CN111157633A - 一种中药组合物制剂的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种中药组合物制剂的检测方法，所述方法高效液相色谱法，具体包括如下步骤：测定条件:以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈‑0.1％磷酸水溶液(10～15)：(85～90)为流动相；对照品溶液的配制:取芍药苷对照品，有机溶剂溶解，得对照品溶液；供试品溶液的配制:取中药组合物制剂，有机溶剂提取，得供试品溶液；测定法:分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。

Description

一种中药组合物制剂的检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药组合物制剂的检测方法，具体涉及一种治疗支气管哮喘的中药组合物制剂的检测方法，属于医药领域。
背景技术
支气管哮喘多发病于夜间和凌晨，在受凉、嗅刺激性气味(烟雾、香水、油漆、灰尘、宠物、花粉等)时容易诱发，是一种由嗜酸粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等参与的炎症反应，增加了气道反应性，进而出现气道呼气受限，最终导致咳嗽、咯痰、喘憋、气促、喉中哮鸣有声等症状，经气管扩张药物治疗后多可缓解，属于中医学“哮病”范畴。
据WHO估计，全球哮喘病的患者高达2.75亿人。近10年哮喘的发病率、病死率呈上升势态，全球范围内，每年有超过18万人死于哮喘。据美国疾病预防控制中心(CDC)报道，近500万美国儿童被诊断患有哮喘。尽管开展了积极地研究和预防，但在1982-1993年间，美国儿童的哮喘相关死亡率仍然增长了78％。哮喘的发病率除了与地区性差异有关外，还与经济状况、营养和风俗习惯等有很大关系，而且发达国家的哮喘发病率比欠发达国家高。
根据2000年全国哮喘会议上海、北京、沈阳及广东等地流行病学资料显示，中国成人哮喘发病率为0.7％-1.5％，儿童为0.11％-2.03％，即全国有1500万-2000万患者，以青年和儿童居多。目前，国内外学者对支气管哮喘的研究逐步增加，但仍然难以详细了解其发病机制，在治疗方面仍未发现疗效显著的药物。肾上腺皮质激素仍然是当前控制气管炎症，预防疾病反复发作的首选药物，但存在较大不良反应。因此，从中医药方面研究支气管哮喘的治疗方法，提高临床疗效，减少疾病的反复反作成为众多国内外中医药学者研究的方向，具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种治疗支气管哮喘的中药组合物及其制备方法、检测方法和应用。
作为本发明的一个方面，本发明提供一种治疗支气管哮喘的中药组合物，该中药组合物由如下原料药制成：黄芪、桂枝、白术、干姜、紫苏子、厚朴、肉桂、白芥子、白芍、五味子、甘草。
在具体的实施方式中，所述中药组合物由如下原料药制成：黄芪6-40重量份、桂枝4-28重量份、白术5-32重量份、干姜4-28重量份、紫苏子4-28重量份、厚朴4-28重量份、肉桂2-18重量份、白芥子1-8重量份、白芍5-32重量份、五味子3-24重量份、甘草3-24重量份。
在优选的实施方式中，所述中药组合物由如下原料药制成：黄芪10-30重量份、桂枝5-20重量份、白术6-24重量份、干姜5-20重量份、紫苏子5-20重量份、厚朴5-20重量份、肉桂2-15重量份、白芥子2-6重量份、白芍6-24重量份、五味子3-18重量份、甘草3-18重量份。
在进一步优选的实施方式中，所述中药组合物由如下原料药制成：黄芪15-22重量份、桂枝7-12重量份、白术9-15重量份、干姜7-12重量份、紫苏子7-12重量份、厚朴7-12重量份、肉桂3-8重量份、白芥子2-4重量份、白芍9-15重量份、五味子4-9重量份、甘草4-9重量份。
