WO2012108347A1 - 自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法及びその製造方法で製造されたローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤 - Google Patents
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Abstract
新規な自然免疫促進作用に優れた「ローヤルゼリー由来の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法」を提供すること、また、該製造方法で製造されたローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤を提供することを課題とし、少なくとも、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程を含むことを特徴とする自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法で課題を解決し、更には、少なくとも、以下の工程（１）ないし（３）を含む自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法で課題を解決した。 （１）乳酸菌を前培養する工程 （２）ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程、及び、 （３）乳酸菌の殺菌を行う工程
Description
本発明は、自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法及びその製造方法で製造されたローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤に関する。
ローヤルゼリー（Ｒｏｙａｌ ｊｅｌｌｙ；ＲＪ）は、ミツバチの若い働き蜂が下咽頭腺及び大腮腺の分泌物を混合して作る乳白色の物質で、水分（含量６６質量％）、ローヤルゼリーに特有なタンパク質（含量１１～１２質量％；細胞増殖促進作用や細胞死抑制作用（特許文献１）を持つアビシン（ＭＪＲＰ１）、免疫抑制作用を持つローヤルゼリー主要タンパク質３（ＭＲＪＰ３）（非特許文献１）、抗菌作用を持つロイヤリシン等）、糖質（含量１０質量％；果糖、ブドウ糖、ショ糖等）、及び、脂質類（含量５～７質量％；殺菌作用、インスリン作用、抗癌作用、神経細胞増殖作用（非特許文献２）を持つ１０－ヒドロキシ－２－デセン酸、免疫制御作用を持つ３，１０－ヒドロキシデカン酸やトランス－１０－ヒドロキシデカ－２－エン酸（非特許文献３）等）で主に構成されている。
更に、ビタミン類（ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、パントテン酸、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ等）、ミネラル類（カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、銅、鉄、亜鉛、リン等）、神経細胞増殖作用を持つアデノシンやアデノシン－１－リン酸のＮ－オキサイド誘導体、ヒトの神経伝達物質アセチルコリンに似た物質、ヒト唾液腺の成長ホルモンパロチンに似た類パロチン等の微量成分を含んでいる。一方、ハチミツはほとんど大部分が糖質（７８質量％）と水分（２０質量％）でできており、ローヤルゼリーとは組成が大きく異なっている。
ローヤルゼリーは、例えば、免疫促進作用（非特許文献１、３）、抗炎症作用（非特許文献４）、抗菌作用（非特許文献５、６）、老化防止作用、成長促進作用、更年期障害の予防・治療、抗癌作用（非特許文献７、８）、創傷治癒促進作用、血流増加作用、血糖低下作用、血圧降下作用（非特許文献９）、血清コレステロール低下作用（非特許文献１０）、抗肝障害作用（非特許文献１１）、抗アトピー性皮膚炎作用（非特許文献１２）、疲労回復作用（非特許文献１３）等の様々な生理作用を持つことが知られており、栄養価の高い健康補助食品や化粧品等に用いられている。また、最近、ローヤルゼリータンパク質のプロテアーゼ分解産物が強力な抗酸化作用（ヒドロキシラジカル消去作用）（非特許文献１４、特許文献２）や血圧降下作用（非特許文献１５、１６）を持つことが判ってきた。
ローヤルゼリーは、女王蜂、女王蜂の幼虫及び若齢の働き蜂の幼虫に給餌される食物で、女王蜂はローヤルゼリーを食べ続けることによって働き蜂の４０倍も長い寿命を保つ。また、１９５４年に老衰で危篤状態になったローマ教皇・ピウス１２世が、医師ガレアジイ・リシーが投与したローヤルゼリーによって驚くべき回復を果たしたことが知られているが、その効能の科学的実態は未だに明らかになっていない。
一方、自然免疫促進作用に関しては、健康食品分野において、酵母細胞壁由来のβ－グルカン、メカブフコイダン等の多糖類を含むものが知られている。
また、ローヤルゼリーの処理や加工に関しては、ローヤルゼリーをプロテアーゼ等で処理することによって、抗酸化作用や血圧降下作用を持つローヤルゼリー由来の食品添加物や医薬品の製造・開発が行われてきている（特許文献３～５）。
近年、社会の高齢化の進展に伴って増え続ける老齢者の、免疫機能及び健康の維持は、充実した生活を営んでいくための重要な課題となっている。そして、このような老齢化社会において、健康維持に貢献する自然免疫を強化・維持する薬剤が必要とされ、更なる開発が期待されている。
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本発明は、上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、新規な自然免疫促進作用に優れた「ローヤルゼリー由来の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法」を提供することにある。また、該製造方法で製造されたローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤を提供することにある。
本発明者は鋭意検討を行った結果、ローヤルゼリーは、抗菌物質であるロイヤリシンや１０－ヒドロキシデセン酸を含むのにも関わらず、意外にも乳酸菌による発酵が可能であることを見出した。
また、本出願人は、既に、ＷＯ ２００８／１２６９０５、ＷＯ ２００９／１５７４０９等で、自然免疫促進作用を有する物質を完全変態型昆虫の幼虫に投与した場合に、その完了に１０分程度を要するゆっくりとした筋収縮（以下、「緩行性筋収縮」と略記する）が起こることを開示している。そして、この緩行性筋収縮は、自然免疫促進作用の有無及び程度を評価する際に擬陽性の原因となっているリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を投与した場合には起こらず、手法も簡便なため、自然免疫促進作用の有無及び程度を評価するための実用的な指標として有効であることを確認している。
そして、前記「ローヤルゼリーを乳酸菌によって発酵を行って得られた生成物」に関して上記評価を行ったところ、緩行性筋収縮を示し、自然免疫促進作用を有することを見出した。また、かかる生成物の自然免疫促進作用の程度は、「発酵前のローヤルゼリーの自然免疫促進作用」より増強されていることも見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、少なくとも、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程を含むことを特徴とする自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法である。
また、本発明は、少なくとも、以下の工程（１）ないし（３）を含むことを特徴とする上記の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法である。
（１）乳酸菌を前培養する工程
（２）ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程、及び、
（３）乳酸菌の殺菌を行う工程
（１）乳酸菌を前培養する工程
（２）ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程、及び、
（３）乳酸菌の殺菌を行う工程
