CN103347527A - 增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法及其制造方法所制造的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题系提供一种新颖的自然免疫促进作用优异的「增强来自蜂王浆的自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法」，以及提供该制造方法所制造的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂，该课题的解决方案系一种增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，其特征在于至少包含将蜂王浆以乳酸菌发酵的步骤，该课题的解决方案还系一种增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，至少包含下述步骤(1)至(3)：(1)前置培养乳酸菌的步骤；(2)将蜂王浆以乳酸菌发酵的步骤；及(3)进行乳酸菌的杀菌的步骤。

Description

增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法及其制造方法所制造的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂
技术领域
本发明系关于增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法及其制造方法所制造的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂。
背景技术
蜂王浆(Royal jelly；RJ)系为蜜蜂的年轻工蜂下咽喉腺(pharyngeal gland)及大颚腺(mandibular gland)的分泌物混合而成的乳白色物质，主要构成为水分(含量66质量%)、蜂王浆所特有的蛋白质(含量11至12质量%；具有细胞增殖(multiplication)促进作用或细胞死亡抑制作用(专利文献1)的卵白素(avidin)(MJRP1)、具有免疫抑制作用的蜂王浆主要蛋白质3(MRJP3)(非专利文献1)、具抗菌作用的蜂王浆抗菌蛋白(Royalisin)等)、糖质(含量10质量%；果糖、葡萄糖、蔗糖等)、及脂质类(含量5至7质量%；具有杀菌作用、胰岛素(insulin)作用、抗癌作用、神经细胞增殖作用(非专利文献2)的10-羟基-2-癸烯酸、具有免疫控制作用的3,10-羟癸烷酸或反式-10-羟癸-2-烯酸(非专利文献3)等)。
进一步，含有维生素类(维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟碱酸(niacin)、泛酸(pantothenic acid)、维生素A、维生素C、维生素E等)、矿物质类(钾、钠、钙、镁、铜、铁、锌、磷等)；具神经细胞增殖作用的腺核苷(adenosine)或腺核苷-1-磷酸的N-氧化物衍生物、类似人类神经传导物质乙酰胆碱的物质、类似人类唾液腺的成长贺尔蒙腮腺素(parotin)的类腮腺素等的微量成分。另一方面，蜂蜜几乎大部分由糖质(78质量%)及水分(20质量%)构成，与蜂王浆组成大为不同。
蜂王浆，周知具有例如免疫促进作用(非专利文献1、3)、抗发炎作用(非专利文献4)、抗菌作用(非专利文献5、6)、防止老化作用、成长促进作用、更年期障碍的预防治疗、抗癌作用(非专利文献7、8)、创伤愈合促进作用、血流增加作用、血糖降低作用、降血压作用(非专利文献9)、血清胆固醇降低作用(非专利文献10)、抗肝损伤作用(非专利文献11)、抗异位性皮肤炎作用(非专利文献12)、疲劳恢复作用(非专利文献13)等各式各样生理作用，而被使用于营养价值(nutritive value)高的健康辅助食品或化妆品等。并且，最近已知蜂王浆蛋白质的蛋白酶分解产物具有强力的抗氧化作用(羟自由基消去作用)(非专利文献14、专利文献2)或降血压作用(非专利文献15、16)。
蜂王浆系为喂食女王蜂、女王蜂的幼虫及幼龄工蜂的幼虫的食物，因女王蜂持续食用蜂王浆，而得以保持较工蜂长40倍的寿命。另外，吾人已知在1954年呈衰老且处于病危状态的罗马教皇皮奥12世，因医师加列亚塞理尔所处方的蜂王浆，而产生令人惊异的恢复效果，但是其功效的科学上的实际状况则尚未明膫。
另一方面，关于自然免疫促进作用，在健康食品领域，周知有包含来自酵母细胞壁的β-葡聚糖、裙带菜孢子叶褐藻糖胶(MekabuFucoidan)等的多糖类。
再者，关于蜂王浆的处理或加工，通过以蛋白酶等来处理蜂王浆，而使具有抗氧化作用或降血压作用的来自蜂王浆的食品添加物或医药品的制造与开发开始进行(专利文献3至5)。
近年来，伴随社会高龄化的进展，持续增加的老年人的免疫功能及健康的维持，已成为用以持续经营充实的生活的重要课题。而且，在这样的老年化社会，对有助于健康维持的自然免疫予以强化与维持的药剂有其需要，且期待其进一步的开发。
先行技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平6-113828号公报
专利文献2：日本特开2007-217358号公报
专利文献3：日本特开2009-029772号公报
专利文献4：日本特开2009-060896号公报
专利文献5：日本特开2008-048729号公报
非专利文献
非专利文献1：Okamoto,I.,Taniguchi,Y.,Kunikata,T.,Kohno,K.,Iwaki,K.,Ikeda,M.,and Kurimoto,M.(2003)Life Sciences73(16),2029-2045
非专利文献2：Hattori,N.,Nomoto,H.,Fukumitsu,H.,Mishima,S.,and Furukawa,S.(2007)Biomed.Res.28(5),261-266.
非专利文献3：Gasic,S.,Vucevic,D.,Vasilijic,S.,Antunovic,M.,Chinou,I.,and Colic,M.(2007)Immunopharmacology andImmunotoxicology29,521-536.
非专利文献4：Kohno,K.,Okamoto,I.,Sano,O.,Arai,N.,Iwaki,K.,Ikeda,M.,and Kurimoto,M.(2004)Biosci.Biotechnol.Biochem.68(1),138-145.
非专利文献5：de Souza,B.M.,Konno,K.,Cesar,L.M.M.,Malaspina,O.,and Palma,S.M.(2004)Peptides25(6),919-928.
非专利文献6：Fujiwara,S.,Imai,J.,Fujiwara,M.,Yaeshima,T.,Kawashima,T.,and Kobayashi,K.(1990)J.Biol.Chem.265(19),11333-11337.
