known site force-ins such as interferon (IFN), tumor necrosis factor (TNF), colony stimulating factor (CSF), transforming growth factor and chemokine This also means a site force-in that can be discovered in the future and is not particularly limited as long as TNF- ⁇ is excluded.
  • IL interleukin
  • IFN interferon
  • TNF tumor necrosis factor
  • CSF colony stimulating factor
  • transforming growth factor and chemokine This also means a site force-in that can be discovered in the future and is not particularly limited as long as TNF- ⁇ is excluded.
  • the site force-in in the present invention is preferably a site force-in selected from the group consisting of colony stimulating factor, chemokine, interleukin and interferon force.
  • colony stimulating factor refers to a function that specifically acts on monocyte cells (granulocytes, neutrophils, monocytes, etc.) to induce colony formation.
  • monocyte cells granulocytes, neutrophils, monocytes, etc.
  • cytokines include G-CSF, GM (glanulocyte- macrophage) -CSF, and M (macrophage) -CSF.
  • G-CSF and GM-CSF are preferable.
  • chemokine is a site force-in that controls the migration and activation of monocytic cells involved in immune responses, such as CXC chemokines [eg, KC (keratinocyte derived chemokine: CXCL8) etc.], CC chemokines [eg, MCP (monocyte chemoattrac tant protein)-1 (CCL2), MIP—1 a (CCL3), MIP—1 ⁇ (CCL4), RANTES (CCL5), Eotaxin (CCLll), etc. ], C chemokine, CX C chemokine.
  • CXC chemokines eg, KC (keratinocyte derived chemokine: CXCL8) etc.
  • CC chemokines eg, MCP (monocyte chemoattrac tant protein)-1 (CCL2), MIP—1 a (CCL3), MIP—1 ⁇ (CCL4), RANTES (CCL5), Eotaxin (CCLll), etc.
  • MIP-1 ⁇ MIP-1 ⁇
  • RANTES RANTES
  • Eotaxin MCP-1
  • KC KC
  • interleukin is a site force-in involved in various biological reactions such as inflammatory reaction, promotion of immune reaction, hematopoiesis, and bone metastasis.
  • IL-1 ⁇ IL-1 118, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 ( ⁇ 70; ⁇ 40 and ⁇ 35 heterodimers, p40, p35), IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, and the like.
  • IL-la, IL-lj8, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL — 12 (p40), IL-13, IL-17 force, IL-1a, IL-1 ⁇ , IL-6, IL-9, IL-12 (p70), IL-12 (p40), IL—13 power is better.
  • IFN interferon
  • IFN-a IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , etc.
  • IFN-y is preferable.
  • tumor necrosis factor is a cytokine having various biological activities such as cytotoxic action and cell growth inhibitory action on various cells. Examples include TNF-a and TNF- ⁇ .
  • TGF Transforming Growth Factor
  • 8 superfamily a group of peptides constituting the TGF-
  • the alginate oligomer of the present invention can act on various cells to promote the secretion of the above-mentioned cyto force-in.
  • Alginic acid oligomer contained in the agent of the present invention means an oligosaccharide having a polymerization degree of less than 20, obtained by decomposing alginic acid, or G, M or a mixture thereof.
  • the alginic acid oligomer is preferably an enzymatic degradation product (that is, a mixture of alginic acid oligomers having different polymerization degrees) or a purified alginic acid oligomer having the same polymerization degree.
  • the alginic acid oligomer may be a mixture of an oligomer of mannuronic acid (hereinafter sometimes referred to as “M oligomer”) and an oligomer of guluronic acid (hereinafter sometimes referred to as “G oligomer”). It may be preferred that mannuronic acid alone or guluronic acid alone.
  • the degree of polymerization of the alginic acid oligomer is less than 20, preferably 2 to 15, particularly preferably 3 to 9.
  • the content of the alginate oligomers in the dosage of the present invention is usually, 0.. 01 to: L00 Weight 0/0, preferably from 0.1 to 90 weight 0/0, more preferably 1 to 10 wt% .
  • the agent of the present invention may be an alginic acid oligomer itself, but may contain any carrier.
  • the carrier include excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, and calcium carbonate, senorelose, methinoresenorelose, hydroxypropenoresenorelose, polypropylene.
  • Norepyrrolidone gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch and other binders, den Disintegrants such as Pung, Canoleboxy methylenocellulose, Hydroxypropinorestarch, Sodium-glycol starch, Sodium bicarbonate, Calcium phosphate, Calcium citrate, Magnesium stearate, Air mouth gill, Talc, Sodium lauryl sulfate Lubricants such as lubricants, citrate, menthol, glycyllysine-ammonium salt, glycine, orange powder, preservatives such as sodium benzoate, sodium bisulfite, methylparaben, propylparaben, citrate, sodium citrate, acetic acid, etc.
  • den Disintegrants such as Pung, Canoleboxy methylenocellulose, Hydroxypropinorestarch, Sodium-glycol starch, Sodium bicarbonate, Calcium phosphate, Calcium citrate, Magnesium stea
  • Stabilizers suspensions such as methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, diluents such as water, saline, orange juice, cocoa butter, polyethylene glycol, white kerosene Etc. Base wack Force and the like S, but is not limited to them.
  • Examples of the dosage form of the agent of the present invention include solid preparations (eg, granules, powders, tablets, capsules and troches), and liquid preparations (eg, injections, drops, eye drops, etc.). But are not limited to these. Alginic acid oligomers are reduced in molecular weight and soluble in solvents such as water, and therefore can be easily taken in any of the above dosage forms.
  • the cells on which the agent of the present invention acts are not particularly limited, and include cells that are conventionally known to secrete cytodynamic force-in or cells that can be discovered in the future. Among them, CSF, chemokine, IL, and IFN force are the group forces. Cells that secrete the selected site force in are preferred. Cells, Th2 cells, rod cells, microglia cells, Thl cells, memory T cells, vascular smooth muscle, T cells, NK cells, immature rod cells, platelets, epithelial cells, fibroblasts, soft cells or mast cells Effector cells such as
  • the organism to which the agent of the present invention is applied is not particularly limited, and examples thereof include animals including humans (eg, mammals, birds, fishes, reptiles, amphibians, etc.).
  • the agent of the present invention may be used alone, but can also be used in combination for cancer chemotherapy and radiotherapy.
  • it can be used in combination with anticancer agents, immunotherapeutic agents, anti-inflammatory agents, vitamin agents and the like. It can also be administered before and after irradiation for cancer treatment. This is particularly useful when the side effect caused by administration of these agents reduces the production of cytodynamic force.
  • the alginic acid oligomer contained in the agent of the present invention is not toxic to living bodies and does not cause side effects. Therefore, by blending the agent of the present invention into general foods and drinks, supplements and the like, functional foods and drinks having a site force in secretion promoting function (immune mechanism enhancing function) can be produced. In order to mix and use alginic acid oligomers in foods and drinks, an effective amount thereof may be added or blended directly or in the above-described preparation form in the production stage of food or drink raw materials or the production stage of food or drinks.
  • the alginic acid used for the preparation of the alginic acid oligomer is not particularly limited, and commercially available ones (eg, sodium alginate) may be used, or brown algae such as kombu, wakame, hinoki etc. are directly extracted. Alginic acid may be used. Further, the extraction method from brown algae is not particularly limited, and it can be carried out by an extraction method known per se.
  • the alginic acid oligomer may be produced by decomposing the polymer as it is, but it is preferable that the arginic acid power is also separated and purified in advance to decompose PG or PM.
  • Alginate PG Separation and purification of PG or PM can be performed by a method known per se, for example, a method according to the heterogeneous acidic hydrolysis method of Haug et al. Can be preferably used (Acta. Chem Scand., 20, 183—190, 1966; Acta. Chem. Scand., 21, 691—704, 1967.
  • sodium alginate is suspended in 0.3 M hydrochloric acid aqueous solution and heated at 100 ° C., and then the solid is separated from the acidic solution by centrifugation or filtration.
  • pH 7
  • an anti-fractionation powder is obtained.
  • the powder is dissolved in 0.1 M aqueous sodium chloride solution, adjusted to pH 2.85 by adding aqueous hydrochloric acid solution and separated into soluble PM and precipitated PG.
  • Purified PM powder can be obtained by washing the precipitate twice with ethanol, dissolving in water, and lyophilizing.
  • Decomposition of alginic acid can be carried out by a method known per se, for example, enzymatic decomposition or acid hydrolysis, but from the viewpoint of the secretion promoting activity of cyto force-in shown in Fig. 3, it can be performed by enzymatic decomposition. preferable.
  • Enzymatic degradation is carried out using an alginate-degrading enzyme, and it is particularly preferable to use an alginate lyase produced by Syudu Alteromonas sp .
  • An alginic acid or purified PG and purified PM can be degraded by enzymatic degradation to prepare an alginic acid oligomer having unsaturated uronic acid as a non-reducing end.
  • the agent of the present invention can be produced by a conventional method containing the alginic acid oligomer prepared through the above steps.
  • solid preparations eg, granules, powders, tablets, capsules, troches, ointments, and transdermal preparations
  • solutions eg, injections, drops, eye drops, etc.
  • a diluent such as water and physiological saline.
  • the agent of the present invention can regulate the secretion of cytodynamic force-in by adjusting the type and blending amount of the alginic acid oligomer contained in the preparation.
  • the types of oligomers as shown in the secretion amounts of G-CSF, MIP-1 ⁇ and RANT ES by each oligomer in Figs.
  • G-CSF select G3, G8, G9, M7 or M8; for RANTES, select G8, G9, M7, M8 or M9.
  • MIP-1 ⁇ an oligomer having a relatively high secretory activity as compared with that of G oligomer may be selected.
  • an alginate oligomer may be selected with reference to various site force-in secretion amounts shown in FIG.
  • G3 is composed only of guluronic acid
  • M7 represents an alginic acid oligomer composed only of mannuronic acid and having a degree of polymerization of 7.
  • the present invention also provides a medicament for improving a condition caused by decreased secretion of a colony stimulating factor or chemokine, comprising an alginic acid oligomer as an active ingredient.
  • the "state resulting from decreased secretion of a colony-stimulating factor or chemokine” refers to a state in vivo that originates from a decrease in the amount of colony-stimulating factor or chemokine secreted by various cells in the living body.
  • Conditions such as decreased neutrophils and decreased function, decreased hematopoietic stem cell differentiation, decreased peripheral blood migration, decreased angiogenesis, increased vascular endothelial cell apoptosis and decreased effector cell migration activity More specifically, “disorders and diseases caused by decreased secretion of colony-stimulating factors or chemokines”, ie granulocytopenia due to side effects such as drug administration and radiotherapy, chronic with various infectious diseases It refers to disorders and diseases such as neutropenia, decreased immune function due to coronary atherosclerosis, myocardial infarction and obstructive arteriosclerosis.
  • ⁇ to improve '' a condition caused by decreased secretion of colony-stimulating factor or chemokine refers to preventing (preventing), treating, and improving symptoms in the above condition. Including doing. That is, the present invention also provides a medicament for preventing or treating a disorder or disease caused by decreased secretion of colony stimulating factor or chemokine.
  • the alginic acid oligomer contained in the medicament of the present invention as an active ingredient promotes secretion of cytodynamic force-in, particularly colony-stimulating factor or chemokine. Therefore, the medicament of the present invention is It can be suitably used for the prevention or treatment of disorders and diseases caused by decreased secretion of colony stimulating factor or chemokine, such as decreased immune function and arteriosclerosis.
  • the alginic acid oligomer contained in the medicament of the present invention as an active ingredient is as described in "(1) Secretion enhancer of cytopower in" of the present invention.
