CN107208040A - 乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂和饮食品 - Google Patents

乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂和饮食品 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种具有高的天然免疫活化能力的乳酸菌,进而提供含有该乳酸菌或来源于该乳酸菌的物质的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂、含有这些物质的饮食品。利用下述物质解决了上述课题:在NITE的NPMD的保藏号为NITE BP‑02005的属于乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌;具有天然免疫活化能力的该乳酸菌或者该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌;具有序列号1所表示的16S rDNA区域的碱基序列的乳酸菌;以该乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂;含有该乳酸菌的肽聚糖作为有效成分的感染症预防治疗剂;含有这些物质的饮食品。

Description

乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、感染症预防治疗 剂和饮食品
技术领域
本发明涉及新型乳酸菌、以该新型乳酸菌的活菌、死菌或处理物作为有效成分的天然免疫活化剂、以该新型乳酸菌的肽聚糖作为有效成分的感染症预防治疗剂、以及含有这些物质的饮食品。
背景技术
乳酸菌从很早开始就被用于发酵食品,用于饮食品、药品、益生菌等的生产。乳酸菌具有革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不形成芽孢、无运动性等特征。
已知类植物乳杆菌(L.paraplantarum)是与植物乳杆菌(L.plantarum)具有近缘关系的乳酸菌,类植物乳杆菌、植物乳杆菌均为非病原性的革兰氏阳性乳酸菌,进行异质乳酸发酵(非专利文献6)。
另外,一部分种、亚种的全基因组已被解读(非专利文献1、2),除此之外,最近重组植物乳杆菌被用于透过动物肠表皮的特异性抗原的提呈,作为能够口服摄取的活的感染症预防剂而受到关注(非专利文献3、4)。
另一方面,已知在天然免疫反应中,树突细胞、巨噬细胞这样的免疫细胞对来源于细菌或病毒的天然免疫活化物质发生应答而产生细胞因子,引起之后的免疫反应。天然免疫机制是生物所共有的感染防御机制,通常为非特异性的,因而具有反应迅速、并且对多种感染源有效地发挥功能的特征。
迄今为止,本发明人已开发出在仅具有天然免疫机制的蚕中能够简便地测定天然免疫活化反应的评价方法(筛选方法)(专利文献1、非专利文献5)。此外,确认了利用该方法能够进行对人等脊椎动物具有天然免疫活化作用的天然免疫活化剂的评价(筛选方法)(专利文献1等)。
另外,本发明人确认了蚕作为对微生物感染症的抵抗性评价的模型动物是有用的(专利文献2、3等)。
免疫机制的异常成为引起各种疾病的原因。因此,期待可根据希望对这样的免疫机制进行调节的优异的天然免疫活化剂或感染症预防治疗剂。另外,还期待开发出含有乳酸菌来源物或上述制剂的饮食品、利用了上述性能优异的乳酸菌的饮食品。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO2008/126905号
专利文献2:日本特开2007-327964号公报
专利文献3:日本特开2012-006917号公报
非专利文献
非专利文献1:Kleerebezem M,Boekhorst J,van Kranenburg R,Molenaar D,Kuipers OP,Leer R,Tarchini R,Peters SA,Sandbrink HM,Fiers MW,Stiekema W,Lankhorst RM,Bron PA,Hoffer SM,Groot MN,Kerkhoven R,de Vries M,Ursing B,deVos WM,Siezen RJ.Complete genome sequence of Lactobacillus plantarumWCFS1.Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Feb 18;100(4):1990-5
非专利文献2:Siezen RJ,Francke C,Renckens B,Boekhorst J,Wels M,Kleerebezem M,van Hijum SA.Complete resequencing and reannotation of theLactobacillus plantarum WCFS1genome.J Bacteriol.2012Jan;194(1):195-6.
非专利文献3:Grangette C,Muller-Alouf H,Goudercourt D,Geoffroy MC,Turneer M,Mercenier A.Mucosal immune responses and protection against tetanustoxin after intranasal immunization with recombinant Lactobacillusplantarum.Infect Immun.2001 Mar;69(3):1547-53.
非专利文献4:Seegers JF.Lactobacilli as live vaccine delivery vectors:progress and prospects.Trends Biotechnol.2002 Dec;20(12):508-15.
非专利文献5:Ishii K,Hamamoto H,Kamimura M,Sekimizu K.Activation ofthe silkworm cytokine by bacterial and fungal cell wall components via areactive oxygen species-triggered mechanism.J Biol Chem.2008 Jan 25;283(4):2185-91.