非专利文献7：田村豊幸、藤井彰、久保山升(1987)日本药理学会杂志89(2)，73-80.关于蜂王浆(Royal Jelly)的抗肿瘤效果的研究。
非专利文献8：Townsend,G.F.,Morgan,J.F.,Tolani,S.,Hazlett,B.,Morgan,H.J.,and Shuel,R.W.(1960)CancerRes.20,503-510.
非专利文献9：野村政孝、圆尾奈绪美、座间味义人、高取真吾、土井志真、川崎博己(2007)药学杂志127(11),1877-1882.
非专利文献10：Guo,H.,Saiga,A.,Sato,M.,Miyazawa,I.,Shibata,M.,and Morimatsu,F.(2007)J.Nutr.Sci.Vitaminol.(Tokyo)53(4),345-348.
非专利文献11：Kanbur,M.,Eraslan,G.,Beyaz,L.,Silici,S.,Liman,B.C.,Altinordulu,S.,and Atasever,A.(2008)Exp.Toxicol.Pathol.61(2),123-132.
非专利文献12：Taniguchi,Y.,Kohno,K.,Inoue,S.,Koya-Miyata,S.,Okamoto,I.,Arai,N.,Iwaki,K.,Ikeda,M.,andKurimoto,M.(2003)Int.Immunopharmacol.3(9),1313-1324.
非专利文献13：Kamakura,M.,Mitani,N.,Fukuda,T.,andFukushima,M.(2001)J.Nutr.Sci.Vitaminol.(Tokyo)47(6),394-401.
非专利文献14：Guo,H.,Kouzuma,Y.,and Yonetani,M.(2008)Food Chemistry113(1),238-245.
非专利文献15：Tokunaga,K.,Yoshida,C.,Suzuki,K.,Maruyama,H.,Futamura,Y.,Araki,Y.,and Mishima,S.(2004)Biol.Pharm.Bull.27(2),189-192.
非专利文献16：Takaki-Doi,S.,Hashimoto,K.,Yamamura,M.,and Kamei,C.(2009)Acta.Med.Okayama63(1),57-64.
发明内容
发明欲解决课题
本发明系鉴于上述先前技术而完成者，其课题在于提供一种新颖的自然免疫促进作用优异的「增强来自蜂王浆的自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法」。又，系提供一种以该制造方法所制造的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂。
解决课题的方法
本发明人等经戮力研讨，结果发现蜂王浆除了含有属于抗菌物质的蜂王浆抗菌蛋白或10-羟癸烯酸，亦令人意外地发现可利用乳酸菌对其进行发酵。
另外，本申请人已经在WO2008/126905、WO2009/157409等专利案，揭示在将具有自然免疫促进作用的物质投与完全变态型昆虫的幼虫的情形，在其结束时发生需时10分钟左右的缓缓的肌纤维收缩(以下简称为「缓行性肌纤维收缩」)。接着，在评价自然免疫促进作用的有无及程度时，于投与成为伪阳性的原因的脂多糖(lipopolysaccharide)(LPS)的情形下并不发生缓行性肌纤维收缩，因方法亦为简便，故可确认作为用以评价自然免疫促进作用的有无及程度的实用上指标是有效的。
接着，经进行关于该「将蜂王浆以乳酸菌进行发酵所得的产物」的上述评价，则发现表现出缓行性肌纤维收缩，且具有自然免疫促进作用。另外，亦发现这种产物的自然免疫促进作用的程度系较「发酵前蜂王浆的自然免疫促进作用」更为增强，因而完成本发明。
亦即，本发明系一种增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，其至少包含将蜂王浆以乳酸菌发酵的步骤。
再者，本发明系上述的增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，其至少包含下述步骤(1)乃至(3)：
(1)前置培养乳酸菌的步骤；
(2)将蜂王浆以乳酸菌发酵的步骤；及
(3)进行乳酸菌的杀菌的步骤
进一步，本发明系来自蜂王浆的自然免疫活性化剂，其系以上述「增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法」所制造之物。
再者，本发明系上述来自蜂王浆的自然免疫活性化剂，其系以至少包含有下述步骤(a)至(c)的筛选方法所得：
(a)将受检物质投与具有自然免疫机构的生物的步骤；
(b)对于该受检物质是否使该具有自然免疫机构的生物的肌肉收缩予以评价的步骤；及
(c)对于使该具有自然免疫机构的生物的肌肉收缩可予以评价的物质进行选择的步骤。
发明效果
根据本发明能够提供一种「新颖的自然免疫促进作用优异的增强来自蜂王浆的自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂」的制造方法，并且，能够提供该制造方法所制造的新颖的自然免疫促进作用优异的「来自蜂王浆的自然免疫活性化剂」。
附图说明
图1为显示酵母β-葡聚糖，及来自蜂王浆的自然免疫活性化剂(发酵蜂王浆)的自然免疫促进作用的剂量反应曲线的示意图。
图2为显示来自蜂王浆的自然免疫活性化剂(发酵蜂王浆)，及干燥蜂王浆的剂量反应曲线的示意图。
具体实施方式
兹就本发明加以说明，不过本发明并非限定于以下具体形态，在本发明的技术范围内可任意地变形。
