WO2012173163A1 - 菌体破砕物及びその配合物 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a microbial cell crushed material that enhances an infection control effect and a growth promotion effect, and a composition thereof.
  • Stress is the biggest cause of innate immunity. Suppresses innate immunity even under physical or mental stress. Stress suppresses macrophages, which are central cells of innate immunity. The cause is not clear, but one mechanism is that glucocorticoids, prostaglandins, catecholamines, and the like induced by stress suppress macrophage activation. Stress is thought to cause many illnesses, but since it is difficult to reduce stress in modern society, measures to avoid this are required.
  • probiotics are provided as viable bacteria contained in yogurt and supplements. Examples of the bacterial species include Escherichia coli, lactic acid bacteria, and Bacillus bacteria (Non-patent Document 2).
  • Non- Patent Document 2 the action to activate immunity was thought to be ingested as a living bacterium, and then required to grow in the intestine, and was considered to be ineffective or extremely low in dead bacteria.
  • Non-patent Document 3 killed lactic acid bacteria are now widely used in Japan as food materials that activate immunity.
  • the bacterial cell component activates immunity, it is said that the same effect is exhibited in both live and dead bacteria.
  • Substances that activate macrophages (and innate immunity) with cell-derived components include lipopolysaccharide, lipoteichoic acid, lipoarabinomannan, peptidoglycan, flagenin, lipoprotein, muramyl dipeptide, proteoglycan, unmethylated cytosine / guanine sequence
  • genes including ⁇ -glucan include Toll-like receptors (TLR) and NOD-like receptors possessed by innate immune cells such as macrophages, neutrophils, dendritic cells, natural killer cells, B-1 cells, and mucosal epithelial cells.
  • TLR Toll-like receptors
  • NOD-like receptors possessed by innate immune cells such as macrophages, neutrophils, dendritic cells, natural killer cells, B-1 cells, and mucosal epithelial cells.
  • Non-patent Document 5 Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor: NLR), C-type lectin receptor (CLR) and the like.
  • NLR nucleotide binding oligomerization domain-like receptor
  • CLR C-type lectin receptor
  • Non-patent Document 5 the innate immune system cells that have taken them in are activated.
  • these recognitions are taken up into the cell and recognized by vesicles (endosomes, phagosomes) and protein complexes (such as inflammasomes). That is, these bacterial cell components are considered to be useful as innate immunity activators, but have been shown to actually have infection control effects, growth promotion effects, and the like (Patent Documents 1 and 2).
  • lipopolysaccharide lipoteichoic acid, lipoarabinomannan, peptidoglycan, flagenin, lipoprotein, muramyl dipeptide, proteoglycan, genes containing unmethylated cytosine / guanine sequences, etc. are purified from cells or prepared by synthesis Yes, but the cost is very high.
  • the above ingredients are sold for tens of thousands of yen per 1 mg. Therefore, practical application as preventive foods and health maintenance supplements is difficult in terms of cost.
  • live cells and dead cells can be produced at a much lower cost than purified products of cell components.
  • the amount of cells actually used is large. For example, a large amount of 150 mg / kg body weight (approximately 1 g per person: 1 trillion cell) per liter of dry lactic acid bacteria is used (Non-patent Document 6). Therefore, if the effect of live cells and dead cells can be enhanced at a low cost, a significant cost reduction can be achieved.
  • Patent Document 3 The effect is equivalent to 1/5 by crushing Bacillus subtilis (Gram positive bacteria) and Brevibacterium lactofermentum (Gram positive bacteria), but Streptococcus thermophilus (Gram It is about half the effect on positive bacteria), Lactobacillus acidophilus (gram-positive bacteria), and Streptomyces tanasiensis (gram-positive bacteria). All of the above are Gram-positive bacteria, but this report shows that cells and disrupted cells achieve a higher effect than LPS alone in Escherichia coli (Gram-negative bacteria). It is limited to some Gram-positive bacteria that the crushed material is more effective than the cells.
  • Gram-positive bacteria can be divided into Gram-positive and Gram-negative bacteria according to the difference in Gram staining, but this difference in staining is due to the difference in the thickness of the cell wall (peptidoglycan layer).
  • Gram-positive bacteria have a thick cell wall (peptidoglycan layer) and gram-positive bacteria are thin. Therefore, Gram-positive bacteria are inhibited by the thick cell wall in the process of Gram staining, and the dye remains.
  • Gram-negative bacteria have a thin peptidoglycan layer and are decolorized, and thus are not Gram-stained (Non-patent Document 7).
  • the peptidoglycan of Gram-positive bacteria is 90% of the dry weight, far more than 10% of Gram-negative bacteria (Non-patent Document 8).
  • Peptidoglycan on the bacterial cell wall is a very large macromolecular substance composed of peptide and sugar, and is a strong substance that retains cell morphology and strength (Non-patent Document 8).
  • Peptidoglycan extracted from cells and muramyl dipeptide obtained by degrading peptidoglycan activate innate immune system cells via dectin 1 receptor on the cell surface of immune system cells, NOD-1, NOD-2, TLR2, etc.
  • Gram-negative bacteria have an extracellular membrane that is not found in Gram-positive bacteria, and there are lipopolysaccharides (LPS).
  • LPS lipopolysaccharides
  • Lipopolysaccharide has a structure in which a sugar chain composed of a plurality of types of sugars is bound to a lipid called lipid A.
  • the sugar chain part is composed of a part called a core polysaccharide and a part called an O antigen.
  • the lipid A portion of lipopolysaccharide penetrates into the lipid layer of the extracellular membrane.
  • the biological activity of lipopolysaccharide activates cells via Toll-like receptor 4 (TLR4), MD-2, and CD14 on the cell surface of immune cells (Non-patent Documents 9 and 10).
  • TLR4 Toll-like receptor 4
  • MD-2 MD-2
  • CD14 cell surface of immune cells
  • the main immune activator of Gram-positive bacteria is peptidoglycan, but not only Gram-positive bacteria but also Gram-negative bacteria exist.
  • peptidoglycan has a significantly lower ability to immunoreact than LPS. From this, it is considered that gram-negative bacteria have a much higher immunostimulatory effect than gram-positive bacteria. Therefore, if a method for amplifying the effect of gram-negative bacterial cells at low cost can be established, it is possible to produce an immunostimulatory material that is much more efficient than gram-positive bacteria.
  • the present invention provides an innate immunity activation substance derived from gram-negative bacterial cells having an infection control effect and a growth promoting effect, a low-cost and practically microbial crushed material, a composition thereof, and The purpose is to provide medicinal products.
  • the disrupted bacterial cell of the present invention is obtained by culturing Gram-negative bacteria and physically disrupting the bacterial cells of the Gram-negative bacteria, including all components including immunostimulatory components of the bacterial cells, It contains LPS having a molecular weight of 20000 or less as an active ingredient.
  • the Gram-negative bacterium is Escherichia coli, Serratia bacterium, Aeromonas bacterium, Ranella bacterium, Enterobacter bacterium, Xanthomonas bacterium, Zymomonas bacterium, Pantoea bacterium, or Acetic acid bacterium.
  • the crushed cell product of the present invention is a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic, food, functional food, bath preparation, feed, pet food or animal product in which the crushed cell product is blended. It is a pharmaceutical product.
  • the crushed cell mixture of the present invention is characterized in that it is a fertilizer, compost or a botanical drug containing the crushed cell.
  • the formulation is intended for growth promotion, immune activation, lifestyle-related diseases, cancer or allergic disease prevention, infection control, or stress resistance.
  • the formulation is intended for growth promotion, immune activation, infection control, or stress resistance.
  • the microbial cell disruption exhibiting the ability to induce nitric oxide production is used to control infection of health foods, pharmaceuticals, skin care products, bath salts, crustaceans and shellfish, fish, poultry, livestock animals, pets, etc. It is effective as a feed and growth promoting feed additive. Further, the shapes used for these feed additives can be effectively used as liquids, solid feeds, pastes, pet supplements, and the like.
  • ⁇ ⁇ ⁇ Gram-negative bacteria may be separated from the culture after culturing with normal nutrients.
