CN103327992A - 用于预防或治疗炎性疾病的包含络石藤提取物和牡丹皮提取物的药物组合物以及制备该药物组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物以及制备该药物组合物的方法，所述药物组合物包含作为活性成分的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物。此外，还提供用于预防或改善炎症的全部基于所述混合物的准药组合物、保健功能食品组合物和化妆品组合物。此外，本发明涉及通过向疑似患有炎性疾病的个体给予所述药物组合物治疗炎性疾病的方法。包含提取物混合物的组合物与单个提取物相比表现出优异的抗炎活性和水肿抑制活性，由此能用于预防、治疗或改善炎性疾病。作为天然物质，提取物与合成药物相比能用作相对无真菌感染或其它副作用的安全疗法。此外，包括抗菌活性、骨强化、消炎活性、血液滋养、滋补等在内的来自络石藤和牡丹皮的提取物的已知生理活性可以产生对预防、治疗和改善炎性疾病的协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及用于预防和治疗炎性疾病的药物组合物以及制备该药物组合物的方法，所述药物组合物包含作为活性成分的来自络石藤(Trachelospermi Caulis)和牡丹皮(Paeonia Suffruticosa Andrews)的提取物混合物。此外，本发明涉及用于预防或改善炎症的准药物组合物、保健功能食品组合物以及化妆品组合物，其包含作为活性成分的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物。此外，本发明涉及用于治疗炎性疾病的方法，其包括向疑似患有炎性疾病的个体给予药物组合物。
背景技术
炎性疾病是炎症作为其主要破坏因子的疾病的统称。炎症为组织对有害刺激的生物反应，其是一种病变，并且伴随有组织退化、循环紊乱和液体渗出三种事件，以及肥大。炎性疾病的实例包括急性和慢性疾病，具体地为(但不限于)水肿、皮炎、过敏症、特应性、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化。
关节是两个或两个以上的骨骼进行接触所在的位置，通常包括用作减震体的软骨组织。关节炎是涉及一个或一个以上关节的炎症的关节病症形式。其是伴随有在受感染关节处产生水肿、疼痛和僵硬的慢性疾病类型。在严重的情况中，关节炎导致残疾。特别地，类风湿性关节炎在大部分生活中是进行性的，导致关节畸形。通常，缺乏有效的治疗和疾病的聚集导致严重的身体残疾。疾病控制和预防中心(CDC)和关节炎基金会(AF)已报道了美国在1997年估计关节炎和其它风湿性疾病影响超过四千三百万人，相当于人口的五分之一，并且预计到2020年影响七千万人，是2020年人口的三分之一，并补充表示患有关节炎的患者数量将随人口老化而持续增加。在韩国，估计在2005年多达一千万人受关节炎影响。尽管在关节处具有类似的炎性症状，但关节炎根据其诱因而具有多种形式。最普遍的形式为骨关节炎(退行性关节疾病)和类风湿性关节炎。其它关节炎形式包括痛风和强直性脊柱炎。在下面表1中将关节炎的形式分类。
[表1]
类风湿性关节炎是可以影响许多组织和器官但主要侵袭滑液关节的慢性全身性炎性疾病。自身免疫，即对自体细胞过量的免疫反应，在慢性和进行性类风湿性关节炎中起到关键作用。炎症在受免疫系统侵袭的细胞中出现。随着时间的推移，类风湿性关节炎几乎总是影响多个关节，主要通常为手部、足部和颈椎的小关节，但也能涉及肘部、髋关节和膝部的更大的关节。在年龄为25至50岁之间的女性中发作是最频繁的，并且伴随有在发作之后的随后10年内身体残疾。
在发作后，类风湿性关节炎在滑液衬里边缘处与肉芽组织(还称为“血管翳”)的形成一同发展，这导致关节软骨的破坏、关节的变形以及关节的骨骼弱化。具有血管翳的滑液组织产生并释放包括细胞因子、趋化因子等在内的各种促炎性分子。此外，最近还报道了组织释放大量的IL-6和IL-8(已知涉及关节的损害和破坏)以及TNF-α、IL-1β、IL-15和IL-18。已涉及多个细胞类型作为在类风湿性关节的病理生理学过程中的主要促进因子，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、滑膜细胞和软骨细胞，并且它们形成关节的分裂，产生损害关节软骨和骨骼的类风湿性关节炎诱导物。
存在已经发展为用于类风湿性关节炎的药物的多种合成化合物。然而，FDA责令医药公司对依那西普(Enbrel)、修美乐(Humira)、瑞米凯德(Remicade)和塞妥珠单抗(Cimzia)添加与增加的潜在致命真菌感染风险相关的新的黑框警告。FDA指出TNF阻断剂尽管缓解了肿胀关节的疼痛，但其抑制免疫系统使身体易受各种感染的侵害，特别警告了在摄取该药物的人中组织胞浆菌病的发作。FDA已经收到240例摄取TNF阻断剂的患者出现组织胞浆菌病的报告。在240名患者中，45名患者(相当于多达约20%的受感染患者)死亡，包括至少12名没有立即诊断出患有组织胞浆菌病的患者。此外，韩国食品和药物管理局(KFDA)宣布，关于药物副作用，与日本摄取类风湿性关节炎药物的130人的死亡相关的报告被传送至韩国医学会和韩国韩国药物协会，强调当摄取用作关节炎用药物的活性成分的甲氨蝶呤时，必须将主治医师和药剂师的指导发给患者，因为该成分可能诱发严重的副作用，例如间质性肺炎和骨髓抑制。用于类风湿性关节炎的合成药物的已知和未知(但很可能)的副作用、例如真菌感染等最近已指引研发朝向能安全地用于治疗类风湿性关节炎的天然草药成分。因此，已经引入了由草药成分制成的多种类风湿关节炎药物。
常规关节炎药物包括：非甾体类炎性药物(NSAIDS)，其被预期仅产生疼痛缓解；肾上腺皮质激素剂，其表现出抗炎性活性和治疗作用；以及抗风湿药物，其能治疗风湿性关节炎。其中典型的抗风湿药物为：免疫调节剂，例如青霉胺和布西拉明；免疫抑制剂，例如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和金盐；以及抗疟剂羟氯喹，它们中的两种或更多种通常组合使用。近五年来，在关节炎药物中已出现许多改变。已经开发了控制疼痛并预防产生许多并发症的药物，例如TNF阻断剂和COX-2抑制剂。在炎症情况中，为炎性介质的许多前列腺素(一组脂质化合物)通过花生四烯酸生物合成，其中包括环氧合酶(COX)。广泛用于治疗大多数炎性疾病的NSAIDS发挥抑制COX酶以防止前列腺素的生物合成的作用。
因为用于关节炎的大部分药物采用草药提取物作为它们的活性成分，所以它们是基于天然物质的并且它们的精确药物机制仍然未知。然而，它们正被积极地发展为口服配制剂，其易于给药并能长时间给药。作为天然物质，与滑液类似，注射透明质酸。作为保健功能食品的辅助物，葡萄糖胺可能与软骨素组合地摄入。天然物质的可用药物的发展可能涉及草药的古代出版物，例如东医宝鉴(Tong-Ui-Bo-Gam)。
随着分子生物技术的巨大进步，已经揭示了天然物质的药物作用和安全性，并且正从不同角度来评估天然药物。目前，天然药物被认为是特殊药物，这是由于它们甚至在长期摄取之后不产生副作用的优点。通常，通过单独或组合地利用药物有效成分来开发天然药物，并且其从草药和/或作为食物被摄入的动物中被提取和分离。天然药物与合成药物相比具有低毒性，其被认为是高度安全的。
然而，天然药物也具有许多问题，特别对于配制。例如，草药提取物的干燥粉末难以处理，因为其吸收大量的水份。甚至当将其配制为固体口服形式时，天然药物在形态和含量方面难以长时间保持，因为当其为配制剂形式时吸收大量水份。
在身体中，各种生物化学事件导致炎症的发作。在对化学刺激的反应中，巨噬细胞产生在炎性过程中发挥重要作用的各种细胞因子和一氧化氮(NO)。由于炎性过程，由iNOS(诱导型一氧化氮合酶)产生的超生理浓度的一氧化氮在各种炎性疾病的病理学中发挥主要作用(Kobayashi Y.等人，J Leukoc Biol.,88,pp1157-62,2010)。此外，各种研究已表明白介素-6(IL-6)和白介素(IL-1β)是一类促进炎性反应的细胞因子(Punzi L.等人,Crit Rev Clin Lab Sci.,2002,39(1):63-88)，其已知导致各种炎性疾病的发作，所述炎性疾病包括类风湿性关节炎(Jang C.H.等人,Rheumatology,2006,45(6):703-710)、纤维肌痛(Hernandez M.E.等人,BMC Res.Notes.,2010,3(1):156)和斯耶格伦氏综合征(BaturoneR.等人,Scand J Rheumatol.,2009,38(5):386-389)。这些研究结果表明，如果其具有抑制一氧化氮(NO)或诸如IL-6和IL-1β的细胞因子的产生的功能，则物质可能有效地用于预防和治疗多种炎性疾病。