  • the alginic acid oligomer is preferably a purified alginic acid oligomer having the same degree of polymerization, ie, a force that is an enzyme degradation product (that is, a mixture of alginic acid oligomers having different degrees of polymerization).
  • the alginic acid oligomer may be a mixture of mannuronic acid and guluronic acid, or may be each alone, but is preferably an M oligomer or a G oligomer.
  • the degree of polymerization of the alginic acid oligomer contained as an active ingredient is less than 20, preferably 2 to 15, particularly preferably 3 to 9.
  • the blending amount of the alginic acid oligomer as the active ingredient is usually 0.01 to 99.9% by weight, preferably 0.1 to 90% by weight, more preferably 1 to 10% by weight. It is.
  • the medicament of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier include excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, Binders such as polypropylpyrrolidone, gelatin, arabic gum, polyethylene glycol, sucrose, starch, starch, carboxy methenoresenolellose, hydroxypropyl starch, sodium-glycolanol starch, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate, etc.
  • Disintegrants such as magnesium stearate, air mouth gill, talc, sodium lauryl sulfate, fragrances such as citrate, menthol, glycyllysine ammonium salt, glycine, orange powder, repose
  • Preservatives such as sodium oxide, sodium hydrogen sulfite, methyl paraben, propyl paraben, stabilizers such as succinic acid, sodium succinate, acetic acid, suspension agents such as methyl cellulose, polybutylpyrrolidone, aluminum stearate, surfactants, etc.
  • Examples of the pharmaceutical dosage form of the present invention include oral agents (eg, liquids, granules, powders, tablets, capsules, troches, etc.) and parenteral agents (eg, injections, eye drops, etc.).
  • oral agents eg, liquids, granules, powders, tablets, capsules, troches, etc.
  • parenteral agents eg, injections, eye drops, etc.
  • the powers are not limited to them.
  • the medicament of the present invention may be a controlled-release preparation (eg, sustained-release microcapsule) such as an immediate-release preparation or a sustained-release preparation. Since the alginic acid oligomer is reduced in molecular weight and soluble in a solvent such as water, it can be easily absorbed regardless of the dosage form.
  • autoimmune diseases Eg, autoimmune hemolytic anemia, mobilization of hematopoietic stem cells into peripheral blood, increased neutrophil count during hematopoietic stem cell transplantation, neutropenia due to cancer chemotherapy, etc.
  • congenital immunodeficiency disease Eg, congenital and idiopathic neutropenia, AD (atopic dermatitis), MDS (myelodysplastic syndrome), etc.
  • acquired immune deficiency diseases eg, human immunodeficiency virus (HIV) infection Neutropenia that interferes with treatment, neutropenia associated with myelodysplastic syndrome, neutropenia associated with aplastic anemia, rheumatoid arthritis, idiopathic alveolar proteinosis, etc.] Is mentioned.
  • the alginic acid oligomer contained in the medicament of the present invention as an active ingredient is as described in "(1) Secretory promoter of cytopower in” in this specification, and can be prepared by the method described therein. it can.
  • the medicament of the present invention is prepared by mixing the alginic acid oligomer as an active ingredient with the pharmaceutically acceptable carrier according to a method known per se generally used as a method for producing a medicament.
  • a method known per se generally used as a method for producing a medicament.
  • a medicament suitable for oral administration can be produced by dissolving an effective amount of an alginic acid oligomer in a diluent such as water or physiological saline (eg, liquid), and an effective amount of an alginic acid oligomer It can be produced as a granule (eg, capsule, tablet). It is also possible to perform inhalation therapy using a nebulizer by applying a liquid agent.
  • a diluent such as water or physiological saline (eg, liquid)
  • an effective amount of an alginic acid oligomer It can be produced as a granule (eg, capsule, tablet). It is also possible to perform inhalation therapy using a nebulizer by applying a liquid agent.
  • parenteral administration eg, intravenous injection, intramuscular injection, local injection
  • injections can be produced, for example, by dissolving an effective amount of an alginic acid oligomer in aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions.
  • These medicaments may contain antioxidants, buffers, antibacterial agents, isotonic agents and the like.
  • These medicines like ampoules and vials, have unit doses! /! Can be enclosed in containers in multiple doses.
  • the amount of secreted cytodynamic force can be adjusted by adjusting the type and amount of the alginate oligomer contained in the medicament of the present invention.
  • the type of oligomer for example, as shown in FIGS. 7 to 9, for the purpose of secretion of a larger amount of cytodynamic force, for G-CSF, select G3, G8, G9, M7 or M8, For RANTES, select G8, G9, M7, M8 or M9.
  • an oligomer having a relatively high secretory activity as compared with that of G oligomer may be selected.
  • an alginate oligomer may be selected with reference to FIG.
  • the amount of oligomer As for the amount of oligomer, the amount of alginic acid oligomer and the administration interval were examined with reference to the time course changes in the amount of secreted cytodynamic force in Figs. 4, 6 and 12, and the dose-dependent secretion activity in Fig. 5. Choose the appropriate one.
  • the medicament of the present invention it is possible to easily adjust the dose of alginate oligomer effective to promote the secretion of cytodynamic force in.
  • the dosage of the medicament of the present invention may be appropriately set according to the activity, type or combination amount of the active ingredient, administration subject, administration route, target disease, purpose of prevention or treatment, patient age and weight, and the like. it can.
  • the dose for oral administration to adults (body weight: about 60 kg) is about 0.1 to LOOg per day, preferably about 0.3 to about 0.3 mg of alginic acid oligomer as an active ingredient when alginate oligomer is a mixture.
  • the alginic acid oligomer is purified at every degree of polymerization (for example, a guluronic acid oligomer with a degree of polymerization of 9), the alginic acid oligomer that is the active ingredient is about 0.01 per day.
  • ⁇ 2 g preferably about 0.15 ⁇ : L 5 g can be administered.
  • the medicament of the present invention can be administered once a day, once a day, or divided into several times as needed, and can be divided into several days.
  • the medicament of the present invention can be safely administered as a veterinary medicament only for humans. wear.
  • the animal to be administered is not particularly limited, and examples thereof include mammals, birds, fishes, reptiles, amphibians and the like.
  • the dosage etc. in this case can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the present invention also provides use of an alginic acid oligomer for producing a medicament for improving a condition caused by decreased secretion of a colony stimulating factor or chemokine.
  • the present invention provides a method for producing a medicament for improving a condition caused by a decrease in secretion of a colony stimulating factor or chemokine using an alginic acid oligomer.
  • the alginic acid oligomer used in the present invention is as described in "(1) Site force-in secretion promoter" in the present specification.
  • it is prepared by the method described in “(1) an agent that promotes secretion of cytodynamic force and (2) a pharmaceutical agent for improving a condition caused by decreased secretion of a colony-stimulating factor or chemokine”. can do.
  • a disorder or disease caused by decreased secretion of a colony stimulating factor or chemokine means “(2) a pharmaceutical agent for improving a condition caused by decreased secretion of a colony stimulating factor or chemokine”. As described above.
  • use of an alginic acid oligomer to produce a medicament for improving a condition caused by a decrease in secretion of a colony stimulating factor or chemokine is not particularly limited.
  • the method described in “(2) Pharmaceutical for improving condition caused by decreased secretion of colony-stimulating factor or chemokine” or a production method known per se can be used.
  • the present invention includes the step of ingesting the secretion enhancer of cyto force-in according to the present invention, and the secretion of cyto force-in selected from the group that also comprises colony-stimulating factor or chemokine inc. Provide a way to promote
  • the present invention also includes a step of administering the pharmaceutical agent of the present invention to a subject in need thereof, ⁇ ⁇ ⁇ a site force-in excluding NF- ⁇ , preferably a site force selected from the group consisting of colony-stimulating factor or chemokine
  • a method for promoting in secretion is provided.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a condition caused by decreased secretion of a mouth-priming factor or chemokine, comprising the step of administering the medicament of the present invention to a subject in need thereof.
  • the alginic acid oligomer contained as an active ingredient in the agent or medicine of this method is as described in "(1) Secretory promoter of cytodynamic force in” in this specification.
  • it is prepared by the method described in “(1) a secretory promoter of cytodynamics and (2) a medicament for improving a condition caused by a decrease in the secretion of colony-stimulating factor or chemokine”. be able to.
  • the "site force-in” that is the subject of this method is as described in "(1) Site force-in secretion promoter” in this specification, and "secretion of colony-stimulating factor, chemokine or interferon”
  • the “state caused by the decrease” is as described in “(2) Pharmaceutical for improving a state caused by decreased secretion of colony stimulating factor or chemokine” in the present specification.
  • the subject to which the method is applied that is, the subject requiring the medicament of the present invention is not particularly limited.
  • mammals, birds, fish, reptiles, amphibians, etc. that can be found only by humans.
  • the dosage and administration method in this case can be appropriately set according to the description in “(2) Medicinal for improving condition caused by decreased secretion of colony stimulating factor or chemokine” in the present specification.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the intake amount and the intake method. Alginate oligomers have very low toxicity, so the intake can be easily adjusted according to individual differences.
  • the present invention is or should be used for promoting the secretion of cytodynamic force in excluding TNF-a.
  • a commercial package is provided that includes a description that describes the secretory promoter of the site force-in.
  • the medicament described in (2) above, and the medicinal power S can be used to improve a condition caused by decreased secretion of colony-stimulating factor or chemokine. Or related to the medicine, which should be used A commercial package is provided that includes a written description.
  • Mouse monocyte-derived cell line (mouse macrophage cell line) RAW264. 7 (ATCC N 0. TIB71) was cultured.
  • the growth medium is RPMI-1640 medium supplemented with antibiotics (Benzyl Penicillin Potassium, Streptomycin Sulfate) at a concentration of 100 g / ml, and then heat treated at 56 ° C for 30 minutes for fetal calf serum ( FBS) added with 10% (v / v) was used.
  • antibiotics Benzyl Penicillin Potassium, Streptomycin Sulfate
  • a cell suspension in a serum tube (stored at 80 ° C in a growth medium containing 10% DMSO) was thawed and transferred to a 15 ml tube.
  • the growth medium was collected and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes at room temperature to remove the supernatant.
  • about 5 ml of growth medium was added and the cells were dispersed, transferred to a culture flask (Falcon, 25 cm 2 plastic flask), and cultured in a 37 ° C, 5% CO gas incubator. ⁇ ⁇
  • the medium was exchanged and subcultured after confirming that there was no contamination with bacteria or the like and that the cells adhered to the bottom of the culture flask.
  • the solution in the flask was removed and allowed to stand again in the gas incubator for about 15 minutes. After confirming that the cells were peeled off at the bottom of the flask, add the growth medium, disperse some of the cells in the growth medium in the new flask, and again in a 37 ° C, 5% CO gas incubator.
  • PG and PM were prepared from commercially available sodium alginate using the method modified by Haug et al. (Acta, Chem. Scand., 20, 183-190, 1966, Carbohydr. Res., 32, 217-225). did.
  • Figure 1 shows the preparation flow chart. Specifically, 20 g of alginic acid (sodium alginate, manufactured by Nacalai Testa) was suspended in 2 L of 0.3 M HC1 solution, and heated to 100 ° C. for 1.5 hours for partial hydrolysis. The precipitate was collected, washed with 0.3 M HC1, then suspended in 250 ml of water syrup, neutralized to pH 7 with dilute NaOH, dissolved in water, and lyophilized to obtain an anti-fractionation powder. .
  • alginic acid sodium alginate, manufactured by Nacalai Testa
  • the precipitate was washed with ethanol (twice), dissolved in water, and freeze-dried to obtain purified PM powder (about 3 g).