在最优选的实施方式中，所述中药组合物由如下原料药制成：黄芪18重量份、桂枝9重量份、白术12重量份、干姜9重量份、紫苏子9重量份、厚朴9重量份、肉桂5重量份、白芥子3重量份、白芍12重量份、五味子6重量份、甘草6重量份；
或，所述中药组合物由如下原料药制成：黄芪16重量份、桂枝11重量份、白术10重量份、干姜11重量份、紫苏子8重量份、厚朴11重量份、肉桂4重量份、白芥子4重量份、白芍10重量份、五味子8重量份、甘草5重量份；
或，所述中药组合物由如下原料药制成：黄芪21重量份、桂枝8重量份、白术14重量份、干姜8重量份、紫苏子11重量份、厚朴8重量份、肉桂7重量份、白芥子2重量份、白芍14重量份、五味子5重量份、甘草8重量份。
作为优选的实施方式，所述黄芪为生黄芪；所述白术为炒白术；所述甘草为生甘草。
本发明所述中药组合物可以是各原料药粉碎后混合而成的组合物，也可以混合或单独提取后得到的提取物，或者是提取物进一步精制纯化得到的有效部位，还可以是加入药学上可接受的辅料制成的常规剂型。
其中，所述提取方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等；所述纯化方法包括水提醇沉、碱溶酸沉以及各种柱色谱纯化方法，如大孔树脂柱、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等；所述常规剂型包括但不限于注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、缓释剂、口服液、滴丸剂或纳米制剂；所述药学可接受的辅料包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。
作为本发明的第二个方面，本发明提供所述中药组合物在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。
作为本发明的第三个方面，本发明提供所述中药组合物制剂的制备方法，所述方法包括：
步骤a，取桂枝、干姜、肉桂三味提取挥发油，得到挥发油A和水提液B；
步骤b，取黄芪、白术、苏子、厚朴、白芥子、白芍、五味子、甘草八味，加常规溶剂提取，得到提取液C；
步骤c，将步骤b的提取液C与步骤a的水提液B合并，浓缩，加入步骤a的挥发油A，制成颗粒剂。
在具体的实施方式中，步骤a得到的挥发油A用倍他环糊精包合，挥发油(mL)与倍他环糊精(g)的比例为1∶(6-10)，包合温度为30℃～50℃，包合时间为1～3h。
在具体的实施方式中，步骤b所述常规溶剂包括水、甲醇、乙醇；优选采用水提取。
在具体的实施方式中，步骤b加水量(ml)为药材(g)的8～12倍，提取时间为1-2小时，提取次数为1-3次。
在具体的实施方式中，步骤c将提取液合并后还包括醇沉除杂的过程，即提取液浓缩后加乙醇至含醇量为50％～70％，取滤液回收乙醇。
在具体的实施方式中，步骤c水提液浓缩至相对密度为1.15～1.20，醇沉浓度为60％。
在具体的实施方式中，步骤c采用湿法制粒，润湿剂为90％～95％的乙醇溶液，优选为95％的乙醇溶液；所述中药组合物与赋形剂比例为3∶(2～3)，优选3∶2；所述赋形剂选自糊精、乳糖、可溶性淀粉中的任意一种或几种，优选为糊精。
在具体的实施方式中，所述制粒过程中环境相对湿度在71％以下。
作为本发明的第四个方面，本发明提供所述中药组合物颗粒剂的检测方法，所述方法高效液相色谱法，具体包括如下步骤：
测定条件：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(10～15)∶(85～90)为流动相；
对照品溶液的配制：取芍药苷对照品，有机溶剂溶解，得对照品溶液；
供试品溶液的配制：取中药组合物颗粒剂，有机溶剂提取，得供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。