本发明的增强来自蜂王浆的自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，至少包含将蜂王浆以乳酸菌发酵的步骤。
本发明中「蜂王浆」(Royal jelly；RJ)，系亦指自蜜蜂的年轻工蜂的上颚(palate)与下颚(Mandible)的咽喉腺所分泌的各自不同成分进行反应所生成的物质。如后所述，若为可以乳酸菌发酵的蜂王浆，并无特别限定，而可使用于本发明。蜂王浆虽然含有属于抗菌物质的蜂王浆抗菌蛋白或10-羟基癸烯酸，但也可进行乳酸菌所致发酵。通过使用本发明的增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，而乳酸菌不受蜂王浆中所含生育阻碍物质所阻碍，可产生自然免疫活性化剂。
蜂王浆的原产国有例如日本、中华人民共和国、台湾、泰国、巴西、欧洲各国、大洋洲各国、美国等，任一原产国的蜂王浆均可合适地使用。另外，亦可适宜混合数个原产国的蜂王浆。使用于发酵的蜂王浆，并无特别限定，不过较佳为液状，在使用冻结干燥状态的蜂王浆的情形中，较佳为以精制水、自来水、适当的缓冲液等加以溶解后使用。又，冻结状态的蜂王浆可予溶融使用。
本发明中的乳酸菌，若为将蜂王浆发酵而制造增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的乳酸菌，则使用上毫无限制。具体而言，有属于乳酸杆菌属(Lactobacillus属)、乳球菌属(Lactococcus属)、链球菌属(Streptococcus属)、明串珠菌属(Leuconostoc属)、双叉杆菌属(Bifidobacterium属)等的乳酸菌。
在该乳酸菌中，较佳为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、戴耳布吕克乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)等的属于乳酸杆菌属的乳酸菌，或乳酸球菌(Lactococcus lactis)等的属于乳球菌属的乳酸菌。
特佳可列举短乳杆菌，例如短乳杆菌NBRC12005、短乳杆菌NBRC12520、短乳杆菌NBRC3345、短乳杆菌NBRC3960、短乳杆菌NBRC13109、短乳杆菌NBRC13110等。
该些乳酸菌可单独使用，亦可就二种以上的乳酸菌来使用。乳酸菌的培养方面，可为静置培养、振荡培养、搅拌培养、通气培养、嫌气培养等方法培养。又，静置培养中有乳酸菌沉淀等的情形时，系进行振荡、搅拌等，亦可将乳酸菌分散。
对于乳酸菌，使用短乳杆菌NBRC12005(以下简称「NBRC12005株」)的情形的增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法系说明于下，但本发明并非限定于NBRC12005株。亦即，下述自然免疫活性化剂的制造方法并非限定于NBRC12005株，而可适用于所有乳酸菌。
<前置前培养步骤>
在下述前置培养步骤之前，为了乳酸菌所致发酵的效率化、乳酸菌的大量调制等，较佳为进行前置前培养步骤。通过混合前置前培养液与乳酸菌而开始前置前培养。前置前培养，若为可使乳酸菌生育的培养条件，则并无特别限定，例如在NBRC12005株的情形，以前置前培养液的培养基组成而言，有例如调配单独一种或二种以上碳源、氮源、有机微量营养素、金属类、脂质类等之物。较佳为葡萄糖、蛋白胨、酵母萃取物、金属类等的培养基成分。
植菌NBRC12005株于前置前培养用的培养基，进行菌体的前置前培养。在NBRC12005株的前置前培养，培养时间较佳为半天至4天，更佳为1天至2天。培养温度较佳为15至50℃，更佳为25至40℃，起始pH较佳为3至9，更佳为在5至8进行前置前培养。较佳为将如此所得的前置前培养液使用于其次的前置培养步骤。
<前置培养步骤>
在将培养完成后的前置前培养液使用于前置培养步骤时，亦可将NBRC12005株洗净，亦可不进行洗净，将以前置前培养所得的前置前培养液，照原样状态，或将分离的NBRC12005株的菌体植菌于前置培养液。又，在完成前置前培养后，进行前置培养的情形，系混合前置培养液与前置前培养完成后的乳酸菌或培养液。在混合前置前培养完成后培养液的情形的混合比率，相对于前置培养液1体积份，较佳为0.001体积份至0.5体积份，更佳为混合相当于0.005体积份至0.2体积份的培养液，因属于其次步骤的发酵步骤的发酵效率良好点较佳。
前置培养步骤，较佳为以包含麸胺酸或其盐的前置培养液培养乳酸菌。在将乳酸菌进行前置培养时，在前置培养液至少含有麸胺酸或其盐。以麸胺酸盐而言，有例如麸胺酸钾、麸胺酸钠、麸胺酸镁、麸胺酸钙等。又，以麸胺酸、蛋白酶及/或胜肽酶，分解「含有麸胺酸的蛋白质或胜肽」，亦可为自蛋白质或胜肽游离的麸胺酸。
前置培养液，进一步亦可含有培养基成分。以培养基成分而言，有例如碳源、氮源、有机微量营养素、金属类、脂质类等。该等亦可单独一种或含有二种以上。以培养基成分而言，较佳有葡萄糖、酵母萃取物、蛋白胨、金属类等。
在前置培养步骤的麸胺酸浓度，亦即，将前置培养液与在前置前培养所得乳酸菌或培养液(该乳酸菌的培养液)混合后的麸胺酸浓度，较佳为0.1至5g/100mL，更佳为0.6至2g/100mL，特佳为0.8至1.5g/100mL。在前置培养步骤的麸胺酸浓度过低的情形，会有在属于其次步骤的发酵步骤的发酵效率不良的情形。
通过将前置培养液与在前置前培养所得的乳酸菌或培养液予以混合，而可开始前置培养。培养时间、温度、pH等的前置培养条件，较佳为可将麸胺酸变换成γ-胺基丁酸的前置培养条件，在上述前置前培养中亦可与培养条件相同。例如较佳为培养时间为半天至4天，更佳为1天至2天。培养温度较佳为15至50℃，更佳为25至40℃，起始pH较佳为3至9，更佳为5至8。