  • Step 2 Preparation of enzyme-treated alginic acid oligomer mixture
  • Alginate lyase (manufactured by SIGMA) was used for the preparation of the unsaturated oligomer. This was adjusted to 10 mgZml with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). 0.2 mM 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 2% PG and PM 2. Incubate 0 ml at 37 ° C for 10 minutes, add 0.2 ml of enzyme solution to the base solution, The reaction was performed for a minute. The enzyme activity was measured with the amount of enzyme at which the absorbance at 235 nm increased by 0.1 per minute as 1 unit.
  • Step 3 Preparation of alginic acid oligomers with different degrees of polymerization
  • Step 1 Preparation of alginate oligomer
  • the alginate oligomer attached to the cells was prepared with RPMI1640 serum-free medium or physiological saline so as to be 10 mgZml, and passed through a zetapore filter.
  • Step 2 Addition of alginic acid oligomer to culturing system
  • RAW264 7 cells were seeded on a flat-bottom 96-well plate so that the number of cells per well was 2 ⁇ 10 4 . Gently stir so that cells do not collect in one place, 37 ° C, 5% CO gas
  • the culture supernatant was collected.
  • Step 3 Detection of G-CSF by ELISA
  • the primary antibody (Anti-mouse G-CSF monoclonal antibody, Purified) diluted to 4 gZml with sterile PBS was added to a 96-well plate for ELISA with 100 ⁇ l per well. After standing at room temperature for a while, the plate was washed twice with a washing solution (0.025% Tween20 in PBS), and a blocking solution (4% BSA in PBS) was added at 200 1 per well. After leaving at room temperature for a while, wash twice with the washing solution and dilute the culture supernatant to 1% with the blocking solution. 100 / zl was added per well.
  • Fig. 3 shows a comparison result of the enzyme-treated alginic acid oligomer and the acid-hydrolyzed alginic acid oligomer with respect to the alginic acid G oligomer mixture.
  • Alginate G oligomer obtained by acid hydrolysis has strong activity with almost no G-CSF secretion promoting activity
  • Enzyme-treated alginate G oligomer has high activity from macrophages and G-CSF secretion promotion activity It was. Similar results were obtained for alginate M oligomers.
  • Alginic acid oligomer mixture (700 mgZkg in 1 ml of PBS) or alginic acid polymer (700 mg / kg in 1 ml of PBS) was injected intraperitoneally into DDY mice (6 weeks old, male, approximately 30 g body weight), and G-CSF in mouse serum The amount was measured over time by ELISA.
  • the alginic acid oligomer mixture was prepared as follows.
  • high-purity sodium alginate manufactured by Kimiki Co., Ltd.
  • water a 5% aqueous solution
  • the alginate lyase Syudoarteromonas sp.No. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 1990-1992
  • the enzyme reaction was stopped by heating the solution in boiling water for 10 minutes.
  • the alginic acid oligomer mixture was passed through a zetapore filter (purchased from Wako Pure Chemical Industries) before use to remove endotoxin.
  • Step 2 Measurement of G-CSF level in mouse serum
  • the alginic acid oligomer mixture prepared in Step 1 above was injected intraperitoneally into mice, and after 0 hour, 0.5 hour, 1 hour, 1.5 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours, 9 hours or 24 hours, respectively. Serum was obtained from mice by conventional methods. The amount of G-CSF in the serum was determined by the same method as described in Iwamoto, M. et al., FE BS Lett. 2005, 579, 4423-4429, and anti-mouse G-CSF antibody (R & D Systems, MN , USA).
  • the alginic acid oligomer mixture was prepared in the same manner as in Step 1 of Example 4.
  • Various concentrations (0.07 mgZkg, 0.7 mgZkg, 7 mg / kg, 70 mg / kg, 700 mgZkg) of alginate oligomer mixture (in 1 ml of PBS) were administered intraperitoneally to mice, and in mouse serum 3 hours later.
  • the amount of G-CSF was measured by ELISA.
  • the alginic acid oligomer mixture prepared in Step 1 of Example 4 above (70 Omg / kg in 1 ml of PBS) was injected into the abdominal cavity of the mouse, and various site force in amounts in the mouse serum were measured over time with the Bio Plex system (BioRad). ).
  • Bio Plex has the advantage of allowing simultaneous quantification of multiple site forces in small sample volumes. In principle, this is a combination of normal ELISA and flow cytometry. In other words, beads bound to antibodies against various site force ins are placed in the test sample, and beads bound to site force ins are flowed. Detected and analyzed by cytometry.
  • IL-2, IL-3, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, GM-CS and INF- ⁇ showed two peaks within 24 hours.
  • G-CSF, GM-CSF, MCP-1, IL-1 ⁇ , RANTES, KC and eotaxin showed one peak.
  • the enzyme-degraded alginic acid oligomers having different degrees of polymerization were measured for the activity of promoting the secretion of various sites against macrophages by ELISA.
  • Fig. 7 shows the results regarding G-CSF secretion promoting activity.
  • Alginate oligomers G3, G8, G9, M7 and M8 were found to have high G-CSF secretion promoting activity.
  • Fig. 9 shows the results regarding RANTES secretion promoting activity. Compared with MIP-1a, the activity differs depending on the structure of the oligomer, and G8, G9, M7, M8, and M9 have a strong effect. G8, G9, M7, M8, and M9 were also found to have strong activity in promoting G-CSF secretion, and showed a similar structure-activity relationship.
  • Fig. 10-1 to Fig. 10: L0-2 show the results regarding other site force in secretion promoting activities.
  • G-CS F MCP-1, RANTES, GM-CSF and eotaxin
  • a strong cytoforce-inducing effect was observed particularly with M oligomers.
  • 8, IL-6, IL-9, and IL-13 are also affected, and IL-5, IL-12 This effect was also observed for KC and KC.
  • MIP-1 ⁇ and RANTES are also known as forces CCL-3 and CCR-5, respectively, and are known to have similar actions. MIP- ⁇ has also been reported to suppress HIV infection. From the above results, it is presumed that the alginic acid oligomer exhibits such a multi-site force-in-inducing action and affects the immune system of the body in many ways.
  • alginic acid oligomer of the present invention has G-CSF secretion promoting activity against macrophages in vivo.
  • C3HZHeJ mice five weeks old, female were bred for 1 week or longer, and 3 ml of thiodarycholate medium (Difco) was intraperitoneally administered to each mouse, and 3 days later with carbon dioxide.
  • Euthanized and peritoneal exudate cells were harvested with Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2). The collected peritoneal exudate cells were washed with PBS, adjusted for cell density in basal medium, and dispensed 1001 to each well of a 96-well flat bottom plate. Cells are sedimented by centrifuging the plate (500 rpm, 5 minutes), and cultured for 2 hours at 37 ° C and 5% CO.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • the cells were washed with 37 ° C PBS to remove non-adherent cells, and immersed in the culture medium again to prepare a monolayer culture of peritoneal exudate cells.
  • the purity of macrophages in monolayer culture of peritoneal exudate cells was 95% or more.
  • Each alginate oligomer solution adjusted to 1 mgZml with a medium was added. 37. C, in a 5% CO incubator
  • Fig. 11 shows the results of G-CSF secretion promoting activity on mouse intraperitoneal macrophages. Alginate oligomers G3, G8, G9, M7 and M8 were found to have high G-CSF secretion promoting activity.
  • mice 5 weeks old, female were bred for 1 week or longer. Per mouse
  • Fig. 12 shows the results of G-CSF secretion promoting activity by intraperitoneal administration of alginic acid oligomers to mice.
  • the concentration-dependent G-CSF inducing activity of the alginate oligomer was examined.
  • mice five weeks old, female were bred for 1 week or longer.
  • mice 0.02, 0.2, 2, 20 mgZml of enzyme digested alginate oligomer (oligomer mixture) or 0.001, 0.01, 0.1, lmgZml of single alginate oligomer (G3, G8) , G9, M7, M8) were each administered intraperitoneally in 0.1 ml.
  • Blood was collected 3 hours after the administration, and the obtained blood was centrifuged at 10, OOOrpm for 10 minutes to collect serum. From the collected serum, the amount of G-CSF was quantified by ELISA.
  • Fig. 13 shows the relationship between the concentration-dependent administration of alginate oligomers and the G-CSF secretion activity. High G-CSF-inducing activity was found in a dose-dependent manner by intraperitoneal administration of alginic acid oligomer alone and Z or a mixture.
  • the agent or medicament of the present invention it is possible to promote the secretion of cyto force in, particularly colony stimulating factor or chemo in, so that granulocytes and neutrophils are proliferated and active can do.
  • the medicament of the present invention is useful for patients whose immune function has declined due to cancer treatment, organ transplantation, immunodeficiency, and the like, and patients who have a permanent autoimmune disease. Also Hara Since the material is alginic acid, it can be provided as an inexpensive and safe agent or medicine.