在具体的实施方式中，所述有机溶剂选自甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿中的任意一种；所述提取方法选自超声提取、回流提取、冷浸提取、渗漉提取、微波提取等方法。
在优选的实施方式中，所述供试品溶液制备采用甲醇超声提取。
在优选的实施方式中，所述流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(11∶89)。
本发明所述各原料药均收载于《中国药典》2015版，炮制方法为《药典》记载方法。
本发明组方中，黄芪，甘，温，归肺、脾经，健脾益肺、补气固表；桂枝，辛，甘，温，归心、肺、膀胱经，温通经脉、助阳化气；二药共成温阳健脾益肺培本之功，用为君药。白术，苦、甘，温归脾、胃经，健脾益气，燥湿利水，止汗，培土绝痰源；干姜，辛、热，归脾、胃、肾、心、肺经，温中散寒，回阳通脉，燥湿消痰；苏子，辛，温，归肺经，降气消痰，平喘；厚朴，苦、辛，温，归脾、胃、肺、大肠经，燥湿消痰，下气除满，善除湿滞伤中，痰饮喘咳；四药相合，健脾消痰、降气平喘共为臣药。肉桂，辛、甘，大热，归肾、脾、心、肝经，补火助阳，引火归源，益命门助脾阳，佐黄芪、白术、干姜温阳健脾；白芥子，辛，温，入肺、胃经，利气豁痰，温中散寒，除痰饮咳喘，佐苏子、厚朴降气消痰平喘；白芍，苦、酸，微寒，归肝、脾经，平肝止痛，养血调经，敛阴止汗，佐君臣，防辛温耗散，缓急迫畅气机；五味子，酸、甘，温，归肺，心、肾经，收敛固涩，益气生津，补肾宁心，与君臣合力益肺宁喘；四药协作助君臣，共担佐药。甘草，甘，平，归心、肺、脾、胃经，补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，调和诸药，用为使药。全方守“温润辛金培本”原理，甘温益气、辛甘化阳、酸甘化阴、阴阳共济，治病求本，共奏温阳健脾益肺、降气平喘之功。
临床研究表明，在主症“喘憋”+体征“干啰音”的总体疗效上，本发明中药组合物的显效率和有效率分别是16.92％、56.92％，对照药物的显效率和有效率分别是6.15％、29.23％，两组比较均有显著的统计学差异(P＝0.001)，说明本发明中药组合物在治疗肺脾肾虚型支气管哮喘慢性持续期患者的主症+体征的显效率和有效率方面明显优于对照组。
附图说明
图1为芍药苷对照品溶液色谱图
图2为中药组合物供试品溶液色谱图
图3为白芍阴性供试品溶液色谱图
具体实施方式
实施例1中药组合物汤剂
组方：黄芪18g、桂枝9g、白术12g、干姜9g、紫苏子9g、厚朴9g、肉桂5g、白芥子3g、白芍12g、五味子6g、甘草6g；
制备方法：按比例取各原料药，水煎煮提取，得中药组合物汤剂。
实施例2中药组合物汤剂
组方：黄芪16g、桂枝11g、白术10g、干姜11g、紫苏子8g、厚朴11g、肉桂4g、白芥子4g、白芍10g、五味子8g、甘草5g；
制备方法：按比例取各原料药，水煎煮提取，得中药组合物汤剂。
实施例3中药组合物汤剂
组方：黄芪21g、桂枝8g、白术14g、干姜8g、紫苏子11g、厚朴8g、肉桂7g、白芥子2g、白芍14g、五味子5g、甘草8g；
制备方法：按比例取各原料药，水煎煮提取，得中药组合物汤剂。
实施例4中药组合物颗粒剂
组方：黄芪18g、桂枝9g、白术12g、干姜9g、紫苏子9g、厚朴9g、肉桂5g、白芥子3g、白芍12g、五味子6g、甘草6g；
制备方法：
桂枝、干姜(破碎成一角硬币大小)和肉桂(破碎成黄豆大小)用水蒸气蒸馏法提取挥发油，药材不浸泡、加8倍量水提取12h，水提取液滤过，备用；收集挥发油，用β-环糊精进行包合，挥发油(mL)与β-CD(g)比例为1∶10，包合温度为40℃，包合3h；