  • the type of bacteria is not particularly limited as long as it is a Gram-negative bacterium and contains LPS.
  • Escherichia coli, Salmonella, Aeromonas, Acinetobacter, Proteus, Serratia, Bordetella pertussis, Yersinia, Neisseria and the like may be used.
  • Gram-negative bacteria used in food such as acetic acid bacteria, Xanthomonas bacteria, Zymomonas bacteria, Pantoea bacteria, Enterobacter bacteria, and the like are desirable in terms of eating experience.
  • the major molecular weight of LPS of Gram-negative bacteria with these dietary experiences is 20000 or less.
  • the bacterial cells are either crushed as they are or after heat sterilization.
  • the crushing treatment is desirably performed non-enzymatically at a low temperature.
  • the disruption of cells can be confirmed under a microscope, and the number of disrupted bacteria is 90% or more, preferably almost 100%.
  • high pressure is used for crushing, it is desirable to crush under cooling, and cooling is preferably 20 ° C or lower, more preferably 4 ° C or lower.
  • a method in which bacteria are frozen for disruption is preferable in terms of cooling. When crushing at high pressure, 400 psi or higher is recommended.
  • Priming action (action induced by primary stimulating substance) is possible as a method for evaluating innate immunity activation.
  • a priming action is defined as an action that does not induce a clear action by itself, but significantly amplifies the action induced by the subsequent stimulation of the process (secondary stimulation).
  • the action induced in this case can be seen as various biological responses. For example, tumor necrosis factor (TNF) induction, interleukin (IL) -1 ⁇ induction, IL-1 ⁇ induction, nitric oxide induction, active oxygen induction, cancer cell cytotoxicity, and the like.
  • the state induced by the priming action is the priming stage (state). In this state, stress resistance, infection control action, cancer metastasis suppression action, etc. are obtained (Non-patent Document 1).
  • interferon ⁇ when interferon ⁇ was administered to mice as a primary stimulus, lipopolysaccharide was administered as a secondary stimulus 3 hours later, and the amount of tumor necrosis factor in the serum 1 hour later was measured, the presence of the primary stimulus was tripled. The concentration of tumor necrosis factor increases about 10 times. In this case, with primary stimulation alone, the amount of tumor necrosis factor in the serum is in a range that can be detected in a healthy state. In this case, interferon ⁇ is called a primary stimulator (primer), and lipopolysaccharide is called a secondary stimulator (trigger). The biological response becomes a tumor necrosis factor induced in the blood by trigger administration.
  • primary stimulator primary stimulator
  • trigger a secondary stimulator
  • macrophages which are mainly cells of innate immunity can be used. Macrophages are cells that are distributed throughout the body. Macrophages have a function to identify and eliminate foreign substances, but because they have the ability to adapt to the environment and change their personality, the characteristics of macrophages vary depending on the tissues present, but all macrophages have a function to eliminate foreign substances Therefore, tissue isolated cells and cell lines such as brain microglia, lung alveolar macrophages, liver Kupffer cells, skin Langerhans cells, peritoneal macrophages, blood-derived monocytes, and bone marrow cells can be used.
  • tissue isolated cells and cell lines such as brain microglia, lung alveolar macrophages, liver Kupffer cells, skin Langerhans cells, peritoneal macrophages, blood-derived monocytes, and bone marrow cells can be used.
  • primers such as interferon gamma to macrophage cell lines (RAW246.7, J774.1, THP-1, NR8383), peritoneal macrophages, peripheral blood monocytes, macrophages differentiated from bone marrow cells, etc.
  • OK-432 Piereptococcus preparation, Chugai Pharmaceutical
  • LPS dead lactic acid bacteria, etc.
  • the priming action can be evaluated by measuring TNF, IL-1 ⁇ , active oxygen, nitric oxide and the like induced in the culture supernatant.
  • RNA can also be evaluated by quantitatively measuring the amount of transcriptional RNA produced by tumor necrosis factor, IL-1 ⁇ , and inducible nitric oxide synthase induced in macrophage cells.
  • prime by using this ability to prime (priming activity) as an indicator, components of Gram-positive and Gram-negative bacteria such as lipopolysaccharide, lipoteichoic acid or lipoarabinomannan, peptidoglycan, flagenin, lipoprotein, muramyl dipeptide, proteoglycan, Even if a substance containing an unmethylated cytosine / guanine sequence is mixed, the priming action can be evaluated as an index of the ability to activate innate immunity.
  • Gram-negative bacteria include Escherichia coli, Pantoea agglomerans, Serratia ficaria, Aeromonas hydrophila, Rahnella aquatilis, Enterobacter cloacae (Enterobacter cloacae), Xanthomonas Xanthomonas campestris) and Zymomonas mobilis are spread on an agar medium for normal bacterial culture and cultured at 37 ° C.
  • the agar medium for example, standard agar medium, brain heart infusion agar medium, or the like can be used.
  • a normal liquid medium such as Tryptosoya broth or Nutrient broth (Becton Dickinson) can be used in a suitable culture flask such as a 3 liter Sakaguchi flask. Shaking culture was performed overnight at 37 ° C. After culturing, the cells were collected by centrifugation (2000 g, 10 minutes) to recover each cell.
  • a sample of E. coli was prepared. 1 g of each bacterial cell was dispersed in 10 ml of phosphate buffered saline (PBS) (viable cell dispersion).
  • PBS phosphate buffered saline
  • Patent Document 3 a suspension of cultured bacteria (viable bacteria) is collected after heating (column 5, lines 20 to 22, this cell treatment method is called “conventional”). It is considered that some components of the microbial cells are lost by collecting the cells after heating.
  • the present invention provides a crushed microbial cell containing all components including the immunizing component of the microbial cell while crushing the microbial cell.
  • the heated bacterial cells were cooled to 4 ° C and crushed with a high-pressure cell disrupter (2000 psi) (high-pressure disrupted cells). The degree of crushing was observed under a biological microscope at a magnification of 1000 times, and it was confirmed that almost no bacteria remained (95% or more crushing).
  • Pantoea A sample of Pantoea was prepared. 1 g of each bacterial cell was dispersed in 10 ml of phosphate buffered saline (PBS) (viable cell dispersion). -After the live bacterial dispersion was heated at 100 ° C for 10 minutes, the precipitate was collected with a centrifuge and resuspended in PBS to prepare non-heated dead cells (conventional heated dead cells). ⁇ Add formalin to the viable bacterial dispersion to 0.5%, store at room temperature for 1 hour and sterilize, collect the precipitate with a centrifuge, remove formalin, resuspend in PBS, Heated dead bacteria were prepared (non-heated dead cells).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the heated cells were cooled to 4 ° C and crushed with a high-pressure cell crusher (2000 to 20000 psi) (high-pressure crushed cells). The degree of crushing was observed under a biological microscope at a magnification of 1000 times, and it was confirmed that almost no bacteria remained (95% or more crushing).
  • a high-pressure cell crusher 2000 to 20000 psi
  • the degree of crushing was observed under a biological microscope at a magnification of 1000 times, and it was confirmed that almost no bacteria remained (95% or more crushing).
  • the heated cell as it was was disrupted by homogenate (polytron homogenizer) treatment homogenate disrupted cell).
  • Each treated microbial cell was confirmed to be free of growing bacteria (dead) using an agar medium.
  • dead bacteria refers to those that are dead, but in which the structure and form of the bacterial cells (for example, spheres for cocci, columnars for rods) are basically maintained, Bacteria destroyed by the present invention refers to those in a state where the form of the cells is not maintained. LPS was purified by extraction and purification based on the conventional method (1992CPB-I).
  • Serratia, Eromonas, Ranella, Enterobacter, Xanthomonas, and Zymomonas produced the following samples. 1 g of each bacterial cell was dispersed in 10 ml of phosphate buffered saline (PBS) (viable cell dispersion). -After the live bacterial dispersion was heated at 100 ° C for 10 minutes, the precipitate was collected with a centrifuge and resuspended in PBS to prepare non-heated dead cells (conventional heated dead cells).