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Abstract

 強い副作用を有し、かつ高価な免疫賦活化剤及びサイトカイン療法に代わって、生体へのサイトカイン供給にあたり安価でかつ安全性の高い剤及び医薬を提供する。  アルギン酸オリゴマーを含有してなる、TNF-αを除くサイトカインの分泌促進剤及びアルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなるコロニー刺激因子又はケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬の使用により、サイトカインの分泌を促進させる。

Description

明 細 書
サイト力イン分泌促進剤
技術分野
[0001] 本発明は、アルギン酸オリゴマーのサイト力イン分泌促進作用に基づぐアルギン酸 オリゴマーの用途に関する。
背景技術
[0002] 近年、高齢化や環境の悪化により、癌、心筋梗塞、糖尿病による閉塞性動脈硬化 症等の様々な疾患を抱える患者が急増して 、る。これらの疾患を抱える患者に対す る有効な治療薬として、各種のサイト力インが注目されている。
[0003] コロニー刺激因子(Colony Stimulating Factor;以下 CSFと表記する)の一種である 顆粒球コロニー刺激因子(Granulocyte- Colony Stimulating Factor ;以下 G— CSFと 表記する)は、単球、マクロファージおよび血管内皮細胞等により分泌される造血因 子であり、生体内での好中球の増殖、分化、機能亢進とその末梢血への放出ならび に血管新生の促進や血管内皮細胞のアポトーシスの抑制等の作用を有することが知 られている(非特許文献 1参照)。一方、ケモカインの一種である Macrophage Inflamm atory Protein— 1 alpha (^λ r MIP— 1 と表己する)および Regulated upon Activation of Normal T cell Expressed and Secreted (以下 RANTESと表記する)は単球、リン パ球、榭状細胞を初めとする様々なエフェクター細胞に作用して遊走活性を示すこと で、免疫反応に多面的に寄与している(非特許文献 2および 3参照)。
[0004] 現在臨床応用されているか、または臨床応用に向けて検討されている免疫療法と しては、非特異的免疫賦活剤を利用した治療法およびサイト力インを利用した治療 法が挙げられる。非特異的免疫賦活剤としてはピシバニール、クレスチンおよびレン チナン等が、サイト力インとしては G— CSFおよび腫瘍壊死因子(Tumor Necrosis Fa ctor ;以下 TNFと表記する) α等が製剤化されて現在使用されている。これらの使 用は、被爆による骨髄障害の治療、抗癌剤の副作用である造血幹細胞の減少に伴う 血液障害、臓器移植による免疫抑制患者の治療および放射線治療後の顆粒球減少 の回復等に効果がある。また、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群 (MDS)および 後天性免疫症候群 (AIDS)等の慢性好中球減少症等に対しても効果が期待されて いる。し力しながら、これらの製剤は一般に高価であり、また過剰投与による間質性肺 炎等の重篤な副作用が報告されている。従って、患者自身のサイト力イン分泌能を高 めることが可能であって、かつ安全性の高い薬剤等の開発が望まれている。
[0005] アルギン酸は、褐藻類の細胞壁構成多糖あるいは細胞間充填物質として存在し、 細胞の保護剤として機能している。アルギン酸は、 β—D—マンヌロン酸 (以下 Μと表 記する)と ex—L グルロン酸 (以下 Gと表記する)の 2種類のゥロン酸力 構成され、 これらが 1 , 4ーグリコシド結合により種々の割合で結合した直鎖状のポリウロニド多糖 である。アルギン酸は、その分子中に Μが連なったポリ— 13—D マンヌロン酸部位 (以下 ΡΜと表記する)、 Gが連なったポリ a Lーグルロン酸部位 (以下 PGと表記 する)ならびに Mおよび Gが交互配列したセグメント部位 (以下 MGランダムと表記す る)を有し、これら 3つのドメインが混在した構造を有する。
[0006] アルギン酸はカルシウム添カ卩によりゲル化することから、アルギン酸ゲルは、生細胞 の固定剤および徐放性医薬品の担体等として幅広く利用されている。またアルギン 酸そのものは、食品の増粘剤、化粧品および繊維加工等の幅広い用途に活用され ている。
[0007] アルギン酸の生理機能としては、整腸作用、血中コレステロール値の低下作用およ び高血圧予防作用等が一般的に知られている。しかしながら、このような機能は「ポリ マーとしてのアルギン酸」に関するものであり、「アルギン酸オリゴマー」の生理機能に つ!ヽてはほとんど知られて 、なかった。
[0008] アルギン酸のサイト力インに関連する生理活性としては、アルギン酸のある試料がヒ トの単球を刺激して、 TNF— a、インターロイキン(Interleukin;以下 ILと表記する) 1 ι8および IL 6の分泌を促進すること (非特許文献 4参照)、マンヌロン酸残基を高 い割合で有するアルギン酸がマクロファージによるサイト力イン分泌のインデューサー として機能する可能性があること (非特許文献 5参照)が報告されて 、る。しかしなが ら、精製された PGおよび PMは、ヒトの単核細胞には何の影響も無ぐ一方で高分子 アルギン酸によるマクロファージからの TNF放出誘導作用には、アルギン酸の分子 量が 5万以上であることが必要との研究報告も存する。最近、本発明者等は、アルギ ン酸オリゴマーが単球 (マクロファージ)の TNF— a分泌を促進することを解明し、ォ リゴマーとしての有用性を見出した (特許文献丄参照)。
[0009] 特許文献 1:特開 2005-145885号公報
非特許文献 1 :Anal.Biochem.l95,38,1991
非特許文献 2 : Blood 100, 2195-2202, 2002
非特許文献 3 Neuropharmacology 39, 2505-2513, 2000
非特許文献 4:J. Immunother., 10, 286-291, 1991
非特許文献 5 : Infect. Immun., 61, 1917-1925, 1993
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の課題は、サイト力イン療法または感染症予防に用いられる、安価でかつ安 全性の高い剤および医薬等を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵素分解することで得ら れたアルギン酸オリゴマーが、細胞を活性ィ匕してサイト力インの分泌を促進させること を見出し、本発明を完成するに至った。
[0012] 即ち、本発明は以下のとおりである。
(1)アルギン酸オリゴマーを含有してなる、 TNF— αを除くサイト力インの分泌促進 剤。
(2)サイト力インが、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターロイキンおよびインター フエロンからなる群より選ばれるものである、(1)記載の剤。
(3)コロニー刺激因子が G— CSFおよび GM— CSFであり、ケモカインが MIP—l α 、 RANTES、 MCP— 1、 Eotaxinおよび KCである、(2)記載の剤。
(4)インターロイキンが IL— 1 α、 IL— 1 j8、 IL— 2、 IL— 3、 IL— 4、 IL— 5、 IL— 6、 I L— 9、 IL— 10、 IL— 12 (p70)、 IL— 12 (p40)、 IL— 13、 IL— 17であり、インター フエロンが IFN— γである、(2)記載の剤。
(5)アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸の酵素分解物またはその精製物である、 (1 )〜(4)の 、ずれかに記載の剤。 (6)アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独力もなるものであ る、(1)〜(5)のいずれかに記載の剤。
(7)アルギン酸オリゴマーの重合度が 3〜9である、 (1)〜(6)の!、ずれかに記載の 剤。
(8)アルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなる、コロニー刺激因子またはケ モカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬。
(9)アルギン酸オリゴマーがアルギン酸の酵素分解物またはその精製物である(8)記 載の医薬。
(10)アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独力 なるもので ある、(8)または(9)記載の医薬。
(11)アルギン酸オリゴマーの重合度が 3〜9である、 (8)〜(10)の 、ずれかに記載 の医薬。
(12)コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬 を製造するためのアルギン酸オリゴマーの使用。
(13) (1)〜(7)のいずれか〖こ記載の剤を摂取する工程を含む、 TNF— αを除くサイ トカインの分泌を促進させる方法。
(14) (8)〜(11)の ヽずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程 を含む、 TNF— aを除くサイト力インの分泌を促進させる方法。
(15) (8)〜(11)の ヽずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程 を含む、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防また は治療する方法。
(16)サイト力インカ コロニー刺激因子およびケモカインカもなる群より選ばれるもの である、(13)または(14)に記載の方法。
(17) (1)〜(7)のいずれか〖こ記載のサイト力インの分泌促進剤、および当該剤が TN F- αを除くサイト力インの分泌促進に使用することができることまたは使用すべきで あることを記載した当該剤に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
(18) (8)〜(11)のいずれかに記載の医薬、および当該医薬がコロニー刺激因子ま たはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療するために使用するこ とができることあるいは使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記 載した記載物を含む商業用パッケージ。
発明の効果
[0013] 本発明のサイト力インの分泌促進剤は、エフェクター細胞に作用し、当該細胞から サイト力インを効率的かつ用量依存的に分泌させることができる。また、本発明の剤 はヒトのみならず各種動物にも用いることができ、その免疫力を高めることができる。
[0014] 本発明の医薬は、サイト力イン療法を必要とする患者に、単独で、または他の薬剤 と併用して用いることにより、サイト力インの分泌を促進することができる。また本発明 の医薬は、免疫力の低下した動物に対する、種々の感染症等への抵抗性を向上さ せるための、感染症予防薬および治療薬としても有用である。
[0015] アルギン酸オリゴマーを使用し、医薬的に許容される担体等と製剤化することにより 、CSFまたはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製造することが できる。
[0016] アルギン酸オリゴマーを使用することで、サイト力イン、特に CSFまたはケモカインの 分泌を促進させることができるので、 CSFまたはケモカインの分泌低下に起因する障 害または疾患を予防および Zまたは治療する方法を提供することができる。
[0017] 本発明の剤または医薬および当該剤または医薬に関する説明等を記載した記載 物を含む商業用パッケージを提供することができる。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]マンヌロン酸ポリマーとグルロン酸ポリマーの調製方法を示す図である。
[図 2]酵素消化したアルギン酸オリゴマー(以下、酵素処理アルギン酸オリゴマーと表 記する)をゲルろ過したチャートを示す図である。
[図 3]酵素処理アルギン酸オリゴマー混合物と、酸加水分解アルギン酸オリゴマー混 合物の G— CSF分泌促進活性の比較を示す図である。
[図 4]アルギン酸オリゴマー混合物(黒丸)およびアルギン酸ポリマー(白丸)のマウス 腹腔内投与による、 G— CSF分泌促進活性の経時変化を示す図である。
[図 5]アルギン酸オリゴマー混合物のマウス腹腔内投与による、投与量依存的な G— CSF分泌促進活性を示す図である。 [図 6-1]アルギン酸オリゴマー混合物のマウス腹腔内投与による、各種サイト力イン分 泌促進活性の経時変化を示す図である。
[図 6-2]アルギン酸オリゴマー混合物のマウス腹腔内投与による、各種サイト力イン分 泌促進活性の経時変化を示す図である。
[図 6-3]アルギン酸オリゴマー混合物のマウス腹腔内投与による、各種サイト力イン分 泌促進活性の経時変化を示す図である。
[図 7]マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーの G— CSF分泌促進活性を示す 図である。
[図 8]マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーの MIP— 1 a分泌促進活性を示 す図である。
[図 9]マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーの RANTES分泌促進活性を示 す図である。