在前置培养步骤，乳酸菌系将刚前置培养步骤之后的麸胺酸或其盐，至少消耗15g/100mL以上，因在其次步骤可效率良好的获得本发明的增强来自蜂王浆的自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的点较佳。更佳的消耗率为20g/100mL以上，再更佳的消耗率为50g/100mL以上。因应麸胺酸或其盐的浓度，在前置培养步骤的麸胺酸或其盐的消耗率可适宜调整。将麸胺酸或其盐以上述范围的消耗率消耗，变换成γ-胺基丁酸的物较佳。
<发酵步骤>
在将通过前置培养步骤所得的乳酸菌使用于发酵时，亦可将NBRC12005株以灭菌水、已灭菌的生理食盐水、已灭菌的缓冲液等洗净。在洗净乳酸菌的情形，亦可以玻璃过滤器、离心分离等除去多余的水分，亦可将已洗净的乳酸菌，再次悬浮于灭菌水、已灭菌的生理食盐水或已灭菌的缓冲液。再者，在前置培养完成后，亦可不进行上述般的洗净，培养液照原样的状态，或将以玻璃过滤器、离心分离等，分离(菌体分离)培养上澄液的乳酸菌使用于发酵步骤亦可。
又，将必要的乳酸菌量一次与发酵液混合亦可，将必要的乳酸菌量分成2次以上混合亦可。又，在使用二种以上乳酸菌的情形，各自的乳酸菌同时与发酵液混合亦可，个别的分开与发酵液混合亦可。
在前置培养步骤所得的乳酸菌或培养液，与发酵液的混合比率，相对于「乳酸菌或培养液与发酵液的混合液」1体积份，较佳为培养液0.05至4体积份，更佳为0.1至3体积份，特佳为0.2至1.5体积份。
发酵步骤，系在前置培养步骤之后进行，将蜂王浆及较佳为含有「麸胺酸或其盐」的发酵液与在前置培养液所得的乳酸菌予以混合，产生本发明的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂的步骤。发酵液，必须至少含有蜂王浆，较佳为含有麸胺酸或其盐。在此，「混合乳酸菌」，不仅是指将经前置培养步骤所得的乳酸菌以适当方法(例如离心分离)分离的乳酸菌予以混合于发酵液的情形，亦指在培养液(前置培养的培养液)的状态，将乳酸菌混合于发酵液的情形。
将发酵液与前置培养步骤所得乳酸菌或培养液混合时的蜂王浆的固体成分浓度，较佳为1至20g/100mL，更佳为3至15g/100mL、特佳为4至10g/100mL。
又，发酵液在增强自然免疫促进作用的点，较佳为含有麸胺酸或其盐，作为麸胺酸盐，例示如麸胺酸钾、麸胺酸钠、麸胺酸镁、麸胺酸钙。所含有的麸胺酸(盐)，系以蛋白酶及/或胜肽酶分解「含有麸胺酸的蛋白质或胜肽」，亦可为自该蛋白质或胜肽游离的麸胺酸(盐)。
在发酵步骤的麸胺酸浓度，亦即，在将发酵液与前置培养步骤所得的乳酸菌或培养液(其乳酸菌的培养液)予以混合后的麸胺酸浓度较佳为0.1至10g/100mL，特佳为1至5g/100mL。
发酵液进一步亦可含有培养基成分。以培养基成分而言，有例如碳源、氮源、有机微量营养素、金属类、脂质类等。该可使用单独一种或使用二种以上。以培养基成分而言，较佳为酵母萃取物、蛋白胨、金属类等。
通过混合在发酵液与前置培养步骤所得的乳酸菌或培养液而开始发酵。发酵时间、温度、pH等发酵条件并无特别限定，不过较佳为发酵天数为半天至10天，更佳为2天至6天。发酵温度较佳为15至50℃，更佳为25至40℃。发酵的起始pH较佳为3至9，更佳为5至8。另外，虽无限定，不过较佳为静置发酵。
此外，本发明中「发酵」，系指通过混合乳酸菌与发酵液，而可产生作为目的的「来自蜂王浆的自然免疫活性化剂」，发酵液与乳酸菌的混合使微生物增殖或不增殖均无妨。
<杀菌步骤>
本发明中「增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法」，更佳为含有进行乳酸菌的杀菌的步骤。以杀菌方法而言，例示有以加热杀菌的方法、使用药剂杀菌的方法、以过滤将乳酸菌除菌的方法、使用离心分离将乳酸菌除菌的方法等，该方法可使用单独一种，亦可组合二种以上。较佳为以加热进行乳酸菌杀菌的方法，此时的加热温度较佳为60℃以上，更佳为80至100℃，特佳为90至100℃。在加热温度过低的情形，会有乳酸菌作为增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂为无问题的程度下无法杀菌的情形，在加热温度过高的情形，则会有所得自然免疫活性化剂分解并使高阶结构变化等，而失去活性等的情形。
<精制步骤>
本发明的「增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法」，较佳为具有精制步骤。以精制方法而言，有凝胶过滤层析法、离子交换层析法、亲和层析法、疏水层析法、逆相层析法(reversedphase chromatography)、正相层析法(normal phase chromatography)、超过滤、电泳等，较佳为通过该单独或者组合而进行精制。在以层析法等精制时，较佳为使用预先以离心分离回收上澄液之物。
凝胶过滤层析法，有可分离各种分子量的蛋白质的凝胶过滤层析法用的载体，可例示交联琼脂糖(agarose)树脂、二氧化硅微粒等。以使用于离子交换层析法的离子交换基而言，有阴离子交换体、阳离子交换体等，以阴离子交换体而言，可例示二乙基胺乙基(DEAE基)、四级胺乙基(QAE)等。又，以阳离子交换体而言，有羧甲基(CM)、磺酸基丙基(SP)等。本发明的自然免疫活性化剂的精制，较佳为具有二乙基胺乙基等的阴离子交换体。
以使用于疏水层析法的载体而言，有结合丁基(Butyl基)、乙基(Ethyl基)、苯基(Phenyl基)的载体等。以使用于逆相层析法的载体而言，可列举键结十八基(C18)、与十八基在烷基长度为不同的C30、C8、C4等的载体等。
以使用于正相层析法的载体而言，除了二氧化硅凝胶之外，可列举结合有氰丙基、具有二醇结构的官能基、胺丙基、聚胺等的载体等。