  • PBS phosphate buffered saline
  • Acetic acid bacteria (Acetobacter aceti, Gluconobacter cerinus) are spread on normal acetic acid bacteria selection medium, such as agricultural modified agar medium (2% glucose, 1% glycerol, 2% ethanol, 1.5% yeast extract, 1% polypeptone, agar) Incubate at 30 ° C. One colony that has emerged can be picked up, and an agricultural modified agar medium or a nutrient broth can be used in an appropriate culture flask such as a 3 liter Sakaguchi flask. The shaking culture was performed at 30 ° C. for 3 days. After culturing, the cells were precipitated by centrifugation (2000 g, 10 minutes) to recover the acetic acid bacteria.
  • agricultural modified agar medium 2% glucose, 1% glycerol, 2% ethanol, 1.5% yeast extract, 1% polypeptone, agar
  • an agricultural modified agar medium or a nutrient broth can be used in an appropriate culture flask such as
  • the number of bacteria was measured with a hemocytometer or the like. Disperse 1 g of acetic acid bacteria in 10 ml of phosphate buffered saline (PBS) (cell dispersion), heat at 120 ° C for 20 minutes in an autoclave, homogenate, 30 minutes ultrasonic, high pressure cell disrupter (15000 psi ) Were each crushed. 9 ml of PBS was added to the high-pressure cell disruption-treated cells. In addition, add 0.1% phenol or 0.5% formalin to the cell dispersion, sterilize by storing at room temperature for 1 hour, collect the precipitate with a centrifuge, and remove phenol or formalin.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the suspension was resuspended in PBS to prepare non-heated acetic acid bacteria.
  • the precipitate is collected by a centrifugal separator to prepare dead acetic acid bacteria dispersed in water. Processed. It was confirmed that each treated acetic acid bacterium was dead using the agricultural university modified agar medium.
  • acetic acid bacteria 1 g is dispersed in 10 ml of phosphate buffered saline (PBS), heated at 100 ° C. for 10 minutes, and then the heated cells are cooled to 4 ° C. to obtain a high-pressure cell disrupter (20,000 psi). (High pressure crushed cells). The degree of crushing was observed under a biological microscope, and it was confirmed that almost no bacteria remained (95% or more crushing). The bacterial cells were confirmed to be free from growing bacteria (dead) using an agrarian modified agar medium.
  • PBS phosphate buffered saline
  • E. coli and macrophage cell activation experiment evaluation of nitric oxide production ability Macrophage activation ability by various treatments of E. coli and pantoea cells was evaluated by nitric oxide production ability.
  • macrophages are stimulated by lipopolysaccharide, lipoteichoic acid, lipoarabinomannan, peptidoglycan, flagenin, lipoprotein, muramyl dipeptide, proteoglycan, genes containing unmethylated cytosine / guanine sequences, etc., nitric oxide synthesis in macrophages The enzyme is induced and as a result produces nitric oxide.
  • Nitric oxide is a kind of activated gas, and acts as an effective molecule for removing foreign substances from activated macrophages because it exhibits damaging activity against bacteria, viruses, cancer cells, and the like. Since the nitric oxide is unstable and mutates to nitrous acid, the nitrous acid was measured.
  • E. coli conventional heat-killed cells, homogenate disrupted cells, ultrasonic disrupted cells, and high-pressure disrupted cells are 20 ng / ml, 200 ng / ml, 2 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml. It prepared so that it might become.
  • RAW246.7 cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum in a carbon dioxide incubator. The culture was started at an initial concentration of 50,000 cells / ml, and when it was grown to about 2 million cells / ml, the initial concentration was adjusted again and the culture was subcultured.
  • Macrophage activation ability was determined by measuring the concentration of nitrous acid, a nitric oxide metabolite induced in this test, with Gries reagent. When the amount of nitrous acid in the culture supernatant after 10 hours of stimulation of macrophages (RAW246.7 cells) at a concentration of 1 ⁇ g / ml is 10 ⁇ M, the macrophage activation capacity of the substance is 1 unit. / ml). To determine the macrophage activation ability of any sample, obtain the nitrite concentration induced by a diluted arbitrary sample, plot the sample concentration (logarithm) and nitrite concentration on a semi-logarithmic graph, and estimate the sample concentration that induces 10 ⁇ M nitrite To do.
  • Table 1 shows the produced nitrite concentration at each concentration of each treated E. coli sample.
  • the culture supernatant of unstimulated RAW246.7 cells had a nitrite detection limit of 2.8-3.1 ⁇ M.
  • E. coli killed by the conventional method 500 ng / 2 units, but the homogenate disrupted cells were 16ng / ml (62.5unit), the ultrasonic disrupted cells were 58ng / ml (17.2 units), and high-pressure crushed cells were 200 ng / ml (5 units). That is, it is clear from this result that the macrophage activating ability is 2.5 to 31 times more effective by treatment even if they are derived from the same Escherichia coli cells.
  • Pantoea bacteria conventional heated dead cells, non-heated dead cells, conventional pretreated high pressure disrupted cells, conventional pretreated homogenate treated cells, high pressure disrupted cells (20000 psi), homogenate disrupted
  • the cells were prepared and diluted so that the cell weight was 2 ng / ml, 20 ng / ml, 200 ng / ml, 2 ⁇ g / ml, and 20 ⁇ g / ml, respectively.
  • RAW246.7 cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum in a carbon dioxide incubator.
  • the culture was started at an initial concentration of 50,000 cells / ml, and when it was grown to about 2 million cells / ml, the initial concentration was adjusted again and the culture was subcultured.
  • put RAW cells in 50,000 cells / 0.1ml / well (96-well culture plate) put 0.1ml each of the prepared samples in wells, and make final concentrations of 1ng / ml, 10ng / ml, 100ng / ml, 1 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml were cultured for 24 hours, and the culture supernatant was collected.
  • nitrite in the culture supernatant of unstimulated RAW246.7 cells was made to have a nitrite production amount of 0 ⁇ M, and the produced nitrous acid concentration at each concentration of each treated Pantoea sample was shown in Table 2.
  • the cell concentration at which each sample induces 10 ⁇ M nitrous acid was plotted on a semilogarithmic graph, and the number of units of each sample was determined and shown in Table 2.
  • the most effective high-pressure cell disruption treatment of Pantoea was performed at a disruption pressure of 2000 psi, 5000 psi, 10000 psi, 20000 psi, and the nitric oxide production ability from RAW246.7 cells was evaluated in the same manner as in the above example.
  • Relative ratios were determined based on conventional heat-killed cells and are summarized in Table 4. Based on conventional heat-killed cells, the pressure of high-pressure crushing was 2000-20000 psi, and the capacity improvement was 8.5 to 21.2 times. However, the effect on pressure was small, and all of this range could be used. .
  • E. coli, Serratia, Eromonas, Ranella, Enterobacter, Xanthomonas, Zymomonas, and Acetic acid bacteria were evaluated as gram-negative bacteria other than Pantoea. .
  • the Escherichia coli, Serratia fungus, Aeromonas fungus, Ranella fungus, Enterobacter fungus, Xanthomonas fungus, Zymomonas fungus and acetic acid fungus prepared in Example 1 were prepared respectively for the conventional heat-killed fungus and the high-pressure disrupted fungus. For each sample, the cell weight was adjusted to 2 ng / ml, 20 ng / ml, 200 ng / ml, and 2 ⁇ g / ml.
  • RAW246.7 cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum in a carbon dioxide incubator. The culture was started at an initial concentration of 50,000 cells / ml, and when it was grown to about 2 million cells / ml, the initial concentration was adjusted again and the culture was subcultured.
  • the nitrite in the culture supernatant of unstimulated RAW246.7 cells was made to have a nitrite production amount of 0 ⁇ M.
  • the cell concentration for inducing nitrous acid was plotted on a semilogarithmic graph, and the number of units of each sample was determined and shown in Table 5.
  • E. coli, Serratia, Eromonas, Ranella, Enterobacter, Xanthomonas, Zymomonas, and Acetic acid bacteria have a remarkable effect of 5.9 to 16.9 times more than conventional heat-killed cells treated with the cells of the present invention. It was.