更に、本発明は、上記の「自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法」で製造されたものであることを特徴とするローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤である。
また、本発明は、少なくとも、以下の工程（ａ）ないし（ｃ）を含むスクリーニング方法で得られた上記のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤。
（ａ）自然免疫機構を有する生物に被検物質を投与する工程
（ｂ）前記被検物質が前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させるか否かを評価する工程
（ｃ）前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させると評価された物質を選択する工程
（ａ）自然免疫機構を有する生物に被検物質を投与する工程
（ｂ）前記被検物質が前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させるか否かを評価する工程
（ｃ）前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させると評価された物質を選択する工程
本発明によれば、「新規な自然免疫促進作用に優れたローヤルゼリー由来の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤」の製造方法を提供することができ、また、該製造方法で製造された、新規な自然免疫促進作用に優れた「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」を提供することができる。
以下、本発明について説明をするが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものではなく、本発明の技術的範囲内で任意に変形することができる。
本発明のローヤルゼリー由来の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法は、少なくとも、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程を含むことを特徴とする。
本発明における「ローヤルゼリー」（Ｒｏｙａｌ ｊｅｌｌｙ；ＲＪ）とは、ミツバチの若い働き蜂の、上顎と下顎の咽頭腺から分泌されるそれぞれ異なった成分が反応することにより生成される物質をいう。後述するように、乳酸菌で発酵できるローヤルゼリーであれば特に限定はなく本発明に用いることができる。ローヤルゼリーは、抗菌物質であるロイヤリシンや１０－ヒドロキシデセン酸を含むにも関わらず、乳酸菌による発酵を行うことができる。本発明の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法を用いることにより、乳酸菌がローヤルゼリーに含まれる生育阻害物質により阻害されずに自然免疫活性化剤を産生することができる。
ローヤルゼリーの原産国は、例えば、日本、中華人民共和国、台湾、タイ、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカ等を挙げることができ、何れの原産国のローヤルゼリーも好適に用いることができる。また、複数の原産国のローヤルゼリーを適宜混合して用いてもよい。発酵に用いるローヤルゼリーは、特に限定はないが、液状であることが好ましく、凍結乾燥状態のローヤルゼリーを用いる場合は、精製水、水道水、適当な緩衝液等で溶解して用いることが好ましい。また、凍結状態のローヤルゼリーは融解して用いることができる。
本発明における乳酸菌は、ローヤルゼリーを発酵して自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤を製造できる乳酸菌であれば特に制限なく用いることができる。具体的には、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属）、ビィフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）等に属する乳酸菌が挙げられる。
これらの中で好ましくは、ラクトバチルス ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス プランタリウム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス デルベッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）等のラクトバチルス属に属する乳酸菌や、又は、ラクトコッカス ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属に属する乳酸菌である。
特に好ましくは、ラクトバチルス ブレビスが挙げられ、例えば、ラクトバチルス ブレビス ＮＢＲＣ１２００５、ラクトバチルス ブレビス ＮＢＲＣ１２５２０、ラクトバチルス ブレビス ＮＢＲＣ３３４５、ラクトバチルス ブレビス ＮＢＲＣ３９６０、ラクトバチルス ブレビス ＮＢＲＣ１３１０９、ラクトバチルス ブレビス ＮＢＲＣ１３１１０等である。
これらの乳酸菌は単独で使用してもよく、２種以上の乳酸菌を使用してもよい。乳酸菌の培養は、静置培養、振とう培養、攪拌培養、通気培養、嫌気培養等の方法で培養することができる。また、静置培養中に乳酸菌が沈む等した場合は振とう、攪拌等を行い、乳酸菌を分散させてもよい。
乳酸菌として、ラクトバチルス ブレビス ＮＢＲＣ１２００５（以下、「ＮＢＲＣ１２００５株」と略することがある）を用いた場合における自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法を以下に説明するが、本発明は、ＮＢＲＣ１２００５株に限定されることはない。すなわち、以下の自然免疫活性化剤の製造方法は、ＮＢＲＣ１２００５株に限定されず、乳酸菌全てに適用が可能である。
＜前々培養工程＞
下記の前培養工程の前に、乳酸菌による発酵の効率化、乳酸菌の大量調製等のために前々培養工程を行うことが好ましい。前々培養液と乳酸菌を混合することにより前々培養が開始される。前々培養は、乳酸菌が生育できる培養条件であれば特に限定されないが、例えば、ＮＢＲＣ１２００５株の場合、前々培養液の培地組成としては、例えば、炭素源、窒素源、有機微量栄養素、金属類、脂質類等を単独又は２種以上を配合したものが挙げられる。好ましくは、グルコース、ペプトン、酵母エキス、金属類等の培地成分を挙げることができる。
下記の前培養工程の前に、乳酸菌による発酵の効率化、乳酸菌の大量調製等のために前々培養工程を行うことが好ましい。前々培養液と乳酸菌を混合することにより前々培養が開始される。前々培養は、乳酸菌が生育できる培養条件であれば特に限定されないが、例えば、ＮＢＲＣ１２００５株の場合、前々培養液の培地組成としては、例えば、炭素源、窒素源、有機微量栄養素、金属類、脂質類等を単独又は２種以上を配合したものが挙げられる。好ましくは、グルコース、ペプトン、酵母エキス、金属類等の培地成分を挙げることができる。
ＮＢＲＣ１２００５株を前々培養用の培地に植菌し、菌体の前々培養を行う。ＮＢＲＣ１２００５株の前々培養において、培養時間は半日～４日が好ましく、更に好ましくは１日～２日である。培養温度は１５～５０℃が好ましく、更に好ましくは２５～４０℃であり、初発ｐＨは３～９が好ましく、更に好ましくは５～８で前々培養を行う。このようにして得られた前々培養液を次の前培養工程に用いることが好ましい。
＜前培養工程＞
培養終了後の前々培養液を前培養工程に用いる際には、ＮＢＲＣ１２００５株を洗浄してもよいし、洗浄を行わず、前々培養で得られた前々培養液を、そのままの状態、又は、分離したＮＢＲＣ１２００５株の菌体を前培養液に植菌してもよい。また、前々培養終了後に前培養を行う場合、前培養液と前々培養終了後の乳酸菌又は培養液を混合する。前々培養終了後の培養液を混合する場合の混合割合は、前培養液１体積部に対して０．００１体積部～０．５体積部が好ましく、更に好ましくは０．００５体積部～０．２体積部に相当する培養液を混合することが、次の工程である発酵工程での発酵の効率が良い点で好ましい。