发明内容
技术问题
致力于本发明，本发明人对炎症或关节炎的植物化学物有效疗法进行了密集且深入的研究，导致发现来自络石藤和牡丹皮的提取物的组合具有控制和抑制在类风湿性关节炎的介质表达中所涉及的因子的活性，由此可用于预防、治疗和改善炎性病症，并且可用于开发能在组合的提取物中稳定的配制剂，由此解决了水份吸收、物质密度、流动性、粘聚等问题。
问题的解决方案
因此，本发明的目的是提供用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
本发明的另一目的是提供用于预防或改善炎症的准药组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
本发明的再一目的是提供用于预防或改善炎症的保健功能食品组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
本发明的又一目的是提供用于预防或改善炎症的化妆品组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
本发明的又一目的是提供制备用于预防或治疗炎性疾病的组合物的方法，其包括：(a)在乙醇水溶液中提取络石藤，然后过滤以分离滤液和残余物，并且将所述滤液干燥以获得含0.05wt%至1.5wt%的牛蒡甙元(arctigenin)的提取物，所述牛蒡甙元用作络石藤的指标物质；(b)在乙醇水溶液中提取牡丹皮，然后过滤以分离滤液和残余物，并且将滤液干燥以获得含1.8wt%至5.3wt%的芍药甙(paeoniflorin)的提取物，所述芍药甙用作牡丹皮的指标物质；以及(c)基于干重以1:1至3:1的比混合所述步骤(a)的络石藤提取物和所述步骤(b)的牡丹皮提取物以获得混合物。
本发明的又一目的是提供治疗炎性疾病的方法，其包括向疑似患有炎性疾病的个体给予药物组合物。
发明的有利效果
与单个提取物相比，包含来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物的本发明组合物表现出优异的抗炎活性和水肿抑制活性，由此能用于预防、治疗或改善炎性疾病。与合成药物相比，作为天然物质，组合物能用作相对无真菌感染或其它副作用的安全疗法。此外，包括抗菌活性、骨强化、消炎活性、血液滋养、滋补(vigoration)等在内的来自络石藤和牡丹皮的提取物的已知生理活性可以产生对预防、治疗和改善炎性疾病的协同作用。当配制为口服剂型时，组合物为制备过程保证了充足的时间段。由吸湿性抑制材料形成的配制剂还耐潮湿，使得其在贮存和给药方面是有利的。
附图简述
图1为示出由络石藤和牡丹皮制备95%乙醇固体提取物的流程图。
图2为示出由络石藤和牡丹皮制备95%乙醇软质提取物的流程图。
图3是来自络石藤的95%乙醇提取物的HPLC色谱图。
图4是来自牡丹皮的95%乙醇提取物的HPLC色谱图。
图5是来自络石藤和牡丹皮的提取物的混合物的HPLC色谱图。
图6是示出当络石藤提取物(TC)、牡丹皮提取物(MCR)、来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物(SI-000902)、复合草药(SI-000413)和Joins片剂(J)中的每一个以100μg/mL浓度施用于源自小鼠的巨噬细胞RAW264.7时，它们对一氧化氮(NO)、IL-1β和IL-6的释放的抑制活性的图表。
图7是示出当来自络石藤和牡丹皮的提取物的混合物(SI-000902)以不同浓度施用于源自小鼠的巨噬细胞RAW264.7时，该混合物对一氧化氮(NO)的释放的抑制活性的图表。
图8是示出当来自络石藤和牡丹皮的提取物的混合物(SI-000902)以不同浓度施用于源自小鼠的巨噬细胞RAW264.7时，该混合物对IL-1β的释放的抑制活性的图表。
图9是示出络石藤提取物(TC)、牡丹皮提取物(MCR)以及来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物(SI-000902)对IL-6诱导的信号通路(JAK2磷酸化、gp130磷酸化和STAT3磷酸化)和PMA诱导的ERK磷酸化的抑制活性的图表。
图10示出照片和计分曲线形式的络石藤和牡丹皮的固体提取物混合物(SI-000902)、吲哚美辛(I)、美洛昔康(M)和布西拉明(B)对炎症的抑制作用。
图11示出计分曲线形式的络石藤和牡丹皮的软质提取物的混合物(SI-000902)和布西拉明(B)对炎症的抑制作用。
图12为示出络石藤和牡丹皮的软质提取物混合物(SI-000902)和布西拉明(B)对关节炎诱导的小鼠的增殖和脾细胞的抑制作用的图表。
图13为示出络石藤和牡丹皮的软质提取物混合物(SI-000902)和布西拉明(B)对关节炎诱导的小鼠的脾细胞的IFN-γ和IL-2的产生的抑制作用的图表。
发明最佳实施方式
根据本发明一方面，本发明提供用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
如本文所用，术语“络石藤”，被称为白花藤(climbing bagbane)，是指亚洲络石(Trachelospermum asiaticum)或其紧密相关的植物(夹竹桃科(Apocyanaceae))的攀缘茎和枝。在韩国古代药物出版物中，来自该草药的提取物被描述为对心、肝和肾在功能上挥发作用以治疗由风和潮湿引起的疾病，并且有助于通过经络系统的生命力流，并且被规定用于脾组织植入、肢体痉挛、腰痛、关节痛、扁桃体炎和疖。已经知道迄今已发现作为络石藤中的生物活性成分的牛蒡甙(arctiin)、牛蒡甙元、络石苷(tracheloside)、马太树脂酚甙(matairesinoside)和磁麻糖具有血管舒张和抗高血压活性。
如本文所用，术语“牡丹皮”，称为牡丹(peony)，是指牡丹的根皮。该根皮对身体是无毒的并用作草药中的药材。在该草药中发现的生理活性成分包括牡丹酚甙(paeonoside)(牡丹酚葡糖苷(paeonolglucoside))、牡丹酚原甙(paeonolide)(牡丹酚-鼠李葡糖苷(paeonol-rhamnoglucoside))和牡丹酚。在草药的贮存期间，牡丹酚甙降解为糖和牡丹酚。此外，检测到芍药甙、氧化芍药甙、苯甲酰芍药甙、牡丹酚原甙丹宁酸(paeonolide tannin)、原青花素B1、苯甲酰氧芍药甙、芍药花甙、紫云英甙和花葵苷。组织化学表明这些成分存在于木质素以及根皮中。在草药医学中，牡丹皮提取物被规定作为淤血的治疗，估计这归因于其单萜苷的抗炎活性。观察到表现出抗菌活性的牡丹酚甚至当其稀释1,500至2,000倍时体外抑制大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌和枯草芽孢杆菌。苯甲酰芍药甙和苯甲酰氧芍药甙用于抑制组胺从肥大细胞的释放，而牡丹酚原甙丹宁酸表现出抗病毒活性。芍药甙抑制血小板聚集并降低纤维蛋白原的水平。在草药医学中，分类为性寒的牡丹皮用作用于抗炎性和淤血的药物，因此被规定用于高胃器官(hypergastric organs)的血管炎症、由于充血而产生的刺痛、发热、化脓和出血，特别用于在子宫和子宫附件中包括月经不调和炎症、充血以及隐痛在内的妇科疾病。此外，疼痛缓解和解痉用于治疗痔疮和阑尾炎。
如上述所述，本发明的药物组合物特征是来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物的抗炎活性。可以通过分别制备络石藤提取物和牡丹皮提取物并将它们以预定比例混合来获得提取物混合物。络石藤提取物和牡丹皮提取物之间基于干重的重量比可以优选为1:1至3:1，并更优选为1:1。此外，来自络石藤和牡丹皮的提取物的量可以根据它们各自的指标物质牛蒡甙元和芍药甙的含量而确定。在该情况下，混合物可以包含0.05wt%至1.5wt%的牛蒡甙元和1.8wt%至5.3wt%的芍药甙。与来自络石藤和牡丹皮的单个提取物相比，提取物混合物确保了药物组合物用于预防和治疗炎性疾病，其在镇痛活性、对急性和慢性炎症以及对一氧化氮和炎性细胞因子的释放的抑制活性方面是优异的。