精制的结果，可获得至少使多糖类作为有效成分。因此，本发明亦可为含有多糖类(作为有效成分)的该来自蜂王浆的自然免疫活性化剂。较佳为含有酸性多糖类(有效成分)的该来自蜂王浆的自然免疫活性化剂。在含有物中，会有仅多糖类或酸性多糖类具有自然免疫促进作用的可能性。在此情形，虽无限定，不过本发明的「来自蜂王浆的自然免疫活性化剂」系「属于多糖类或酸性多糖类的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂」。
<自然免疫活性化剂的利用与用途、发酵蜂王浆组成物>
本发明的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂，可作为活性化人类的自然免疫(促进作用)的剂予以利用。本发明的「来自蜂王浆的自然免疫活性化剂」服用了再投与为理想。又，不仅可利用作为人类摄取的医药品，而且可调配于食品加以利用。又，亦可投与家畜。在家畜的饲料，亦可调配作为补充剂、营养辅助食品、医药品等。
有效成分亦可在单离之后使用。又，以剂形而言，并无特别限定，而有例如散剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、胶囊剂、药丸、栓剂、液剂等。又，亦可调配成形(forming)剂、基剂、乳化剂、溶剂、稳定剂等。
本发明的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂、其精制品，或经单离的有效成分，通过含有各种成分而可制成发酵蜂王浆组成物。以此等各种成分而言，有例如糖、脂质、乳化剂、增黏剂、调味料、香料、酸味调整剂、保存料、果汁、香料、营养成分等，可在不损及本发明效果的范围使用。又，该各种成分可单独使用，亦可混合二种以上使用。
例如，以糖而言，可例示蔗糖、异构化(isomerization)糖、葡萄糖、果糖、巴拉金糖、茧糖(trehalose)、乳糖、木糖等。以乳化剂而言，可例示蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、卵磷脂等。以增黏剂而言，可例示海藻胶(carrageenan)、阿拉伯橡胶、三仙胶(xanthan gum)、古亚胶(guar gum)、果胶(pectin)、刺槐豆胶(Locust bean gum)增黏剂淀粉、结兰胶(gellan gum)等。以酸味调整剂而言，可例示柠檬酸、乳酸、苹果酸、反丁烯二酸、葡萄糖酸、酒石酸等。以保存料而言，可例示苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、对羟苯甲酸酯(parahydroxybenzoate)、亚硫酸钠、果胶分解物、甘胺酸等。以果汁而言，可例示西红柿汁、梅果汁、苹果汁、柠檬汁、橘子汁、浆果(berry)系果汁等。以香料而言，可例示草药(herb)、香辛料(spice)等的调味料(condiment)、水果(fruit)系香料、香草(vanilla)等的香料等。以营养成分而言，有维生素D等的维生素类；钙、镁、铁、锰、锌等的矿物质类等。
以本发明的制造方法所得「来自蜂王浆的自然免疫活性化剂」、其精制品、经单离的有效成分，或发酵蜂王浆组成物可含于食品中。以此种食品的具体形态而言，有例如饮料类、糖果、砂糖糖果(candy)、橡胶、面包、肉类(meat)制品、乳制品、蒸馏(retort)食品、快餐食品、冷冻食品、胶状食品、养蜂产品、腌渍品、调味料等。该等食品，作为健康食品、功能性食品、特定保健用食品、营养功能食品、营养辅助食品、补充剂等亦为有用。又，以作为该等食品的形状而言，可列举颗粒、粉末、锭剂、胶囊、咀嚼锭(chewable)、饮料(drink)、胶冻(jelly)、糊、粒等。
<自然免疫促进作用的评价>
自然免疫促进作用的有无程度的评价，较佳为依照WO2008/126905、WO2009/157409记载的方法(在下述记载概要的方法)来进行。本发明的「至少含有将蜂王浆以乳酸菌发酵步骤为其特征的制造方法所制造的来自蜂王浆的剂」，为有自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂，系指通过上述国际公开小册记载的方法(在下述记载概要的方法)，而首先发现，又已被确认。
进一步通过上述国际公开小册记载的方法(在下述记载概要的方法)，而首先发现将蜂王浆以乳酸菌发酵，与通过属于原料的蜂王浆而增强自然免疫促进作用，而可提供本发明的「增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法」。
亦即，在对蚕等完全变态型昆虫的幼虫投与试料的情形，将具有自然免疫促进作用的物质投与完全变态型昆虫的幼虫的情形，在其结束时发生需时10分钟左右的缓缓地肌纤维收缩(以下简称「缓行性肌纤维收缩」)。接着，在评价自然免疫促进作用时，于投与成为伪阳性原因的脂多糖(LPS)的情形，并不发生该缓行性肌纤维收缩，故可作为用以评价自然免疫促进作用的实用上指标。
本发明的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂，较佳为至少以含有下述步骤(a)至(c)的筛选方法所得之物，可依照需要进一步含有其它步骤：
(a)将受检物质投与具有自然免疫机构的生物的步骤；
(b)对于该受检物质是否使该具有自然免疫机构的生物的肌肉收缩予以评价的步骤；及
(c)对于使该具有自然免疫机构的生物的肌肉收缩可予以评价的物质进行选择的步骤。
在投与具有自然免疫机构的生物时，以缓行性肌纤维收缩活性的大小评价自然免疫促进活性作用的大小，因自然免疫促进作用大小的评价为正确，故佳。