  • mice The method we established was used for the induction of priming action and the dose dependency in TNF production by intravenous administration of mice using Escherichia coli (Non-patent Document 11).
  • a negative control physiological saline was administered.
  • a conventional method a conventional heated dead cell was used.
  • test products 3 C3H / He mice were used for the test in the heating and test samples (E. coli dead cells, autoclaved cells, sonicated cells, high-pressure cell disrupted cells) .
  • OK-432 (Pishibanil; Chugai Pharmaceutical) was used as a trigger. OK-432 was suspended by adding physiological saline for injection to a final concentration of 5 KE / ml (1 KE is 0.1 mg). 0.2 ml of each test solution used as a primer (priming inducer) and physiological saline in the control group were administered intravenously. 3 hours after administration, 1-KE / 0.2 ml of OK-432 suspension was intravenously administered per mouse as a trigger (TNF inducer). Two hours later, blood was collected, heated at 37 ° C. for 30 minutes, and then serum was obtained by centrifugation. The amount of TNF in serum was measured using a commercially available ELISA kit (manufactured by Biolegend).
  • the priming action was based on 1/2 of the amplification factor of TNF induced by OK-432 1KE amplified by 0.2 ⁇ g of interferon- ⁇ (Nippon Roche).
  • Arbitrary samples were prepared at multiple concentrations, administered intravenously to mice as a primer, and after 3 hours, as a trigger, OK-432 induced TNF amplification factor of TNF induced by OK-432 alone Ask for.
  • the degree of priming action (priming activity) of any sample is determined by the following method. Plot the arbitrary sample concentration (logarithm) and TNF amplification factor on a semi-logarithmic graph to estimate the minimum sample concentration that gives half of the TNF induction factor of interferon- ⁇ .
  • Results Table 6 shows the amount of serum TNF induced by interferon- ⁇ and OK-432.
  • 1KE of OK-432 was administered alone, the amount of TNF in the serum was 125 pg / ml.
  • the concentration of each treated bacterial cell sample that gave the minimum concentration at which the TNF amplification factor was 3.6 times 1/2 was examined.
  • Table 7 shows the results of the dose of each treated cell sample and the amount of TNF in serum induced by OK-432.
  • the relative values are also shown in Table 7.
  • the cell body was 2.1 ng (48 units), and the homogenate disrupted cell body was 6.5 ng (15 units).

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Abstract

　菌体破砕物は、グラム陰性菌を培養し、該グラム陰性菌の菌体を物理的に破砕することにより得られ、該菌体の免疫活性化成分を含むすべての成分を含み、分子量２００００以下のＬＰＳを有効成分として含む。この菌体破砕物は、健康食品、医薬品、スキンケア製品、入浴剤、甲殻類や貝類、魚類、家禽類、畜産動物、ペット類の感染防除用飼料、成長促進飼料添加物として有効であり、感染防除効果や成長促進効果のあるグラム陰性菌の菌体由来の自然免疫活性化物質を、低コストで実用性のある微生物菌体破砕物及びその配合物を提供できる。

Description

菌体破砕物及びその配合物
　本発明は、感染防除効果や成長促進効果を増強する微生物菌体破砕物、及びその配合物に関する。
　すべての生物は生まれながらにして生体に備わっている異物（健康な自己には存在しない物質：死んだ細胞、変性した生体分子、侵入微生物、がん細胞など）を認識し排除する機構である自然免疫を持っている。このことから、自然免疫が健常に働いていれば、健康な状態であり、自然免疫が何らかの原因により健常に働いていない状態は不健康と言える。自然免疫が正常に機能しないことから推測される疾患としては、感染症、代謝病、老化促進、がん、不妊症、認知症、アレルギー性疾患などがあげられる。
　自然免疫が正常に働かない最大の原因はストレスである。物理的または精神的なストレスであっても自然免疫を抑制する。ストレスにより自然免疫の中心的細胞であるマクロファージが抑制される。原因は明らかではないが、その機構の一つとしては、ストレスにより誘導されるグルココルチコイドやプロスタグランジン、カテコールアミンなどがマクロファージの活性化を抑制することがあげられる。ストレスは多くの疾病の原因となっていると考えられているが、ストレスの低減は現代社会にあって困難であるため、これを回避できる方策が求められる。
　ストレスによる自然免疫の抑制を回避する方法として、我々は自然免疫の中心的細胞であるマクロファージの活性化に着目している。マクロファージの活性化能を指標として、自然免疫の活性化を制御すると、ストレスによる自然免疫抑制を回避することができ、その結果として感染症の増悪化や、がんの転移促進などを予防できる（非特許文献１）。また、異物を識別して貪食し、排除するマクロファージを活性化することで、異物の排除能が高まり、細菌やウイルスに対する感染症の予防することが出来るし、炎症を抑制し、組織修復をするマクロファージを活性化することで、炎症が原因である生活習慣病に対しても予防効果がある。その他に、代謝病、老化促進、がん、不妊症、認知症、アレルギー性疾患などの予防効果もある。
　これまでもっとも良く知られている自然免疫を活性化する日常に利用されている食品素材はプロバイオティクスとして知られている生菌群である。プロバイオティクスは、ヨーグルトやサプリメントなどに含まれている生菌として提供されている。菌種としては大腸菌、乳酸菌、バチルス菌などがある（非特許文献２）。