培養終了後の前々培養液を前培養工程に用いる際には、ＮＢＲＣ１２００５株を洗浄してもよいし、洗浄を行わず、前々培養で得られた前々培養液を、そのままの状態、又は、分離したＮＢＲＣ１２００５株の菌体を前培養液に植菌してもよい。また、前々培養終了後に前培養を行う場合、前培養液と前々培養終了後の乳酸菌又は培養液を混合する。前々培養終了後の培養液を混合する場合の混合割合は、前培養液１体積部に対して０．００１体積部～０．５体積部が好ましく、更に好ましくは０．００５体積部～０．２体積部に相当する培養液を混合することが、次の工程である発酵工程での発酵の効率が良い点で好ましい。
前培養工程は、グルタミン酸又はその塩を含む前培養液で乳酸菌を培養することが好ましい。乳酸菌を前培養する際には、前培養液に少なくともグルタミン酸又はその塩を含有させることが好ましい。グルタミン酸塩としては、例えば、グルタミン酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸マグネシウム、グルタミン酸カルシウム等が挙げられる。また、グルタミン酸は、プロテアーゼ及び／又はペプチダーゼで、「グルタミン酸を含有するタンパク質又はペプチド」を分解し、タンパク質又はペプチドから遊離させたグルタミン酸であってもよい。
前培養液は、更に培地成分を含有してもよい。培地成分としては、例えば、炭素源、窒素源、有機微量栄養素、金属類、脂質類等が挙げられる。これらは単独又は２種以上を含有してもよい。培地成分としては、好ましくは、グルコース、酵母エキス、ペプトン、金属類等を挙げることができる。
前培養工程でのグルタミン酸濃度、すなわち、前培養液と前々培養で得られた乳酸菌又は培養液（その乳酸菌の培養液）とを混合した後のグルタミン酸濃度は、０．１～５ｇ／１００ｍＬが好ましく、０．６～２ｇ／１００ｍＬがより好ましく、０．８～１．５ｇ／１００ｍＬが特に好ましい。前培養工程でのグルタミン酸濃度が低過ぎる場合、次の工程である発酵工程での発酵の効率が良くない場合がある。
前培養液と、前々培養で得られた乳酸菌又は培養液とを混合することにより、前培養が開始される。培養時間、温度、ｐＨ等の前培養条件は、グルタミン酸をγ－アミノ酪酸に変換できる前培養条件が好ましく、上記した前々培養における培養条件と同じでもよい。例えば、培養時間は半日～４日が好ましく、更に好ましくは１日～２日である。培養温度は１５～５０℃が好ましく、更に好ましくは２５～４０℃であり、初発ｐＨは３～９が好ましく、更に好ましくは５～８である。
前培養工程では、乳酸菌は、前培養工程開始直後のグルタミン酸又はその塩を、少なくとも１５ｇ／１００ｍＬ以上消費したものが、次工程で本発明のローヤルゼリー由来の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤が効率良く得られる点で好ましい。更に好ましい消費率は２０ｇ／１００ｍＬ以上であり、より好ましい消費率は５０ｇ／１００ｍＬ以上である。グルタミン酸又はその塩の濃度に応じて前培養工程でのグルタミン酸又はその塩の消費率は適宜調整することが可能である。グルタミン酸又はその塩を、上記範囲の消費率で消費してγ－アミノ酪酸に変換したものが好ましい。
＜発酵工程＞
前培養工程によって得られた乳酸菌を発酵に用いる際には、ＮＢＲＣ１２００５株を、滅菌水、滅菌した生理食塩水、滅菌した緩衝液等で洗浄してもよい。乳酸菌を洗浄した場合、ガラスフィルター、遠心分離等で余分な水分を除去してもよく、洗浄した乳酸菌を再度、滅菌水、滅菌した生理的食塩水又は滅菌した緩衝液に懸濁してもよい。更に、前培養終了後、上記のような洗浄を行わず、培養液そのままの状態、又は、ガラスフィルター、遠心分離等で培養上清を分離（菌体分離）した乳酸菌を発酵工程に用いてもよい。
前培養工程によって得られた乳酸菌を発酵に用いる際には、ＮＢＲＣ１２００５株を、滅菌水、滅菌した生理食塩水、滅菌した緩衝液等で洗浄してもよい。乳酸菌を洗浄した場合、ガラスフィルター、遠心分離等で余分な水分を除去してもよく、洗浄した乳酸菌を再度、滅菌水、滅菌した生理的食塩水又は滅菌した緩衝液に懸濁してもよい。更に、前培養終了後、上記のような洗浄を行わず、培養液そのままの状態、又は、ガラスフィルター、遠心分離等で培養上清を分離（菌体分離）した乳酸菌を発酵工程に用いてもよい。
また、必要な乳酸菌量を一度に発酵液と混合してもよいし、必要な乳酸菌量を２回以上に分けて混合してもよい。また、２種以上の乳酸菌を使用する場合は、それぞれの乳酸菌を同時に発酵液と混合してもよく、別々に分けて発酵液と混合してもよい。
前培養工程で得られた乳酸菌又は培養液と、発酵液の混合割合は、「乳酸菌又は培養液と発酵液の混合液」１体積部に対して、培養液０．０５～４体積部が好ましく、０．１～３体積部がより好ましく、０．２～１．５体積部が特に好ましい。
発酵工程は、前培養工程の後に行われ、ローヤルゼリー及び好ましくは「グルタミン酸又はその塩」を含む発酵液と、前培養液で得られた乳酸菌とを混合し、本発明のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤を生成する工程である。発酵液は、少なくともローヤルゼリーを含有することが必須であるが、グルタミン酸又はその塩を含有することが好ましい。ここで、「乳酸菌を混合する」とは、前培養工程で得られた乳酸菌を適当な手段（例えば、遠心分離）で分離した乳酸菌を、発酵液に混合する場合のみならず、培養液（前培養の培養液）の状態で乳酸菌を発酵液に混合する場合もいう。
発酵液と前培養工程で得られた乳酸菌又は培養液を混合したときのローヤルゼリーの固形分濃度は、１～２０ｇ／１００ｍＬが好ましく、より好ましくは３～１５ｇ／１００ｍＬ、特に好ましくは４～１０ｇ／１００ｍＬである。
また、発酵液は、自然免疫促進作用を増強させる点で、グルタミン酸又はその塩を含有することが好ましく、グルタミン酸塩として、グルタミン酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸マグネシウム、グルタミン酸カルシウムが例示される。含有されるグルタミン酸（塩）は、プロテアーゼ及び／又はペプチダーゼで「グルタミン酸を含有するタンパク質又はペプチド」を分解し、該タンパク質又はペプチドから遊離させたグルタミン酸（塩）であってもよい。
発酵工程でのグルタミン酸濃度、すなわち、発酵液と前培養工程で得られた乳酸菌又は培養液（その乳酸菌の培養液）とを混合した後のグルタミン酸濃度は、０．１～１０ｇ／１００ｍＬが好ましく、特に好ましくは１～５ｇ／１００ｍＬである。
発酵液は更に培地成分を含有してもよい。培地成分としては、例えば、炭素源、窒素源、有機微量栄養素、金属類、脂質類等が挙げられる。それらは単独又は２種以上で用いられる。培地成分としては、好ましくは、酵母エキス、ペプトン、金属類等を挙げることができる。
発酵液と前培養工程で得られた乳酸菌又は培養液とを混合することにより発酵が開始される。発酵時間、温度、ｐＨ等の発酵条件は特に限定されないが、発酵日数は半日～１０日が好ましく、更に好ましくは２日～６日である。発酵の温度は１５～５０℃が好ましく、更に好ましくは２５～４０℃である。発酵の初発ｐＨは３～９が好ましく、更に好ましくは５～８である。また、限定されないが、静置発酵が好ましい。
なお、本発明における「発酵」とは、乳酸菌と発酵液とを混合することにより目的とする「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」が産生されることであり、発酵液と乳酸菌の混合により微生物が増殖してもしなくてもどちらでも構わない。
＜殺菌工程＞
本発明における「自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法」は、更に乳酸菌の殺菌を行う工程を含むことが好ましい。殺菌方法としては、加熱により殺菌する方法、薬剤を用いて殺菌する方法、ろ過により乳酸菌を除菌する方法、遠心分離を用いて乳酸菌を除菌する方法等が例示でき、これら方法を単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせてもよい。好ましくは、加熱により乳酸菌を殺菌する方法であり、その際の加熱温度は６０℃以上が好ましく、より好ましくは８０～１００℃、特に好ましくは９０～１００℃である。加熱温度が低過ぎる場合には、乳酸菌が自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤として問題がない程度に殺菌できない場合があり、加熱温度が高過ぎる場合には、得られた自然免疫活性化剤が分解してしまう、高次構造が変化してしまう、等により活性を失う等の場合がある。