非专利文献6:Curk MC,Hubert JC,Bringel F.Lactobacillus paraplantarumsp.now.,a new species related to Lactobacillus plantarum.Int J SystBacteriol.1996 Apr;46(2):595-8.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供一种具有高的天然免疫活化能力的新型乳酸菌,此外在于提供以该乳酸菌或者该乳酸菌的死菌或处理物作为有效成分的天然免疫活化剂、含有该乳酸菌或来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂的饮食品。
另外,在于提供以来源于新型乳酸菌的物质作为有效成分的感染症预防治疗剂及饮食品。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究,结果发现,特定的(亚种的)乳酸菌株具有比通常据称具有天然免疫活化能力的各种物质、或迄今为止作为属于乳杆菌属等的其他乳酸菌而为人所知的乳酸菌更高的天然免疫活化能力。
此外,对上述的具有天然免疫活化能力的乳酸菌进行了其性状分析和16S rRNA碱基序列等的分析,结果明确了其为属于乳杆菌(Lactobacillus)属的新型乳酸菌株(下文中有时简称为“#11-1”)。
另外发现,食用了该乳酸菌的肽聚糖组分的蚕尽管不具有获得性免疫机制,但令人意外的是感染绿脓杆菌后的存活时间延长,被赋予了对感染绿脓杆菌的抵抗性,从而完成了本发明。
即,本发明提供一种乳酸菌,其属于乳杆菌(Lactobacillus)属,其在独立行政法人日本国家技术评估学会(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)的保藏号为NITE BP-02005。
此外,提供上述乳酸菌经分离或纯化而得到的乳酸菌。
另外,本发明提供一种乳酸菌,其为上述乳酸菌或者该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌,其具有天然免疫活化能力。
另外,本发明提供具有序列表的序列号1所表示的16SrDNA区域的碱基序列的上述乳酸菌。
此外,提供上述乳酸菌经分离或纯化而得到的乳酸菌。
另外,本发明提供一种天然免疫活化剂,其是以上述乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂,其特征在于,
上述乳酸菌的处理物为选自由乳酸菌的培养物;浓缩物;糊化物;喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等干燥物;液化物;稀释物;破碎物;杀菌加工物;以及来自该培养物的提取物组成的组中的至少一种处理物。
另外,本发明提供一种感染症预防治疗剂,其特征在于,含有上述乳酸菌的肽聚糖作为有效成分。
另外,本发明提供一种感染症预防治疗剂,其特征在于,含有上述天然免疫活化剂作为有效成分。
另外,本发明提供一种感染症预防治疗剂,其特征在于,含有上述乳酸菌的肽聚糖作为有效成分。
另外,本发明提供一种饮食品,其含有上述乳酸菌、上述天然免疫活化剂或上述感染症预防治疗剂。
另外,本发明提供一种饮食品,其是采用使用上述乳酸菌进行发酵的工序而制造的,并提供上述饮食品为发酵乳的饮食品。
发明的效果
根据本发明,能够提供一种具有极高的天然免疫活化能力的新型乳酸菌。
此外,能够提供以该新型乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的具有极高的天然免疫活化能力的新型天然免疫活化剂,能够提供含有(来源于)该乳酸菌或该天然免疫活化剂的天然免疫活化能力优异的饮食品。
此外,根据本发明,能够提供含有该新型乳酸菌的肽聚糖作为有效成分的感染症预防治疗剂,该感染症预防治疗剂能够通过口服给药而预防细菌等引起的感染症。因此,含有该感染症预防治疗剂的饮食品对于感染症预防是有效的。
使本发明的新型乳酸菌及新型天然免疫活化剂得以发现的筛选方法利用了对天然免疫活化物质发生应答而引起蚕标本的肌收缩的现象,由LPS导致的假阳性的天然免疫活化能力的检出得到抑制,另外,由于是使用了蚕个体的测定,因而可得到还考虑了样品的ADME(吸收、分布、代谢及排泄)、PK(药代动力学)的测定结果,并且能够排除具有毒性的化合物。
因此,本发明的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂和饮食品具有通过了上述检测的优异效果。
本发明的乳酸菌不仅能够用于一般饮食品、健康食品、药剂、发酵饮食品、益生菌的生产等,还被用于利用天然免疫活化的疾病的预防和治疗。作为发酵饮食品,特别适合于作为发酵乳、乳酸菌饮料、酸奶、酱菜、酱菜制造用乳酸菌发酵剂等的用途。另外,由于耐酸性强,因而还具有在胃中不被分解而可到达至小肠的特点。
附图说明
图1是示出本发明的乳酸菌类植物乳杆菌#11-1的16S rDNA和近缘的类植物乳杆菌DSM10667的16S rDNA(NR-025447.1)的利用了BLAST的同源性分析的结果的图。
图2是图1的续图。
图3是示出食用了乳酸菌植物乳杆菌PGN的肽聚糖组分的蚕与未食用的蚕在感染绿脓杆菌后的存活期间的图。
具体实施方式
下面对本发明进行说明,但本发明并不限于以下的具体方式,可以在技术构思的范围内任意进行变形。
<乳酸菌>
本发明涉及一种乳酸菌,其属于乳杆菌(Lactobacillus)属,其在独立行政法人日本国家技术评估学会(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)的保藏号为NITE BP-02005。
下面,对该属于乳杆菌(Lactobacillus)属的新型乳酸菌株(#11-1)进行详细说明。