在一实施方案中，甚至当提取物混合物以单个提取物一半浓度使用时，测量到提取物混合物对一氧化氮和细胞因子的抑制活性比单个提取物的更高或与其近似。特别地，当组合使用时，确定提取物混合物对IL-1β产生和促进B细胞分化的IL-6诱导的JAK2和STAT3磷酸化具有协同抑制作用，由此为互补性的而不干扰或妨碍它们自身的活性(图6至9)。
来自络石藤和牡丹皮的每一提取物可以为通过提取过程、稀释或浓缩提取物、干燥提取物之后的残留物、粗过滤提取物或精过滤而获得的提取物，但本发明不限于此。可以利用典型的提取溶剂并优选使用选自水、具有1至6个碳原子的醇或其组合的提取溶剂来获得单个提取物。醇可以优选为乙醇、甲醇或丁醇，并且更优选为90%至99%的乙醇溶液。
来自络石藤和牡丹皮的每一提取物包括但不限于乙醇固体提取物或软质提取物。
如本文所用，术语“固体提取物”表示通过将草药材浸入合适的溶剂以使有用成分通过冷沉淀、暖沉淀或渗滤而浸提入溶剂中，然后以合适方式浓缩和干燥浸出液，从而制备的试剂。固体提取物可以被加工为块、颗粒或粉末。在本发明一实施方案中，洗涤络石藤和牡丹皮，用95%乙醇提取并过滤，并将滤液合并、浓缩、干燥和研磨以获得固体提取物(图1)。
如本文所用，术语“固体提取物”表示通过将草药材浸入合适溶剂(纯化水、乙醇等)以使有用成分浸提入溶剂，然后浓缩浸出液以形成糖浆，从而制备的试剂。在本发明一实施方案中，洗涤络石藤和牡丹皮，用95%乙醇提取并过滤，并将滤液合并且浓缩以获得软质提取物(图2)。
选作络石藤指标物质的牛蒡甙元具有分子量为372的经验式C21H24O6，并且用作二苄基丁内酯配体。正在积极地研究其在各种植物中、特别是菊科植物(composite plants)中的生理活性。该化合物是用于炎性疾病的药物中的重要成分并可以表现出潜在的药物功效，这有助于当其含量被限于某一范围时的协同作用。在药物组合物中，牛蒡甙元的含量优选为0.03wt%至2.0wt%，并且更优选为0.05wt%至1.5wt%。
选作牡丹皮的指标物质的芍药甙具有分子量为480.45的经验式C23H28O11，并且为在牡丹的根中发现的重要成分。该化合物还被称为牡丹皂素，为无色结晶物质，并已知具有扩张血管、对抗炎性和过敏以及促进免疫活性的作用。本发明的药物组合物可以包含的芍药甙的量优选为1.4wt%至5.5wt%，并更优选为1.8wt%至5.3wt%。
在本发明一实施方案中，发现来自络石藤和牡丹皮的提取物(其从不同的位置和不同的时间点收集)包含0.05wt%至1.5wt%的牛蒡甙元和1.8wt%至5.3wt%的芍药甙。
本发明的组合物特征在于抑制炎性因子一氧化氮(NO)、IL-6或IL-1β释放的能力。该组合物通过抑制一氧化氮和炎性因子IL-6和IL-1β的释放来对炎性疾病表现出预防或治疗作用。在本发明一实施方案中，观察到来自络石藤和牡丹皮的提取物的混合物针对一氧化氮和炎性因子具有优异的抑制活性(图6)。
如本文所用，术语“炎性疾病”是炎症作为它们主要破坏因子的疾病的统称。炎性疾病的实例包括但不限于水肿、皮炎、过敏症、特应性、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化，并且优选类风湿性关节炎和水肿，前者是更加优选的。
关节炎是由于细菌感染或外伤而发生在关节区域内的与炎性变化有关的疾病的统称。关节炎大体分为急性关节炎和慢性关节炎。急性关节炎还如下进一步划分。(1)浆液性关节炎：通常由外伤诱发，但也可能因为未知原因而发生。其通常发生在一个关节处。(2)浆液纤维蛋白性关节炎：其与急性类风湿性关节炎一起发生，并且在关节腔内聚集浑浊渗出液。甚至在炎症减轻后，由于假膜的生成，其可能导致运动障碍。(3)化脓性关节炎：发生于关节的开放性伤口或接触性传染病如淋病、伤寒、猩红热和败血病的多发的关节炎。1-2月龄的婴幼儿可能由于骨的不可愈合性严重损害而发展为关节脱位。成年人经常发生骨膜骨髓炎，其导致破裂以及使脓液流入关节，因此被称为继发性化脓性关节炎。慢性关节炎可以如下被进一步划分。(1)特殊类型的炎症：一般是指由结核性关节炎或梅毒性关节炎或中年人常见的尿酸代谢失调而引起的痛风性关节炎。(2)多发性关节炎：慢性类风湿性关节炎是最常见的。急性浆液性关节炎可能转变为多发性关节炎，或其可能在肺炎、梅毒和淋病期间作为多关节炎而发生，或者其可能为一类败血病。此外，斯蒂尔病也属于此类。(3)畸形性关节炎：通常由退变性衰老过程或外伤而诱发。(4)血友病关节炎：由血友病患者的关节出血而诱发。退行性关节炎也称为骨关节炎，其是由关节软骨的退行性变化而造成的局部关节炎并主要发生于中年或老年人。这类关节炎诱发炎性细胞因子和一氧化氮的水平升高。
类风湿性关节炎是慢性、全身性炎性疾病，其可能感染许多器官，并且其的诱因仍未知。该过程初始产生关节周围滑液膜的炎性反应，这然后逐渐蔓延至邻近软骨和骨骼，导致关节的破坏和变形。关节外临床表现包括贫血、干燥综合征、皮下结节、肺纤维化、血管炎、真皮溃疡等。在本发明一实施方案中，发现络石藤和牡丹皮的提取物的混合物对类风湿性关节炎具有体内预防和治疗作用，如利用类风湿性关节炎诱导的小鼠作为动物模型所测量的。
水肿是诸如淋巴液或渗出液的液体在皮肤下或在身体的一个或一个以上的体腔中的异常积聚。当水肿发作时，受感染的皮肤或软组织肿胀并变得摸起来易脆。当按压时，在皮肤中产生暂时性压痕。在本发明一实施方案中，发现来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物对水肿具有预防和治疗作用，如通过其中在向其给予混合物之后用肉眼评价关节炎诱导的小鼠中的水肿的试验所测量的。通常，混合物降低了受试组的足部肿胀。
如本文所用，术语“预防(prevention)”或“预防(prophylaxis)”意指导致抑制或延迟炎性疾病发作的任何作用，这归因于给予本发明的药物组合物。术语“治疗”意指导致炎性疾病的症状得到改善或炎性状态的有益改变的任何作用，这归因于给予本发明的组合物。
本发明的药物组合物还可以包含药物可接受的载体。包含药物可接受的载体的药物组合物可以为各种口服或非口服剂型。对此，本发明的药物组合物可以与稀释剂或赋形剂如填充剂、增稠剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等组合配制。预期口服给药的固体制剂可以为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊等形式。对于这些固体试剂，本发明的化合物与至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶组合配制。除了单一的赋形剂，可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。其中，预期口服给药的液体制剂为混悬剂、内用溶液、乳剂、糖浆等。除了单一的稀释剂如水或液体石蜡，在液体制剂中可以包含各种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。此外，本发明的药物组合物可以为肠胃外剂型，例如无菌水溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂、栓剂等。可注射的丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及酯如油酸乙酯可以适于非水性溶剂和栓剂。栓剂的基质材料包括Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可油脂、月桂精油脂以及甘油明胶。
此外，本发明的药物组合物的剂型可以选自片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊、混悬剂、内用溶液、乳剂、糖浆、无菌水溶液、非水性溶液、冻干剂和栓剂。
来自络石藤和牡丹皮的提取物已经长期用作食物或药用，并且对提取物混合物的剂量没有设置特殊限制，但根据各种因素而变化，所述因素包括体内吸收率、患者年龄、性别、健康状态和饮食、给药时间、给药途径、排泄率和疾病严重性。通常，络石藤和牡丹皮的提取物混合物可以以每日剂量为10mg/kg至1000mg/kg，并优选为50mg/kg至500mg/kg给药。优选地，考虑有效量的范围来配制本发明的药物组合物。由此获得的单位剂量配制剂可以根据负责监测或观察药物给药的专家的决定或者根据个体需求利用专门的方案或以多次剂量方式在规则时间间隔下给药。