本発明における「自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法」は、更に乳酸菌の殺菌を行う工程を含むことが好ましい。殺菌方法としては、加熱により殺菌する方法、薬剤を用いて殺菌する方法、ろ過により乳酸菌を除菌する方法、遠心分離を用いて乳酸菌を除菌する方法等が例示でき、これら方法を単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせてもよい。好ましくは、加熱により乳酸菌を殺菌する方法であり、その際の加熱温度は６０℃以上が好ましく、より好ましくは８０～１００℃、特に好ましくは９０～１００℃である。加熱温度が低過ぎる場合には、乳酸菌が自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤として問題がない程度に殺菌できない場合があり、加熱温度が高過ぎる場合には、得られた自然免疫活性化剤が分解してしまう、高次構造が変化してしまう、等により活性を失う等の場合がある。
＜精製工程＞
本発明の「自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法」は、精製工程を有することが好ましい。精製方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動等が挙げられ、これら単独若しくは組み合わせることにより精製を行うことが好ましい。クロマトグラフィー等で精製する際に、予め遠心分離により上清を回収したものを用いることも好ましい。
本発明の「自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法」は、精製工程を有することが好ましい。精製方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動等が挙げられ、これら単独若しくは組み合わせることにより精製を行うことが好ましい。クロマトグラフィー等で精製する際に、予め遠心分離により上清を回収したものを用いることも好ましい。
ゲルろ過クロマトグラフィーは、種々の分子量のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体があり、架橋アガロース樹脂、シリカ粒子等を例示することができる。イオン交換クロマトグラフィーに用いられているイオン交換基としては、陰イオン交換体、陽イオン交換体等があり、陰イオン交換体としては、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ基）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ）等を例示することができる。また、陽イオン交換体としては、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホプロピル（ＳＰ）基等が挙げられる。本発明の自然免疫活性化剤の精製には、ジエチルアミノエチル基等を持つ陰イオン交換体が好ましい。
疎水クロマトグラフィーに用いられる担体としては、ブチル基（Ｂｕｔｙｌ基）、エチル基（Ｅｔｈｙｌ基）、フェニル基（Ｐｈｅｎｙｌ基）が結合した担体等が挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、オクタデシル基（Ｃ１８）、オクタデシル基とはアルキル基の長さが異なるＣ３０、Ｃ８、Ｃ４等が結合した担体等が挙げられる。
順相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、シリカゲルのほか、シアノプロピル基、ジオール構造を有する官能基、アミノプロピル基、ポリアミン等が結合した担体等が挙げられる。
順相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、シリカゲルのほか、シアノプロピル基、ジオール構造を有する官能基、アミノプロピル基、ポリアミン等が結合した担体等が挙げられる。
精製の結果、少なくとも多糖類が有効成分として得られた。従って、本発明は、多糖類を（有効成分として）含有する前記のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤でもある。好ましくは、酸性多糖類を（有効成分として）含有する前記のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤である。含有物のうち、多糖類又は酸性多糖類のみが自然免疫促進作用を有する可能性がある。その場合は、限定はされないが、本発明の「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」は、「多糖類又は酸性多糖類であるローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」である。
＜自然免疫活性化剤の利用・用途、発酵ローヤルゼリー組成物＞
本発明のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤は、ヒトの自然免疫（促進作用）を活性化させる剤として利用することができる。本発明の「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」は、服用して投与することが望ましい。また、ヒトが摂取する医薬品として利用することができるのみならず、食品に配合して利用することができる。また、家畜に投与することもできる。家畜の飼料に、サプリメント、栄養補助食品、医薬品等として配合してもよい。
本発明のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤は、ヒトの自然免疫（促進作用）を活性化させる剤として利用することができる。本発明の「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」は、服用して投与することが望ましい。また、ヒトが摂取する医薬品として利用することができるのみならず、食品に配合して利用することができる。また、家畜に投与することもできる。家畜の飼料に、サプリメント、栄養補助食品、医薬品等として配合してもよい。
有効成分を単離してから用いてもよい。また、剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤等が挙げられる。また、賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。
本発明のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤、その精製品、又は、単離された有効成分は、各種成分を含有させることにより、発酵ローヤルゼリー組成物とすることができる。かかる各種成分としては、例えば、糖、脂質、乳化剤、増粘剤、調味料、香料、酸味調整剤、保存料、果汁、香料、栄養成分等が挙げられ、本発明の効果を損なわない範囲で使用することができる。また、該各種成分は、単独で用いてもよいし２種以上を混合して用いてもよい。
例えば、糖としては、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等を例示することができる。乳化剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等を例示することができる。増粘剤としては、カラギーナン、アラビアガム、キサンタンガム、グァーガム、ペクチン、ローカストビーンガム増粘剤澱粉、ジェランガム等を例示することができる。酸味調整剤としては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、酒石酸等を例示することができる。保存料としては、安息香酸及びその塩、ソルビン酸及びその塩、パラベン、亜硫酸ナトリウム、ペクチン分解物、グリシン等を例示することができる。果汁としては、トマト果汁、梅果汁、リンゴ果汁、レモン果汁、オレンジ果汁、ベリー系果汁等を例示することができる。香料としては、ハーブ、スパイス等の香辛料、フルーツ系香料、バニラ等の香料等を例示することができる。栄養成分としては、ビタミンＤ等のビタミン類；カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類；等が挙げられる。