形态:本发明的#11-1是以米糠酱菜作为分离源而首次分离出的。
在培养基中的生长状况:
(1)在GAM和MRS琼脂培养基上形成白色菌落。未观察到扩散性色素。
(2)在加入有碳酸钙的MRS琼脂培养基上,伴随着乳酸的生成,观察到透明带的形成。
生理学性质:本发明的#11-1的生理学、化学分类学性质如下。
(1)对氧的态度:厌氧
(2)过氧化氢酶:-
(3)碱性磷酸酶:-
(4)酯酶:-
(5)酯酶脂肪酶:-
(6)脂肪酶:-
(7)亮氨酸芳基酰胺酶:+
(8)缬氨酸芳基酰胺酶:+
(9)胱氨酸芳基酰胺酶:-
(10)胰蛋白酶:-
(11)α-胰凝乳蛋白酶:-
(12)酸性磷酸酶:+
(13)萘酚-AS-BI-磷酸水解酶:+
(14)α-半乳糖苷酶:-
(15)β-半乳糖苷酶:-
(16)β-葡糖醛酸苷酶:-
(17)α-葡糖苷酶:-
(18)β-葡糖苷酶:-
(19)N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶:-
(20)α-甘露糖苷酶:-
(21)α-岩藻糖苷酶:-
(22)由下述糖类等生成酸和气体的能力
甘油(Glycerol):-
赤藓糖醇(Erythritol):-
D-阿拉伯糖(D-Arabinose):-
L-阿拉伯糖(L-Arabinose):-
D-核糖(D-Ribose):±
D-木糖(D-Xylose):-
L-木糖(L-Xylose):-
D-核糖醇(D-Adonitol):-
甲基-β-D-吡喃木糖(methyl-β-D-xylopyranoside):-
D-半乳糖(D-Galactose):+
D-葡萄糖(D-Glucose):+
D-果糖(D-Fructose):+
D-甘露糖(D-Mannose):+
L-山梨糖(D-Sorbose):-
L-鼠李糖(L-Rhamnose):-
半乳糖醇(Dulcitol):-
肌醇(Inositol):-
D-甘露醇(D-Mannitol):+
D-山梨糖醇(D-Sorbitol):-
甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(methyl-α-D-mannopyranoside):-
甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷(methyl-α-D-glucopyranoside):+
N-乙酰基葡糖胺(N-Acetyl glucosamine):+
扁桃苷(Amygdalin):±
熊果苷(Arbutin):+
七叶苷(Esculin):+
水杨苷(Salicin):+
D-纤维二糖(D-Cellobiose):+
D-麦芽糖(D-Maltose):+
D-乳糖(D-Lactose):-
D-蜜二糖(D-Melibiose):-
D-蔗糖(D-Sucrose):+
D-海藻糖(D-Trehalose):+
胰岛素(Insulin):-
D-松三糖(D-Melezitose):-
D-棉子糖(D-Raffinose):-
淀粉(Starch):-
糖原(Glycogen):-
木糖醇(Xylitol):-
龙胆二糖(Gentiobiose):+
D-松二糖(D-Turanose):-
D-来苏糖(D-Lyxose):-
D-塔格糖(D-Tagatose):-
D-岩藻糖(D-Fucose):-
L-岩藻糖(L-Fucose):-
D-阿拉伯糖醇(D-Arabitol):-
L-阿拉伯糖醇(L-Arabitol):-
葡糖酸盐(Gluconate):±
2-酮基-葡糖酸盐(2-Keto-gluconate):-
5-酮基-葡糖酸盐(5-Keto-gluconate):-
分子生物学分析结果:与作为分子生物学系统分类指标使用的16S rRNA相关的#11-1的分析结果如下。
即,利用PCR由#11-1的基因组DNA扩增出16S rRNA区域的碱基序列,利用测序仪进行分析,结果发现了相当于16S rRNA的大致全长的碱基序列。
利用NCBI的BLAST分析对该碱基序列进行同源性检索的结果是,#11-1的16S rDNA区域的碱基序列与乳杆菌属的类植物乳杆菌DSM10667株的碱基序列(登记号:NR_025447.1)显示出98%的相同率,因此#11-1属于L.plantarum paraplantarum种。
但是,并不完全一致,因而本发明的#11-1是与上述菌株不同的乳酸菌株(亚种)。
将上述#11-1的生理学、化学分类学性质与基于伯杰氏系统细菌学手册(Bergey’sManual of Systematic Bacteriology,vol.3 1989)的分类及其他文献的记载内容对照,进而考虑上述16S rDNA分析的结果来进行判断的结果是,本发明的#11-1是属于乳杆菌(Lactobacillus)属的新型微生物。
与属于乳杆菌属的已知菌株等相比,#11-1显示出最高的天然免疫活化能力,将上述特征等包括在内进行综合研究的结果是,判断#11-1为分离出的新型微生物菌株。
#11-1在千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室、独立行政法人日本国家技术评估学会(Natural Institute of Technology and Evaluation;下文简称为“NITE”)的专利微生物保藏中心(NPMD)进行了日本国内保藏,是以保藏号:NITE P-02005(保藏日:2015年2月5日)进行了保藏的微生物。
关于#11-1,之后向千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室、独立行政法人日本国家技术评估学会(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)提交了原保藏申请书,进行了由日本国内保藏(原保藏日:2015年2月5日)转移为基于布达佩斯条约的保藏的转移请求((转移日(国际保藏日):2016年1月28日),其存活得到证明,向基于布达佩斯条约的保藏(国际保藏)的转移请求被受理,结果获得了保藏号“NITE BP-02005”。