本发明的药物组合物还可以包含二氧化硅和药物可接受的用于口服给药的赋形剂。有效地避免口服组合物吸收水份。
由于络石藤提取物和牡丹皮提取物均具有高吸湿性，提取物混合物的片剂配制剂可以变得过软以至于不能保持片剂形状。该问题的解决方案是最大水平地抑制活性成分自身的吸湿性。由于这个原因，采用二氧化硅和药物可接受的赋形剂。
二氧化硅用于改善络石藤提取物和牡丹皮提取物的吸湿性。与微晶纤维素或硅酸钾(其通常用作赋形剂以阻断水份吸收)相比，二氧化硅可以以显著更小的量使用，由此表现出对配制剂和指标物质的稳定性更大的作用。
在本发明一实施方案中，与当不含二氧化硅而含玉米淀粉相比，当包含二氧化硅时观察到络石藤提取物和牡丹皮提取物的干燥颗粒在室温下高度耐潮湿并且完全保持它们的形态。此外，对崩解和长期稳定性的试验表明由含二氧化硅的提取物的干燥颗粒形成的片剂甚至当它们在高温和高湿度条件下贮存时也将崩解时间和活性成分含量保持在某一水平。
二氧化硅的使用抑制了活性成分的吸湿性并使配制剂保持其形态，由此保证了足以精确完成制造过程的长时间段。由吸湿性抑制材料形成的配制剂还耐潮湿，以至于其在贮存和配送方面是有利的。甚至当其在高温和潮湿条件下长时段贮存时，配制剂确保了指标物质保持稳定，表现出恒定释放性能(药代动力学)。
本发明的药物组合物可以优选包含100重量份的络石藤提取物加牡丹皮提取物的混合物以及30重量份至100重量份的二氧化硅。更优选地，可以使用50重量份的二氧化硅。如果基于100重量份的络石藤提取物加牡丹皮提取物的混合物，所用的二氧化硅的量低于30重量份，则吸湿性不被充分抑制，由此仅实现对口服制剂的轻微稳定作用。另一方面，当二氧化硅的量超过100重量份时，片剂变大，并且相对大量的非活性物质趋于诱发副作用。此外，过剩量仅实现对配制剂的轻微稳定作用。
如本文所用，术语“药物可接受的赋形剂”泛指药物上被接受的载体。口服制剂的赋形剂包括稀释剂、填充剂、增稠剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂和芳香剂，但不限于此。优选地，赋形剂可以为微晶纤维素或硅酸钾。与二氧化硅类似，微晶纤维素或硅酸钾能用于从来自络石藤和牡丹皮的提取物中吸收水分，更易于促进固体配制剂的形成。
基于100重量份的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物，微晶纤维素或硅酸钾可以优选以10重量份至50重量份的量使用。当以小于10重量份的量使用时，微晶纤维素或硅酸钾连同二氧化硅表现出对吸湿性的轻微协同作用。超过50重量份的量使片剂尺寸大，并对配制剂的稳定性未实现积极作用。
本发明的药物组合物的口服剂型包括但不限于散剂、颗粒剂、填充剂、软胶囊、片剂和混悬剂，优选为散剂、颗粒剂、软胶囊或片剂。片剂的水份含量优选为4%至6%，并且更优选为5%。
根据本发明的另一方面，本发明提供了用于预防或改善炎症的准药组合物，其包含作为活性成分的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物。对于来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物，其描述如上所述。更详细地，本发明的组合物可以添加至用于预防或改善炎症的准药组合物中。
如本文所用，术语“准药”可以定义为用于治愈、缓解、治疗或预防疾病目的的由在人或动物中使用的纤维、橡胶或类似物质制成的物品；除仪器、机器等之外的物品，其对人体具有温和作用或不具有直接影响；以及在用于灭菌、杀灭昆虫以及用于类似目的的试剂范围内的物品。所有物品不包括意在同时规定为诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或动物疾病以及用于药物影响人或动物的结构和功能的那些。
当用作准药添加剂时，本发明的组合物可以适当地原样使用或利用典型方法与另一准药或准药组分组合使用。可以根据使用目的来适当地确定混合物中活性成分的量。
本发明组合物可以施用的准药的实例包括但不限于消毒剂、沐浴露、漱口水、湿巾、去垢皂、洗手用品、加湿器填充剂、口罩、软膏和过滤器涂层。
根据本发明的再一方面，本发明提供了用于预防或改善炎症的保健功能食品组合物，其包含作为活性成分的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物。对于来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物，其描述如上所述。更详细地，本发明的组合物可以添加至用于预防或改善炎症的保健功能食品组合物中。
当用作保健功能食品添加剂时，本发明的提取物组合物可以适当地以未改变的形式使用，或与利用典型方法制备的另一保健功能食品或保健功能食品成分组合地使用。可以根据使用目的来适当地确定活性成分的量。
对可以添加本发明的提取物组合物的保健功能食品的种类没有特别限制。这类保健功能食品的实例包括肉食、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、糖果糕点、披萨饼、拉面、其它面条、口香糖、乳制品如冰激凌、各种汤、饮料、茶、饮品(drinks)、酒精饮料和维生素复合物。所有典型可接受的保健功能食品可以包含本发明的活性成分。此外，动物饲料落在本发明的范围内。
此外，本发明的保健功能食品组合物可以包含各种营养物、维生素、矿物质、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、以及用于碳酸饮料的碳酸化剂。此外，本发明的组合物能包含用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于预防或改善炎症的化妆品组合物，其包含作为活性成分的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物。对于来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物，其描述如上所述。更详细地，本发明的组合物可以添加至用于预防或改善炎症的化妆品组合物中。
本发明的化妆品组合物可以配制为一般的乳剂或水溶性形式。乳剂化妆品的实例包括营养洗剂、面霜、精油等。皮肤洗剂为一类水溶性化妆品形式。合适的化妆品形式的实例包括但不限于溶液、凝胶、固体或糊剂制剂、水包油乳剂、混悬液、微乳剂、微胶囊、微粒或离子脂质体、非离子囊泡分散剂、乳剂、鞣皮剂(skins)、洗剂、散剂、软膏剂、喷雾剂、遮瑕膏(conceal stick)等。此外，其还制备为泡沫形式或具有一定量压缩推进剂的气溶胶形式。
此外，化妆品组合物可以包含脂质、有机溶剂、溶解剂、增稠剂、凝胶剂、软化剂、抗氧化剂、助悬剂、稳定剂、发泡剂、芳香剂、表面活性剂、水、离子或非离子乳化剂、填充剂、掩蔽剂、螯合剂、防腐剂、维生素、UV阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水或亲脂活化剂、脂质体和/或其它用于与皮肤相关的科研领域的一般补充剂。
根据本发明的另一方面，本发明提供制备用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物方法，其包括：(a)在乙醇水溶液中提取络石藤，然后过滤以分离滤液和残余物，并且将所述滤液干燥以获得含0.05wt%至1.5wt%的牛蒡甙元的提取物，所述牛蒡甙元用作络石藤的指标物质；(b)在乙醇水溶液中提取牡丹皮，然后过滤以分离滤液和残余物，并且将滤液干燥以获得含1.8wt%至5.3wt%的芍药甙的提取物，所述芍药甙用作牡丹皮的指标物质；以及(c)基于干重以1:1至3:1的比混合所述步骤(a)的络石藤提取物和所述步骤(b)的牡丹皮提取物以获得混合物。
在步骤(a)和(b)中，用乙醇溶液提取络石藤和牡丹皮，然后过滤以分离滤液和残余物，并且干燥所述滤液以获得分别含0.05wt%至1.5wt%的牛蒡甙元和1.8wt%至5.3wt%的芍药甙的提取物。步骤(a)和(b)可以以顺序、倒序或同时进行。
络石藤提取物和牡丹皮提取物可以为固体提取物或软质提取物形式，优选为软质提取物。对于固体提取物和软质提取物，它们的描述如上所述。
在本发明一实施方案中，满足韩国药典规定的络石藤和牡丹皮的草药材被切开、洗涤、用95%乙醇提取并过滤，并将滤液合并、浓缩、干燥和研磨以获得络石藤和牡丹皮的固体提取物(图1)。将络石藤和牡丹皮的草药材洗涤、用95%乙醇提取并过滤，并且将滤液合并并浓缩以获得络石藤和牡丹皮的软质提取物(图2)。