以「具有自然免疫机构的生物」而言，较佳为属于昆虫类的生物。该「昆虫类」系指节肢动物门颚亚门(Subphylum Mandibulata)的一网，包含无翅亚纲(protura)、弹尾类(collembola)、无翅昆虫类及有翅昆虫类的四亚纲的纲之意。以「属于昆虫类的生物」而言，并无特别限制，可依目的适宜选择，以处理的便利性的点，较佳为幼虫。以该幼虫而言，并无特别限制，可依目的适宜选择，例如有鳞翅目(Lepidoptera)(含有蛾或蝶)、甲虫目(含独角仙)的幼虫等。此外，该幼虫，于该受检物质的投与容易性等的点，较佳为大型幼虫。该「大型幼虫」系指体长1cm以上的幼虫。以该幼虫而言，较佳为例如蚕(家蚕的幼虫)、蓖麻蚕(eri silkmoth)的幼虫等。
以具有自然免疫机构的生物而言，在步骤(b)中较佳为使用易于测定受检物质所致肌肉收缩程度的生物，即使此点，特佳也为蚕。又，以蚕而言，例如如后述实施例所示，较佳为使用蚕的断头肌肉标本。若使用蚕的断头肌肉标本时，在可排除来自中枢神经的信号输入的点较有利。
以受检物质对具有自然免疫机构的生物的投与方法而言，并无特别限制，可依目的适宜选择，有例如经口投与、腹腔内投与、对血液中注射、对肠内注入、对饲料(饵料)的添加等。又，作为对该具有自然免疫机构的生物的该受检物质的投与量，并无特别限制，可依目的适宜选择。
评价受检物质是否将具有自然免疫机构的生物肌肉收缩(步骤(b))。以评价该受检物质是否将该具有自然免疫机构的生物肌肉收缩的方法而言，例如系通过将该具有自然免疫机构的生物肌肉收缩的程度，以肌纤维收缩值(Contraction value值；(C值))表示，来评价(参照例如Ishii K.,Hamamoto H.,Kamimura M.,Sekimizu K.,J.Biol.Chem.Jan.25；283(4):2185-91(2008))。
具体言之，系测定该受检物质的投与前及投与后的该具有自然免疫机构的生物的体长，求得将「投与前的体长」－「投与后的体长」以「投与前的体长」相除的肌纤维收缩值(C值)。肌肉收缩的程度越大则C值变大，若完全无肌肉收缩，则C值为0。又，相反地肌肉松弛时，则C值成为负(minus)值。肌纤维收缩的过程以适当的方法，例如使用连接于记录计的信号转换器(transducer)加以监视，并测定使肌纤维收缩的程度呈最大时的C值为适当。肌纤维收缩所需时间，因会对应投与的该受检物质种类或量等而变化，故予以适宜选择。
在肌纤维收缩值(C值)为正(plus)值时，该受检物质评价为具有自然免疫促进作用。又，肌纤维收缩值(C值)越大，则该受检物质可评价为自然免疫促进作用越大。通过将蜂王浆以乳酸菌发酵，而较发酵前的蜂王浆的肌纤维收缩值(C值)变大时，则可评价为自然免疫促进作用增强
在投与完全变态型昆虫的幼虫时的以缓行性肌纤维收缩大小而可评价自然免疫促进作用的作用机制系如下述。亦即，其机制为，促进自然免疫功能的物质(可例示胜肽多糖、β-葡聚糖等)，在进入具有自然免疫系统的生物体内时，则与免疫活性细胞(immunocompetent cell)的受体结合，其结果产生活性氧种，在其为完全变态型昆虫的幼虫的情形，则获致属于麻痹胜肽(paralyticpeptide)的BmPP的活性化，使经活性化的BmPP作用于肌肉细胞，而促进肌肉的收缩。
肌纤维收缩，除此以外亦发生于使神经传导物质作用的情形，此情形的肌纤维收缩，相对于投与试料之后于数秒以内完成的快速反应，自然免疫系统经活性化情形的肌纤维收缩，因系收缩的结束需时约10分钟程度的缓行性肌纤维收缩，故两者可以明确地区别。
又，此评价方法，相较于使用巨噬细胞(Macrophage)等的免疫活性细胞的评价方法，则有可反映体内动态的优点。再者，在使用培养细胞进行评价的情形，亦有不受「被视为有自然免疫促进作用的可能性，而LPS造成被评价为伪阳性物质的问题」的影响(LPS并无被评价为具有自然免疫功能活性化作用)的优点。
因此，因进行组成物的自然免疫促进作用的评价，该组成物亦有含有不进行精制的各式各样成分的可能性，故在本发明成为特别合适的指标。因此，将其作为指标予以评价，结果经过选择已经评价使具有自然免疫机构的生物肌肉收缩的物质的步骤(步骤(c))，本发明的制造方法，首先发现作为优异的自然免疫活性化剂的制造方法。
使用受检物质，进行该步骤(a)至步骤(b)所致评价，接着，在步骤(c)，通过自各种受检物质中，选择使该具有自然免疫机构的生物肌肉收缩可予以评价的物质，而可容易地且有效率地筛选自然免疫活性化剂。
【实施例】
兹根据实施例、研讨例进一步详细说明本发明如下，但本发明并非限定于下述实施例。以下，单视为「%」者，若无特别限定，则指「质量%」。
[自然免疫活性化剂的调制]
实施例1
<前置前培养步骤>
在300mL容积附阻板(baffle)的三角烧瓶中，装入包含100mL的1%葡萄糖、1%酵母萃取物的液体培养基(pH7.2)与1mL的10%锰酵母液，盖上透气性硅胶盖(SILICOSEN(注册商标))，在121℃进行15分钟热压器灭菌，制成液体培养基。
在液体培养基中添加50μL经甘油保存的NBRC12005株，在30℃进行静置培养一天。其后，在与上述相同地制成的液体培养基中添加3mL的NBRC12005株的培养液，在30℃进行静置培养1天，进行NBRC12005株的前置前培养。
<前置培养步骤>
在5L容积MBS公司制迷你发酵机中，投入包含3L的1%葡萄糖、1%酵母萃取物的液体培养基(pH7.2)与1mL的10%锰酵母液，进行121℃、20分钟热压器灭菌。添加75mL经热压器灭菌(于121℃15分钟)的40%麸胺酸钠1水合物溶液，调制前置培养液。
其后，以前置前培养添加90mL所得的培养液，进行1天前置培养。此外，培养温度系在30℃、无通气下进行静置培养。
<发酵步骤>
在10L容积MBS公司制发酵机(jar fermentor)中，投入包含3L的2%酵母萃取物、60mL的10%锰酵母液的发酵用培养基，在121℃经热压器灭菌20分钟。