　かつては、免疫を活性化する作用は、生菌として摂取され、その後に腸内で増殖することが必要であると考えられ、死菌では効果が無いか極めて低いとの考えられていた（非特許文献２）。しかし、近年では生菌だけでなく、死菌にも免疫賦活効果があることがわかってきた(非特許文献３)。例えば、乳酸菌死菌は免疫を活性化する食品用素材として、現在広く日本でも利用されている。死菌でも効果が現れる機構としては、菌体成分が免疫を活性化するため、生菌でも死菌でも同じ作用を示すとされている(非特許文献４)。
　菌体由来成分でマクロファージ（や自然免疫）を活性化する物質としては、リポ多糖、リポタイコ酸、リポアラビノマンナン、ペプチドグリカン、フラジェニン、リポプロテイン、ムラミルジペプチド、プロテオグリカン、非メチル化シトシン・グアニン配列を含む遺伝子、βグルカンなどがある。これらの菌体成分は、マクロファージや好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、B-1細胞、粘膜上皮細胞などの自然免疫系細胞が持つトル様受容体(TLR)や、NOD様受容体（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor：NLR)、C型レクチン受容体(CLR)等に認識される(非特許文献５)。その結果、これらを取り込んだ自然免疫系細胞は活性化する。なお、これらの認識は細胞の外膜上で行われる他、細胞内に取り込まれて小胞（エンドソーム、ファゴソーム）や、タンパク質複合体(インフラマソームなど）で認識されている。すなわち、これらの菌体成分は自然免疫活性化物質として有用性があると考えられるが、実際に、感染防除効果や成長促進効果等があることが示されている（特許文献１，２）。
　しかしながら、リポ多糖、リポタイコ酸、リポアラビノマンナン、ペプチドグリカン、フラジェニン、リポプロテイン、ムラミルジペプチド、プロテオグリカン、非メチル化シトシン・グアニン配列を含む遺伝子などは菌体から精製するか、合成することで調整出来るが、その費用は極めて高い。上記成分は1mgあたり数万円で販売されている。そのため、予防食品や健康維持サプリメントとしての実用化は費用の点から困難である。
　一方、生菌体や死菌体は、菌体成分の精製物よりは遙かに安価に製造できる。しかし、実際に使用される菌体量は多い。例えば、乳酸菌死菌乾燥重量で150mg/kg体重（人あたりすると約1g: 1 trillion cells）という多量が使用されている(非特許文献６)。そのため、安価に生菌体や死菌体の効果を高めることができれば、著しいコストダウンが達成出来る。
　これまで、100℃で10分間処理した後に遠心分離して得た死菌体を物理的または酵素的に破砕することで、効果が高まることが報告されている（特許文献３）。その効果はバチラス・サチラス（グラム陽性菌）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（グラム陽性菌）を破砕することにより5分の1量にしても同等の効果が得られるが、ストレプトコッカス・サーモフィラス（グラム陽性菌）、ラクトバチラス・アシドフィラス（グラム陽性菌）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（グラム陽性菌）には2分の1程度の効果である。以上はすべてグラム陽性菌であるが、この報告では、大腸菌（グラム陰性菌）には菌体と菌体破砕物がLPS単独よりも高い効果を達成するということは示されているが、菌体破砕物が菌体よりも効果が認められるのは一部のグラム陽性菌に限定されている。
　細菌はグラム染色性の違いによってグラム陽性菌とグラム陰性菌は分けられるが、この染色性の違いは細胞壁（ペプチドグリカン層）の厚さの違いに起因している。グラム陽性菌は細胞壁（ペプチドグリカン層）が厚く、グラム陽性菌は薄い。そのため、グラム陽性菌は、グラム染色の過程で色素の脱色が厚い細胞壁により阻害され色素が残る。一方、グラム陰性菌はペプチドグリカン層が薄く、脱色されるため、グラム染色されない(非特許文献７)。グラム陽性菌のペプチドグリカンは乾燥重量の90％にも及び、グラム陰性菌の10％よりも遙かに多い(非特許文献８)。
　細菌細胞壁のペプチドグリカンはペプチドと糖からなる極めて巨大な高分子物質であり、細胞の形態、強度を保持させる強固な物質である（非特許文献８）。細胞から抽出したペプチドグリカンや、ペプチドグリカンを分解して得られるムラミルジペプチドは免疫系細胞の細胞表面のデクチン1受容体や、NOD-1、 NOD-2、TLR2などを介して自然免疫系細胞を活性化できる。
　一方、グラム陰性菌はグラム陽性菌に無い細胞外膜が存在し、そこにリポ多糖(lipopolysaccharide: LPS)が存在する。リポ多糖はリピドAと呼ばれる脂質に、複数種の糖からなる糖鎖が結合した構造をとる。糖鎖部分は、コア多糖と呼ばれる部分と、O抗原と呼ばれる部分から構成される。リポ多糖のリピドA部分は、細胞外膜の脂質層に入り込んでいる。リポ多糖の生物活性は免疫細胞の細胞表面のToll様受容体4 (TLR4)、MD-2、CD14を介して細胞を活性化する（非特許文献９，１０）。以上のことから、グラム陽性菌とグラム陰性菌は構造が全くことなり、このことが、グラム陽性菌で効果がある菌体処理でも、グラム陰性菌には効果が得られない結果になっていると考えられる。
　ところで、グラム陽性菌の主要な免疫活性化物質はペプチドグリカンであるが、ペプチドグリカンはグラム陽性菌だけでなく、グラム陰性菌も存在する。また、ペプチドグリカンはLPSに比べて免疫活性する能力は著しく低い。このことから、グラム陰性菌はグラム陽性菌よりも免疫賦活作用がきわめて高いと考えられる。そのため、グラム陰性菌体を安価に効果を増幅させる方法が確立できれば、グラム陽性菌よりもきわめて効率のよい免疫活性化素材を製造することが可能である。
　そこで、われわれは、低コストでグラム陰性菌の菌体の免疫活性化効果を高めるグラム陰性菌破砕物を作製することを鋭意努力したところ、ついに5から30分の1で菌体と同等の効果が得られる破砕物を作成することに成功した。
特許第４０４３５３３号公報 特開平６－２１７７１２号公報 特許第２５２６７３３号公報
Takeru Nakamoto, et al., Treatmentsfor the activating macrophages that reduces surgical stress and postoperative mortalitiesfrom bacterial infections and tumor metastases. in vivo 21: 357-364 (2007) R. Herich,M. Levkut, Lactic acid bacteria, probiotics and immune system. Vet. Med.-Czech,47, 169-180, 2002. Elisa OVintini1, and Marcela S Medina1, Host immunity in the protective response to nasalimmunization with a pneumococcal antigen associated to live and heat-killedLactobacillus casei. BMC Immunology, 12: 46, 2011 Adams CA,Nutrition Research Review, 2010, 23 (1), 37-46. またはAdrianaA Pedroso and Margie D Lee, Poultry Informed Professional, 114, 1-4, 2010. ウィキペディア(http://ja.wikipedia.org/wiki/Toll様受容体) Takamitsu T, et al., Effect ofa cell preparation of Enterococcus faecalis strain EC-12 on digesta flow andrecovery from constipation in a pig model and human subjects. Microbial Ecologyin Health and Disease. 17, 107-113, 2005. ウィキペディア(http://ja.wikipedia.org/wiki/グラム染色) ウィキペディア(http://ja.wikipedia.org/wiki/ペプチドグリカン) ウィキペディア(http://ja.wikipedia.org/wiki/リポ多糖) ウィキペディア(http://ja.wikipedia.org/wiki/リピドA) Takashi Nishizawa, et al.,Homeostasis as regulated by activated macrophage. I. Lipopolysaccharide (LPS)from wheat flour: Isolation, purification and some biological activities. Chem.Pharm. Bull. 40: 479-483 (1992)