在步骤(c)中，步骤(a)的络石藤提取物和步骤(b)的牡丹皮提取物基于干重以1:1至3:1的比进行混合以获得混合物。在该混合物中，络石藤提取物和牡丹皮提取物既不干扰也不妨碍它们各自的活性，而表现出互补药物机制，由此能用于制备有效药物组合物。对于药物组合物，其描述如上所述。
如上所述的炎性疾病优选包括水肿、皮炎、过敏症、特应性、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化，并且优选类风湿关节炎和水肿，前者是更加优选的。
本发明的方法还可以包括(d)将步骤(c)的混合物与二氧化硅和乙醇混合，以及(e)通过完全蒸发乙醇来干燥步骤(d)的组合以获得用于口服剂量配制物的干燥混合物。
在步骤(d)中，步骤(c)的混合物与二氧化硅结合，然后向其添加乙醇。该步骤旨在抑制混合物的吸湿性。更具体地，利用高速混合器使络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物与二氧化硅结合，然后向其添加乙醇。可以在将络石藤提取物和牡丹皮提取物混合在一起之前或之后添加二氧化硅。
在该方法中，基于100重量份的步骤(c)的混合物，二氧化硅可以以30重量份至100重量份的量使用。对于重量比，其描述如上所述。
此外，可以向络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物添加药物可接受的赋形剂。赋形剂可以包括但不限于微晶纤维素或硅酸钾。基于100重量份的络石藤提取物加牡丹皮提取物的混合物，微晶纤维素或硅酸钾可以以10重量份至50重量份的量使用。
在步骤(e)中，通过完全蒸发乙醇来干燥步骤(d)的组合以获得用于耐潮湿的口服剂量配制剂的干燥混合物。乙醇的蒸发优选在真空中进行或利用热空气干燥器进行，后者是优选的。在步骤(e)之后，对于本领域技术人员而言显而易见的典型的另外方法可以用于将该组合配制为各种形式，包括散剂、颗粒剂、填充剂、硬胶囊、片剂或混悬剂等。片剂是高度稳定的，不仅因为组合自身是耐潮湿的，而且因为当该组合被配制其中时，片剂自身具有抗吸湿作用。
在本发明的又一方面中，本发明提供了治疗炎性疾病的方法，其包括向疑似患有炎性疾病的个体给予药物组合物。
如本文所用，术语“疑似患有炎性疾病的个体”是指已经受到或易于受到炎性疾病侵袭的包括人在内的动物。可以通过向疑似患有炎性疾病的个体给予本发明的包含络石藤和牡丹皮提取物混合物的药物组合物来治愈炎性疾病。对于炎性疾病，其描述如上所述。
如本文所用，术语“给药”意指将本发明的药物组合物以合适方式引入疑似患有炎性疾病的个体。只要其使本发明的化合物达到靶组织，可以使用任何给药途径，无论口服或肠胃外的。
本发明的治疗方法包括给予药物有效量的包含来自络石藤和牡丹皮的提取物的药物组合物。对本领域技术人员显而易见的是，可以由主治医师在合理医学判断的范围内确定合适的总日剂量。此外，可以以单一剂量来给予组合物，或其可以延展至每天多剂量。然而，为了本发明的目的，某一患者的治疗有效剂量取决于各种因素，包括寻求实现的反应的类型和程度、预期用途的任何其它试剂的使用、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食、给药时间、给药途径、组合物排泄率、治疗持续时间、与组合物混合或连同混合物同时给药的其它药物，以及医学领域公知的其它因素。
实施方式
通过下列实施例可以获得对本发明的更好理解，所述实施例为例示而描述的，并不解释为限制本发明。
制备例1：络石藤和牡丹皮的药物配制剂的制备
1-1.络石藤和牡丹皮的95%乙醇固体提取物的制备
将满足韩国药典要求的草药材(络石藤和牡丹皮)切开并称重。它们用95%乙醇提取并加热以渗出活性成分。将渗出物过滤并将滤液合并且浓缩。向浓缩物添加95%乙醇，然后使其静置24小时，然后过滤。将滤液在减压下浓缩并在真空中干燥以提供分别来自络石藤和牡丹皮的固体提取物(图1)。固体提取物的浓缩比为约40:1。
在以相同方式进行乙醇提取之后，将提取物在减压下浓缩并在真空中干燥以得到固体提取物。浓缩比为约20:1。
1-2.络石藤和牡丹皮的95%乙醇软质提取物的制备
将所选的材料(络石藤和牡丹皮)称重并在95%乙醇中加热两次。将所得渗出物过滤并将滤液在减压下浓缩以得到分别来自络石藤和牡丹皮的软质提取物(图2)。软质提取物的浓缩比为约20:1。
制备例2：混合物提取物的制备
将络石藤和牡丹皮的草药物质以等量混合，并将混合物用95%乙醇以与制备例1相同方式提取，从而获得固体提取物和软质提取物。
制备例3：提取物混合物的制备
将制备例1中制备的具有相同浓缩比的来自络石藤和牡丹皮的固体提取物以1:1的重量比混合在一起，从而获得固体提取物混合物。
同样地，将制备例1中制备的具有相同浓缩比的来自络石藤和牡丹皮的软质提取物以1:1的重量比混合在一起，从而获得软质提取物混合物。
制备例4：来自络石藤和牡丹皮提取物的干燥颗粒的制备
将在制备例1-2中获得的来自络石藤和牡丹皮的软质提取物分别通过在50%乙醇中沉淀而过滤，并将乙醇溶剂回收，以及浓缩。在真空中干燥之后，将浓缩物研磨以分别获得络石藤和牡丹皮的干燥颗粒。
制备例5：含微晶纤维素的络石藤和牡丹皮的干燥混合颗粒的制备
制备例1-2中获得的络石藤和牡丹皮的各自软质提取物以5g的量溶解在50mL的95%乙醇中，从而分别获得络石藤和牡丹皮的乙醇溶液。向络石藤和牡丹皮的每一乙醇溶液添加2.5g的微晶纤维素，此后，向其添加乙醇并缓慢搅拌。在均匀混合之后，利用热空气干燥器将乙醇完全蒸发以获得络石藤干燥混合颗粒和牡丹皮干燥混合颗粒(1)，二者均含微晶纤维素。
此外，除了向络石藤和牡丹皮的每一乙醇溶液添加10g微晶纤维素之外，以相同方式制备络石藤干燥混合颗粒和牡丹皮干燥混合颗粒(2)。
制备例6：含二氧化硅的络石藤和牡丹皮的干燥混合颗粒的制备
制备例1-2中获得的来自络石藤和牡丹皮的各自软质提取物以5g的量溶解在50mL的95%乙醇中，从而分别获得络石藤和牡丹皮的乙醇溶液。向络石藤和牡丹皮的每一乙醇溶液添加2.5g的二氧化硅，此后，向其添加乙醇并缓慢搅拌。在均匀混合之后，利用热空气干燥器将乙醇完全蒸发以获得络石藤干燥混合颗粒和牡丹皮干燥混合颗粒，二者均含二氧化硅。
制备例7：含玉米淀粉的干燥混合颗粒的制备
制备例1-2中获得的络石藤和牡丹皮的各自软质提取物以5g的量溶解在50mL的95%乙醇中，从而分别获得络石藤和牡丹皮的乙醇溶液。向络石藤和牡丹皮的每一乙醇溶液添加15g的玉米淀粉，此后，向其添加乙醇并缓慢搅拌。在均匀混合之后，利用热空气干燥器将乙醇完全蒸发以获得络石藤干燥混合颗粒和牡丹皮干燥混合颗粒，二者均含玉米淀粉。
实施例1：指标物质含量的分析
利用高效液相色谱(HPLC)在下列条件下分析在制备例中获得的固体提取物和软质提取物的指标物质含量。
1-1.络石藤的95%乙醇提取物的指标物质的分析
利用高效液相色谱定量地测量具有下列化学式1的牛蒡甙元，即制备例1中制备的络石藤提取物的指标物质。
(1)络石藤的指标物质：牛蒡甙元(化学式1)
[化学式1]
(2)牛蒡甙元的分析条件
-柱：Waters X-bridge C18(250*4.6mm/5μm)
-注射体积：20μL
-流速：1ml/min
-检测波长：UV230nm
-流动溶剂：纯化水、ACN
-流动溶剂的分析条件
表2
[表2]
| 分钟 | 纯化水 | ACN |
| 0 | 80 | 20 |
| 30 | 60 | 40 |
| 35 | 80 | 20 |
| 40 | 80 | 20 |
(3)牛蒡甙元HPLC色谱图
从图3所示的色谱图读取牛蒡甙元的峰。
1-2.牡丹皮的95%乙醇提取物的指标物质的分析
利用高效液相色谱定量地测量具有下列化学式2的芍药甙，即制备例1中制备的牡丹皮提取物的指标物质。
(1)牡丹皮的指标物质：芍药甙(化学式2)
[化学式2]
(2)芍药甙的分析条件
-柱：Waters X-bridge C18(250*4.6mm/5μm)
-注射体积：20μL
-流速：1ml/min
-检测波长：UV230nm
-流动溶剂：0.1%磷酸盐、ACN
-流动溶剂的分析条件
表3
[表3]
| 分钟 | 0.1%磷酸盐 | ACN |
| 0 | 89 | 11 |
| 25 | 89 | 11 |
| 30 | 30 | 70 |
| 35 | 30 | 70 |
| 40 | 89 | 11 |
| 45 | 89 | 11 |