其后，在将天然的生蜂王浆(固体成分浓度34%)以1N的NaOH调整至pH6.7后，在包含以精制水经1.6倍稀释的蜂王浆稀释液1.2L及经热压器灭菌(于121℃15分钟)的0.6L的40%麸胺酸钠1水合物溶液的发酵液中，添加1.2L以前置培养所得的培养液，进行5天发酵。发酵温度在30℃、无通气下，进行静置发酵。但是，发酵中1天进行1次搅拌。此外，在上述10%锰酵母液有不溶性沉淀的情形，系在室温放置15分钟，将上澄液制成10%锰酵母液。
在5天的发酵完成后，于105℃予以过加热30分钟，进行灭菌，以冻结干燥而获得本发明的「来自蜂王浆的自然免疫活性化剂」。经该冻结干燥的自然免疫活性化剂的γ-胺基丁酸含量为27.4%。
[自然免疫促进作用的测定]
(1)蚕肌纤维标本的制成
如以下记载，使用蚕的缓行性肌纤维收缩的测定，进行自然免疫活性的评价。缓行性肌纤维收缩的测定系依照Ishii K.,HamamotoH.,Kamimura M.,Sekimizu K.,J.Biol.Chem.Jan.25；283(4):2185-91(2008)记载的方法进行。
亦即，自5岁的第1天给予含抗生物质的人工饵料(artificialfeed)(Silk mate2S、日本农产工业)而饲育的5岁第5天的蚕(体重约5g)的眼纹(eye-spot)稍下边，以解剖刀切断，以镊子(tweezer)摘除肠管及丝腺(silk gland)。其后，使用新月形解剖针，将20cm程度长度的车缝线(machine sewing thread)自切剖面通至稍下边，将细线两端缠接，以作出轮。在蚕的尾脚部分，绑紧20cm的车缝线后，将重量27g的夹具通过细线，缠接细线两端，制成蚕肌纤维标本。制成的标本，吊在支架上1至2小时，予以稳定化。
(2)肌纤维标本安装于信号转换器端子
进行信号转换器端子的校正，将端子水平地固定于支架后，在端子的一端安装重量27g的夹具，另一端，安装卸下夹具的蚕肌纤维标本，再调整两端的均衡性。
(3)蚕肌纤维收缩试验
以经热压器灭菌的0.9%NaCl水溶液，调制自然免疫活性化剂的浓度200mg/mL的悬浮液。其后，使用0.9%NaCl水溶液，来调制稀释成1/4、1/16、1/64、1/256的悬浮液。将该等悬浮液取1mL结核菌素注射器，使用27规格的注射针，每0.05mL注射于安装于信号转换器端子的蚕肌纤维标本。在6分钟后，以尺计测肌纤维收缩前后的肌纤维标本长度，以下述方式计算肌纤维收缩值。
C值(肌纤维收缩值)=([收缩前长度]-[收缩后长度])/[收缩前长度]
在肌纤维收缩的阳性对照组，使用空气、酵母β-葡聚糖(Sigma、G5011)、裙带菜孢子叶褐藻糖胶(理研维生素)，而在阴性对照组系使用0.9%NaCl水溶液。
(4)数据解析
将投与各肌纤维标本的试样重量(mg)的对数作为横轴，C值(肌纤维收缩值)作为纵轴予以绘图，使用KaleidaGraph version4.0(Synergy Software)，进行非线形回归曲线拟合(non-linearregression curve fitting)，制成剂量反应曲线(does response curve)。自所得剂量反应曲线，求得给予C值(肌纤维收缩值)=0.15的试样的重量(mg)(此定义为1活性单位(unit))，计算每检体1mg的活性(U/mg)。在表1及图1表示该结果。
比较例1
将在实施例1使用作为原料的蜂王浆的冻结干燥品与实施例1作相同评价。结果如表1、图1所示。
参考例1
酵母β-葡聚糖系使用东方酵母公司制，裙带菜孢子叶褐藻糖胶系使用理研维生素公司制之物，与实施例1、比较例1同样地测定自然免疫促进作用。结果如表1、图1所示。
比较例2
将蔬菜(圣女小西红柿、菠菜、天本萝卜(Japanese radishes)、生姜)予以冻结干燥，以研钵粉碎后，相对于各1g试样，添加5mL蒸馏水，实施8000rpm、5分钟离心。在沉淀中添加3mL蒸馏水，使用热压器，于121℃经20分钟加热处理。使其在室温，以8000rpm、10分钟离心，而获得上澄液，制成热水萃取物。将热水萃取物试样以0.9%NaCl稀释，以成为稀释率0.001至1质量%，注射0.05mL于蚕的断头肌肉标本的体腔内，在6分钟后测定体长，与实施例1同样地测定自然免疫促进作用(表1)。在此「稀释率」系指相对于以0.9%NaCl水溶液稀释的液全体的上述热水萃取物试样的质量%。
【表1】
Figure BDA00003610956600191
在本发明的自然免疫活性化剂的投与，虽然来自酵母的β-葡聚糖或裙带菜孢子叶褐藻糖胶不良，但具有自然免疫促进作用。接着，其效果较属于原料的冻结干燥蜂王浆更优异100倍以上，可确认本发明的效果。再者，吾人可知比已比较的各种蔬菜具有更高的自然免疫促进作用。
又，在本发明的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂的投与，与来自酵母β-葡聚糖相同，进行浓度依赖性肌纤维收缩，其比活性为0.50U/mg(图1、表1)。由与属本发明的自然免疫活性化剂的原材料的冻结干燥蜂王浆的比较，自然免疫促进作用因发酵处理而增强175倍(图2、表1)，可确认本发明的「以乳酸菌发酵所致效果」。
在投与属检体的溶剂的0.9%NaCl水溶液的情形，并不发生肌纤维收缩(肌纤维收缩值=0.00)，而在属阳性对照组的空气，则产生收缩(肌纤维收缩值=0.43)。此外，在酵母β-葡聚糖或裙带菜孢子叶褐藻糖胶，发生浓度依赖性收缩，自剂量反应曲线所计算的比活性，各自为77U/mg与2.0U/mg。
实施例2
[自然免疫活性化剂的有效成分的分离]
(1)热水萃取液的调制