关于细菌的一般性状,由于其作为菌株的性质容易发生变异,因而#11-1也可能不限于前面所示的生理学性状的范围内。另外,该“变异”当然包括天然变异和人工变异这两种情况。
下面对#11-1的培养方法进行记载。#11-1的培养方法按照对乳杆菌属的微生物进行的一般培养方法来进行即可。
培养优选在厌氧条件下进行。作为培养基中的碳源,例如可以使用D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙酰基葡糖胺、扁桃苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、蔗糖、D-海藻糖、龙胆二糖、糖蜜、水饴、油脂类等有机碳化合物,作为氮源,可以使用肉提取物、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、干燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、氨基酸、铵盐等有机/无机氮化合物。
另外,关于盐类,可以根据需要适当添加钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、磷酸盐、铁盐、铜盐、锌盐、钴盐等无机盐类。此外,从增加目标物的产生量的方面考虑,优选添加生物素、维生素B1、胱氨酸、油酸甲酯、猪油等生长促进物质。
另外,可以添加硅油、表面活性剂等消泡剂。作为制备好的培养基,优选使用例如MRS培养基、GAM培养基等。
关于培养条件,如上文所述,按照对乳杆菌属微生物进行的一般培养条件来进行即可。若为液体培养法,则优选静置培养。若为小规模培养,则可以使用利用带盖玻璃瓶的静置培养法。
培养温度优选保持在25℃~37℃之间,更优选在32℃~37℃进行。关于培养pH,优选在pH7附近进行。培养时间是根据所使用的培养基组成、培养温度等而变动的因素,在#11-1的情况下,在优选12~72小时、更优选24~48小时的情况下能够确保充分量的目标物。
还优选挑取培养得到的菌落,再次在培养基上进行单菌落形成。
<天然免疫活化剂>
本发明的新型乳酸菌“#11-1”作为该乳酸菌本身、另外作为该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌具有天然免疫活化能力。
即,本发明涉及一种具有天然免疫活化能力的乳酸菌,其是保藏号为NITE BP-02005的属于乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌或该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌。
天然免疫活化能力的测定通过实施例中具体记载的方法、即在Ishii K.,Hamamoto H.,Kamimura M.,Sekimizu K.,J.Biol.Chem.Jan.25;283(4):2185-91(2008)中也有详细记载的蚕的缓慢性肌收缩(緩行性筋収縮)来测定。
“#11-1或其经天然或人工变异而得到的乳酸菌”、“该乳酸菌的死菌”、“该乳酸菌的处理物”均具有天然免疫活化能力。
此处,作为“乳酸菌的处理物”,可以举出选自由乳酸菌的培养物、浓缩物、糊化物、干燥物、液化物、稀释物、破碎物、杀菌加工物以及来自培养物的提取物组成的组中的至少一种处理物。此处,作为“干燥物”,可以举出喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等。
本发明的另一方式为“一种天然免疫活化剂,其是以上述本发明的乳酸菌(#11-1或其经天然或人工变异而得到的乳酸菌)、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂,其特征在于,上述乳酸菌的处理物为选自由乳酸菌的培养物、浓缩物、糊化物、干燥物、液化物、稀释物、破碎物、杀菌加工物以及来自培养物的提取物组成的组中的至少一种处理物”。
本发明的天然免疫活化剂可以以各种状态含有上述本发明的乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物。例如可以举出悬浮液、乳酸菌体、培养上清液、包含培养基成分的状态等。
作为乳酸菌,可以适当使用活菌体、湿菌、干燥菌等。另外,也可以是实施了杀菌即加热杀菌处理、放射线杀菌处理、破碎处理等而得到的死菌。
作为本发明的天然免疫活化剂中的有效成分的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的处理物相对于天然免疫活化剂整体的含量没有特别限制,可以根据目的适当选择,在将天然免疫活化剂整体设为100质量份时,以“乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的处理物的总量”计,优选含有0.001质量份~100质量份、更优选含有0.01质量份~99质量份、特别优选含有0.1质量份~95质量份、进一步优选含有1质量份~90质量份。
另外,上述有效成分可以单独使用任意1种,也可以合用2种以上。在合用2种以上的情况下,对于上述天然免疫活化剂中的各有效成分的含有比也没有特别限制,可以根据目的适当选择。
本发明的天然免疫活化剂含有上述乳酸菌、上述乳酸菌的死菌或上述乳酸菌的处理物作为有效成分,但除了这些有效成分以外,还可以含有“其他成分”。
作为上述天然免疫活化剂中的上述“其他成分”,没有特别限制,可以在不损害本发明效果的范围内根据目的适当选择,例如可以举出药学上可接受的载体等。