(3)芍药甙HPLC色谱图
从图4所示的色谱图读取芍药甙的峰。
1-3.络石藤和牡丹皮的95%乙醇提取物混合物的指标物质的分析
以上述相同方式使用HPLC分析制备例3中获得的提取物混合物的指标物质牛蒡甙元和芍药甙的含量。
从图5的色谱图中读取牛蒡甙元(a)和芍药甙(b)的峰，显示与络石藤和牡丹皮的各自指标物质的图谱类似的图谱。这些结果表明指标物质的分析是合适的，因为两种指标物质的峰既不重叠也不彼此干扰，表明含量特异性和再现性。
实施例2：根据浓缩比分析固体提取物和软质提取物中指标物质的含量
在与实施例1相同条件下，根据浓缩比分析络石藤提取物和牡丹皮提取物的指标物质牛蒡甙元和芍药甙的含量。络石藤中的指标物质牛蒡甙元的含量测量为0.05wt%至1.5wt%，而牡丹皮提取物包含量为1.8wt%至5.3wt%的指标物质芍药甙(表4)。在表4中，Rot No.表示采集位置和时间不同的草药材。
[表4]
实施例3：络石藤和牡丹皮提取物混合物对一氧化氮和细胞因子的抑制活性的试验
为了检验本发明提取物混合物的抗炎活性，分析提取物混合物对细胞内一氧化氮和细胞因子的抑制活性。所有测量值表达为仅用LPS处理的对照的百分比。为了比较，使用Joins片剂(用于关节炎的常规片剂药物)和本发明人发布的第10-0847740号韩国专利的复合草药(SI-00413)。
3-1.细胞制备
在37°C下，将小鼠巨噬细胞RAW264.7(ATCC,#TIB-71)保持在5%CO2条件下的DMEM(杜尔贝科改良伊戈尔培养基，其补充有10%FBS(胎牛血清)、青霉素(100单位/mL)和硫酸链霉素(100μg/mL))中。
3-2.提取物混合物对一氧化氮(NO)的抑制活性的测量
将源自小鼠的巨噬细胞RAW264.7用于分析对一氧化氮的抑制活性。利用ELISA分析试剂盒(Promega,G2930)测定培养基中一氧化氮的水平。对此，在酶标仪(microplate reader)上读取OD550nm UV。对此，用预定浓度的没有出现细胞毒性的样本处理细胞。
如图6所见，NO的产生被络石藤提取物(100μg/mL)抑制了92.8%，被牡丹皮提取物(100μg/mL)抑制了80.3%，并且被来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物(100μg/mL)抑制了91.3%。发现它们以比Joins片剂更高的收益抑制了一氧化氮产生。甚至当提取物混合物以单个提取物一半浓度使用时，测量到提取物混合物对一氧化氮的抑制活性与单个提取物近似。因此，提取物组合物用作优异的抗炎复合试剂，其中单个提取物互补而不干扰或妨碍它们自身的活性，因为当组合使用时确定单个提取物具有对一氧化氮产生的协同抑制作用。
3-3.提取物混合物对IL-6的抑制活性的测量
将源自小鼠的巨噬细胞RAW264.7用于分析对IL-6的抑制活性。利用ELISA分析试剂盒(Thermo,EM2IL6)来测定培养基中的IL-6水平。对此，在酶标仪上读取OD450nm和OD550nm UV。对此，用预定浓度的没有出现细胞毒性的样本处理细胞。
如图6所见，IL-6的产生被络石藤提取物(100μg/mL)抑制了70.9%，被牡丹皮提取物(100μg/mL)抑制了82.7%，并且被来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物(100μg/mL)抑制了76.7%。提取物有效地抑制IL-6的释放，预期提取物具有对炎症的高治疗活性。甚至当提取物混合物以单个提取物一半浓度使用时，测量到提取物混合物对IL-6的抑制活性与单个提取物近似。因此，提取物混合物用作优异的抗炎复合试剂，其中单个提取物互补而不干扰或妨碍它们自身的活性，因为当组合使用时确定单个提取物具有对IL-6产生的协同抑制作用。
3-4.提取物混合物对IL-1β的抑制活性的测量
将源自小鼠的巨噬细胞RAW264.7用于分析对IL-1β的抑制活性。利用ELISA分析试剂盒(Thermo,EM2IL1b)测定培养基中IL-1β的水平。对此，在酶标仪上读取OD450nm和OD550nm UV。对此，用预定浓度的没有出现细胞毒性的样本处理细胞。
如图6所见，IL-1β的产生被络石藤提取物(100μg/mL)抑制了77.3%，被牡丹皮提取物(100μg/mL)抑制了59.4%，并且被来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物(100μg/mL)抑制了86.5%。提取物以比Joins片剂更高的收益有效地抑制IL-1β的释放，预期提取物具有对炎症的高治疗活性。甚至当提取物混合物以单个提取物一半浓度使用时，测量到提取物混合物对IL-1β的抑制活性与单个提取物相比为协同的。因此，提取物混合物用作优异的抗炎复合试剂，其中单个提取物互补而不干扰或妨碍它们自身的活性，因为当组合使用时确定单个提取物具有对IL-1β产生的协同抑制作用。
3-5.根据混合物浓度的提取物混合物对硝酸和IL-1β的抑制活性
的测量
在以上述相同方式在进行NO和IL-1β试验之前用200ng/ml的LPS，或100μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、3μg/mL或1μg/mL的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物处理细胞，不同之处在于将ELISA分析试剂盒(R&D systems,MLB00B)用于IL-1β。
如能在图7和图8中所见，提取物混合物以与剂量相关的方式抑制一氧化氮和IL-1β的释放。
源自小鼠巨噬细胞RAW264.7中的这些试验表明来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物能形成优异的抗炎复合试剂，其中各提取物是互补的而不干扰或妨碍它们自身的活性，因为当组合使用时确定各提取物具有对一氧化氮(NO)、IL-6和IL-1β的产生的协同抑制作用。
实施例4：络石藤和牡丹皮的提取物混合物对IL-6诱导的信号通路的抑制活性的试验
4-1.对IL-6诱导的STAT3磷酸化的抑制活性的试验
将HepG2细胞在6孔板中以5×104细胞/孔的密度铺板，并生长至80%融合。在该培养基被无血清培养基替换之后，将细胞另外培养6小时，并用络石藤提取物、牡丹皮提取物以及来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物处理30分钟。
此后，将细胞用20ng/ml IL-6孵育10分钟，然后在40μL溶解缓冲液[pH8，20mM Tris-HCl、137mM NaCl、10%甘油、1%TritonX-100、1mM Na3VO4、2mM EDTA、1mM PMSF、20mM亮抑酶肽、20μg/ml抑肽酶，Sigma]中细胞溶解。在离心(13,000g,15min)之后，在上清液中获得蛋白。将未用IL-6样品处理的HepG2细胞用作对照。利用DC蛋白分析试剂盒(Bio-Rad,USA)定量地分析蛋白。将蛋白装载到10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)并在30mA下通过电泳2小时而分离。然后，在90V下，将它们从凝胶转移至PVDF膜(WeatranS，孔径0.2;Whatman,USA)，持续90分钟。将膜用Tris-缓冲液(T-TBS；50mM Tri-HCl，pH7.6，150mM NaCl，0.2%吐温-20，5%脱脂牛奶；Sigma)阻断4-12小时，并用T-TBS洗涤5次。将膜用作为一级抗体的抗-磷酸化-STAT3多克隆抗体(1:1000稀释)处理2小时，并用T-TBS洗涤5次，然后用作为二级抗体的HRP-结合的抗兔抗体(1:5000稀释)孵育1小时。在用T-TBS洗涤之后，在暗室中用ECL试剂盒(Amersham,USA)显影薄膜。
如能在图9中所见，与对照相比，以及与用络石藤提取物或牡丹皮提取物处理的组相比，在用来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物处理的组中，检测到更低水平的磷酸化STAT3。因此，观察到提取物混合物抑制IL-6诱导的STAT3磷酸化。因此，本发明的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物具有抑制IL-6释放并由此抑制IL-6诱导的信号通路的功能。