　本発明は、上記課題に鑑み、感染防除効果や成長促進効果のあるグラム陰性菌の菌体由来の自然免疫活性化物質を、低コストで実用性のある微生物菌体破砕物、その配合物及び医薬品を提供することを目的とする。
　本発明の菌体破砕物は、グラム陰性菌を培養し、該グラム陰性菌の菌体を物理的に破砕することにより得られ、該菌体の免疫活性化成分を含むすべての成分を含み、分子量２００００以下のＬＰＳを有効成分として含むことを特徴とする。
　また、前記グラム陰性菌が大腸菌、セラチア菌、エロモナス菌、ラーネラ菌、エンテロバクター菌、キサントモナス菌、ザイモモナス菌、パントエア菌、又は酢酸菌であることが望ましい。
　また、本発明の菌体破砕物の配合物は、前記菌体破砕物が配合されている医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、浴用剤、飼料、ペット用食品又は動物用医薬品であることを特徴とする。
　また、本発明の菌体破砕物の配合物は、前記菌体破砕物が配合されている肥料、堆肥又は植物用医薬品であることを特徴とする。
　また、前記配合物は、成長促進、免疫活性化、生活習慣病、がん若しくはアレルギー性疾患の予防、感染防除、又はストレス抵抗性を目的としたものであることが望ましい。
　また、前記配合物は、成長促進、免疫活性化、感染防除、又はストレス抵抗性を目的としたものであることが望ましい。
　本発明によれば、一酸化窒素産生誘導能を示す本菌体破砕物は、健康食品、医薬品、スキンケア製品、入浴剤、甲殻類や貝類、魚類、家禽類、畜産動物、ペット類の感染防除用飼料、成長促進飼料添加物として有効である。また、これらの飼料添加物に使われる形状としては、液体、固形飼料、練り餌、ペット用サプリメントなどとして有効に使用することができる。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。本発明者らは鋭意研究をすすめた結果、グラム陰性菌の菌体を簡単な処理により、未破砕の菌体、精製LPSや精製ペプチドグリカン、精製DNA単独よりも、強力な免疫活性化誘導能を示すことを発見し、本発明を完成したものである。
　グラム陰性菌は通常の栄養素で培養後、菌体を培養物から分離してもよい。グラム陰性菌で、LPSを含むものであれば特に細菌の種類は限定されない。例えば、大腸菌、サルモネラ菌、エロモナス菌、アシネトバクター、プロテウス菌、セラチア菌、百日咳菌、エルシニア菌、ナイセリア菌などでもよい。特に、食に用いられているグラム陰性細菌である、酢酸菌、キサントモナス菌、ザイモモナス菌、パントエア菌、エンテロバクター菌などは食経験がある点で望ましい。また、これらの食経験のあるグラム陰性菌のLPSの主要な分子量は20000以下である。
　菌体はそのまま、もしくは、加熱殺菌後、菌体を機械的に破砕処理する。破砕処理は低温下で非酵素的に行うことが望ましい。細胞の破砕は顕微鏡下で確認可能であり、破砕細菌は90%以上であり、ほぼ100%が好ましい。破砕に高圧を用いる場合には、冷却下に破砕することが望ましく、冷却は20℃以下、より望ましくは4℃以下がよい。破砕に細菌を凍結させて行う方法は冷却の点で好ましい。高圧破砕する場合は400psi以上がよい。
　自然免疫活性化の評価方法としては、プライミング作用（一次刺激物質によって誘導される作用）が可能である。プライミング作用とは、それ自身では明確な作用を誘導しないが、そのプロセスが引き続く刺激（二次刺激）によって誘導される作用を有意に増幅する作用と定義される。この場合に誘導される作用は、種々の生物学的な応答として見る事が出来る。例えば、腫瘍壊死因子（TNF）誘導、インターロイキン(IL)-１α誘導、IL-１β誘導、一酸化窒素誘導、活性酸素誘導、がん細胞障害作用、などである。プライミング作用により誘導される状態がプライミング段階（状態）であり、この状態では、ストレス抵抗性、感染防除作用、がん転移抑制作用などが得られる（非特許文献１）。例えば、一次刺激としてインターフェロンγをマウスに投与し、3時間後に二次刺激としてリポ多糖を投与し、その1時間後の血清中の腫瘍壊死因子の量を測定すると、一次刺激の存在によって3倍から10倍程度に腫瘍壊死因子の濃度が増加する。この場合に一次刺激単独では、血清中に腫瘍壊死因子量は健常状態で検出できる範囲である。この場合のインターフェロンγを一次刺激物質(プライマー)と呼び、リポ多糖を二次刺激物質（トリガー）と呼ぶ。生物学的応答はトリガー投与で血液中に誘導された腫瘍壊死因子となる。
　同様に、細胞を使ってプライミング作用を調べることが出来る。細胞は主に自然免疫の中心的細胞であるマクロファージを用いることが出来る。マクロファージは全身にくまなく分布する細胞である。マクロファージは異物を識別し排除する機能を持つが、環境に適合して性格を変える能力があるため、存在する組織ごとにマクロファージの性格が異なるが、異物に対する排除機能はすべてのマクロファージが持っているため、脳のマイクログリア、肺の肺胞マクロファージ、肝臓のクッパ-細胞、皮膚のランゲルハンス細胞、腹腔マクロファージ、血液由来の単球、骨髄細胞などの組織単離細胞や株化細胞が利用出来る。例を上げれば、マクロファージ細胞株（RAW246.7、J774.1、THP-1、NR8383）や、腹腔マクロファージ、末梢血単球、骨髄細胞を分化誘導したマクロファージなどにインターフェロンγなどのプライマーを加えて培養し、その後にトリガーとして、OK-432(ピシバニール、溶連菌製剤、中外製薬)、LPS、乳酸菌死菌体などを加える。培養上清中に誘導されたTNFやIL-1β、活性酸素、一酸化窒素などを測定することでプライミング作用を評価出来る。また、マクロファージ細胞内に誘導される腫瘍壊死因子、やIL-1β、誘導性一酸化窒素合成酵素の転写RNA産生量を定量的に測定することでも評価出来る。このプライミングする能力（プライミング活性）を指標とすることで、グラム陽性菌やグラム陰性菌の成分であるリポ多糖あるいはリポタイコ酸あるいはリポアラビノマンナン、ペプチドグリカン、フラジェニン、リポプロテイン、ムラミルジペプチド、プロテオグリカン、非メチル化シトシン・グアニン配列を含む遺伝子などが、混在する物質であっても、自然免疫活性化能の指標としてプライミング作用を評価出来る。
　グラム陰性菌として、大腸菌（Escherichia coli）、パントエア菌（Pantoea agglomerans）、セラチア菌（Serratia ficaria）、エロモナス菌（Aeromonas hydrophila）、ラーネラ菌（Rahnella aquatilis）、エンテロバクター菌（Enterobacter cloacae）、キサントモナス菌（Xanthomonas campestris）、ザイモモナス菌（Zymomonas mobilis）は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えばトリプトソーヤブロスやニュートリエントブロス（ベクトンディキンソン）を適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養後に、遠心分離操作（2000g、10分）で菌体を沈殿させて各菌体を回収した。
　大腸菌のサンプルを作製した。1gの各菌体を10mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に分散した（生菌分散液）。特許文献３においては、培養菌（生菌）の懸濁液を加熱後に集菌しており（５欄、２０～２２行、この菌体の処理方法を「従来型」と呼ぶ）、この場合、加熱後に集菌することによって菌体の一部の成分が失われていると考えられる。これに対して、本発明は、菌体を破砕すると共に、菌体の免疫活性化成分を含むすべての成分を含む菌体破砕物を提供するものである。
・生菌分散液を100℃、10分加熱した後、遠心分離器で沈殿を回収し、PBSで再懸濁し、非加熱死菌を調製した（従来型加熱死菌体）。
・生菌分散液にホルマリンを0.5%になるように添加し、室温で1時間保存して殺菌した後、遠心分離器で沈殿を回収し、ホルマリンを除去して、PBSで再懸濁し、非加熱死菌を調製した（非加熱死菌体）。
・生菌分散液をオートクレーブで100℃、10分加熱した後に、そのままの加熱菌体をホモジネート（ポリトロンホモジナイザー）処理により菌体を破砕した（ホモジネート破砕菌体）。
・生菌分散液をオートクレーブで100℃、10分加熱した後に、そのままの加熱菌体を30尾分間、超音波処理し、菌体を破砕した（超音波破砕菌体）。
・生菌分散液を100℃、10分加熱した後、そのままの加熱菌体を4℃に冷却して高圧細胞破砕装置(2000psi)で破砕処理した（高圧破砕菌体）。破砕の程度は生物顕微鏡下で1000倍の倍率で観察し、菌の形態がほぼ残っていないこと(95%以上の破砕)を確認した。
　パントエア菌のサンプルを作製した。1gの各菌体を10mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に分散した（生菌分散液）。
・生菌分散液を100℃、10分加熱した後、遠心分離器で沈殿を回収し、PBSで再懸濁し、非加熱死菌を調製した（従来型加熱死菌体）。