作为该载体,没有特别限制,例如可以根据后述的剂型等适当选择。另外,作为天然免疫活化剂中的“其他成分”的含量,也没有特别限制,可以根据目的适当选择。
<感染症预防治疗剂>
上述本发明的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的处理物在具有天然免疫活化能力的同时,或者由于具有天然免疫活化能力,因而作为感染症预防治疗剂有用,特别是作为口服给药用的感染症预防治疗剂有用。
本发明人确认了,本发明的乳酸菌的肽聚糖的口服给药对于感染了绿脓杆菌的蚕发挥延长寿命的效果。需要说明的是,已经确认:感染了细菌等的蚕的抵抗性与人等哺乳类的抵抗性具有相关性(例如,专利文献2、3等)。
具体而言,确认了植物乳杆菌乳酸菌的肽聚糖对蚕赋予针对绿脓杆菌感染的抵抗性。
认为这是由于,蚕没有获得性免疫机制,无法对抗原产生抗体。因此,口服给药的植物乳杆菌的肽聚糖在肠内等将蚕的天然免疫机制活化,其结果,对感染控制起到了效果。
对于小鼠等具有获得性免疫机制的动物来说,已知口服给药细菌的肽聚糖时可被赋予免疫力。
但是,本发明中,在不具有获得性免疫机制而仅具有天然免疫机制的蚕中,乳酸菌的肽聚糖赋予了对于绿脓杆菌感染的抵抗性。认为肽聚糖将蚕的天然免疫机制活化,对感染产生了抵抗,这表明对于同样具有天然免疫机制的哺乳类等动物来说,含有本发明的乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物的天然免疫活化剂具有作为感染症预防治疗剂的效果。
含有植物乳杆菌、类植物乳杆菌等乳杆菌属的乳酸菌的肽聚糖作为有效成分的制剂对于人等哺乳类也作为感染症预防治疗剂有用。
因此,本发明的其他方式为一种感染症预防治疗剂,其特征在于,含有上述天然免疫活化剂作为有效成分;进而为一种感染症预防治疗剂,其特征在于,含有上述乳酸菌的肽聚糖作为有效成分。
<药品;饮食品;健康食品等>
本发明的乳酸菌及来源于该乳酸菌的本发明的天然免疫活化剂能够混配于药品、准药品、一般饮食品、健康食品、奶粉等具有标准的饮食品等中,可以不受它们的形态的限制而应用于各种药品、饮食品等中。
其中,采用使用上述本发明的乳酸菌进行发酵的工序而制造的饮食品、以及其中的发酵乳容易发挥出乳酸菌的通常的效果及本发明特有的上述效果,因而优选。
作为本发明的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂的剂型,没有特别限制,例如可以根据后述的期望的给药方法适当选择。
具体而言,例如可以举出口服固形剂(片剂、包覆片剂、颗粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂等)、口服液剂(内服液剂、糖浆剂、酏剂等)、注射剂(溶剂、混悬剂等)、软膏剂、贴剂、凝胶剂、乳膏剂、外用散剂、喷雾剂、吸入散布剂等。
作为上述口服固形剂,例如可以在上述有效成分中加入赋形剂,进一步根据需要加入粘结剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味/矫臭剂等添加剂,通过常规方法进行制造。
作为该赋形剂,例如可以举出乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素、硅酸等。
作为上述粘结剂,例如可以举出水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、虫胶、磷酸钙、聚乙烯基吡咯烷酮等。
作为该崩解剂,例如可以举出干燥淀粉、藻酸钠、琼脂粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、乳糖等。
作为该润滑剂,例如可以举出精制滑石、硬脂酸盐、硼砂、聚乙二醇等。
作为该着色剂,例如可以举出二氧化钛、氧化铁等。
作为该矫味/矫臭剂,例如可以举出白糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等。
作为上述口服液剂,例如可以在上述有效成分中加入矫味/矫臭剂、缓冲剂、稳定剂等添加剂,通过常规方法进行制造。
作为该矫味/矫臭剂,例如可以举出白糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等。作为上述缓冲剂,例如可以举出柠檬酸钠等。作为上述稳定剂,例如可以举出黄芪胶、阿拉伯胶、明胶等。
作为上述注射剂,例如可以在上述有效成分中添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、局部麻醉剂等,通过常规方法制造皮下用、肌肉内用、静脉内用等的注射剂。
作为该pH调节剂和该缓冲剂,例如可以举出柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠等。作为上述稳定剂,例如可以举出焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸、硫代乳酸等。作为上述等渗剂,例如可以举出氯化钠、葡萄糖等。作为上述局部麻醉剂,例如可以举出盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因等。
作为上述软膏剂,例如可以在上述有效成分中混配公知的基剂、稳定剂、湿润剂、防腐剂等,通过常规方法混合来进行制造。
作为该基剂,例如可以举出液体石蜡、白色凡士林、白蜂蜡、辛基十二烷醇、石蜡等。作为上述防腐剂,例如可以举出对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯等。
作为上述贴剂,例如可以将作为上述软膏剂的乳膏剂、凝胶剂、糊剂等通过常规方法涂布到公知的支撑体上来进行制造。作为上述支撑体,例如可以举出由棉、人造纤维、化学纤维构成的机织布、无纺布、软质氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯等的膜、发泡体片等。
