CN110734504A - 一种制备金针菇子实体多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备金针菇子实体多糖的方法，包括将金针菇子实体用乙醇提取后热水提取，得到粗多糖提取液；加入硫酸铵、有机溶剂，震荡反应，反应后离心；将离心所得下层水相透析、干燥，得到金针菇多糖。本发明方法快捷、方便的有效提取金针菇多糖，并且实现了同时提高金针菇多糖的提取率和纯度，本发明制备的金针菇多糖抗氧化活性显著优于经过纯化步骤制得的金针菇多糖。

Description

一种制备金针菇子实体多糖的方法

技术领域

本发明属于金针菇多糖制备技术领域，具体涉及一种制备金针菇子实体多糖的方法。

背景技术

金针菇(Flammulina velutipes(Curtis)Singer)是世界上产销量第三位的食用菌，金针菇不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，而且含有多糖、脂类、糖蛋白、酚类、倍半萜等活性物质，具有多种生物活性。

随着工厂化金针菇栽培的飞速发展，对金针菇的营养和药用价值认识的全面提升，金针菇的销量逐年增多，近几年关于金针菇的应用与研究逐渐成为热点。金针菇不仅富含多种营养成分，其中多糖是重要生物活性物质之一，具有抗疲劳、提高记忆力、抗衰老等，有优良的保健功效，其疗效显著、无毒副作用引起研究者广泛关注，因此如何获取多糖即对金针菇多糖提取工艺的研究既是基础研究，也是重中之重。提取方法的不同对得率、纯度、空间结构和生物活性有重要影响。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

本发明提供一种制备金针菇子实体多糖的方法。

为解决上述技术问题的方法，本发明提供了如下技术方案：一种制备金针菇子实体多糖的方法，其包括，

将金针菇子实体用乙醇脱脂后热水提取，得到粗多糖提取液；

加入硫酸铵、有机溶剂，震荡反应，反应后离心；

将离心所得下层水相透析、干燥，得到金针菇多糖。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：所述震荡反应，为在磁场下震荡反应。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：所述乙醇脱脂，为将子实体与乙醇按照质量体积比为1：(8～12)超声脱脂0.5～2h。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：所述热水提取，为用沸水提取0.5～2h。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：所述加入硫酸铵，硫酸铵的加入量为所述粗多糖提取液体积的的10％～60％。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：所述有机溶剂为叔丁醇，所述叔丁醇的加入量为所述粗多糖提取液体积的1～2倍。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：反应后离心，为5000～8000g离心15min～20min。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：所述震荡反应，为以400～600rpm的速度，在30～40℃反应50～70min。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：所述透析，为采用截留分子量为8000～10000的透析袋流水透析。

作为本发明所述的制备金针菇子实体多糖的方法的一种优选方案：所述在磁场下震荡反应，磁场条件为采用钕铁硼磁铁距离萃取管1～5cm放置。

本发明的有益效果：本发明方法快捷、方便的有效提取金针菇多糖，并且实现了同时提高金针菇多糖的提取率和纯度，本发明制备的金针菇多糖抗氧化活性显著优于经过纯化步骤制得的金针菇多糖。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为采用实施例1和实施例3提取方法制得的金针菇多糖分子量大小及分布情况图。

图2为实施例1和实施例3提取方法得到的金针菇多糖产品的DPPH〃自由基清除率能力测定。

图3为FRAP和TEAC模型对体外抗氧化能力的测定。

图4为实施例1和实施例3方法提取的金针菇提取物清除ABTS⁺〃的作用。

图5为实施例1和实施例3提取方法获得的金针菇多糖刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO能力测定。

图6为凝胶柱层析后的均一多糖FVPT1和FVPT2对铁离子的还原能力的影响。

图7为凝胶柱层析后的均一多糖FVPT1和FVPT2对清除ABTS⁺〃的作用。

图8为凝胶柱层析后的均一多糖FVPT1和FVPT2对小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的影响。