本発明の製造方法で得られる「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」、その精製品、単離された有効成分、又は、発酵ローヤルゼリー組成物は、食品に含有させることができる。そのような食品の具体的形態としては、例えば、飲料類、菓子、キャンディ、ガム、パン、畜肉製品、乳製品、レトルト食品、即席食品、冷凍食品、ゼリー状食品、養蜂産品、漬物、調味料等を挙げることができる。これらの食品は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメント等としても有用である。また、それらの食品としての形状としては、顆粒、粉末、タブレット、カプセル、チュアブル、ドリンク、ゼリー、ペースト、粒等を挙げることができる。
＜自然免疫促進作用の評価＞
自然免疫促進作用の有無・程度の評価は、ＷＯ ２００８／１２６９０５、ＷＯ ２００９／１５７４０９に記載の方法（下記に概要を記載した方法）によって行うことが好ましい。本発明の「少なくとも、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程を含むことを特徴とする製造方法で製造されたローヤルゼリー由来の剤」が、自然免疫促進作用がある自然免疫活性化剤であることは、上記国際公開パンフレットに記載の方法（下記に概要を記載した方法）によって見出され、また確認された。
自然免疫促進作用の有無・程度の評価は、ＷＯ ２００８／１２６９０５、ＷＯ ２００９／１５７４０９に記載の方法（下記に概要を記載した方法）によって行うことが好ましい。本発明の「少なくとも、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程を含むことを特徴とする製造方法で製造されたローヤルゼリー由来の剤」が、自然免疫促進作用がある自然免疫活性化剤であることは、上記国際公開パンフレットに記載の方法（下記に概要を記載した方法）によって見出され、また確認された。
更に、上記国際公開パンフレットに記載の方法（下記に概要を記載した方法）によって、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させると、原料であるローヤルゼリーより自然免疫促進作用が増強されることが見出され、本発明の「自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法」を提供することができた。
すなわち、カイコ等の完全変態型昆虫の幼虫に試料を投与した場合に、自然免疫促進作用を有する物質を完全変態型昆虫の幼虫に投与した場合には、その完了に１０分程度を要するゆっくりとした筋収縮（以下、「緩行性筋収縮」と略記する）が起こる。そしてこの緩行性筋収縮は、自然免疫促進作用を評価する際に擬陽性の原因となっているリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を投与した場合には起こらないので、自然免疫促進作用を評価するための実用的な指標として用いることができる。
本発明のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤は、少なくとも、以下の工程（ａ）ないし（ｃ）を含むスクリーニング方法で得られたものであるのが好ましく、必要に応じて更にその他の工程を含んでもよい。
（ａ）自然免疫機構を有する生物に被検物質を投与する工程
（ｂ）前記被検物質が前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させるか否かを評価する工程
（ｃ）前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させると評価された物質を選択する工程
（ａ）自然免疫機構を有する生物に被検物質を投与する工程
（ｂ）前記被検物質が前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させるか否かを評価する工程
（ｃ）前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させると評価された物質を選択する工程
自然免疫機構を有する生物に投与した際の緩行性筋収縮活性の大きさで自然免疫促進活性作用の大きさを評価することが、自然免疫促進作用の大きさの評価が正確であるために好ましい。
「自然免疫機構を有する生物」としては、昆虫類に属する生物が好ましい。前記「昆虫類」とは、節足動物門大顎亜門の一網であって、カマアシムシ類、トビムシ類、無翅昆虫類、及び有翅昆虫類の４亜綱からなる綱を意味する。「昆虫類に属する生物」としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、取り扱いの便宜性の点で、幼虫であることが好ましい。前記幼虫としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鱗翅目（ガやチョウを含む）、甲虫目（カブトムシを含む）の幼虫等が挙げられる。なお、前記幼虫は、前記被検物質の投与のし易さ等の点で、大型の幼虫であることが好ましい。前記「大型の幼虫」とは、体長が１ｃｍ以上である幼虫を指す。前記幼虫としては、例えば、カイコ（カイコガの幼虫）、エリサンの幼虫等が好ましい。
自然免疫機構を有する生物としては、工程（ｂ）において被検物質による筋肉の収縮の程度を測定し易い生物を使用することが好ましく、この点でも、カイコは特に好適である。また、カイコとしては、例えば、後述する実施例に示すように、カイコの断頭筋肉標本を使用することも好ましい。カイコの断頭筋肉標本を使用すると、中枢からの信号の入力を排除できるという点で有利である。
被検物質の自然免疫機構を有する生物への投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入、飼料（餌）への添加等が挙げられる。また、前記自然免疫機構を有する生物への前記被検物質の投与量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
被検物質が自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させるか否かを評価する（工程（ｂ））。前記被検物質が前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させるか否かを評価する方法としては、例えば、前記自然免疫機構を有する生物の筋肉の収縮の程度をContraction value値（Ｃ値）（筋収縮値）で表すことにより評価する（例えば、Ishii K., Hamamoto H., Kamimura M., Sekimizu K., J.Biol.Chem.Jan.25;283(4):2185-91（2008）参照）。
具体的には、前記被検物質の投与前、及び投与後の前記自然免疫機構を有する生物の体長を測定し、「投与前の体長」－「投与後の体長」を、「投与前の体長」で割り算した筋収縮値（Ｃ値）を求める。筋肉収縮の程度が大きいほどＣ値は大きくなり、筋肉収縮が全くなければＣ値は０となる。また、逆に筋肉が弛緩すればＣ値は負（マイナス）の値となる。筋収縮の過程を適当な方法、例えば記録計に連結したトランスジューサーを用いてモニターし、筋収縮の程度が最大となったときのＣ値を測定することが適当である。筋収縮に必要な時間は、投与した前記被検物質の種類や量等に応じて変化するので、適宜選択する。
筋収縮値（Ｃ値）が正（プラス）の値であるときに、該被検物質は自然免疫促進作用を有すると評価する。また、筋収縮値（Ｃ値）が大きいほど、該被検物質は自然免疫促進作用が大きいと評価することができる。ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させることによって、発酵前のローヤルゼリーより筋収縮値（Ｃ値）が大きくなれば、自然免疫促進作用が増強されたと評価することができる
完全変態型昆虫の幼虫に投与した際の緩行性筋収縮の大きさで自然免疫促進作用が評価できる機序は以下の通りである。すなわち、自然免疫機能を促進する物質（ペプチドグリカン、β－グルカン等が例示される）が、自然免疫系を持つ生物の体内に入ると免疫担当細胞の受容体に結合し、その結果として活性酸素種が産生され、それが完全変態型昆虫の幼虫の場合には麻痺ペプチドであるＢｍＰＰの活性化をもたらし、活性化されたＢｍＰＰが筋肉細胞に作用して筋肉の収縮を促すというメカニズムである。
筋収縮はこれ以外に神経伝達物質が作用した場合にも起こるが、その場合の筋収縮は試料を投与してから数秒以内に終了する速い反応であるのに対して、自然免疫系が活性化された場合の筋収縮は、収縮の完了に約１０分程度を要する緩行性筋収縮なので、両者は明確に区別することができる。