本发明的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂例如可以适合用于需要活化天然免疫机制的个体、对于细菌等希望得到获得性免疫的个体等。
具体而言,例如可以通过对需要进行健康维持或疲劳恢复的个体;需要进行癌或生活习惯病的预防或治疗的个体;感染了细菌、真菌、病毒等的个体;等等进行给药来使用。
作为本发明的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂的给药对象动物,没有特别限制,例如可以举出:人;小鼠、大鼠等实验动物;猴;马;牛、猪、山羊、鸡等家畜;猫、狗等宠物;等等。
另外,作为上述天然免疫活化剂的给药方法,没有特别限制,例如可以根据上述剂型等适当选择,可以举出口服给药、腹腔内给药、向血液中注射、向肠内注入等。其中,从简便地发挥出上述效果的方面考虑,优选口服给药。
作为上述天然免疫活化剂或上述感染症预防治疗剂的给药量,没有特别限制,可以根据作为给药对象的个体的年龄、体重、所期望的效果的程度等来适当选择,例如,成人1天的给药量以有效成分的量计优选为1mg~30g、更优选为10mg~10g、特别优选为100mg~3g。
另外,作为给药时期,也没有特别限制,可以根据目的适当选择,例如,可以预防性地给药,也可以治疗性地给药。
含有本发明的上述乳酸菌、该乳酸菌的死菌或处理物、天然免疫活化剂、或者感染症预防治疗剂的饮食品(下文中有时简称为“本发明的饮食品”)中的乳酸菌、天然免疫活化剂或感染症预防治疗剂的含量没有特别限制,可以根据目的、饮食品的方式(种类)来适当选择,在将饮食品整体设为100质量份时,以上述的总量计优选含有0.001质量份~100质量份,更优选为0.01质量份~100质量份,特别优选为0.1质量份~100质量份的含量。
另外,可以单独使用上述中的任意1种,也可以合用2种以上。在合用2种以上的情况下,对于上述饮食品中的各物质的含量比没有特别限制,可以根据目的适当选择。
本发明的饮食品具有天然免疫活化能力和/或感染症预防治疗能力。
本发明的饮食品除了含有上述本发明的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂以外,还可以进一步含有“其他成分”。
作为上述“其他成分”,没有特别限制,可以在不损害本发明效果的范围内根据目的适当选择,例如可以举出各种食品原料等。另外,“其他成分”的含量没有特别限制,可以根据目的适当选择。
本发明的乳酸菌可以用于一般饮食品、健康食品、药剂、发酵饮食品、益生菌的生产等。作为发酵饮食品,特别适合于作为发酵乳、乳酸菌饮料、酸奶、酱菜、酱菜制造用乳酸菌发酵剂等的用途。
作为上述食品的种类,没有特别限制,可以根据目的适当选择,例如可以举出:果冻、糖果、巧克力、饼干、橡皮糖等点心类;绿茶、红茶、咖啡、软饮等嗜好饮料;发酵乳、酸奶、冰激凌、非乳脂冰激凌(lacto ice)等乳制品;蔬菜饮料、果实饮料、果酱类等蔬菜/果实加工品;汤等液体食品;面包类、面类等谷物加工品;各种调味料;等等。其中,优选酸奶、发酵乳等乳制品。
作为这些食品的制造方法,没有特别限制,例如可以根据通常的各种食品的制造方法适当地制造。
另外,上述食品例如可以以片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服固形剂或内服液剂、糖浆剂等口服液剂的形式来制造。上述口服固形剂、口服液剂的制造方法没有特别限制,可以根据目的适当选择,例如可以模仿上述药剂的口服固形剂、口服液剂的制造方法进行制造。
本发明的饮食品作为以活化天然免疫机制、赋予对感染症的抵抗力等为目的的功能性食品、健康食品等特别有用。
在将本发明的乳酸菌、其死菌或处理物等用于饮食品的制造的情况下,制造方法可以利用本领域技术人员公知的方法来进行。本领域技术人员可以将使本发明的乳酸菌的(死)菌体或处理物与其他成分混合的工序、成形工序、杀菌工序、发酵工序、烧制工序、干燥工序、冷却工序、造粒工序、包装工序等适当组合来制作目标饮食品。
另外,在将本发明的乳酸菌用于各种发酵乳的制造的情况下,可以使用本领域技术人员公知的方法进行制造。例如可以举出采用在发酵乳中以死菌形式添加需要量的本发明的乳酸菌的工序而制造的饮食品、采用使用本发明的乳酸菌作为乳酸菌发酵剂进行发酵的工序而制造的饮食品。
在使用本发明的乳酸菌作为乳酸菌发酵剂进行发酵的情况下,可以利用与本发明的乳酸菌的培养条件同样的条件等来进行。
实施例
下面,基于实施例和研究例更详细地说明本发明,但本发明并不限定于下述实施例等的具体范围。
<材料>
<<培养基和培养条件>>
GAM培养基、MRS琼脂培养基分别由Nissui公司、BD(Becton Dickinson)公司获得,必要时添加了碳酸钙(CaCO3)。
厌氧培养中使用了AnaeroPak(注册商标)(Mitsubishi gas chemicals公司制造)。
<<乳酸菌的分离>>
使用米糠酱菜作为发酵食品。将悬浮于生理盐水(0.9质量%的NaCl)中而成的液体涂布至MRS培养基上,在37℃下进行2天厌氧培养。
挑取菌落,在CaCO3-MRS培养基上进行单菌落形成。
从其中利用后述的方法测定天然免疫活化能力,得到天然免疫活化能力优异的乳酸菌株(#11-1)。分离出乳酸菌株(#11-1)。
通过CaCO3-MRS培养基上的白色菌落形成和透明带的形成确认了乳酸发酵,确认#11-1为乳酸菌。另外,对菌落进行革兰氏染色,确认了#11-1的革兰氏阳性。
<<乳酸菌的鉴定>>
通过使用PCR酶KOD FX Neo(Toyobo)、引物9F、1541R的菌落PCR,获得了16S rDNA片段。
通过利用BigDye(注册商标)Terminator v3.1循环测序试剂盒、ABI PRISM(注册商标)3100遗传分析仪的直接测序,确定了序列。