图9为FVPT1单糖组成测定图。

图10为FVPT2单糖组成测定图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实验方法：

多糖和蛋白含量测定：用苯酚-硫酸法测定金针菇粗提物样品中的总糖含量，计算金针菇粗多糖的纯度，用BCA试剂盒测定金针菇粗提物样品中蛋白质的含量，实验结果均用平均值±标准偏差(SD)表示。

Y_多糖得率＝M_提取物/M_样品×100％

P_多糖纯度＝M_多糖/M_粗提物×100％

F_{蛋白质含量}＝M_蛋白质/M_粗提物×100％。

高效阴离子色谱检测单糖组成：

ICS-2500高效阴离子色谱仪(选用PA-20柱子)测定单糖。样品制备：准备称取2mg金针菇多糖样品充分溶解于2mol/L 3mL三氟乙酸，110℃下油浴5h，氮吹仪吹干三氟乙酸，再加入3mL甲醇吹干，重复6次，先转移至玻璃试管再转移转移50mL定容瓶中，超声1h混匀，取1mL样品溶液于样品瓶中，待检测。以12混标多糖为标曲，依次排序，每次进样体积25μL，流动相：2.5mmol/L的NaOH作淋洗液；淋洗方法采用单一浓度梯度淋洗；流速：0.45mL/min；上样量：25μL；温度30℃。

高效液相(HPLC)测定多糖分子量大小与分布：

HPSEC-MALLS-RI联用技术，2695Waters HPLC泵，在线脱气机，2414示差折光检测器。G6000PWxl凝胶柱串联G4000PW xl柱，水溶性粗多糖用流动相配成浓度为4mg/mL，离心(12000rpm×15min)后取上清，均取1.5mL于样品瓶待测。用0.15moL/L NaNO₃和0.05moL/LNaH₂PO₄，0.02％叠氮钠混合液配制配置成流动相，流速设定为0.5mL/min，进样体积100μL，使用Astraruan软件分析数据，对多糖分布范围和分子量大小进行采集和分析。

抗氧化能力测定：

清除DPPH〃自由基试验：

参照Brand报道的实验方案并稍作改动。取1mL金针菇多糖水溶液加入2mL含有2×10^-4mol/L DPPH的50％乙醇溶液混匀，避光放置30min，在波长517nm处测吸光度，并标记为A，0.2mg/mL维生素C溶液为阳性对照，所有待测样品和阳性对照均设5个不同的浓度梯度(0.1～1.0mg/mL)。DPPH·的清除率的计算如下所示：

式中：A1为待测液的吸光度；A2为乙醇溶液替换DPPH溶液的吸光度；A3为乙醇溶液替换样液的吸光度。

铁还原抗氧化能力测定(FRAP法)：

在宫智勇等实验方案上略有改动。取样品溶于待测液100μL，将溶液与新配制的900μL FRAP试剂(300mmol/L醋酸盐缓冲液、20mmol/L三氯化铁溶液、10mmol/L TPTZ溶液＝10：1：1)混合均匀，37℃孵育反应2h。反应完全后，在最大吸收光为593nm波长下测定金针菇多糖水溶液的吸光度值。以FeSO₄为标品绘制标曲，将吸光度值转化对应的为FRAP值，即μmol Fe²⁺/g样品，以维生素C作为阳性对照。

Trolox等价抗氧化能力测定(TEAC法)：

根据参考文献方法，测定样品的ABTS自由基清除活性。将ABTS(7.4mM)和过硫酸钾(4.95mM)的混合物在室温下暗处混匀14h，以形成自由基阳离子ABTS⁺〃。用磷酸盐缓冲溶液(pH＝7)稀释工作溶液，在731nm处获得0.7的吸光度值。将100μL样品与ABTS稀释工作液(3.9mL)混合，在避光条件下37℃反应20min，紫外734nm波长下测定吸光度，以水溶性维生素E(Trolox)为标准品计算抗氧化活性，即μmol Trolox/g样品。以维生素C作为阳性对照，醋酸钠缓冲液为空白对照。