・生菌分散液にホルマリンを0.5%になるように添加し、室温で1時間保存して殺菌した後、遠心分離器で沈殿を回収し、ホルマリンを除去して、PBSで再懸濁し、非加熱死菌を調製した（非加熱死菌体）。
・生菌分散液を100℃、10分加熱した後、遠心分離器で沈殿を回収し、PBSで再懸濁し、4℃に冷却して高圧破砕装置（コンタクトシステムズ社製、2000psi）で破砕した（従来型前処理高圧破砕菌体）。
・生菌分散液をオートクレーブで100℃、10分加熱した後に、遠心分離器で沈殿を回収し、その後、沈殿をPBSで分散し、ホモジネート（ポリトロンホモジナイザー）処理した（従来型前処理ホモジネート処理菌体）。
・生菌分散液を100℃、10分加熱した後、そのままの加熱菌体を4℃に冷却して高圧細胞破砕装置(2000から20000psi)で破砕処理した（高圧破砕菌体）。破砕の程度は生物顕微鏡下で1000倍の倍率で観察し、菌の形態がほぼ残っていないこと(95%以上の破砕)を確認した。
・生菌分散液をオートクレーブで100℃、10分加熱した後に、そのままの加熱菌体をホモジネート（ポリトロンホモジナイザー）処理により菌体を破砕した（ホモジネート破砕菌体）。
　各処理した菌体は寒天培地を用いて増殖菌がないこと（死んでいること）を確認した。なお、本明細書において、「死菌」は、死んでいるが、菌体の構造や形態（例えば、球菌なら球形、桿菌なら円柱形）が基本的に維持されている状態のものを言い、本発明によって破壊処理された菌は、菌体の形態が維持されていない状態のものを言う。
　LPSの精製は従来法に基づいて抽出精製を行った（1992CPB-I）。
　セラチア菌、エロモナス菌、ラーネラ菌、エンテロバクター菌、キサントモナス菌、ザイモモナス菌は次のサンプルを作製した。1gの各菌体を10mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に分散した（生菌分散液）。
・生菌分散液を100℃、10分加熱した後、遠心分離器で沈殿を回収し、PBSで再懸濁し、非加熱死菌を調製した（従来型加熱死菌体）。
・生菌分散液を100℃、10分加熱した後、そのままの加熱菌体を4℃に冷却して高圧細胞破砕装置(2000～20000psi)で破砕処理した（高圧破砕菌体）。破砕の程度は生物顕微鏡下で1000倍の倍率で観察し、菌の形態がほぼ残っていないこと(95%以上の破砕)を確認した。
　各処理した菌体は寒天培地を用いて増殖菌がないこと（死んでいること）を確認した。
　酢酸菌（Acetobacter aceti, Gluconobacter cerinus）は通常の酢酸菌選択培地、例えば農大改変寒天培地（2％グルコース、1％グリセロール、2％エタノール、1.5％酵母エキス、1%ポリペプトン、寒天）に塗り広げ、３０℃で培養を行う。出現した一つのコロニーをとり、農大改変寒天培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３０℃にて３日間、振盪培養を行った。培養後に、遠心分離操作（2000g、10分）で菌体を沈殿させて酢酸菌を回収した。菌数は、血球計算盤等で測定した。1gの酢酸菌体を10mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に分散し（菌体分散液）、オートクレーブで120℃20分加熱後にホモジネート処理、30分間超音波処理、高圧細胞破砕装置(15000psi)で破砕処理をそれぞれ行った。高圧細胞破砕処理菌体は9mlのPBSを添加した。また、菌体分散液にフェノールを0.1％またはホルマリンを0.5%になるように添加し、室温で1時間保存して殺菌した後、遠心分離器で沈殿を回収し、フェノールまたはホルマリンを除去して、PBSで再懸濁し、非加熱酢酸菌死菌を調製した。また、従来法として、菌体分散液を100℃10分で加熱処理後、遠心分離器で沈殿を回収し、水で分散した酢酸菌死菌を調製し、さらに、この菌を30分間超音波処理した。各処理した酢酸菌は農大改変寒天培地を用いて死んでいることを確認した。
　酢酸菌1gを10mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に分散し、これを100℃、10分加熱した後、そのままの加熱菌体を4℃に冷却して高圧細胞破砕装置(20,000psi)で破砕処理した（高圧破砕菌体）。破砕の程度は生物顕微鏡下で観察し、菌の形態がほぼ残っていないこと(95%以上の破砕)を確認した。
　菌体は農大改変寒天培地を用いて増殖菌がないこと（死んでいること）を確認した。
大腸菌およびマクロファージ細胞活性化実験：一酸化窒素産生能評価
　大腸菌およびパントエア菌体の各種処理によるマクロファージ活性化能を一酸化窒素産生能で評価した。マクロファージはリポ多糖あるいはリポタイコ酸あるいはリポアラビノマンナン、ペプチドグリカン、フラジェニン、リポプロテイン、ムラミルジペプチド、プロテオグリカン、非メチル化シトシン・グアニン配列を含む遺伝子などで刺激を受けると、マクロファージ内で一酸化窒素合成酵素が誘導され、その結果、一酸化窒素を産生する。一酸化窒素は活性化ガスの一種であり、細菌やウイスル、がん細胞などに対して障害活性を示すため、活性化マクロファージの異物排除の実行分子として働く。その一酸化窒素は不安定であって亜硝酸に変異するため、その亜硝酸を測定した。
　大腸菌の従来型加熱死菌体、ホモジネート破砕菌体、超音波破砕菌体、高圧破砕菌体(2000psi)をそれぞれについて菌体重量として、20ng/ml, 200ng/ml, 2μg/ml, 20μg/mlになるように調製した。RAW246.7細胞は10%牛胎児血清を添加下RPMI1640培地で、炭酸ガスインキュベータで培養した。初期濃度5万個/mlで培養を開始し、約200万個/mlに増殖したところで、初期濃度に調製し直し、培養を継代した。実験にはRAW細胞を5万個/0.1ml/ウェル (96 ウェル培養用プレート)に入れ、これに調製したサンプルを各0.1mlずつウェルに入れて最終濃度で10ng/ml, 100ng/ml, 1μg/ml, 10μg/mlとして、24時間培養を行い、培養上清を回収した。
　マクロファージ活性化能は、本試験で誘導される一酸化窒素の代謝産物である亜硝酸の濃度をグリエス試薬で測定した。1μg/mlの濃度でマクロファージ（RAW246.7細胞）を刺激した24時間（24時間）後の培養上清中の亜硝酸量が10μMになる場合にその物質のマクロファージ活性化能を1単位(unit/ml)とする。任意のサンプルのマクロファージ活性化能は、希釈任意サンプルが誘導する亜硝酸濃度を求め、片対数グラフにサンプル濃度（対数）と亜硝酸濃度をプロットし、10μMの亜硝酸を誘導するサンプル濃度を推定する。この濃度が1μg/mlになるための倍数を求めて、これをマクロファージ活性化単位とする。例えば、あるサンプルが100ng/mlで10μMの亜硝酸を誘導する濃度であったら、1μg/ml÷100ng/ml=10となり、このサンプルは10単位のマクロファージ活性化能であるとする。
結果
　各処理大腸菌サンプルの各濃度の産生亜硝酸濃度を表１に示した。未刺激のRAW246.7細胞の培養上清は亜硝酸検出限界2.8～3.1μMであった。各処理大腸菌体の各濃度の亜硝酸濃度から10μMの亜硝酸濃度を誘導する菌体濃度を片対数グラフにプロットして求めると、従来法による大腸菌死菌（従来型加熱死菌体で500ng/mlとなり、2unitであったが、ホモジネート破砕菌体は16ng/ml (62.5unit)、超音波破砕菌体は58ng/ml
(17.2unit)であり、高圧破砕菌体は200ng/ml (5unit)となった。すなわち、この結果から、同じ大腸菌の菌体由来であっても、処理によりマクロファージ活性化能が2.5倍～31倍も効果が高くなることが明らかである。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　次に、パントエア菌を用いて、従来型加熱死菌体、非加熱死菌体、従来型前処理高圧破砕菌体、従来型前処理ホモジネート処理菌体、高圧破砕菌体(20000psi)、ホモジネート破砕菌体を調整し、それぞれについて菌体重量として、2ng/ml, 20ng/ml, 200ng/ml, 2μg/ml, 20μg/mlになるように希釈した。RAW246.7細胞は10%牛胎児血清を添加下RPMI1640培地で、炭酸ガスインキュベータで培養した。初期濃度5万個/mlで培養を開始し、約200万個/mlに増殖したところで、初期濃度に調製し直し、培養を継代した。実験にはRAW細胞を5万個/0.1ml/ウェル (96 ウェル培養用プレート)に入れ、これに調製したサンプルを各0.1mlずつウェルに入れて最終濃度で1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 1μg/ml, 10μg/mlとして、24時間培養を行い、培養上清を回収した。
 
結果