[図 10-1]マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーの各種サイト力イン分泌活性 を示す図である。
[図 10-2]マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーの各種サイト力イン分泌活性 を示す図である。
[図 11]マウス腹腔内マクロファージに対するアルギン酸オリゴマーの G— CSF分泌促 進活性を示す図である。
[図 12]アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内投与による G— CSF分泌促進活性を示 す図である。
[図 13]アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内投与が、濃度依存的な G— CSF分泌促 進活性を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
(ί)サイト力インの分泌 谁剤
本明細書中「サイト力イン」とは、免疫系、造血系などにおいて主要な細胞間情報伝 達を担う一群の液性因子を意味し、公知のサイト力イン、例えばインターロイキン (IL) 、インターフェロン (IFN)、腫瘍壊死因子 (TNF)、コロニー刺激因子(CSF)、トラン スフォーミング成長因子およびケモカインなどの自体公知のサイト力インだけでなぐ 将来発見されうるサイト力インをも意味し、 TNF— αを除く限りにおいて特に限定され ない。
本発明におけるサイト力インとしては、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターロイ キンおよびインターフェロン力もなる群より選ばれるサイト力インが好ましい。
[0020] 本明細書中「コロニー刺激因子 (CSF)」とは、単球系細胞 (顆粒球、好中球、単球 など)に特異的に作用してそのコロニー形成を誘導する機能などを有するサイトカイ ンであり、例えば G— CSF、 GM (glanulocyte- macrophage) -CSF, M (macrophage )一 CSFなどが挙げられる。
本発明におけるコロニー刺激因子としては、 G— CSF、 GM— CSFが好ましい。
[0021] 本明細書中「ケモカイン」とは、免疫応答に関与する単球系細胞の遊走作用、活性 化などを制御するサイト力インであり、例えば CXCケモカイン [例、 KC (keratinocyte derived chemokine: CXCL8)等]、 CCケモカイン [例、 MCP (monocyte chemoattrac tant protein) - 1 (CCL2)、 MIP— 1 a (CCL3)、 MIP— 1 β (CCL4)、 RANTES ( CCL5)、 Eotaxin (CCLl l)等]、 Cケモカイン、 CX Cケモカインなどが挙げられる。
3
本発明におけるケモカインとしては、 MIP— 1 α、 RANTES, Eotaxin、 MCP— 1 、KCが好ましい。
[0022] 本明細書中「インターロイキン (IL)」とは、炎症反応、免疫反応の促進、造血、骨代 謝などの様々な生体反応に関与するサイト力インであり、例えば IL— 1 α、 IL— 1 18、 IL— 2、 IL— 3、 IL— 4、 IL— 5、 IL— 6、 IL— 7、 IL— 8、 IL— 9、 IL— 10、 IL— 11、 I L— 12 (ρ70 ;ρ40と ρ35のへテロ 2量体、 p40、 p35)、 IL— 13、 IL— 14、 IL— 15、 I L— 16、 IL— 17などが挙げられる。
本発明においては、 IL— l a、 IL— l j8、 IL— 2、 IL— 3、 IL— 4、 IL— 5、 IL— 6、 I L— 9、 IL— 10、 IL— 12 (p70)、 IL— 12 (p40)、 IL— 13、 IL— 17力 子ましく、 IL— 1 a、 IL- 1 β、 IL— 6、 IL— 9、 IL— 12 (p70)、 IL— 12 (p40)、 IL— 13力 り好ま しい。
[0023] 本明細書中「インターフェロン(Interferon ;以下 IFNと表記する)」とは、抗ウィルス 作用、細胞増殖抑制作用、抗腫瘍作用、免疫細胞活性化作用などの様々な生物活 性を有するサイト力インであり、例えば IFN— a、 IFN- β、 IFN— γなどが挙げられ る。本発明における IFNとしては、 IFN— yが好ましい。
[0024] 本明細書中「腫瘍壊死因子(Tumor Necrosis Factor ;TNF)」とは、種々の細胞に 対する細胞傷害作用、細胞増殖抑制作用などの様々な生物活性を有するサイトカイ ンであり、例えば TNF— a、 TNF- βなどが挙げられる。
[0025] 本明細書中「トランスフォーミング成長因子(Transforming Growth Factor ;TGF)」と は、細胞に対する増殖抑制作用、分化調節作用、遊走作用、各種細胞外マトリックス の産生促進作用などの様々な生物活性を有するサイト力インであり、 TGF— |8スー パーファミリーを構成する一群のペプチド、例えば TGF— β、ァクチビン、 BMPなど が挙げられる。
[0026] 本発明のアルギン酸オリゴマーは、各種細胞に作用して上記サイト力インの分泌を 促進させることができる。
[0027] 本発明の剤に含まれる「アルギン酸オリゴマー」は、アルギン酸を分解して得られた 重合度 20未満の G、 Mまたはその混合物力 なるオリゴ糖を意味する。
上記アルギン酸オリゴマーは、酵素分解物(すなわち、重合度の異なるアルギン酸 オリゴマーの混合物)そのものであるか、同じ重合度のアルギン酸オリゴマー精製物 であることが好ましい。また、上記アルギン酸オリゴマーは、マンヌロン酸のオリゴマー (以下、 Mオリゴマーと表記する場合がある)およびグルロン酸のオリゴマー(以下、 G オリゴマーと表記する場合がある)の混合物であっても、それぞれ単独であってもよい 力 マンヌロン酸単独またはグルロン酸単独であることが好まし 、。
さらに、本発明の剤においては、アルギン酸オリゴマーの重合度は 20未満、好まし くは 2〜15、特に好ましくは 3〜9である。
[0028] 本発明の剤におけるアルギン酸オリゴマーの含有量は、通常、 0. 01〜: L00重量0 /0 、好ましくは 0. 1〜90重量0 /0、より好ましくは 1〜10重量%である。
[0029] 本発明の剤は、アルギン酸オリゴマーそのものでも良 、が、任意の担体を含んで ヽ ても良い。当該担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖 、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セ ノレロース、メチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ポリプロピノレピロリドン、 ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デン プン、カノレボキシメチノレセルロース、ヒドロキシプロピノレスターチ、ナトリウムーグリコー ル—スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クェン酸カルシウム等の崩壊 剤、ステアリン酸マグネシウム、エア口ジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、 クェン酸、メントール、グリシルリシン-アンモ-ゥム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香 剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等 の保存剤、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビ -ルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、 生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯 油等のベースワックス等が挙げられる力 S、それらに限定されるものではない。
[0030] 本発明の剤の剤形としては、例えば固形剤 (例、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤 およびトローチ剤等)、ならびに液剤 (例、注射剤、点滴剤および点眼剤等)が挙げら れるが、それらに限定されるものではない。アルギン酸オリゴマーは、低分子化されて おり、水等の溶媒に可溶であるため、上記いずれの剤形を採っても容易に摂取する ことができる。
[0031] 本発明の剤が作用する細胞としては特に限定されることなぐサイト力インを分泌す ることが従来公知な細胞または将来発見され得る細胞全てが含まれる。中でも CSF、 ケモカイン、 ILおよび IFN力 なる群力 選択されるサイト力インを分泌する細胞が好 ましぐ例えば、単球、マクロファージ、血管内皮細胞、好中球、好酸球、好塩基球、 マスト細胞、 Th2細胞、榭状細胞、ミクログリア細胞、 Thl細胞、メモリー T細胞、血管 平滑筋、 T細胞、 NK細胞、未成熟榭状細胞、血小板、上皮細胞、線維芽細胞、軟 骨細胞または肥満細胞等のエフェクター細胞が挙げられる。
また、本発明の剤が適用される生物としても特に限定されることは無ぐ例えば、ヒト を含む動物 (例、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類等)が挙げられる。
[0032] 本発明の剤は、単独で用いてもよいが、癌の化学療法および放射線療法等の際に 併用することもできる。例えば、抗癌剤、免疫療法剤、抗炎症剤、ビタミン剤等と組み 合わせて用いることができる。また、癌治療に用いる放射線照射前後にも投与するこ とができる。これらの剤を投与することにより発生する副作用により、サイト力インの分 泌が低下する場合に特に有用である。 [0033] 本発明の剤が含有するアルギン酸オリゴマーは、生体に対する毒性を有さず、また 副作用も生じさせない。従って、本発明の剤を一般の飲食品、サプリメント等に配合 することで、サイト力イン分泌促進機能 (免疫機構増強機能)を有する機能性飲食品 等を製造することもできる。アルギン酸オリゴマーを飲食品に配合して用いるには、そ の有効量を直接もしくは上記製剤形態で、飲食品原料の製造段階または飲食品の 製造段階において、添加、配合すればよい。
[0034] 次に、アルギン酸オリゴマーの調製方法について説明する。
アルギン酸オリゴマーの調製に使用されるアルギン酸としては特に限定されず、巿 販されているもの(例、アルギン酸ナトリウム)を用いてもよいし、コンブ、ワカメ、ヒジキ 等の褐藻類カゝら直接抽出したアルギン酸を用いてもよい。また褐藻類からの抽出方 法は特に限定されず、自体公知の抽出方法により行うことができる。
[0035] アルギン酸オリゴマーは、ポリマーのまま分解して製造してもよいが、予めアルギン 酸力も PGまたは PMを分離精製しておき、それらを分解することが好ましい。アルギ ン酸カもの PGまたは PMの分離精製は、 自体公知の方法により行うことができ、例え ば Haugらの不均一酸性加水分解法に準じた方法を好ましく利用することができる (A cta. Chem. Scand., 20, 183—190, 1966; Acta. chem. Scand., 21, 691—704, 1967参照
) o
[0036] 例えば図 1に示すように、アルギン酸ナトリウムを 0. 3M塩酸水溶液に懸濁し、 100 °Cで加熱した後、固形物を遠心分離またはろ過によって酸性溶液から分離する。次 いで得られた固形物 (残渣)を 0. 3M塩酸水溶液で洗浄し、水に懸濁し、希水酸ィ匕 ナトリウム溶液で中和 (pH = 7)して可溶ィ匕した後凍結乾燥して抗分別粉末を得る。さ らに、該粉末を 0. 1Mの塩化ナトリウム水溶液中に溶解し、塩酸水溶液を加え pH2. 85に調整して可溶ィ匕した PMと沈殿した PGに分離する。
[0037] 沈殿した PGは、 pH2〜3の塩酸で洗浄し、水に懸濁した後水酸ィ匕ナトリウム水溶液 で pH7に調整し溶解する。さらにエタノール(PG溶液 Zエタノール = 1Z2, vZv)を 添加して、 PGを沈殿させる。沈殿物をエタノールで 2回洗浄した後水に溶解し、凍結 乾燥することで精製 PG粉末を得ることができる。
[0038] 一方、可溶ィ匕した PMは、水酸ィ匕ナトリウム水溶液で pH7に調整し、エタノール (P M溶液 Zエタノール = 1Z2, vZv)を添加して、 PMを沈殿させる。沈殿物をェタノ ールで 2回洗浄した後水に溶解し、凍結乾燥することで精製 PM粉末を得ることがで きる。
[0039] アルギン酸の分解は、 自体公知の方法、例えば酵素分解または酸加水分解により 行うことができるが、図 3に示すサイト力インの分泌促進活性の点から、酵素分解によ り行うことが好ましい。酵素分解はアルギン酸分解酵素を用いて行うが、特にシユード アルテロモナス sp. No. 272株の産生するアルギン酸リアーゼ(biosci. Biotechnol. B iochem., 65, 133-142, 2001参照)を用いることが好ましい。酵素分解によりアルギン 酸または精製 PGおよび精製 PMを分解し、不飽和結合のゥロン酸を非還元末端とす るアルギン酸オリゴマーを調製することができる。
また、重合度が異なるアルギン酸オリゴマーを精製するためには、ゲルろ過や各種 クロマトグラフィー等の自体公知の分離手段を制限無く用いることができる。
[0040] 本発明の剤は、以上の工程を経て調製されたアルギン酸オリゴマーを含有させ、常 法により製造することができる。