黄芪、白术、苏子、厚朴、白芥子、白芍、五味子、甘草这八味药加水10倍量，提取3次，每次2小时，煎液滤过，滤液与上述蒸馏后的水溶液合并，浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)，加乙醇调节醇沉浓度到60％，静置过夜，抽滤，适当浓缩(测定黄芪甲苷的转移率为90.45％，芍药苷的转移率为88.29％)，于70℃真空干燥箱内完全干燥，粉碎成细粉，加入之前的挥发油包合物，充分混合，得组合物浸膏粉；
将组合物浸膏粉与糊精按3∶2的药辅比混合均匀，湿法制粒，以95％乙醇为润湿剂，环境相对湿度控制在71％以下，制备颗粒，干燥、包装即得成品颗粒。
本发明研究发现，制粒过程中要严格控制环境相对湿度在71％以下，如果相对湿度高于71％，则会造成物料吸潮，制粒困难。
实施例5中药组合物颗粒剂
组方：黄芪16g、桂枝11g、白术10g、干姜11g、紫苏子8g、厚朴11g、肉桂4g、白芥子4g、白芍10g、五味子8g、甘草5g；
制备方法同实施例4。
实施例6中药组合物颗粒剂
组方：黄芪21g、桂枝8g、白术14g、干姜8g、紫苏子11g、厚朴8g、肉桂7g、白芥子2g、白芍14g、五味子5g、甘草8g；
制备方法同实施例4。
实施例7中药组合物颗粒剂
组方：黄芪18g、桂枝9g、白术12g、干姜9g、紫苏子9g、厚朴9g、肉桂5g、白芥子3g、白芍12g、五味子6g、甘草6g；
制备方法：
桂枝、干姜(破碎成一角硬币大小)和肉桂(破碎成黄豆大小)用水蒸气蒸馏法提取挥发油，药材不浸泡、加10倍量水提取12h，水提取液滤过，备用；收集挥发油，用β-环糊精进行包合，挥发油(mL)与β-CD(g)比例为1∶8，包合温度为30℃，包合2h；
黄芪、白术、苏子、厚朴、白芥子、白芍、五味子、甘草这八味药加水8倍量，提取2次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液与上述蒸馏后的水溶液合并，浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)，加乙醇调节醇沉浓度到70％，静置过夜，抽滤，适当浓缩(测定黄芪甲苷的转移率为66.11％，芍药苷的转移率为82.74％)，于70℃真空干燥箱内完全干燥，粉碎成细粉，加入之前的挥发油包合物，充分混合，得组合物浸膏粉；
组合物浸膏粉与糊精按3∶2的药辅比混合均匀，湿法制粒，以93％乙醇为润湿剂，环境相对湿度控制在71％以下，制备颗粒，干燥、包装即得成品颗粒。
实施例8中药组合物颗粒剂
组方：黄芪14g、桂枝16g、白术8g、干姜16g、紫苏子6g、厚朴15g、肉桂3g、白芥子5g、白芍8g、五味子14g、甘草4g；
制备方法同实施例7。
实施例9中药组合物颗粒剂
组方：黄芪25g、桂枝6g、白术19g、干姜6g、紫苏子16g、厚朴6g、肉桂10g、白芥子2g、白芍17g、五味子4g、甘草14g；
制备方法同实施例7。
实施例10中药组合物颗粒剂
组方：黄芪18g、桂枝9g、白术12g、干姜9g、紫苏子9g、厚朴9g、肉桂5g、白芥子3g、白芍12g、五味子6g、甘草6g；
制备方法：
桂枝、干姜(破碎成一角硬币大小)和肉桂(破碎成黄豆大小)用水蒸气蒸馏法提取挥发油，药材不浸泡、加12倍量水提取10h，水提取液滤过，备用；收集挥发油，用β-环糊精进行包合，挥发油(mL)与β-CD(g)比例为1∶6，包合温度为50℃，包合1h；
黄芪、白术、苏子、厚朴、白芥子、白芍、五味子、甘草这八味药加水12倍量，提取1次，每次1小时，煎液滤过，滤液与上述蒸馏后的水溶液合并，浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)，加乙醇调节醇沉浓度到50％，静置过夜，抽滤，适当浓缩(测定黄芪甲苷的转移率为76.97％，芍药苷的转移率为86.73％)，于70℃真空干燥箱内完全干燥，粉碎成细粉，加入之前的挥发油包合物，充分混合，得组合物浸膏粉；
组合物浸膏粉与糊精按1∶1的药辅比混合均匀，湿法制粒，以95％乙醇为润湿剂，环境相对湿度控制在71％以下，制备颗粒，干燥、包装即得成品颗粒。