序列信息使用NCBI BLASTN 2.2.27+(8)由16S核糖体RNA序列数据库(细菌和古细菌(Bacteria and Archaea),7545序列)进行分析。
将#11-1的16S rDNA区域的碱基序列示于序列表的序列号1。
确定16S rDNA的碱基序列,通过BLAST分析对同源性进行了检索,结果表明,与图1和图2所示的乳酸菌的同源性高。
如图1和图2所示,该碱基序列与类植物乳杆菌DSM10667株(碱基序列:NR_025447.1)近缘,但不完全一致,因而可知是新型的“类植物乳杆菌”。
<<保藏>>
如上所述,实施例中使用的本发明的“#11-1”是从米糠酱菜中分离出的,其作为属于乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌#11-1被保藏在作为基于专利法实施规则的保藏机构、并且作为基于与专利手续上的微生物保藏的国际认可有关的布达佩斯条约的国际保藏当局得到认可的独立行政法人日本国家技术评估学会专利微生物保藏中心(NPMD)(千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)(保藏号:NITE P-02005、保藏日2015年2月5日)。
关于#11-1,之后向千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室、独立行政法人日本国家技术评估学会(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)提交了原保藏申请书,进行了由日本国内保藏(原保藏日:2015年2月5日)转移为基于布达佩斯条约的保藏的转移请求((转移日(国际保藏日):2016年1月28日),其存活得到证明,向基于布达佩斯条约的保藏(国际保藏)的转移请求被受理,结果获得了保藏号“NITE BP-02005”。
实施例1
<天然免疫活化能力的测定>
将在MRS培养基中培养了一夜的类植物乳杆菌#11-1(L.paraplantarum#11-1)株在121℃下灭菌处理20分钟后,将50μL注射至5龄蚕的断头肌肉标本中,通过缓慢性肌收缩测定天然免疫活化能力。
基于缓慢性肌收缩的天然免疫活化能力的测定按照Ishii K.,Hamamoto H.,Kamimura M.,Sekimizu K.,J.Biol.Chem.Jan.25;283(4):2185-91(2008)中记载的方法来进行。
即,将测定物质的浓度的分成多个阶段而得到的试样0.05mL分别向5龄蚕的断头肌肉标本中进行血液内给药,在收缩的长度达到最大时(约10分钟后)分别测定体长。
从注射前的体长减去注射后的体长,用其值除以注射前的体长,将所得到的值作为“C值(收缩值,Contraction Value)”,将C值=0.15定义为1U(unit(单位))。
用0.9%生理盐水将试样连续稀释成1/1、1/4、1/16、1/64、1/256,用所得到的液体分别测定C值,将横轴作为测定物质的浓度、纵轴作为C值进行作图,由所得到的图求出提供1U(C值=0.15)的“测定物质对蚕的给药质量(mg)”,求出每单位质量(mg)显示出几个U(单位),对测定物质的天然免疫活化能力的大小进行了评价。
另外,将生理盐水0.05mL作为阴性对照(允许C值为0.05以下),将空气0.2mL作为阳性对照(允许C值限制在0.2~0.4内的情况),同时进行测定。
比较例1~3
在实施例1中,代替类植物乳杆菌#11-1(L.paraplantarum#11-1)株,使用了表1所示的革兰氏阳性细菌#4、#11-2和A,除此以外,与实施例1同样地通过蚕的肌收缩测定了天然免疫活化能力。
将实施例1和比较例1~3的来源、性状示于下述表1。另外,作为参考,将近缘菌株的名称和“测定菌株与该菌株的同源性测定结果”一并示于表1。
将天然免疫活化能力的测定结果示于下述表2。
[表1]
[表2]
对本发明的乳酸菌的天然免疫活化能力进行了测定,结果如表2所示,实施例1的类植物乳杆菌#11-1的天然免疫活化能力极高,为165U/mg。
另外,由表2中的实施例1与比较例1、2的“天然免疫活化能力(U/mg)”的测定结果的比较也可知,与从米糠酱菜得到的其他菌株相比,本发明的类植物乳杆菌#11-1显示出极高的天然免疫活化能力。
另外,作为所谓“植物性乳酸菌”而为人所知的柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)KM20的天然免疫活化能力为43U/mg,低于本发明的类植物乳杆菌#11-1(比较例3)。
比较例4
在实施例1中,代替类植物乳杆菌#11-1(L.paraplantarum#11-1)株,使用了保加利亚乳杆菌OLL1073株,除此以外,与实施例1同样地通过蚕的肌收缩测定了天然免疫活化能力。
比较例5
在实施例1中,代替类植物乳杆菌#11-1(L.paraplantarum#11-1)株,使用了干酪乳杆菌YIT9029株,除此以外,与实施例1同样地通过蚕的肌收缩测定了天然免疫活化能力。
比较例6
在实施例1中,代替类植物乳杆菌#11-1(L.paraplantarum#11-1)株,使用了乳酸乳球菌JCM5805株,除此以外,与实施例1同样地通过蚕的肌收缩测定了天然免疫活化能力。
将比较例4~6的结果示于表3。
[表3]
比较例4~6的乳酸菌是实际在市售的发酵乳的制造中使用的乳酸菌。
如表3所示,可知实施例1的本发明的乳酸菌#11-1与比较例4~6的乳酸菌相比具有更高的天然免疫活化能力。
在将本发明的类植物乳杆菌#11-1的灭菌处理物作为测定物质时,天然免疫活化能力极高,因此,本发明的乳酸菌、本发明的乳酸菌的死菌、或本发明的乳酸菌的处理物(培养物;浓缩物;糊化物;喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等干燥物;液化物;稀释物;破碎物;杀菌加工物;来自培养物的提取物;等等)作为天然免疫活化剂是优异的。