例えば、固形剤 (例、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、軟膏剤および 経皮製剤)は所定量のアルギン酸オリゴマーを固体や顆粒として含有させることで製 造することができる。一方、液剤 (例、注射剤、点滴剤および点眼剤等)は水および生 理食塩水のような希釈液に所定量のアルギン酸オリゴマーを溶解させることで製造す ることがでさる。
[0041] 本発明の剤は、その製剤中に含有させるアルギン酸オリゴマーの種類および配合 量を調整することで、サイト力インの分泌を調節することができる。例えばオリゴマーの 種類については、図 7〜9の各オリゴマーによる G— CSF、 MIP—1 αおよび RANT ESの分泌量にそれぞれ示されるように、より多量のサイト力インの分泌を目的とする 場合は、 G— CSFの場合、 G3、 G8、 G9、 M7または M8を選択し、 RANTESの場 合、 G8、 G9、 M7、 M8または M9を選択する。また MIP— 1 αの場合は、 Gオリゴマ 一に比して相対的に高い分泌活性を有する Μオリゴマーを選択すればよい。さらに 他のサイト力インの場合は、図 10に示される各種サイト力イン分泌量を参考に、アル ギン酸オリゴマーを選択すればよい。ここで、例えば G3とは、グルロン酸のみで構成 され、その重合度が 3であるアルギン酸オリゴマーを表し、例えば M7とは、マンヌロン 酸のみで構成され、その重合度が 7であるアルギン酸オリゴマーを表す。
またオリゴマーの配合量については、図 4、図 6および図 12に示されるサイト力イン 分泌量の経時変化、ならびに図 5に示される投与量依存的な分泌活性を参考に、ァ ルギン酸オリゴマーの配合量および投与間隔を適宜選択すればよい。
[0042] (2)コロニー刺激 早またはケモカインの分泌低下に走 3 する状態を己 善するため の医薬
本発明はまた、アルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなる、コロニー刺激 因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬を提供する
[0043] 本明細書において「コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状 態」とは、生体内の各種細胞が分泌するコロニー刺激因子またはケモカイン量の低 下に端を発する、生体内における好中球の減少および機能低下、造血幹細胞の分 化能低下、末梢血への遊走能の低下、血管新生の減少、血管内皮細胞のアポトー シスの増加ならびにエフェクター細胞の遊走活性の低下等の状態などを 、 、、具体 的には、「コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害および疾 患」、すなわち薬剤投与および放射線治療等の副作用による顆粒球減少、種々の感 染症に伴う慢性好中球減少症、冠動脈硬化等による各種免疫機能の低下、心筋梗 塞および閉塞性動脈硬化症等の障害および疾患などをいう。
これらの障害等はコロニー刺激因子またはケモカインの分泌を促進させることで改 善することができる。
なお、本明細書において、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因 する状態を「改善する」とは、上記状態を未然に防止 (予防)すること、治療することお よび上記状態における症状を改善することを含む。すなわち、本発明は、コロニー刺 激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害または疾患を予防または治療 する医薬をも提供する。
[0044] 本発明の医薬が有効成分として含有するアルギン酸オリゴマーは、サイト力イン、特 にコロニー刺激因子またはケモカインの分泌を促進する。従って、本発明の医薬は、 コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害および疾患、例えば 免疫機能低下、動脈硬化症等の予防または治療等に好適に使用され得る。
[0045] 本発明の医薬が有効成分として含有するアルギン酸オリゴマーは、本発明の「(1) サイト力インの分泌促進剤」で説明した通りである。
該アルギン酸オリゴマーは、酵素分解物(すなわち、重合度の異なるアルギン酸ォ リゴマーの混合物)である力、同じ重合度のアルギン酸オリゴマー精製物であることが 好ましい。また、上記アルギン酸オリゴマーは、マンヌロン酸およびグルロン酸の混合 物であっても、それぞれ単独であってもよいが、 Mオリゴマーまたは Gオリゴマーであ ることが好ましい。
さらに、本発明の医薬においては、有効成分として含有するアルギン酸オリゴマー の重合度は 20未満、好ましくは 2〜 15、特に好ましくは 3〜9である。
[0046] 本発明の医薬において、有効成分であるアルギン酸オリゴマーの配合量は、通常、 0. 01〜99. 9重量%、好ましくは 0. 1〜90重量%、より好ましくは 1〜10重量%で ある。
[0047] 本発明の医薬は、医薬上許容される担体を含むことができる。医薬上許容される担 体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セ ルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチル セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、ァラビ ァゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシ メチノレセノレロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウムーグリコーノレ スターチ、炭 酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クェン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マ グネシゥム、エア口ジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クェン酸、メントー ル、グリシルリシン'アンモ-ゥム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナト リウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クェン 酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビュルピロリドン、ス テアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、ォレ ンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースヮッ タスなどが挙げられる力 それらに限定されるものではない。 [0048] 本発明の医薬の投与剤形としては、例えば経口剤 (例、液剤、顆粒剤、散剤、錠剤 、カプセル剤、トローチ剤等)および非経口剤 (例、注射剤、点眼剤等)が挙げられる 力 それらに限定されるものではない。また本発明の医薬は、その剤形が速放性製 剤または徐放性製剤等の放出制御製剤(例、徐放性マイクロカプセル剤)であっても よい。アルギン酸オリゴマーは、低分子化されており、水等の溶媒に可溶であるため 、上記いずれの剤形を採っても容易に吸収される。
[0049] 「コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害および疾患」、す なわち本発明の医薬を投与することで予防または治療され得る障害および疾患とし ては、例えば、自己免疫疾患 [例、自己免疫性溶血性貧血、造血幹細胞の末梢血中 への動員、造血幹細胞移植時の好中球数の増加促進、がん化学療法による好中球 減少症等]、先天性免疫不全疾患 [例、先天性 ·特発性好中球減少症、 AD (アトピー 性皮膚炎)、 MDS (骨髄異形成症候群)等]、後天性免疫不全疾患 [例、ヒト免疫不 全ウィルス (HIV)感染症の治療に支障を来す好中球減少症、骨髄異形成症候群に 伴う好中球減少症、再生不良性貧血に伴う好中球減少症、リウマチ性関節炎、特発 性肺胞蛋白症等]等が挙げられる。また、神経芽腫、悪性リンパ腫、脳腫瘍、網膜芽 腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍等に対して抗癌剤を投与した際の好中球等の減少 に際しても好ましく用いられる。
[0050] 本発明の医薬が有効成分として含有するアルギン酸オリゴマーは、本明細書「(1) サイト力インの分泌促進剤」中で説明した通りであり、そこに記載した方法で調製する ことができる。
[0051] また、本発明の医薬は、医薬の製造法として一般的に用いられている自体公知の 手段に従って、上記アルギン酸オリゴマーを有効成分として、上記医薬的に許容され る担体と混合して製剤化することができる。
例えば、経口投与に好適な医薬は、水または生理食塩水のような希釈液に有効量 のアルギン酸オリゴマーを溶解させて製造する (例、液剤)ことができ、また有効量の アルギン酸オリゴマーを固体や顆粒として含有させて製造する(例、カプセル剤、錠 剤)ことができる。液剤を応用して、噴霧器を用いた吸入療法を行うことも可能である 。一方、非経口的投与 (例、静脈内注射、筋肉注射、局所注入)に好適な医薬 (例、 注射薬)は、例えば水性および非水性の等張な無菌の注射液に有効量のアルギン 酸オリゴマーを溶解させて製造することができる。なお、これらの医薬には抗酸化剤、 緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。これらの医薬は、アンプルおよ びバイアルのように、単位投与量ある!/ヽは複数回投与量ずつ容器に封入することが できる。
[0052] また、本発明の医薬中に含有させるアルギン酸オリゴマーの種類および配合量を 調整することで、サイト力インの分泌量を調節することができる。オリゴマーの種類に ついては、例えば図 7〜9に示すように、より多量のサイト力インの分泌を目的とする 場合は、 G— CSFの場合、 G3、 G8、 G9、 M7または M8を選択し、 RANTESの場 合、 G8、 G9、 M7、 M8または M9を選択する。また MIP— 1 αの場合は、 Gオリゴマ 一に比して相対的に高い分泌活性を有する Μオリゴマーを選択すればよい。さらに 他のサイト力インの場合は、図 10を参考にアルギン酸オリゴマーを選択すればよい。 またオリゴマーの配合量については、図 4、図 6および図 12のサイト力イン分泌量の 経時変化、ならびに図 5の投与量依存的な分泌活性を参考に、アルギン酸オリゴマ 一の配合量および投与間隔を適宜選択すればょ 、。
本発明の医薬によれば、サイト力インの分泌を促進させるのに有効なアルギン酸ォ リゴマーの投与量を容易に調整することができる。
[0053] 本発明の医薬の投与量は、有効成分の活性、種類または配合量、投与対象、投与 ルート、対象疾患、予防または治療の目的、患者の年齢および体重等により適宜設 定することができる。成人 (体重約 60kg)に経口投与する場合の投与量は、アルギン 酸オリゴマーが混合物の場合は、有効成分であるアルギン酸オリゴマーを 1日あたり 約 0. 1〜: LOOg、好ましくは約 0. 3〜30gとなるように投与することができ、アルギン酸 オリゴマーが重合度ごとに精製されている(例えば重合度 9のグルロン酸オリゴマー) 場合は、有効成分であるアルギン酸オリゴマーを 1日あたり、約 0. 01〜2g、好ましく は約 0. 15〜: L 5gとなるように投与することができる。本発明の医薬は、 1日あたり、 必要に応じて一度に、または数回に分割して投与することができ、また数日に分けて 投与することちでさる。
[0054] また本発明の医薬は、ヒトだけでなぐ動物用医薬としても安全に投与することがで きる。投与対象となる動物としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、魚類、爬 虫類、両生類等が挙げられる。この場合の投与量等は、当業者であれば適切に決定 することが可能である。
[0055] (3)コロニー刺激 W子またはケモカインの分泌低下に走 3闵する状態の己 善用医蓉を 製造するためのアルギン酸オリゴマーの使用
また本発明は、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の 改善用医薬を製造するためのアルギン酸オリゴマーの使用を提供する。具体的には 、アルギン酸オリゴマーを使用したコロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に 起因する状態の改善用医薬の製造方法を提供する。
[0056] 本発明で使用されるアルギン酸オリゴマーは、本明細書中「(1)サイト力インの分泌 促進剤」で説明した通りである。またこれは、本明細書中「(1)サイト力インの分泌促 進剤および (2)コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改 善するための医薬」に記載した方法で調製することができる。本発明において、「コロ ニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する障害または疾患」とは、本明 細書中「(2)コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善 するための医薬」で説明した通りである。
[0057] 該使用においては、〔1〕コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する 状態の改善用医薬を製造するために、〔2〕アルギン酸オリゴマーを使用する、限りに おいて特に制限はなぐ本明細書中「(2)コロニー刺激因子またはケモカインの分泌 低下に起因する状態を改善するための医薬」に記載した方法や、自体公知の製造方 法を利用することができる。