また、この評価方法は、マクロファージ等の免疫担当細胞を用いた評価方法に比べて体内動態を反映できるという利点がある。更に、培養細胞を用いて評価を行う場合に、「自然免疫促進作用の可能性があるとされて擬陽性物質と評価されてしまい問題となるＬＰＳ」の影響を受けない（ＬＰＳは自然免疫機能活性化作用があると評価されない）という利点もある。
そのため、精製の進んでいないさまざまな成分を含んでいる可能性もある組成物の自然免疫促進作用の評価が行えるので、本発明には特に適した指標となっている。従って、これを指標として評価した結果、自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させると評価された物質を選択する工程を経て（工程（ｃ））、本発明の製造方法が、優れた自然免疫活性化剤の製造方法として見出された。
被検物質を用いて前記工程（ａ）～工程（ｂ）による評価を行い、次いで、工程（ｃ）において、種々の被検物質の中から前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させると評価された物質を選択することにより、容易に、かつ効率的に自然免疫活性化剤をスクリーニングすることができる。
以下、実施例、検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。以下、単に「％」とあるのは、特に限定のない限り、「質量％」を意味する。
［自然免疫活性化剤の調製］
実施例１
＜前々培養工程＞
３００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに、１００ｍＬの１％グルコース、１％酵母エキスからなる液体培地（ｐＨ７．２）と１ｍＬの１０％マンガン酵母液を入れ、シリコ栓（登録商標）をして、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、液体培地を作成した。
液体培地にグリセロールストックしたＮＢＲＣ１２００５株を５０μＬ添加し、３０℃で１日間静置培養を行った。次に、上記と同様に作成した液体培地にＮＢＲＣ１２００５株の培養液を３ｍＬ添加し、３０℃で１日間静置培養を行い、ＮＢＲＣ１２００５株の前々培養を行った。
実施例１
＜前々培養工程＞
３００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに、１００ｍＬの１％グルコース、１％酵母エキスからなる液体培地（ｐＨ７．２）と１ｍＬの１０％マンガン酵母液を入れ、シリコ栓（登録商標）をして、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、液体培地を作成した。
液体培地にグリセロールストックしたＮＢＲＣ１２００５株を５０μＬ添加し、３０℃で１日間静置培養を行った。次に、上記と同様に作成した液体培地にＮＢＲＣ１２００５株の培養液を３ｍＬ添加し、３０℃で１日間静置培養を行い、ＮＢＲＣ１２００５株の前々培養を行った。
＜前培養工程＞
５Ｌ容ＭＢＳ社製ミニジャーファメンターに、３Ｌの１％グルコース、１％酵母エキスからなる液体培地（ｐＨ７．２）と１ｍＬの１０％マンガン酵母液を投入し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。オートクレーブ滅菌（１２１℃で１５分）した４０％グルタミン酸ナトリウム１水和物溶液を７５ｍＬ添加し前培養液を調製した。
次に前々培養により得られた培養液を９０ｍＬ添加し、１日間前培養を行った。なお、培養温度は３０℃、通気なしで静置培養を行った。
５Ｌ容ＭＢＳ社製ミニジャーファメンターに、３Ｌの１％グルコース、１％酵母エキスからなる液体培地（ｐＨ７．２）と１ｍＬの１０％マンガン酵母液を投入し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。オートクレーブ滅菌（１２１℃で１５分）した４０％グルタミン酸ナトリウム１水和物溶液を７５ｍＬ添加し前培養液を調製した。
次に前々培養により得られた培養液を９０ｍＬ添加し、１日間前培養を行った。なお、培養温度は３０℃、通気なしで静置培養を行った。
＜発酵工程＞
１０Ｌ容ＭＢＳ社製ジャーファメンターに、３Ｌの２％酵母エキス、６０ｍＬの１０％マンガン酵母液からなる発酵用培地を投入し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。
次に、天然の生ローヤルゼリー（固形分濃度が３４％）を、１ＮのＮａＯＨでｐＨ６．７に調整した後、精製水で１．６倍希釈したローヤルゼリー希釈液１．２Ｌ及びオートクレーブ滅菌（１２１℃で１５分）した４０％グルタミン酸ナトリウム１水和物溶液０．６Ｌからなる発酵液に、前培養により得られた培養液１．２Ｌを添加し、５日間発酵を行った。発酵温度は３０℃、通気なしで静置発酵を行った。ただし、発酵中は１日に１回攪拌を行った。なお、上記１０％マンガン酵母液に不溶性の沈殿がある場合には、１５分間室温で放置し、上清を１０％マンガン酵母液とした。
１０Ｌ容ＭＢＳ社製ジャーファメンターに、３Ｌの２％酵母エキス、６０ｍＬの１０％マンガン酵母液からなる発酵用培地を投入し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。
次に、天然の生ローヤルゼリー（固形分濃度が３４％）を、１ＮのＮａＯＨでｐＨ６．７に調整した後、精製水で１．６倍希釈したローヤルゼリー希釈液１．２Ｌ及びオートクレーブ滅菌（１２１℃で１５分）した４０％グルタミン酸ナトリウム１水和物溶液０．６Ｌからなる発酵液に、前培養により得られた培養液１．２Ｌを添加し、５日間発酵を行った。発酵温度は３０℃、通気なしで静置発酵を行った。ただし、発酵中は１日に１回攪拌を行った。なお、上記１０％マンガン酵母液に不溶性の沈殿がある場合には、１５分間室温で放置し、上清を１０％マンガン酵母液とした。
５日間の発酵終了後、１０５℃で３０分間過加熱し滅菌を行い、凍結乾燥によって本発明の「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」を得た。この凍結乾燥された自然免疫活性化剤のγ－アミノ酪酸含量は２７．４％であった。
［自然免疫促進作用の測定］
（１）カイコ筋標本の作成
以下に記載の通り、カイコの緩行性筋収縮の測定を用いて自然免疫活性の評価を行った。緩行性筋収縮の測定は、Ishii K., Hamamoto H., Kamimura M., Sekimizu K., J.Biol.Chem.Jan.25;283(4):2185-91（2008） に記載の方法に従って行った。
すなわち、５齢１日目から抗生物質含有の人工餌（シルクメイト２Ｓ、日本農産工業）を与えて飼育した５齢５日目のカイコ（体重約５ｇ）の眼状紋のやや下辺を解剖バサミで切断し、腸管及び絹糸腺をピンセットで取り除いた。次に、半月状の解剖針を用いて、２０ｃｍ程度の長さのミシン糸を切断面よりやや下辺に通し、輪を作るように糸の両端を結んだ。カイコの尾脚部分には２０ｃｍのミシン糸を縛りつけた後、重さ２７ｇのクリップを糸に通し、糸の両端を結んで、カイコ筋標本を作成した。作成した標本はスタンドに１～２時間吊るして安定化させた。
（１）カイコ筋標本の作成
以下に記載の通り、カイコの緩行性筋収縮の測定を用いて自然免疫活性の評価を行った。緩行性筋収縮の測定は、Ishii K., Hamamoto H., Kamimura M., Sekimizu K., J.Biol.Chem.Jan.25;283(4):2185-91（2008） に記載の方法に従って行った。
すなわち、５齢１日目から抗生物質含有の人工餌（シルクメイト２Ｓ、日本農産工業）を与えて飼育した５齢５日目のカイコ（体重約５ｇ）の眼状紋のやや下辺を解剖バサミで切断し、腸管及び絹糸腺をピンセットで取り除いた。次に、半月状の解剖針を用いて、２０ｃｍ程度の長さのミシン糸を切断面よりやや下辺に通し、輪を作るように糸の両端を結んだ。カイコの尾脚部分には２０ｃｍのミシン糸を縛りつけた後、重さ２７ｇのクリップを糸に通し、糸の両端を結んで、カイコ筋標本を作成した。作成した標本はスタンドに１～２時間吊るして安定化させた。
（２）トランスデューサー端子への筋標本の取り付け
トランスデューサー端子のキャリブレーションを行い、端子をスタンドに水平に固定した後、端子の一端に重さ２７ｇのクリップを取り付け、もう一端にはクリップを外したカイコ筋標本を取り付けて、両端のバランスを調整した。