实施例1：

新鲜金针菇子实体清洗干净后，冻干至恒重，得到金针菇子实体，称取5g子实体按照1：10(g/mL)用95％乙醇超声提取1h除脂质，残渣待完全挥干乙醇后，用100℃热水提取1h，得到粗多糖提取液；

将粗多糖提取液中加入20g的固体硫酸铵，然后加入75mL的叔丁醇，将萃取管放置磁场下(磁场条件为采用尺寸为100cm*100cm*20cm的钕铁硼磁铁N35距离萃取管5cm放置)，并在恒温震荡仪中以500rpm的速度，40℃反应60min，7000g离心15min后形成清晰的三相；上层叔丁醇收集后回收利用，将下层水相使用截留分子量为8000的透析袋透析以除去小分子杂质，浓缩后干燥，得到纯化的金针菇多糖，命名为TPPFVP。

本发明提取金针菇多糖的金针菇的得率EY(％)由EY＝(CL*VL)/M*100表示，其中，M是金针菇的总质量，CL和VL是水相中多糖的浓度和体积。计算金针菇多糖TPPFVP的多糖的提取率为14.2％，纯度达到65％。

实施例2：

实施例1的制备方法去掉磁场辅助，其余均与实施例1相同，计算金针菇多糖TPPFVP的多糖的提取率为6.1％。

研究例1：

有机溶剂对多糖提取率的影响：将实施例1中有机溶剂叔丁醇分别替换为异丙醇、乙酸乙酯、异丁醇和正丁醇，计算得到的金针菇多糖TPPFVP的多糖的提取率分别为8.3％、9.1％、9.5％、9.6％。

叔丁醇用量对多糖提取率的影响：将实施例1中叔丁醇用量分别调整为35ml、150ml，计算得到的金针菇多糖TPPFVP的多糖的提取率分别为8.1％、7.8％。

提取温度对多糖提取率度的影响：将实施例1中反应温度分别调整为30℃反应60min、50℃反应60min，计算得到的金针菇多糖TPPFVP的多糖的提取率分别为12.5％、12.7％。

提取时间对纯度的影响：将实施例1中反应时间调整为40℃反应20min、40℃反应90min，得到的金针菇多糖TPPFVP的纯度分别为52％、50％。

硫酸铵含量对提取率和纯度的影响：将实施例1中硫酸铵含量分别调整为5g、30g，计算得到的金针菇多糖TPPFVP的多糖的提取率分别为7％、6.3％，纯度分别为16％、31％。

有机溶剂不仅影响提取过程中的介电常数和有机溶剂的极性，而且对提取体系的稳定性有至关重要的影响作用，因此，选择合适的有机溶剂在TPP的纯化过程中起着重要作用，可能是由于叔丁醇的分子大小和支链结构刚好阻止其渗透到蛋白质的折叠三级结构中，使得蛋白相不易破坏，体系稳定，从而显著提高了多糖提取率和纯度。

硫酸铵的质量分数在本方法中是至关重要的，而且在众多条件中起着至关重要的作用，它和蛋白质形成沉淀密切相关，随着硫酸铵质量分数的不断增加下层可溶性蛋白可能由于盐析作用而从水相中析出，随着硫酸铵的含量增加，金针菇多糖提取率先升高后降低，可能是因为金针菇多糖在低浓度硫酸铵盐情况下能有效的分配，但是随着硫酸铵质量分数持续增加，可能会导致金针菇多糖与水分子间的氢键断裂，降低了提取率。

实施例3：

醇沉法：

新鲜金针菇子实体清洗干净后，冻干至恒重，得到金针菇子实体,称取5g子实体按照1：10(g/mL)用95％乙醇超声提取1h除脂质，残渣待完全挥干乙醇后，用100℃热水提取1h，得到粗多糖提取液；

取500ml金针菇提取液，沿壁加入乙醇，一边加一边搅拌混匀，直到乙醇浓度为30％，4℃静置24h，高速离心机12000rpm离心20min后取沉淀，挥去乙醇后，加适量水充分溶解，冻干后备用，此部分为FVP30；上清液继续加100％乙醇至体系中直至乙醇浓度为60％，4℃静置一天，取沉淀，溶解，挥去乙醇，冻干机冻干，此部分为FVP60。取500ml金针菇提取液，沿壁加入乙醇，一边加一边搅拌混匀，直到乙醇浓度为70％，4℃静置24h，取沉淀，溶解，挥去乙醇，冻干步骤同上，此部分FVP70。