[0058] (4)サイト力インの分泌を促進させる方法
さらに本発明は、本発明のサイト力インの分泌促進剤を摂取する工程を含む、 TNF — αを除くサイト力イン、好ましくはコロニー刺激因子またはケモカインカもなる群より 選ばれるサイト力インの分泌を促進させる方法を提供する。
また、本発明は、本発明の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、 Τ NF— αを除くサイト力イン、好ましくはコロニー刺激因子またはケモカインカもなる群 より選ばれるサイト力インの分泌を促進させる方法を提供する。 さらに本発明は、本発明の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、コ 口-一刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療する 方法を提供する。
[0059] 本方法の剤または医薬に有効成分として含まれるアルギン酸オリゴマーは、本明細 書中「(1)サイト力インの分泌促進剤」で説明した通りである。またこれは、本明細書 中「(1)サイト力インの分泌促進剤および (2)コロニー刺激因子またはケモカインの分 泌低下に起因する状態を改善するための医薬」に記載した方法で調製することがで きる。
[0060] 本方法の対象となる「サイト力イン」とは、本明細書中「(1)サイト力インの分泌促進 剤」で説明した通りであり、「コロニー刺激因子、ケモカインまたはインターフェロンの 分泌低下に起因する状態」とは、本明細書中「(2)コロニー刺激因子またはケモカイ ンの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬」で説明した通りである。
[0061] 本方法が適用される対象、すなわち本発明の医薬を必要とする対象としては特に 限定されない。例えばヒトだけでなぐ哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類等が挙 げられる。この場合の投与量および投与方法は、本明細書中(2)コロニー刺激因子 またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬」における記載 に準じて適宜設定することができる。摂取量および摂取方法等も、当業者であれば 適切に決定することが可能である。アルギン酸オリゴマーの毒性は非常に低いので、 個体差に応じて摂取量の加減が容易である。
[0062] (5)本発 S月の剤または医. ¾feよび 該剤または医 に する f 月を f¾した^載 •を含む パッゲージ
本発明は、上記(1)記載のサイト力イン分泌促進剤、および当該サイト力インの分泌 促進剤が TNF— aを除くサイト力インの分泌促進に使用することができることまたは 使用すべきであることを記載した当該サイト力インの分泌促進剤に関する説明を記載 した記載物を含む商業用パッケージを提供する。
[0063] また、本発明の別の実施態様においては、上記(2)記載の医薬、および当該医薬 力 Sコロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を改善するために 使用することができることあるいは使用すべきであることを記載した当該医薬に関する 説明を記載した記載物を含む商業用パッケージを提供する。
実施例
[0064] 以下、実施例を示してさらに具体的に本発明を説明する。以下は代表的な実施例 を示すものでこれらに限定されるものではなぐ本発明の技術的思想を逸脱しな ヽ範 囲内で種々の応用が可能である。
[0065] [試験例 1]細胞の培養
マウス単球由来細胞株(マウスマクロファージ系株化細胞) RAW264. 7 (ATCC N 0. TIB71)を培養した。生育培地としては、 RPMI— 1640培地に抗生物質(Benzyl P enicilin Potassium、 Streptomycin Sulfate)を 100 g/ mlとなるよつに添カロし、 らに 5 6°Cで 30分熱処理した牛胎児血清 (FBS)を 10% (v/v)添加したものを用いた。
[0066] 細胞の培養に際しては、セラムチューブ中の細胞懸濁液(10% DMSOを含む生 育培地中にて 80°Cに保存されているもの)を融解し、 15mlチューブに移し、これ に生育培地をカ卩えて室温にて 2000rpm、 10分間の遠心を行い、上清を除いた。次 いで約 5mlの生育培地をカ卩えて細胞を分散させ、培養フラスコ(ファルコン社製、 25c m2プラスチックフラスコ)に移し、 37°C、 5%COガス培養器にて培養を行った。ー晚
2
放置し、細菌等の混入がないこと、および細胞が培養フラスコの底面に接着している ことを確認して、培地交換および継代培養を行った。
[0067] 該細胞の継代培養に際しては、フラスコ内の生育培地を除き、 0. 2%トリプシン Z0 . 05%EDTA溶液と入れ換え、 37°C、 5%COガス培養器内で細胞が個々に分か
2
れるまで静置後、フラスコ内の溶液を取り除き、再びガス培養器内で約 15分静置した 。フラスコ底面力も細胞が剥がれてきたことを確認してから、生育培地をカ卩え、一部の 細胞を新たなフラスコ内の生育培地に分散させ、再び 37°C、 5%COガス培養器で
2
培養を行った。
[0068] [実施例 1]酵素消化アルギン酸オリゴマーの調製
工程 1 : PG、 PMの調製
市販のアルギン酸ナトリウムより、 Haugらの方法 (Acta, Chem. Scand., 20, 183-190 , 1966, Carbohydr. Res., 32, 217-225)に改良をカ卩えた方法で PGおよび PMを調製 した。調製のフローチャートを図 1に示す。 [0069] 具体的には、アルギン酸 (アルギン酸ナトリウム、ナカライテスタ社製) 20gを 2Lの 0 . 3M HC1溶液に懸濁し、 1. 5時間 100°Cに加熱して部分加水分解を行った。沈殿 を採取して、 0. 3M HC1で洗浄した後、 250mlの水〖こ懸濁し、希 NaOHで pH7に 中和して水に溶解させた後、凍結乾燥して、抗分別粉末を得た。該粉末 5gを 1Lの 0 . 1M NaCl中に溶解し、 1Lの酸性水溶液(300mlの 0. 1M HCl+ 700mlの水) を加え pH2. 85に調整した。沈殿した PGと懸濁した PMとを分離した。沈殿した PG は pH2— 3の HC1で洗浄し、 300mlの水に懸濁させ、 NaOHで pH7に調整し溶解し た。エタノール(PGZエタノール =1Z2, vZv)を加えて、 PGを沈殿させ、沈殿した PGをエタノールで洗浄(2回)した後、沈殿を水に溶解し、凍結乾燥によって、精製さ れた PGの粉末 (約 1. 5g)を得た。一方、懸濁した PMは、 NaOHで pH7に調整し、 エタノール(PMZエタノール =1Z2, vZv)を添加して、 PMを沈殿させた。該沈殿 をエタノールで洗净(2回)した後、水に溶解し、凍結乾燥によって、精製された PM の粉末 (約 3g)を得た。
[0070] 工程 2:酵素処理アルギン酸オリゴマー混合物の調製
不飽和オリゴマーの調製には、アルギン酸リアーゼ(SIGMA社製)を用いた。これ を 10mMリン酸緩衝液(pH7. 0)で lOmgZmlにした。 0. 2%の PGおよび PMを含 む 50mMリン酸緩衝液(pH7. 0) 2. 0mlを 37°Cで 10分間インキュベートし、この基 質溶液に酵素溶液を 0. 2ml添加して、 2分間反応を行った。 235nmにおける吸光 度が 1分間に 0. 1増加する酵素量を 1単位 (unit)として酵素活性を測定した。
[0071] 次!、で、 5gの PGおよび PMを 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 0) 50mlに溶解し、アル ギン酸リアーゼ 0. Olm lOmgZml、比活性 7. 24単位 Zmg)を 2時間ごとに 3回 加え、 37°Cで反応させた。このオリゴマー溶液をメンブランろ過した。次いで水を溶 出液としたゲルろ過カラムを用いて脱塩操作を行った。さらに蒸留水で緩衝化した Bi o-Gel P— 2カラム(2. 5 X 95cm)にリン酸塩を含む試料を供し、流速 0. 26ml/ minで溶出した。リン酸塩の定量はモリブデンブルー法にて行った。リン酸塩を含ま ない部分のみをプールし、凍結乾燥後、乾燥標品として各オリゴマーを得た。
[0072] 工程 3:重合度の異なるアルギン酸オリゴマーの調製
重合度の異なる酵素処理アルギン酸オリゴマーを得る場合は、工程 2のメンブレン ろ過の後、予め 50mMのリン酸緩衝液 (pH7. 5)で緩衝ィ匕した Bio— Gel P— 6カラ ム(8. 8 X 95cm)に 1. 3mlZminの流速で各サンプルを供した。重合度の異なるォ リゴマーを含むフラクションをプールし、濃縮した。このゲルろ過の溶出曲線を図 2に 示す。重合度の決定は、ブルーデキストラン 2, 000とガラタツロン酸を用い、 Whitak erの方法に従つて行つた。
[0073] [実施例 2]酸加水分解アルギン酸オリゴマー (混合物)の調製
1%の PGおよび PMを含む溶液(0. IN HC1にて pH4. 0に調整)を 121。Cで 80 分間加水分解した。冷却後、該溶液を 0. IN NaOHで中和した後脱塩操作を行い 、凍結乾燥し、乾燥標品として該アルギン酸オリゴマー混合物を得た。
[0074] [実施例 3]アルギン酸オリゴマーのマクロファージに対する G— CSF分泌促進活性 酵素分解アルギン酸オリゴマーのマクロファージに対する G— CSF分泌促進活性 を、 ELISA法を用いて測定した。
[0075] 工程 1:アルギン酸オリゴマーの調製
細胞に添カ卩するアルギン酸オリゴマーは、 lOmgZmlとなるように RPMI1640無血 清培地もしくは生理食塩水で調製し、ゼータポアフィルターに通したものを使用した。
[0076] 工程 2:アルギン酸オリゴマーの培着系への添加
RAW264. 7細胞を、平底 96ゥエルプレートに 1ゥエルあたりの細胞数が 2 X 104と なるように播種した。細胞が一ヶ所に集まらないように軽く攪拌し、 37°C、 5%COガ
2 ス培養器内で一晩培養した。各ゥエルの細胞数にばらつきが無 ヽことを顕微鏡で確 認し、ここに無血清培地で lmg/mlに調製した上記アルギン酸オリゴマー溶液をそ れぞれ添加した。該細胞は、 37°C、 5%COガス培養器内で一晩培養した後、各培
2
養上清を回収した。
[0077] 工程 3 :ELISAによる G— CSFの検出
次いで、 ELISA用 96ゥエルプレートに滅菌 PBSで 4 gZmlに希釈した一次抗体 (Anti-mouse G-CSF monoclonal antibody, Purified)を 1ゥエルあたり 100 μ 1添カロし た。室温で一晚静置後、洗浄溶液(0. 025% Tween20 in PBS)で 2回洗浄し、 ブロッキング溶液(4% BSA in PBS)を 1ゥエルあたり 200 1添カ卩した。室温で一 晚静置後、洗浄溶液で 2回洗浄し、ブロッキング溶液で 1%に希釈した培養上清を 1 ゥエルあたり 100 /z l添加した。室温で 1時間静置後、洗浄溶液で 5回洗浄し、ブロッ キング溶液で 1000倍希釈した酵素 抗体コンジュゲート(Anti-Rabbit Ig, HRP-link ed Whole Ab Donkey)を 1ゥエルあたり 100 μ 1添カ卩した。室温で 30分間静置し、洗浄 溶液で 5回洗净後、基質溶液(TMB Peroxidase Substrateと PeroxidaseSolution Bを 1: 1で混合したもの)を 100 /z l添加した。室温で 30分間静置した後、反応停止剤として 1Nのリン酸溶液を 50 1添加し、よく攪拌した後マイクロプレートリーダーにより吸光 度 (Abs=450nm)を測定した。なお、標準物質としては既知濃度の組換え G— CS Fを用い、比較として酸加水分解により調製したアルギン酸オリゴマーを用いた。
[0078] アルギン酸 Gオリゴマー混合物に関する、酵素処理アルギン酸オリゴマーと酸加水 分解アルギン酸オリゴマーの比較結果を図 3に示す。酸加水分解で得られたアルギ ン酸 Gオリゴマーには G— CSF分泌促進活性はほとんど認められな力つた力 酵素 処理したアルギン酸 Gオリゴマーにはマクロファージからの高 、G - CSF分泌促進活 性が認められた。また、アルギン酸 Mオリゴマーについても同様の結果が得られた。
[0079] [実施例 4]マウス腹腔へのアルギン酸オリゴマー混合物の投与による、血中 G— CS F量の経時変化
アルギン酸オリゴマー混合物(PBS 1ml中、 700mgZkg)またはアルギン酸ポリ マー(PBS 1ml中、 700mg/kg)を DDYマウス(6週齢、雄性、体重約 30g)腹腔 内に注入し、マウス血清中の G— CSF量を経時的に ELISA法にて測定した。
丁-程 ί:アルギン酸オリゴマー混合物の調製
アルギン酸オリゴマー混合物は、次のように調製した。
すなわち、高純度アルギン酸ナトリウム (キミ力社製)を水に溶解させて 5%水溶液と し、ここに終濃度が 1 g/mlとなるようにアルギン酸リアーゼ (シユードアルテロモナ ス sp. No. 272株の培地力ら、 Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 1990— 1992記 載の方法で精製したもの)を加え、 40°Cで 3日間インキュベートした。溶液を沸騰水 中で 10分間加熱することで酵素反応を停止させた。アルギン酸オリゴマー混合物は 、エンドトキシンを除去するため、使用前にゼータポアフィルター(和光純薬社から購 人)に通した。