トランスデューサー端子のキャリブレーションを行い、端子をスタンドに水平に固定した後、端子の一端に重さ２７ｇのクリップを取り付け、もう一端にはクリップを外したカイコ筋標本を取り付けて、両端のバランスを調整した。
（３）カイコ筋収縮試験
オートクレーブ滅菌した０．９％ＮａＣｌ水溶液で自然免疫活性化剤の濃度２００ｍｇ／ｍＬの懸濁液を調製した。次に、０．９％ＮａＣｌ水溶液を用いて１／４、１／１６、１／６４、１／２５６に希釈した懸濁液を調製した。これらの懸濁液を１ｍＬツベルクリンシリンジにとり、２７ゲージの注射針を用いて０．０５ｍＬずつトランスデューサー端子に取り付けたカイコ筋標本に注射した。６分後に筋収縮前後の筋標本の長さを物差しで計測し、筋収縮値を以下の通り算出した。
Ｃ値（筋収縮値）＝（［収縮前の長さ］－［収縮後の長さ］）／［収縮前の長さ］
オートクレーブ滅菌した０．９％ＮａＣｌ水溶液で自然免疫活性化剤の濃度２００ｍｇ／ｍＬの懸濁液を調製した。次に、０．９％ＮａＣｌ水溶液を用いて１／４、１／１６、１／６４、１／２５６に希釈した懸濁液を調製した。これらの懸濁液を１ｍＬツベルクリンシリンジにとり、２７ゲージの注射針を用いて０．０５ｍＬずつトランスデューサー端子に取り付けたカイコ筋標本に注射した。６分後に筋収縮前後の筋標本の長さを物差しで計測し、筋収縮値を以下の通り算出した。
Ｃ値（筋収縮値）＝（［収縮前の長さ］－［収縮後の長さ］）／［収縮前の長さ］
筋収縮のポジティブ対照には、空気、酵母β－グルカン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５０１１）、メカブフコイダン（理研ビタミン）を用い、ネガティブ対照には０．９％ＮａＣｌ水溶液を用いた。
（４）データ解析
各筋標本に投与したサンプルの重量（ｍｇ）の対数を横軸に、Ｃ値（筋収縮値）を縦軸にプロットし、カレイダグラフバージョン４．０（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して非線形回帰カーブフィッティングを行なって用量応答曲線を作成した。得られた用量応答曲線から、Ｃ値（筋収縮値）＝０．１５を与えるサンプルの重量（ｍｇ）を求め（これを１活性単位（ｕｎｉｔ）と定義する）、検体１ｍｇ当りの活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。表１及び図１にこれらの結果を示す。
各筋標本に投与したサンプルの重量（ｍｇ）の対数を横軸に、Ｃ値（筋収縮値）を縦軸にプロットし、カレイダグラフバージョン４．０（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して非線形回帰カーブフィッティングを行なって用量応答曲線を作成した。得られた用量応答曲線から、Ｃ値（筋収縮値）＝０．１５を与えるサンプルの重量（ｍｇ）を求め（これを１活性単位（ｕｎｉｔ）と定義する）、検体１ｍｇ当りの活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。表１及び図１にこれらの結果を示す。
比較例１
実施例１で原料として用いたローヤルゼリーの凍結乾燥品を実施例１と同様に評価した。結果を表１、図１に示す。
実施例１で原料として用いたローヤルゼリーの凍結乾燥品を実施例１と同様に評価した。結果を表１、図１に示す。
参考例１
酵母β－グルカンは、オリエンタル酵母社製、メカブフコイダンは、理研ビタミン社製のものを用い、実施例１、比較例１と同様にして自然免疫促進作用の測定をした。結果を表１、図１に示す。
酵母β－グルカンは、オリエンタル酵母社製、メカブフコイダンは、理研ビタミン社製のものを用い、実施例１、比較例１と同様にして自然免疫促進作用の測定をした。結果を表１、図１に示す。
比較例２
野菜（ミニトマト、ホウレンソウ、ダイコン、ショウガ）を凍結乾燥し、乳鉢で粉砕した後、各サンプル１ｇに対して５ｍＬの蒸留水を加え、８０００ｒｐｍ、５分の遠心を施した。沈殿に蒸留水３ｍＬを加え、オートクレーブ器を用いて、１２１℃にて２０分加熱処理した。これを室温にて８０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を得て、熱水抽出物とした。熱水抽出物サンプルを、希釈率０．００１～１質量％となるように０．９％ＮａＣｌで希釈し、０．０５ｍＬをカイコの断頭筋肉標本の体腔内に注射し、６分後に体長を測定し、実施例１と同様にして自然免疫促進作用の測定をした（表１）。ここで「希釈率」とは、０．９％ＮａＣｌ水溶液で希釈した液全体に対する上記熱水抽出物サンプルの質量％である。
野菜（ミニトマト、ホウレンソウ、ダイコン、ショウガ）を凍結乾燥し、乳鉢で粉砕した後、各サンプル１ｇに対して５ｍＬの蒸留水を加え、８０００ｒｐｍ、５分の遠心を施した。沈殿に蒸留水３ｍＬを加え、オートクレーブ器を用いて、１２１℃にて２０分加熱処理した。これを室温にて８０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を得て、熱水抽出物とした。熱水抽出物サンプルを、希釈率０．００１～１質量％となるように０．９％ＮａＣｌで希釈し、０．０５ｍＬをカイコの断頭筋肉標本の体腔内に注射し、６分後に体長を測定し、実施例１と同様にして自然免疫促進作用の測定をした（表１）。ここで「希釈率」とは、０．９％ＮａＣｌ水溶液で希釈した液全体に対する上記熱水抽出物サンプルの質量％である。
本発明の自然免疫活性化剤の投与では、酵母由来β－グルカンやメカブフコイダンには劣るものの、自然免疫促進作用を有していた。そして、その効果は原料である凍結乾燥ローヤルゼリーよりも１００倍以上優れており、本発明の効果を確認することができた。更に、比較した各種野菜よりも高い自然免疫促進作用を有することが分かった。
また、本発明のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤の投与では、酵母由来β－グルカンと同様に濃度依存的に筋収縮し、その比活性は０．５０Ｕ／ｍｇであった（図１、表１）。本発明の自然免疫活性化剤の原材料である凍結乾燥ローヤルゼリーとの比較から、自然免疫促進作用は発酵処理によっては１７５倍増強され（図２、表１）、本発明の「乳酸菌で発酵させることによる効果」を確認することができた。
検体の溶媒である０．９％ＮａＣｌ水溶液を投与した場合には筋収縮は起こらず（筋収縮値＝０．００）、ポジティブ対照である空気では収縮が起きた（筋収縮値＝０．４３）。なお、酵母β－グルカンやメカブフコイダンでは濃度依存的に収縮が起こり、用量応答曲線から算出した比活性はそれぞれ７７Ｕ／ｍｇと２．０Ｕ／ｍｇであった。
実施例２
［自然免疫活性化剤の有効成分の分離］
（１）熱水抽出液の調製
実施例１で得られた「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」の粉末１０ｇに０．９％ＮａＣｌ水溶液を５０ｍＬ加えて２００ｍｇ／ｍＬの懸濁液を調製した。次に、オートクレーブを用いて１２１℃で２０分間加熱した。懸濁液の冷却後、高速遠心機（日立工機ＣＲ－２１、ローターＲ１０Ａ２）を用い、室温で８０００ｒｐｍ５分間の遠心分離によって上清４８ｍＬ（熱水抽出液画分）を得た。次に、この遠心上清を１６ｍＬずつ分注し、９９．５％エタノールをそれぞれ３２ｍＬずつ加えて良く攪拌し、室温で８０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で１．５ｇ（乾燥重量）の白色沈殿（エタノール沈殿画分）を得た。沈殿４００ｍｇを８ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）に溶解し、１５０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で上清を回収し、これを陰イオン交換クロマトグラフィーの出発材料とした。
［自然免疫活性化剤の有効成分の分離］
（１）熱水抽出液の調製