本发明和醇沉法分别制得的金针菇多糖TPPFVP的多糖得率及蛋白含量见表1。

表1

提取方法	蛋白含量(％)	多糖得率(％)
			30％醇沉FVP30	16.60％	0.86％
60％醇沉FVP60	19.37％	1.12％
			70％醇沉FVP70	20.27％	2.22％
本发明TPPFVP	12.19％	14.2％

图1为采用实施例1和实施例3提取方法制得的金针菇多糖分子量大小及分布情况图。不同纯化的方法的金针菇多糖分子量大小及分布差异明显，FVP30和FVP70在Peak1处分子量为2.75×10⁷和2.36×10⁷Da，Peak2处分子量为5.13×10⁵和4.77×10⁵Da。FVP60、TPPFVP在Peak2处分子量2.36×10⁵和3.31×10⁵Da。结果表明，本发明提取的多糖与常规醇沉法获得多糖的分子量分布情况差异明显。由此可知，多糖分子量大小、分布情况和单糖组成均会对金针菇多糖的理化性质和生物活性产生影响。

实施例1和实施例3不同提取方法得到的金针菇多糖的单糖组成见表2，不同纯化方法得到的多糖，经高效阴离子色谱检测后的单糖组成及摩尔数见表2，金针菇醇沉的多糖主要由Gal(半乳糖)、Glc(葡萄糖)和Man(甘露糖)等单糖组成，而本发明提取的FVPTTP比醇沉法得到的多糖FVP30、FVP60、FVP70单糖组成多得到一种单糖葡萄糖胺Glcn。

表2

注：表中数值为摩尔比。

图2为实施例1和实施例3提取方法得到的金针菇多糖产品的DPPH〃自由基清除率能力测定。TPPFVP对DPPH〃的清除能力明显好于醇沉提取物。当TPPFVP浓度为1mg/mL的时候，清除能力超过了48％，IC₅₀值为0.8117mg/mL，远高于其他纯化方法得到的金针菇多糖。

FRAP法基于氧化还原反应，评定待测样品的抗氧化能力即对还原价态的二价铁氧化能力，在一定条件下(pH＜7)，TPTZ能够和三价态的铁离子结合在一起形成络合物，当抗氧化物存在时，整个溶液体系颜色逐渐变为蓝紫色，在最大吸收峰593nm处，吸光度值和还原能力能力呈线性关系，反应过程如下所示：

Fe³⁺-TPTZ→Fe²⁺-TPTZ(蓝色)

图3为FRAP和TEAC模型对体外抗氧化能力的测定，从图3可知，不同提取方法得到的金针菇提取物对铁离子的还原能力不同，TPPFVP对三价铁离子的还原能力明显好于常规醇沉提取物，且对铁离子的还原能力呈剂量依懒性。当提取物浓度为1mg/mL时，还原能力为323.2μmol Fe²⁺/L。

图4为实施例1和实施例3方法提取的金针菇提取物清除ABTS⁺〃的作用，通过TEAC模型对不同提取方法获得的金针菇提取物清除ABTS⁺〃自由基能力进行测定，TEAC模型是以ABTS为显色剂，经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基A BTS⁺·，加入抗氧化剂后使反应体系褪色，然后在73 4nm处检测吸光度，观察吸光度的变化，最后与Trolox(一种类似于V_E的水溶性物质)的对照标准体系比较，换算出被测物质总的抗氧化能力，测得的结果用μmolTrolox/L或以TEAC值表示。图4结果表明，在本实验范围内，三本发明提取的金针菇表现出良好的清除ABTS⁺〃的能力，且呈剂量依懒性。在5mg/mL时，对ABTS⁺〃自由基的清除能力为7451.1μmolTrolox/L，而TEAC抗氧化模型中，不同醇沉提取物的ABTS+清除能力低于实施例1方法提取物。三种抗氧化模型(DPPH、FRAP和TEAC)测定金针菇多糖的抗氧化能力呈现一致的趋势TPPFVP＞FVP60＞FVP70＞FVP30，且抗氧化能力分别为Vc的52％和48％。