工程 2:マウス血清中の G - CSF量の測定 上記工程 1で調製したアルギン酸オリゴマー混合物をマウス腹腔内に注入し、 0時 間、 0. 5時間、 1時間、 1. 5時間、 2時間、 3時間、 6時間、 9時間または 24時間後に 各マウスから常法により血清を得た。血清中の G— CSF量は、 Iwamoto, M. et al., FE BS Lett. 2005, 579, 4423-4429に記載の方法と同様の方法で、抗マウス G— CSF抗 体(R&D Systems, MN, USA)を用いた ELISA法によって測定した。
[0080] 結果を図 4に示す (なお、実験は 3回行った。図中、それぞれの点は 3回の平均値 を表し、各バーは標準偏差を示す)。血清中の G— CSF量は、アルギン酸オリゴマー 混合物を注入後速やかに増加し、 2時間で最大量に達した。この高濃度は 6時間後 まで維持された。次いで徐々に減少し、 24時間後にはベースライン量に戻った。一 方、アルギン酸ポリマーを注入した場合は、血清中の G— CSF量に何も変化が認め られなかった。
[0081] [実施例 5]マウス腹腔へのアルギン酸オリゴマー混合物の投与量と血中 G— CSF量 との相関
アルギン酸オリゴマー混合物は、実施例 4の工程 1と同様の方法で調製した。種々 の濃度(0. 07mgZkg、 0. 7mgZkg、 7mg/kg, 70mg/kg, 700mgZkg)のァ ルギン酸オリゴマー混合物(PBS 1ml中)をマウス腹腔内に投与して、 3時間後のマ ウス血清中の G— CSF量を ELISA法で測定した。
[0082] 結果を図 5に示す (なお、実験は 3回行った。図中、それぞれの点は 3回の平均値 を表し、各バーは標準偏差を示す)。血清中の G— CSF量は、アルギン酸オリゴマー 混合物の投与量の増加に伴って増加し、 70mgZkgの投与量でプラトーに達した。
[0083] [実施例 6]マウス腹腔へのアルギン酸オリゴマー混合物の投与による各種サイトカイ ン分泌活性
上記実施例 4の工程 1で調製したアルギン酸オリゴマー混合物(PBS 1ml中、 70 Omg/kg)をマウス腹腔内に注入し、マウス血清中の各種サイト力イン量を経時的に Bio Plexシステム(バイオラッド社製)で測定した。 Bio Plexは少量のサンプル量で 複数のサイト力インの同時定量が可能な利点を有する。原理的には通常の ELISAに フローサイトメトリーを組み合わせたものである。すなわち、各種サイト力インに対する 抗体が結合したビーズを試験サンプルにカ卩え、サイト力インと結合したビーズをフロー サイトメトリーで検出し、分析した。
[0084] 結果を図 6— 1〜6— 3に示す (なお、実験は 2回行い、それぞれの値は 2回の平均 値を表す。 2回の測定値の差は 5%以内である)。ピーク値において、 G— CSF、 MC P— 1、 IL— 6、 KC、 RANTESおよび IL— 12 (p40)の分泌量は 5000pg/mUり 高力つた。
また、 IL— 2、 IL— 3、 IL— 10、 IL— 12 (p70)、 IL— 13、 IL— 17、 GM— CSおよ び INF— γは、 24時間以内に 2つのピークを示した。一方、 G— CSF、 GM— CSF、 MCP— 1、 IL— 1 α、 RANTES, KCおよび eotaxinは、 1つのピークを示した。
[0085] [実施例 7]アルギン酸オリゴマーのマクロファージに対する各種サイト力イン分泌促 進活性
重合度の異なる各酵素分解アルギン酸オリゴマーにっき、マクロファージに対する 各種サイト力イン分泌促進活性を ELISA法にて測定した。
[0086] アルギン酸オリゴマーの調製および該オリゴマーの培養細胞への添カ卩は、実施例 3 の工程 1および 2と同様の方法で行った。また、培養上清中のサイト力イン量は Bio Plexシステム (バイオラッド社製)で定量した。
[0087] G— CSF分泌促進活性に関する結果を図 7に示す。アルギン酸オリゴマーの G3、 G8、 G9、 M7および M8に高い G— CSF分泌促進活性を見出すことができた。
[0088] MIP- 1 a分泌促進活性に関する結果を図 8に示す。マンヌロン酸オリゴマーには 分子サイズの影響はあまり見られず、いずれも強い作用が認められた。一方、ダル口 ン酸オリゴマーでは G8および G9に他に比べて強い作用が認められた。
[0089] RANTES分泌促進活性に関する結果を図 9に示す。 MIP— 1 aに比べてオリゴマ 一の構造により活性が異なり、 G8、 G9、 M7、 M8および M9に強い作用が認められ た。なお、 G8、 G9、 M7、 M8および M9は G— CSF分泌促進についても同様に強 い活性が認められ、カゝなり類似した構造活性相関を示した。
[0090] 他のサイト力イン分泌促進活性に関する結果を図 10— 1〜: L0— 2に示す。 G-CS F、 MCP—1、 RANTES, GM— CSFおよび eotaxinについては、特に Mオリゴマ 一による強いサイト力イン放出誘導作用が認められた。また、 IL—1ひ、 IL—l |8、 IL 6、 IL— 9および IL— 13についても当該作用が認められ、さらに IL— 5、 IL—12お よび KCについても、弱いながら当該作用が認められた。
[0091] MIP—1 αおよび RANTESは別名力 それぞれ CCL— 3および CCR—5として知 られており、類似した作用を有する事が知られている。 MIP- Ι αはまた、 HIV感染 を抑制すること等が報告されている。以上の結果から、アルギン酸オリゴマーはこのよ うな複数のサイト力イン放出誘導作用を発現し、多面的に生体の免疫系に影響を与 えるものと推定される。
[0092] [実施例 8]アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内マクロファージに対する G— CSF分 泌促進活性
生体内におけるマクロファージに対しても、本発明のアルギン酸オリゴマーが G— C SF分泌促進活性を有するかを確認した。
[0093] C3HZHeJマウス(5週齢、雌性)を 1週間以上予備飼育し、該マウスに 3%チォダリ コレート培地 (ディフコ社製)をマウス 1匹あたり 3ml腹腔内投与し、 3日後に炭酸ガス で安楽死させ、腹腔浸出細胞を Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、 pH7. 2 )にて採取した。回収した腹腔浸出細胞は、 PBSで洗浄後、基礎培養液中で細胞密 度の調整を行い、 96穴平底プレートの各ゥエルに 100 1ずつ分注した。プレート遠 心(500rpm、 5分間)により細胞を沈降させ、 37°C、 5%COの条件下で 2時間培養
2
した。培養終了後直ちに 37°Cの PBSで洗浄して非付着細胞を除去し、再度培養液 に浸して、腹腔浸出細胞の単層培養を調製した。この腹腔浸出細胞の単層培養に おける、マクロファージの純度は 95%以上であった。培地で lmgZmlに調整した各 アルギン酸オリゴマー溶液を添カ卩した。 37。C、 5%COインキュベーター内でー晚培
2
養後、上清中の G— CSF量を ELISAにて定量した。
[0094] 用いるアルギン酸オリゴマーの調製および該オリゴマーの培養細胞への添カロは、 実施例 3の工程 1および 2と同様の方法で行った。また、 ELISAによる定量は、実施 例 3の工程 3と同様の方法で行った。
[0095] マウス腹腔内マクロファージに対する G— CSF分泌促進活性に関する結果を図 11 に示す。アルギン酸オリゴマーの G3、 G8、 G9、 M7および M8に高い G— CSF分泌 促進活性を見出すことができた。
[0096] [実施例 9]マウス生体に対するアルギン酸オリゴマーの G— CSF分泌促進活性 マウス生体内にアルギン酸オリゴマーを投与することによって、生体中の G— CSF 量が増大するかを調べた。
[0097] DDYマウス(5週齢、雌性)を 1週間以上予備飼育した。該マウスに対し、 1匹あたり
200mgZmlの酵素消化アルギン酸オリゴマー(オリゴマー混合物)または lOmgZ mlのアルギン酸オリゴマー(G3、 G8、 G9、 M7、 M8)各 0. 1mlを腹腔内投与した。 投与後 0、 0. 5、 1、 1. 5、 3、 9時間後に採血し、得られた血液を 10分間、 10, OOOr pmで遠心して血清を採取した。採取した血清中に含まれる G— CSF量を ELIS Aで 里しァこ。
[0098] アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内投与による G— CSF分泌促進活性に関する 結果を図 12に示す。アルギン酸オリゴマーのマウス腹腔内投与により、投与 3時間後 をピークに高 、G - CSF誘導活性を見出すことができた。
[0099] [実施例 10]
生体への適切な投与量を調べる目的で、アルギン酸オリゴマーの濃度依存による G— CSF誘導活性を調べた。
[0100] DDYマウス(5週齢、雌性)を 1週間以上予備飼育した。該マウスに対し、 1匹あたり 0. 02、 0. 2、 2、 20mgZmlの酵素消化アルギン酸オリゴマー(オリゴマー混合物) または 0. 001、 0. 01、 0. 1、 lmgZmlの単独アルギン酸オリゴマー(G3、 G8、 G9 、 M7、 M8)を各 0. 1ml腹腔内に投与した。投与後 3時間後に採血し、得られた血液 を 10分間、 10, OOOrpmで遠心して血清を採取した。採取した血清から、 ELISAに より G— CSF量を定量した。
[0101] アルギン酸オリゴマーの濃度依存的な投与と、 G— CSF分泌活性の関係に関する 結果を図 13に示す。アルギン酸オリゴマーの単独および Zまたは混合物をマウス腹 腔内投与することにより、濃度依存的に高い G— CSF誘導活性を見出した。
産業上の利用可能性
[0102] 本発明の剤または医薬によれば、サイト力イン、特にコロニー刺激因子またはケモ 力インの分泌を促進することができるので、顆粒球および好中球を増殖させ、かつ活 性ィ匕することができる。本発明の医薬は、癌治療、臓器移植、免疫不全等により免疫 機能が低下した患者や、恒常的な自己免疫疾患を有する患者に有用である。また原 材料がアルギン酸であるため、安価で安全な剤または医薬として提供することが可能 である。
本出願は、日本で出願された特願 2005— 361056 (出願日: 2005年 12月 14日 )を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
[I] アルギン酸オリゴマーを含有してなる、 TNF- aを除くサイト力インの分泌促進剤。
[2] サイト力インが、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターロイキンおよびインターフエ ロン力もなる群より選ばれるものである、請求項 1記載の剤。
[3] コロニー刺激因子が G— CSFおよび GM— CSFであり、ケモカインが MIP— 1 a、 R
ANTES, MCP—1、 Eotaxinおよび KCである、請求項 2記載の剤。
[4] インターロイキンが IL—l α、 IL—l j8、 IL— 2、 IL— 3、 IL— 4、 IL— 5、 IL— 6、 IL—
9、 IL- 10、 IL- 12 (p70)、 IL— 12 (p40)、 IL— 13、 IL— 17であり、インターフエ口 ンが IFN— yである、請求項 2記載の剤。
[5] アルギン酸オリゴマー力 アルギン酸の酵素分解物またはその精製物である、請求 項 1〜4のいずれかに記載の剤。
[6] アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独力 なるものである、 請求項 1〜5のいずれかに記載の剤。
[7] アルギン酸オリゴマーの重合度が 3〜9である、請求項 1〜6のいずれかに記載の剤
[8] アルギン酸オリゴマーを有効成分として含有してなる、コロニー刺激因子またはケモ 力インの分泌低下に起因する状態を改善するための医薬。
[9] アルギン酸オリゴマーがアルギン酸の酵素分解物またはその精製物である請求項 8 記載の医薬。
[10] アルギン酸オリゴマーがマンヌロン酸単独またはグルロン酸単独力もなるものである、 請求項 8または 9記載の医薬。
[I I] アルギン酸オリゴマーの重合度が 3〜9である、請求項 8〜 10のいずれかに記載の 医薬。
[12] コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態の改善用医薬を製 造するためのアルギン酸オリゴマーの使用。
[13] 請求項 1〜7のいずれか〖こ記載の剤を摂取する工程を含む、 TNF— aを除くサイト 力インの分泌を促進させる方法。
[14] 請求項 8〜11のいずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を 含む、 TNF ひを除くサイト力インの分泌を促進させる方法。
[15] 請求項 8〜11のいずれかに記載の医薬をそれを必要とする対象に投与する工程を 含む、コロニー刺激因子またはケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または 治療する方法。
[16] サイト力インが、コロニー刺激因子およびケモカインカもなる群より選ばれるものであ る、請求項 13または 14に記載の方法。
[17] 請求項 1〜7のいずれかに記載のサイト力インの分泌促進剤、および当該剤が TNF aを除くサイト力インの分泌促進に使用することができることまたは使用すべきであ ることを記載した当該剤に関する説明を記載した記載物を含む商業用パッケージ。
[18] 請求項 8〜11のいずれかに記載の医薬、および当該医薬がコロニー刺激因子また はケモカインの分泌低下に起因する状態を予防または治療するために使用すること ができることあるいは使用すべきであることを記載した当該医薬に関する説明を記載 した記載物を含む商業用パッケージ。
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