实施例11中药组合物颗粒剂
组方：黄芪8g、桂枝26g、白术5g、干姜27g、紫苏子4g、厚朴26g、肉桂2g、白芥子7g、白芍5g、五味子22g、甘草3g；
制备方法同实施例10。
实施例12中药组合物颗粒剂
组方：黄芪38g、桂枝4g、白术30g、干姜4g、紫苏子26g、厚朴4g、肉桂17g、白芥子1g、白芍30g、五味子3g、甘草22g；
制备方法同实施例10。
实施例13中药组合物汤剂
组方：黄芪35g、桂枝5g、白术27g、干姜5g、紫苏子24g、厚朴5g、肉桂16g、白芥子2g、白芍26g、五味子3g、甘草20g；
制备方法：按比例取各原料药，水煎煮提取，得中药组合物汤剂。
实施例14中药组合物汤剂
组方：黄芪32g、桂枝6g、白术25g、干姜6g、紫苏子22g、厚朴7g、肉桂15g、白芥子8g、白芍22g、五味子6g、甘草19g；
制备方法：按比例取各原料药，水煎煮提取，得中药组合物汤剂。
实施例15中药组合物汤剂
组方：黄芪15g、桂枝12g、白术9g、干姜12g、紫苏子7g、厚朴12g、肉桂3量份、白芥子4g、白芍9g、五味子9g、甘草4g；
制备方法：按比例取各原料药，水煎煮提取，得中药组合物汤剂。
实施例16中药组合物片剂
组方：黄芪22g、桂枝7g、白术15g、干姜7g、紫苏子12g、厚朴7g、肉桂8g、白芥子2g、白芍15g、五味子4g、甘草9g；
制备方法：
桂枝、干姜(破碎成一角硬币大小)和肉桂(破碎成黄豆大小)用水蒸气蒸馏法提取挥发油，药材不浸泡、加8倍量水提取12h，水提取液滤过，备用；收集挥发油，用β-环糊精进行包合，挥发油(mL)与β-CD(g)比例为1∶10，包合温度为40℃，包合3h；
黄芪、白术、苏子、厚朴、白芥子、白芍、五味子、甘草这八味药加水10倍量，提取3次，每次2小时，煎液滤过，滤液与上述蒸馏后的水溶液合并，浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)，加乙醇调节醇沉浓度到60％，静置过夜，抽滤，适当浓缩，于70℃真空干燥箱内完全干燥，粉碎成细粉，加入之前的挥发油包合物，充分混合，得组合物浸膏粉；
将组合物浸膏粉加入常规片剂辅料制成片剂。
实施例17中药组合物片剂
组方：黄芪17g、桂枝10g、白术11g、干姜10g、紫苏子7g、厚朴10g、肉桂3g、白芥子4g、白芍9g、五味子7g、甘草4g；
制备方法同实施例16。
实施例18中药组合物片剂
组方：黄芪20g、桂枝7g、白术13g、干姜7g、紫苏子10g、厚朴7g、肉桂8g、白芥子2g、白芍13g、五味子4g、甘草7g；
制备方法同实施例16。
实施例19
组方：黄芪提取物18g、桂枝提取物9g、白术提取物12g、干姜提取物9g、紫苏子提取物9g、厚朴提取物9g、肉桂提取物5g、白芥子提取物3g、白芍提取物12g、五味子提取物6g、甘草提取物6g。
实施例20
组方：黄芪提取物16g、桂枝提取物11g、白术提取物10g、干姜提取物11g、紫苏子提取物8g、厚朴提取物11g、肉桂提取物4g、白芥子提取物4g、白芍提取物10g、五味子提取物8g、甘草提取物5g。
实施例21
组方：黄芪提取物21g、桂枝提取物8g、白术提取物14g、干姜提取物8g、紫苏子提取物11g、厚朴提取物8g、肉桂提取物7g、白芥子提取物2g、白芍提取物14g、五味子提取物5g、甘草提取物8g。
实施例22
组方：黄芪提取物17g、桂枝提取物10g、白术提取物11g、干姜提取物10g、紫苏子提取物7g、厚朴提取物10g、肉桂提取物3g、白芥子提取物4g、白芍提取物9g、五味子提取物7g、甘草提取物4g。
实施例23
组方：黄芪提取物20g、桂枝提取物7g、白术提取物13g、干姜提取物7g、紫苏子提取物10g、厚朴提取物7g、肉桂提取物8g、白芥子提取物2g、白芍提取物13g、五味子提取物4g、甘草提取物7g。