4-2.对PMA诱导的ERK磷酸化的抑制活性的试验
为了检验在实施例4-1所显示的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物的抑制活性对IL-6诱导的信号通路是否是选择性的，分析提取物混合物对PMA诱导的ERK磷酸化的抑制活性，所述PMA诱导的ERK磷酸化不同于IL-6诱导的信号通路。
以与IL-6诱导的STAT3磷酸化试验相同的方式，用20ng/ml PMA处理HepG2细胞，同时将不用样品和PMA处理的HepG2细胞用作对照。
如图9所示，没有检测到对PMA-诱导的ERK磷酸化的抑制作用。因此，来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物不能抑制PMA-诱导的信号通路，但其对IL-6诱导的信号通路的抑制活性是特异性的。
4-3.对IL-6诱导的JAK2和gp130磷酸化的抑制活性的试验
将HepG2细胞在6孔板中以5×104细胞/孔的密度铺板，并生长至80%融合。在该培养基被无血清培养基替换之后，将细胞另外培养6小时，并用络石藤提取物、牡丹皮提取物以及来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物处理30分钟。
此后，将细胞用20ng/ml IL-6孵育10分钟，然后在40μL溶解缓冲液[pH8，20mM Tris-HCl、137mM NaCl、10%甘油、1%TritonX-100、1mM Na3VO4、2mM EDTA、1mM PMSF、20mM亮抑酶肽、20μg/ml抑肽酶，Sigma，USA]中细胞溶解。在离心(13,000g,15min)之后，在上清液中获得蛋白。将上清液用抗-JAK2抗体和抗-gp130抗体(Cell signaling,INC.)孵育4至12小时，然后用蛋白A/G加琼脂糖(Santa Cruz Biotechnology,USA)免疫沉淀。在离心之后，将沉淀物用缓冲液洗涤三次，并用作电泳用样品。将未用IL-6样品处理的HepG2细胞用作对照。利用DC蛋白分析试剂盒(Bio-Rad,USA)定量地分析蛋白。将蛋白装载到8%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)并在30mA下通过电泳2小时而分离。然后，在90V下，将它们从凝胶转移至PVDF膜(Weatran S，孔径0.2;Whatman,USA)，持续90分钟。将膜用Tris-缓冲液(T-TBS；50mM Tri-HCl，pH7.6，150mM NaCl，0.2%Tween-20，5%脱脂牛奶)阻断4-12小时，并用T-TBS洗涤5次。将膜用作为一级抗体的抗-磷酸化酪氨酸抗体(1:1000稀释)处理2小时，并用T-TBS洗涤5次，然后用作为二级抗体的HRP-结合的抗小鼠抗体(1:5000稀释)孵育1小时。在用T-TBS洗涤之后，在暗室中用ECL试剂盒(Amersham,USA)显影膜。
当来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物对IL-6诱导的gp130磷酸化具有低抑制活性时，如能在图9中所见的，与对照相比，以及与用络石藤提取物或牡丹皮提取物处理的小组相比，在用提取物混合物处理的小组中检测到更低水平的磷酸化JAK2。因此，观察到提取物混合物抑制IL-6诱导的JAK2磷酸化。因此，本发明的来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物具有抑制IL-6释放的功能。
实施例5：利用类风湿关节炎诱导的小鼠作为动物模型的动物测试(CIA)
5-1.来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物在关节炎诱导的小鼠中
的抗抑制活性的试验
将牛II型胶原和佐剂分别乳化，并且以100μg的剂量向尾部皮下注射每一乳剂。三周后，通过腹内注射100μg牛II型胶原来实现加强剂量(booster)以诱导关节炎。在诱导后立即给予药物，持续21天，并且测量它们对关节炎的抑制活性。每天向小鼠口服给予吲哚美辛(1mg/kg)、美洛昔康(4mg/kg)、布西拉明(300mg/kg)以及来自络石藤和牡丹皮的提取物混合物(SI-000902)的混悬剂。为了比较，采用正常组(未诱导关节炎)和对照(给予载体)。在口服给药之前，以在1%羧甲基纤维素钠溶液中的20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg浓度来分散提取物混合物(固体提取物、软质提取物)。每三天用肉眼通过盲测来测量在每一小鼠的四足中的水肿严重性，并且评价为0至4级。
在本发明的提取物混合物(SI-000902)的固体提取物(图10)与软质提取物(图11)之间的水肿没有差异。通常，更高剂量的提取物混合物导致测试组的足部中更低的肿胀(图10)。
具体地，如根据关节炎分数所测量的，发现固体提取物型混合物对关节炎具有与参照药物吲哚美辛、美洛昔康和布西拉明相似的抑制活性。特别在400mg/kg剂量下，混合物表现出比美洛昔康和布西拉明更高的关节炎抑制作用(图10)。参考关节炎指数，在200mg/kg剂量下，软质提取物型混合物对关节炎的抑制作用与布西拉明相似(图11)。这些结果意味着提取物混合物对关节炎具有与用于关节炎的常规药物相似的治疗作用，由此能安全地用作用于抑制和缓解关节炎的天然物质。
5-2.提取物混合物在关节炎诱导的小鼠中对脾细胞增殖的抑制活
性的试验
从关节炎诱导的小鼠中无菌切除脾脏，将其切碎并通过过滤器过滤以分离和仅收集细胞。这些细胞用RBC溶解缓冲液处理以除去红血球。将由此获得的脾细胞在96孔板中以5×105细胞/孔的密度铺板，然后向每个孔添加50μg/ml热失活II型胶原。将脾细胞孵育72小时。在完成孵育之前6小时，将细胞用BrdU标记溶液(5-溴-2’-脱氧尿苷标记溶液)处理以标记DNA。在孵育后，将细胞固定，并且利用BrdUELISA细胞增殖分析试剂盒(Roche)来测定对脾细胞增殖的抑制活性。
与正常组、对照和给予布西拉明的组相比，在给予提取物组合物(SI-000902)的组中抑制了脾细胞增殖。脾细胞的生长在以100mg/kg剂量用提取物混合物给药的组中降低了29.2%，在以200mg/kg剂量给药的组中降低了45.5%。该抑制活性与正对照布西拉明(51.1%的抑制)是相当的(图12)。因此，本发明的提取物混合物(SI-000902)能用于调节免疫反应，如所观察到的，抑制了脾细胞的增殖，这在免疫反应中起到重要作用。
5-3.提取物混合物在关节炎诱导的小鼠中对脾细胞的IFN-γ和
IL-2的抑制活性的试验
从关节炎诱导的小鼠中无菌切除脾脏，并用于产生细胞混悬液。该混悬液用RBC溶解缓冲液处理以除去红血球。将由此获得的脾细胞在24-孔板中以5×106细胞/孔的密度铺板，然后通过每孔50μg/ml热失活II型胶原来刺激细胞。将脾细胞孵育48小时。利用ELISA试剂盒(R&D systems)测量培养基中的细胞因子IFN-γ和IL-2的水平以检验提取物混合物对细胞因子的抑制作用。
与正常组、对照和给予布西拉明的组相比，在给予提取物组合物(SI-000902)的组中抑制了IFN-γ和IL-2的活性。IFN-γ的活性在以100mg/kg剂量用提取物混合物给药的组中降低了60.6%，并且在以200mg/kg剂量给药的组中降低了74.7%。对于IL-2，其活性当以100mg/kg剂量给药提取物混合物时降低了25.3%，并且在200mg/kg剂量下降低了36.8%。这种抑制活性与正对照布西拉明(88.5%(IFN-γ)，39.1%(IL-2))相当。因此，本发明的提取物混合物(SI-000902)能用于调节免疫反应(图13)。
实施例6：基于来自络石藤和牡丹皮的提取物的干燥混合颗粒的形态稳定性的测试
6-1.基于来自络石藤和牡丹皮的提取物的干燥颗粒的形态稳定性
如制备例4所述，将来自络石藤和牡丹皮的各自软质提取物在减压下干燥并研磨为颗粒，其的形态稳定性在室温下进行监测。
随时间流逝，水份吸收导致络石藤的干燥颗粒溶化。此外，牡丹皮的干燥颗粒由于它们的吸湿性而溶化。尽管它们的溶化时间根据相对湿度而变化，但络石藤和牡丹皮的干燥颗粒在1至2周内在形态上变回初始的软质提取物。