実施例１で得られた「ローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤」の粉末１０ｇに０．９％ＮａＣｌ水溶液を５０ｍＬ加えて２００ｍｇ／ｍＬの懸濁液を調製した。次に、オートクレーブを用いて１２１℃で２０分間加熱した。懸濁液の冷却後、高速遠心機（日立工機ＣＲ－２１、ローターＲ１０Ａ２）を用い、室温で８０００ｒｐｍ５分間の遠心分離によって上清４８ｍＬ（熱水抽出液画分）を得た。次に、この遠心上清を１６ｍＬずつ分注し、９９．５％エタノールをそれぞれ３２ｍＬずつ加えて良く攪拌し、室温で８０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で１．５ｇ（乾燥重量）の白色沈殿（エタノール沈殿画分）を得た。沈殿４００ｍｇを８ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）に溶解し、１５０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で上清を回収し、これを陰イオン交換クロマトグラフィーの出発材料とした。
（２）陰イオン交換クロマトグラフィーによる多糖類の分離
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で平衡化した、２０ｍＬのＤＥＡＥ－セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ社、ＤＥ５２）を充填したカラムに８ｍＬの試料水溶液をアプライし、１００ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）でカラムを洗浄した後、１００ｍＬの０．４Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で吸着画分を溶出し、５ｍＬずつ４２本のフラクションに分画した。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で平衡化した、２０ｍＬのＤＥＡＥ－セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ社、ＤＥ５２）を充填したカラムに８ｍＬの試料水溶液をアプライし、１００ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）でカラムを洗浄した後、１００ｍＬの０．４Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で吸着画分を溶出し、５ｍＬずつ４２本のフラクションに分画した。
各フラクションについて、フェノール－硫酸法で全糖量を定量し、また、自然免疫促進作用を測定した。陰イオン交換クロマトグラフィー画分の糖含量と筋収縮値（Ｃ値）（自然免疫促進作用）の結果を表２に示す。
（３）フェノール－硫酸法による糖定量
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で１０倍希釈した各画分０．１ｍＬに、５（ｗ／ｖ）％フェノール水溶液を０．１ｍＬ加え、５秒間ボルテックスミキサーで撹拌した後、濃硫酸０．５ｍＬを加えて撹拌し、室温で２０分間反応させた。各反応液を０．２ｍＬずつ９６穴ミクロプレートに分注し、４９０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＭＴＰ－３００、コロナ電気）で測定した。検量線は、Ｄ－グルコースを標準試料として作成した。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で１０倍希釈した各画分０．１ｍＬに、５（ｗ／ｖ）％フェノール水溶液を０．１ｍＬ加え、５秒間ボルテックスミキサーで撹拌した後、濃硫酸０．５ｍＬを加えて撹拌し、室温で２０分間反応させた。各反応液を０．２ｍＬずつ９６穴ミクロプレートに分注し、４９０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＭＴＰ－３００、コロナ電気）で測定した。検量線は、Ｄ－グルコースを標準試料として作成した。
（４）分画フラクションの濃縮
各フラクション３．０ｍＬに９９．５％エタノールを６．０ｍＬずつ加え、良く攪拌した後、室温で８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、沈殿を回収した。乾燥した沈殿に０．９％ＮａＣｌ水溶液を０．５ｍＬずつ加えて溶解し、６倍濃縮液を調製した。
各フラクション３．０ｍＬに９９．５％エタノールを６．０ｍＬずつ加え、良く攪拌した後、室温で８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、沈殿を回収した。乾燥した沈殿に０．９％ＮａＣｌ水溶液を０．５ｍＬずつ加えて溶解し、６倍濃縮液を調製した。
（５）分画フラクション濃縮液の筋収縮値（Ｃ値）の測定
カイコ筋標本にフラクション６倍濃縮液を０．２ｍＬずつ注射した。ものさしを用いて筋標本の長さを測定して、筋収縮値（Ｃ値）＝（［収縮前の長さ］－［収縮後の長さ］）／［収縮前の長さ］）を算出した（表２）。カイコ筋収縮のポジティブ対照には空気を、ネガティブ対照には０．９％ＮａＣｌ水溶液を用いた。
カイコ筋標本にフラクション６倍濃縮液を０．２ｍＬずつ注射した。ものさしを用いて筋標本の長さを測定して、筋収縮値（Ｃ値）＝（［収縮前の長さ］－［収縮後の長さ］）／［収縮前の長さ］）を算出した（表２）。カイコ筋収縮のポジティブ対照には空気を、ネガティブ対照には０．９％ＮａＣｌ水溶液を用いた。
ＤＥＡＥ－セルロースカラムクロマトグラフィーで、自然免疫活性化剤の熱水抽出液中に含まれる多糖類は画分６及び２７を中心とする２個のピークに分離した。糖の回収率は５８％であった。
糖のピーク１（画分４～６）及びピーク２（画分２６～３０）は共に筋収縮活性（自然免疫促進作用）を示した。この時、サンプルの溶媒である０．９％ＮａＣｌ水溶液を投与してもカイコの筋収縮は起こらなかったが（筋収縮値＝０．００）、ポジティブ対照である空気では収縮が起きた（筋収縮値＝０．３８）。
表１及び図１、２に示すように、乳酸菌を用いた発酵処理によって、出発材料の凍結乾燥ローヤルゼリーよりも著しく高い自然免疫促進作用を有する自然免疫活性化剤が得られた。表２から、その活性成分は２種類存在した。また、多糖類であり、酸性多糖類であると推認された。
本発明における自然免疫活性化剤は、天然のローヤルゼリーに由来するので安全性が高く、自然免疫増強剤として、機能性食品、食品、医薬品等の添加剤として広く利用することができる。
本願は、２０１１年２月７日に出願した日本の特許出願である特願２０１１－０２４０４０に基づくものであり、その出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
Claims (7)
- 少なくとも、ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程を含むことを特徴とする自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法。
- 少なくとも、以下の工程（１）ないし（３）を含むことを特徴とする請求項１に記載の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法。
（１）乳酸菌を前培養する工程
（２）ローヤルゼリーを乳酸菌で発酵させる工程、及び、
（３）乳酸菌の殺菌を行う工程 - 上記乳酸菌がラクトバチルス ブレビスである請求項１又は請求項２に記載の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法。
- 上記（３）乳酸菌の殺菌を行う工程が、加熱により乳酸菌を殺菌する工程である請求項２又は請求項３に記載の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法。
- 請求項１ないし請求項４の何れかの請求項に記載の自然免疫促進作用が増強された自然免疫活性化剤の製造方法で製造されたものであることを特徴とするローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤。
- 酸性多糖類を含有する請求項５に記載のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤。
- 少なくとも、以下の工程（ａ）ないし（ｃ）を含むスクリーニング方法で得られた請求項５又は請求項６に記載のローヤルゼリー由来の自然免疫活性化剤。
（ａ）自然免疫機構を有する生物に被検物質を投与する工程
（ｂ）前記被検物質が前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させるか否かを評価する工程
（ｃ）前記自然免疫機構を有する生物の筋肉を収縮させると評価された物質を選択する工程
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