另外,类植物乳杆菌作为属、种已确认了作为发酵食品的安全性。
利用本发明的类植物乳杆菌#11-1使乳发酵而得到的饮食品具有天然免疫活化能力。
实施例2
<对于细菌感染的效果实验>
按照常规方法从获得自独立行政法人理化学研究所的属于植物乳杆菌的“Lactobacillus plantarum subsp.plantarum JCM 1057”(以下,在图3中也简称为“植物乳杆菌PGN”)制备肽聚糖组分,将其以2.7质量%混合至蚕的人工饲料中,连续供给2天。注射前以总量计供给了0.041g。
之后,如下考察了植物乳杆菌乳酸菌的肽聚糖对于绿脓杆菌感染的效果。
将绿脓杆菌(PAO1)在30℃下培养整晚。将其菌液用生理盐水稀释1000倍,将该稀释液50μL注射至蚕的体液中。
注射后,中止向蚕供给肽聚糖的食饵,在27℃下进行饲养,经时地计测存活数(存活比例)。
如图3所示,可知食用了植物乳杆菌的肽聚糖组分的蚕与未食用的蚕相比,绿脓杆菌感染后的存活时间延长。
可知,通过植物乳杆菌的肽聚糖组分,赋予了蚕对于绿脓杆菌感染的抵抗性。
认为该结果是由于,口服给药的植物乳杆菌的肽聚糖在肠内将蚕的天然免疫活化,结果对感染控制显示出效果。
可知,含有乳酸菌植物乳杆菌的肽聚糖作为有效成分的制剂对于人等哺乳类也作为感染症预防治疗剂有用。
另外,植物乳杆菌已确认了作为发酵食品的安全性。因此,含有乳酸菌植物乳杆菌的肽聚糖作为有效成分的感染症预防治疗剂作为人等哺乳类的饮食品有用。
实施例3
<天然免疫活化剂和感染症预防治疗剂的制造>
<<片剂>>
将培养后的#11-1在121℃下灭菌处理20分钟后,进行浓缩。将该浓缩后的#11-1的培养液20.0mg、乳糖40mg、淀粉20mg以及低取代度羟丙基纤维素5mg均匀混合后,以羟丙基甲基纤维素8质量%水溶液作为粘结剂,利用湿式造粒法制造压片用颗粒。向其中加入提供润滑性所需要的硬脂酸镁0.5mg~1mg后,使用压片机进行压片,制成片剂。
<<液剂>>
将上述浓缩后的#11-1的培养液10.0mg溶解在2质量%的2-羟丙基-β-环糊精水溶液10mL中,制成注射用液剂。
工业实用性
本发明的新型乳酸菌及其处理物具有高的天然免疫活化能力,进而还具有感染症预防治疗效果。因此,能够提供含有利用了本发明的乳酸菌的活化天然免疫的天然免疫活化剂或感染症预防治疗剂的药剂或饮食品,能够在药品业界、食品业界等中广泛使用。
本申请基于2015年2月6日提交的日本专利申请特愿2015-022567,将该申请的全部内容引用至此,作为本发明说明书的公开内容并入本文中。
保藏号
NITE BP-02005
序列表自由文本
序列号1是与属于乳杆菌(Lactobacillus)属的未知菌株的16S rDNA的大致全长相当的碱基序列。
序列表
<110> 株式公司染色体创药研究所(Genome Pharmaceuticals Institute Co.,Ltd.)
株式公司安添纳(Antenna Co., Ltd.)
国立大学法人东京大学(The University of Tokyo)
<120> 乳酸菌、来源于该乳酸菌的天然免疫活化剂、感染症预防治疗剂和饮食品(Lactic acid bacterium, innate immunity activator derived
therefrom, agent for preventing or treating infection, and food anddrink)
<130> PF-061059-WO
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1480
<212> DNA
<213> 类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1473)..(1473)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
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Claims (10)

1.一种乳酸菌,其属于乳杆菌(Lactobacillus)属,其在独立行政法人日本国家技术评估学会(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)的保藏号为NITE BP-02005。
2.一种乳酸菌,其为权利要求1所述的乳酸菌或者该乳酸菌经天然或人工变异而得到的乳酸菌,其具有天然免疫活化能力。
3.如权利要求1或权利要求2所述的乳酸菌,其具有序列表的序列号1所表示的16SrDNA区域的碱基序列。
4.一种天然免疫活化剂,其是以权利要求1至权利要求3中任一项权利要求所述的乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂,其特征在于,
所述乳酸菌的处理物为选自由乳酸菌的培养物、浓缩物、糊化物、干燥物、液化物、稀释物、破碎物、杀菌加工物以及来自该培养物的提取物组成的组中的至少一种处理物。
5.一种感染症预防治疗剂,其特征在于,含有权利要求1至权利要求3中任一项权利要求所述的乳酸菌的肽聚糖作为有效成分。
6.一种感染症预防治疗剂,其特征在于,含有权利要求4所述的天然免疫活化剂作为有效成分。
7.一种饮食品,其含有权利要求1至权利要求3中任一项权利要求所述的乳酸菌。
8.一种饮食品,其含有权利要求4所述的天然免疫活化剂。
9.一种饮食品,其含有权利要求5或权利要求6所述的感染症预防治疗剂。
10.一种饮食品,其是采用使用权利要求1至权利要求3中任一项权利要求所述的乳酸菌进行发酵的工序而制造的。
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