在实施例1所得的「来自蜂王浆的自然免疫活性化剂」的10g粉末中，添加50mL的0.9%NaCl水溶液，再调制200mg/mL的悬浮液。其后，使用热压器，在121℃加热20分钟。在悬浮液的冷却后，使用高速离心机(天立工机CR-21、转子R10A2)，在室温，通过8000rpm、5分钟的离心分离，而获得上澄液48mL(热水萃取液馏分)。其后，将该离心上澄液以每16mL分注，将99.5%乙醇各自以每32mL添加，予以良好搅拌，在室温以8000rpm、5分钟的离心分离，获得1.5g(干燥重量)的白色沉淀(乙醇沉淀馏分)。将400mg沉淀溶解于8mL的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)，以15000rpm、5分钟的离心分离回收上澄液，将其制成阴离子交换层析法的起始材料。
(2)阴离子交换层析法所致多糖类的分离
在以10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)经平衡化的填充有20mL的DEAE-纤维素(Whatman公司、DE52)的柱中，涂布8mL的试料水溶液，以100mL的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)洗净柱后，以含有100mL的0.4M NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)溶离吸附馏分，并以每5mL划分成42个部分(fraction)。
就各部分，以酚-硫酸法定量全糖量，又测定自然免疫促进作用。阴离子交换层析法馏分的糖含量与肌纤维收缩值(C值)(自然免疫促进作用)的结果如表2所示。
(3)酚-硫酸法所致糖定量
在以10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.9)稀释10倍的各馏分0.1mL，添加0.1mL的5(w/v)%酚水溶液，以漩涡式混合器(Vortex mixer)搅拌5秒后，添加0.5mL浓硫酸，予以搅拌，在室温反应20分钟。将各反应液每0.2mL分注于96孔微盘，以微盘分析仪(MTP-300、Corona电气)测定490nm的吸光度。校正曲线系以D-葡萄糖作为标准试料制成。
(4)划分部分的浓缩
将99.5%乙醇每6.0mL添加于3.0mL的各部分，良好的搅拌后，在室温进行8000rpm、5分钟离心，并回收沉淀。在已干燥的沉淀中将0.9%NaCl水溶液以每0.5mL添加，予以溶解，调制6倍浓缩液。
(5)划分部分浓缩液的肌纤维收缩值(C值)的测定
将部分6倍浓缩液每0.2mL注射于蚕肌纤维标本。用尺测定肌纤维标本的长度，计算肌纤维收缩值(C值)=([收缩前长度]-[收缩后长度])/[收缩前长度])(表2)。在蚕肌纤维收缩的阳性对照组使用空气，在阴性对照组使用0.9%NaCl水溶液。
【表2】
Figure BDA00003610956600221
以DEAE-纤维素柱层析法，在自然免疫活性化剂的热水萃取液中所含的多糖类，系被分离为以馏分6及27作为中心的2个波峰。糖的回收率为58%。
糖的波峰1(馏分4至6)及波峰2(馏分26至30)均表示肌纤维收缩活性(自然免疫促进作用)。此时，即使投与属试样的溶剂的0.9%NaCl水溶液，也不会发生蚕的肌纤维收缩(肌纤维收缩值=0.00)，在属于阳性对照组的空气，则发生收缩(肌纤维收缩值=0.38)。
如表1及图1、图2所示，通过使用了乳酸菌的发酵处理，可获得自然免疫活性化剂，其具有较起始材料的冻结干燥蜂王浆显著增高的自然免疫促进作用。由表2可知，其活性成分存在二种。又可推定是多糖类、且是酸性多糖类。
【产业上可利用性】
本发明中自然免疫活性化剂，因系来自天然的蜂王浆，故安全性高，作为自然免疫增强剂，被广泛利用作为机能性食品、食品、医药品等的添加剂。
本申请案系根据2011年2月7日申请的日本专利申请的特愿2011-024040者，该申请的全部内容兹以题述方式纳入本发明的说明书的揭示。

Claims (7)

1.一种增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，其特征在于，至少包含将蜂王浆以乳酸菌发酵的步骤。
2.如权利要求1所述的增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，其特征在于，至少包含下述步骤(1)至(3)：
(1)前置培养乳酸菌的步骤；
(2)将蜂王浆以乳酸菌发酵的步骤；及
(3)进行乳酸菌的杀菌的步骤。
3.如权利要求1或2所述的增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，其特征在于，该乳酸菌为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。
4.如权利要求2或3所述的增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法，其特征在于，该步骤(3)的进行乳酸菌的杀菌的步骤，系通过加热而进行乳酸菌的杀菌的步骤。
5.一种来自蜂王浆的自然免疫活性化剂，其特征在于，系以如权利要求1至4中任一项所述的增强自然免疫促进作用的自然免疫活性化剂的制造方法所制造的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂。
6.如权利要求5所述的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂，其特征在于，其包含有酸性多糖类。
7.如权利要求5或6所述的来自蜂王浆的自然免疫活性化剂，其特征在于，其系以至少包含有下述步骤(a)至(c)的筛选方法所得：
(a)将受检物质投与具有自然免疫机构的生物的步骤；
(b)对于该受检物质是否使该具有自然免疫机构的生物的肌肉收缩予以评价的步骤；及
(c)对于使该具有自然免疫机构的生物的肌肉收缩可予以评价的物质进行选择的步骤。
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