此外，进行检验以观察当使用常规方法时络石藤和牡丹皮的干燥材料是否能被配制为固体形式而不溶化。对此，在干燥之后立即将络石藤和牡丹皮材料与赋形剂混合并进行压片过程。在开始的几分钟，形成了片剂，但自从形成后10分钟，片剂由于它们自身的吸湿性而塌陷。不管在形态消失之前如何尝试加工成产品，络石藤和牡丹皮的材料仍吸收过快而不能保证充足的加工时间。
6-2.基于络石藤和牡丹皮的含微晶纤维的干燥混合颗粒的形态稳
定性
如制备例5所述，将来自络石藤和牡丹皮的各自软质提取物以不同重量比与微晶纤维素混合以制备络石藤的干燥混合颗粒和牡丹皮的干燥混合颗粒，二者均含微晶纤维素。在这种情况下，首先，将1重量份的来自络石藤和牡丹皮的各自软质提取物与0.5重量份的微晶纤维素混合。分别地，将1重量份的来自络石藤和牡丹皮的各自软质提取物与2重量份的微晶纤维素混合(分别为制备例5的干燥混合颗粒1和干燥混合颗粒2)。
含0.5重量份微晶纤维素的干燥混合颗粒随时间溶化为软质形式，由此不能保证压片过程的充足时间。
观察到含2重量份晶体的基于络石藤的干燥混合颗粒保持它们的颗粒形态。该形态保持还在基于牡丹皮的干燥混合颗粒中发现。尽管随时间部分聚集，但这些颗粒能确保足以进行压片过程的时间段。
6-3.基于络石藤和牡丹皮的含二氧化硅的干燥混合颗粒的形态稳
定性
如制备例6所述，将来自络石藤和牡丹皮的各自软质提取物加工成基于络石藤和牡丹皮的含二氧化硅的干燥混合颗粒。
观察到甚至在三个月后基于络石藤的干燥混合颗粒保持它们的形态。该形态保持还在基于牡丹皮的干燥混合颗粒中发现。此外，这些基于络石藤和牡丹皮的干燥混合颗粒耐潮湿，以至于它们能长时间压片而不塌陷或固化。
6-4.基于络石藤和牡丹皮的含二氧化硅的干燥混合颗粒所形成的
片剂的长期稳定性
在由高度吸湿材料制成的片剂的情况下，片剂的稳定性存在许多问题：片剂易于塌陷；该材料部分溶化或聚集，然后变硬以至于崩解延迟。由在制备例6中制备的基于络石藤和牡丹皮的含二氧化硅的干燥混合颗粒制成片剂。观察到片剂在室温下暴露长时间段之后保持它们的形态。
此外，该片剂既不塌陷也不变硬，而甚至在高温高湿环境(温度:40°C,RH:75%)贮存之后仍确保恒定时间的崩解，如表5所示。
[表5]
| 片剂贮存时间 | 崩解时间 |
| 仅在制备后(0个月) | 16min |
| 在制备后1个月 | 17min |
| 在制备后6个月 | 16min |
此外，指标物质的含量也随时间保持稳定，如下面表6所示。
[表6]
| 牡丹皮芍药甙(%) | 络石藤牛蒡甙元(%) | |
| 初始(2010.10.8) | 2.87 | 0.22 |
| 2个月(2010.12.3) | 2.81 | 0.24 |
| 3个月(2011.1.19) | 2.85 | 0.25 |
| 4个月(2011.2.28) | 2.81 | 0.26 |
| 6个月(2011.4.10) | 3.06 | 0.24 |
| 7个月(2011.5.19) | 3.12 | 0.25 |
6-5.基于络石藤和牡丹皮的含玉米淀粉的干燥混合颗粒的形态稳
定性
如形态稳定性所测量的，观察到在制备例7中制备的基于络石藤和牡丹皮的各自含玉米淀粉的干燥混合颗粒与制备例中所制备的颗粒相比更不受水份影响，而均匀地溶化为软质形式。
当在具有赋形剂的混合物中配制为片剂时，基于络石藤和牡丹皮两者的干燥混合颗粒塌陷，与在制备例4中制备的干燥颗粒相同。因此，基于络石藤或牡丹皮的含玉米淀粉的干燥混合颗粒不适于在GMP设备下生产产品。
尽管为了示例目的公开了本发明的优选实施方案，本领域技术人员应认识到各种改变、添加或替换是可能的，而不背离随附的权利要求所公开的发明的范围和主旨。
Claims (25)
1.用于预防或治疗炎性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述混合物包含基于干重比例为1:1至3:1的所述络石藤提取物和所述牡丹皮提取物。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中用选自水、具有1至6个碳原子的醇及其组合的溶剂各自提取所述提取物。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述醇选自甲醇、乙醇和丁醇。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其中用乙醇以固体提取物或软质提取物形式提取所述络石藤提取物和牡丹皮提取物。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述络石藤提取物包含作为指标物质的量为0.05wt%至1.5wt%的牛蒡甙元。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述牡丹皮提取物包含作为指标物质的量为1.8wt%至5.3wt%的芍药甙。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其用于抑制一氧化氮(NO)、IL-6或IL-1β的释放。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述炎性疾病选自水肿、皮炎、过敏症、特应性、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述炎性疾病为类风湿关节炎。
11.如权利要求1所述的药物组合物，其还包含二氧化硅和药物可接受的用于口服给药的赋形剂。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中基于100重量份的所述络石藤提取物加所述牡丹皮提取物的混合物，包含30重量份至100重量份的二氧化硅。
13.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述赋形剂为微晶纤维素或硅酸钾。
14.如权利要求11所述的药物组合物，其的形式选自散剂、颗粒剂、硬胶囊和片剂。
15.用于预防或改善炎症的准药组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
16.用于预防或改善炎症的保健功能食品组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
17.用于预防或改善炎症的化妆品组合物，其包含作为活性成分的络石藤提取物和牡丹皮提取物的混合物。
18.用于制备预防或治疗炎性疾病的药物组合物的方法，其包括：
(a)在乙醇水溶液中提取络石藤，然后过滤以分离滤液和残余物，并且将所述滤液干燥以获得含0.05wt%至1.5wt%的牛蒡甙元的提取物，所述牛蒡甙元用作络石藤的指标物质；
(b)在乙醇水溶液中提取牡丹皮，然后过滤以分离滤液和残余物，并且将所述滤液干燥以获得含1.8wt%至5.3wt%的芍药甙的提取物，所述芍药甙用作牡丹皮的指标物质；以及
(c)基于干重以1:1至3:1的比例混合所述步骤(a)的络石藤提取物和所述步骤(b)的牡丹皮提取物以获得混合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述步骤(a)的络石藤提取物和所述步骤(b)的牡丹皮提取物分别为软质提取物形式。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述步骤(a)和(b)以顺序、倒序或同时进行。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述炎性疾病选自水肿、皮炎、过敏症、特应性、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化。
22.如权利要求18所述的方法，其还包括：
(d)使所述步骤(c)的混合物与二氧化硅和乙醇结合；以及
(e)通过完全蒸发所述乙醇以干燥所述步骤(d)的组合，从而获得用于口服剂量配制剂的干燥混合物。
23.如权利要求22所述的方法，其中基于100重量份的步骤(c)的混合物，所述二氧化硅以30重量份至100重量份的量使用。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述步骤(c)的混合物在步骤(d)中还与药物可接受的盐结合。
25.用于治疗炎性疾病的方法，其包括向疑似患有所述炎性疾病的个体给予权利要求1至14中任一权利要求所述的药物组合物。
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