　未刺激のRAW246.7細胞の培養上清の亜硝酸を亜硝酸産生量0μMとし、各処理パントエア菌サンプルの各濃度の産生亜硝酸濃度を表２に示した。各サンプルが10μMの亜硝酸を誘導する菌体濃度を片対数グラフにプロットして各サンプルのユニット数を求めて表２に示した。従来型加熱死菌体で400ng/mlとなり、2.5unitであったが、従来型前処理高圧破砕菌体、従来型前処理ホモジネート破砕菌体は300ng/ml (3.3unit)、非加熱死菌体は185ng/ml (5.4unit)であり、ホモジネート破砕菌体は44ng/ml (23unit)、高圧破砕菌体は12ng/ml (83unit)となった。この結果から、従来型加熱死菌体を基準にして、相対比を求めることが出来るので、表２にまとめた。従来型の処理でも、1.3倍程度の能力向上（1.3分の1で同等の効果が出る）が認められた。一方、従来型の処理をせずに菌体をホモジネート破砕または高圧破砕すると9.2～33.2倍の著しい能力向上がみられた。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　最も効果の高かったパントエア菌の高圧細胞破砕処理について破砕圧2000psi, 5000psi, 10000psi, 20000psiについて処理を行い、上記例と同様にRAW246.7細胞からの一酸化窒素産生能を評価した。従来型加熱死菌体を基準にして、相対比を求め、表４にまとめた。従来型加熱死菌体を基準にすると、高圧破砕の圧力は2000～20000psiで8.5から21.2倍の能力向上がみられたが、圧力に対する効果の変化は少なく、この範囲ではすべて使用可能であった。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　パントエア菌以外のグラム陰性菌として、大腸菌、セラチア菌、エロモナス菌、ラーネラ菌、エンテロバクター菌、キサントモナス菌、ザイモモナス菌、酢酸菌を用いて、高圧破砕菌体のマクロファージ活性化能の評価を行った。
　実施例１で調整した大腸菌、セラチア菌、エロモナス菌、ラーネラ菌、エンテロバクター菌、キサントモナス菌、ザイモモナス菌、酢酸菌を、従来型加熱死菌体と高圧破砕菌体それぞれ作製した。各サンプルについて菌体重量として、2ng/ml, 20ng/ml, 200ng/ml, 2μg/mlになるように調製した。なお、酢酸菌のみは2μg/ml, 20μg/ml, 200μg/ml, 2mg/mlで調整した。RAW246.7細胞は10%牛胎児血清を添加下RPMI1640培地で、炭酸ガスインキュベータで培養した。初期濃度5万個/mlで培養を開始し、約200万個/mlに増殖したところで、初期濃度に調製し直し、培養を継代した。実験にはRAW細胞を5万個/0.1ml/ウェル (96 ウェル培養用プレート)に入れ、これに調製したサンプルを各0.1mlずつウェルに入れて最終濃度で1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml, 1μg/ml, 10μg/ml（酢酸菌は1μg/ml, 10μg/ml, 100μg/ml, 1mg/ml）として、24時間培養を行い、培養上清を回収した。
実施例２と同様に、未刺激のRAW246.7細胞の培養上清の亜硝酸を亜硝酸産生量0μMとし、各処理グラム陰性菌サンプルの各濃度の産生亜硝酸濃度から、各サンプルが10μMの亜硝酸を誘導する菌体濃度を片対数グラフにプロットして各サンプルのユニット数を求めて表５に示した。大腸菌、セラチア菌、エロモナス菌、ラーネラ菌、エンテロバクター菌、キサントモナス菌、ザイモモナス菌、酢酸菌共に従来型加熱死菌体よりも本発明の菌体処理により5.9倍から16.9倍の著しい効果が認められた。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
マウスを用いたプライミング作用測定
　大腸菌体を用いたマウス静脈内投与によるTNF産生におけるプライミング作用の誘導及びその用量依存性についての実験方法は我々が確立した方法を用いた（非特許文献１１）。　陰性対照は生理食塩水を投与した。従来法として、従来型加熱死菌体を用いた。試験品としては、加熱、試験検体（大腸菌死菌体、オートクレーブ加熱処理菌体、超音波処理菌体、高圧細胞破砕菌体）投与量群は各3匹のC3H/Heマウスを試験に用いた。
　トリガーとして、OK-432（ピシバニール；中外製薬）を用いた。OK-432は注射用生理食塩水を終濃度5KE/ml（1KEは0.1mg）になるように加え懸濁した。プライマー（プライミング誘導剤）として用いる各試験液及びコントロール群の生理食塩水は静脈内に0.2mlを投与した。投与3時間後に、トリガー（TNF誘導剤）としてOK-432懸濁液をマウスあたり1KE/0.2mlを静脈内投与した。その2時間後に採血し、37℃で30分加温の後遠心分離による血清を得た。血清中のTNF量の測定は市販のELISAキット(Biolegend社製)を用いて実施した。
　プライミング作用は、インターフェロン-γ(日本ロッシュ)の0.2μgによって増幅されるOK-432 1KEが誘導するTNFの増幅倍数の1/2を基準とした。任意のサンプルを複数の濃度に調製し、これをプライマーとしてマウスに静脈投与し、3時間後にトリガーとして投与したOK-432により誘導されるTNFから、OK-432単独で誘導されるTNFの増幅倍率を求める。任意のサンプルのプライミング作用の程度（プライミング活性）は以下の方法で求める。片対数グラフに任意のサンプル濃度（対数）とTNF増幅倍率をプロットし、インターフェロン-γのTNF誘導倍率の1/2を与える最小のサンプル濃度を推定する。このサンプル濃度が0.1μgになるための倍数を求めて、これをプライミング活性単位とする。例えば、あるサンプルが10ng（0.01μg）で0.1μgのインターフェロン-γで誘導されるTNFの倍率の1/2の濃度であったら、0.1μg÷10ng=10となり、このサンプルは10単位のプライミング活性があるとする。
 
結果
　インターフェロン-γとOK-432で誘導される血清中のTNF量を表６に示した。OK-432の1KEを単独投与した場合の血清中のTNF量は125pg/mlであった。インターフェロン-γの0.1μgをマウスに1μg静脈投与した後に、OK-432を投与した場合のTNF濃度は950pg/mlであった。従って、インターフェロン-γの0.1μgのTNFの増幅倍率は950÷125=7.6倍であった。この1/2の3.6倍のTNF増幅倍率となる最小濃度を与える各処理菌体サンプルの濃度を調べた。各処理菌体サンプルの投与量とOK-432により誘導される血清中のTNF量の結果を表７に示した。また、従来型加熱死菌体に比べて、処理方法がどの程度活性化能を増強するか示すために従来型加熱死菌体のTNF誘導能(unit数)を1としたときの各サンプルで相対値も表７に示した。従来型前処理高圧破砕菌体では34ng(2.9unit)、従来法大腸菌死菌破砕物（超音波処理菌体）は27ng(3.7unit)、 高圧破砕菌体は0.80ng(125unit)、超音波処理菌体は2.1ng(48unit)であり、ホモジネート破砕菌体は6.5ng(15unit)となった。すなわち、この結果から、同じ大腸菌の菌体由来であっても、従来処理法では1.3倍で差が無かったが、本開発処理法によりマクロファージ活性化能が5倍～43倍も効果が高くなることが明らかである。
 
 
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　明細書、特許請求の範囲及び図面を含む２０１１年　６月１４日に出願の日本特許出願２０１１－１３２７４３の開示は、そのまま参考として、ここにとり入れるものとする。
　本明細書で引用したすべての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として、ここにとり入れるものとする。
 

Claims (6)

  1. 　グラム陰性菌を培養し、該グラム陰性菌の菌体を物理的に破砕することにより得られ、該菌体の免疫活性化成分を含むすべての成分を含み、分子量２００００以下のＬＰＳを有効成分として含むことを特徴とする菌体破砕物。
  2. 　前記グラム陰性菌が大腸菌、セラチア菌、エロモナス菌、ラーネラ菌、エンテロバクター菌、キサントモナス菌、ザイモモナス菌、パントエア菌、又は酢酸菌であることを特徴とする請求項１記載の菌体破砕物。
  3. 　請求項１又は２記載の菌体破砕物が配合されている医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、浴用剤、飼料、ペット用食品又は動物用医薬品であることを特徴とする菌体破砕物の配合物。
  4. 　請求項１又は２記載の菌体破砕物が配合されている肥料、堆肥又は植物用医薬品であることを特徴とする菌体破砕物の配合物。
  5. 　成長促進、免疫活性化、生活習慣病、がん若しくはアレルギー性疾患の予防、感染防除、又はストレス抵抗性を目的としたものであることを特徴とする請求項３記載の配合物。
  6. 　成長促進、免疫活性化、感染防除、又はストレス抵抗性を目的としたものであることを特徴とする請求項４記載の配合物。
     
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