图5为实施例1和实施例3提取方法获得的金针菇多糖刺激巨释细胞RAW264.7释放NO能力测定，PBS(磷酸缓冲液)为阴性对照，LPS(脂多糖)为阳性对照(1μg/mL)。对比NO(一氧化氮)释放量最大值TPPFVP＞FVP30＞FVP70＞FVP60。

实施例4：

将实施例1得到的金针菇多糖FVPTPP进行凝胶柱层析，用超纯水充分溶解FVPTTP并配制成10mg/mL溶液，在12000rpm离心15min，取上清，上样量10mL，经S-300凝胶柱多次纯化收集，此步骤重复三次，直到得到凝胶柱出现对称峰，即判定为均一多糖组分，均一多糖组分分别命名为FVPT1和FVPT2。鉴定FVPT1和FVPT2的分子量大小，FVPT2[2.1×10⁴(±3.4％)]和FVPT1[1.6×10⁴(±2.6％)]均为分子量较低的糖，表明纯化金针菇多糖分子量较低，为20kDa左右。均一多糖FVPT1和FVPT2总糖含量和分子量大小见表3。

表3

多糖样品	重均分子量Mw(Da)	总糖含量(％)
			FVPT1	1.64×10<sup>4</sup>Da	89.35
FVPT2	2.06×10<sup>4</sup>Da	92.26

金针菇均一多糖的抗氧化能力评价：图6～图8分别为凝胶柱层析后的均一多糖FVPT1和FVPT2对铁离子的还原能力、清除ABTS⁺〃的作用、对小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的影响。高效阴离子色谱检测金针菇均一多糖组分FVPT1和FVPT2，图9为FVPT1单糖组成测定图，FVPT1单糖组成为(摩尔比)：岩藻糖：半乳糖：葡萄糖：甘露糖＝1：3.5：1：1.4；图10为FVPT2单糖组成测定图。FVPT2单糖组成为(摩尔比)：岩藻糖：半乳糖：葡萄糖＝1：3：10。通过对比可知，凝胶柱层析纯化后的多糖抗氧化活性弱于对比文件1制得的金针菇多糖TPPFVP。并且实施例1和实施例4得到的金针菇多糖的分子量和组分具有较大差异。金针菇多糖抗氧化能力可能是纯化过程中其他多糖、小分子物质或者不同物质的协同作用导致提取物呈现明显抗氧化活性。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：包括，

将金针菇子实体用乙醇脱脂后热水提取，得到粗多糖提取液；

加入硫酸铵、有机溶剂，震荡反应，反应后离心；

将离心所得下层水相透析、干燥，得到金针菇多糖。

2.如权利要求1所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：所述震荡反应，为在磁场下震荡反应。

3.如权利要求1或2所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：所述乙醇提取，为将子实体与乙醇按照质量体积比为1：(8～12)提取0.5～2h。

4.如权利要求1或2所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：所述热水提取，为用沸水提取0.5～2。

5.如权利要求1或2所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：所述加入硫酸铵，硫酸铵的加入量为金针菇子实体质量的1～4倍。

6.如权利要求1或2所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：所述有机溶剂为叔丁醇，所述叔丁醇的加入量为所述粗多糖提取液体积的1～2倍。

7.如权利要求6所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：反应后离心，为5000～8000g离心15min～20min。

8.如权利要求1或2所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：所述震荡反应，为以400～600rpm的速度，在30～40℃反应50～70min。

9.如权利要求1或2所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：所述透析，为采用截留分子量为8000～10000的透析袋流水透析。

10.如权利要求2所述的制备金针菇子实体多糖的方法，其特征在于：所述在磁场下震荡反应，磁场条件为采用钕铁硼磁铁距离萃取管1～5cm放置。

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