以上实施例19-23所述桂枝提取物、干姜提取物、肉桂提取物分别为桂枝、干姜、肉桂、辛夷的挥发油提取物；所述黄芪提取物、白术提取物、苏子提取物、厚朴提取物、白芥子提取物、白芍提取物、五味子提取物、甘草提取物分别为黄芪、白术、苏子、厚朴、白芥子、白芍、五味子、甘草经水提醇沉工艺制备的提取物，所述醇沉浓度为60％。
对照实施例
组方：黄芪18g、桂枝9g、白术12g、干姜9g、防风9g、厚朴9g、茯苓12g、肉桂5g、紫菀12g、白芍12g、五味子6g、甘草6g；
制备方法：桂枝、干姜(破碎成一角硬币大小)和肉桂(破碎成黄豆大小)用水蒸气蒸馏法提取挥发油，药材不浸泡、加8倍量水提取12h，水提取液滤过，备用；收集挥发油，用β-环糊精进行包合，挥发油(mL)与β-CD(g)比例为1∶10，包合温度为40℃，包合3h；
黄芪、白术、防风、厚朴、茯苓、紫菀、白芍、五味子、甘草这九味药加水10倍量，提取3次，每次2小时，煎液滤过，滤液与上述蒸馏后的水溶液合并，浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)，加乙醇调节醇沉浓度到60％，静置过夜，抽滤，适当浓缩(测定黄芪甲苷的转移率为90.45％，芍药苷的转移率为88.29％)，于70℃真空干燥箱内完全干燥，粉碎成细粉，加入之前的挥发油包合物，充分混合，得组合物浸膏粉；
将组合物浸膏粉与糊精按3∶2的药辅比混合均匀，湿法制粒，以95％乙醇为润湿剂，环境相对湿度控制在71％以下，制备颗粒，干燥、包装即得成品颗粒。
实施例24临床效果实验
1、临床资料
1.1、病例来源
130例病例分别来自北京中医药大学东直门医院、河南中医学院第一附属医院、山东中医药大学第一附属医院、山东中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第一附属医院2011年4月-2013年6月期间的门诊患者。
1.2、病例选择
病例诊断纳入标准：
(1)反复发作喘息、气急、胸闷或咳嗽，多与接触变应原、冷空气、物理、化学性刺激、病毒性上呼吸道感染，运动等有关；
(2)发作时在双肺可闻及散在或弥漫性，以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长；
(3)上述症状可经治疗缓解或自行缓解；
(4)除外其它疾病所引起的喘息、气急、胸闷和咳嗽；
(5)临床表现不典型者(如无明显喘息或体征)，应至少具备以下1项试验阳性：
①支气管激发试验或运动激发试验阳性；
②支气管舒张试验阳性FEV1增加≥12％，且FEV1增加绝对值≥200ml；
③呼气流量峰值(pulsed electric fields，PEF)日内(或2周)变异率≥20％。
符合1～4条或4、5条者，可以诊断为哮喘。
支气管哮喘慢性持续期：是指在相当长的时间内，每周均不同频度和(或)不同程度地出现症状(喘息、气急、胸闷、咳嗽等)。
哮喘急性发作：是指喘息、气急、咳嗽、胸闷等症状突然发生，或原有症状急剧加重，常有呼吸困难，以呼气流量降低为其特征，常因接触变应原等刺激物或治疗不当等所致。
哮喘急性发作程度：
轻度：不需要临床门诊、口服激素、支气管解痉治疗和氧疗；
中度：需要临床门诊、或需要口服激素、或需要支气管解痉治疗、或需要氧疗；
重度：需要住院或急诊治疗(1.严重的急性发作：患者在休息时感到气紧，耸肩前倾位，说话用单词而不成句；焦虑，昏睡或昏迷，心动过缓，或呼吸频率超过30次/min；响亮的喘息或无喘息；脉搏大于120次/min；即使在初步的治疗后，PEF仍小于预计值或个人最佳值60％；患者极度疲劳。2.对初始的支气管舒张剂治疗反应迟缓，且持续至少3h。3.在口服糖皮质激素治疗开始后2～6h无改善。4.进一步恶化)。
1.3、分组方法
按照随机分组的原则，将入选患者分为治疗组65例，对照组65例。
2、治疗方法及疗效观察指标
2.1、治疗用药
治疗组口服本发明中药组合物颗粒剂(按实施例4制备)治疗。
对照组口服对照药物颗粒剂(按对照实施例制备)治疗。
2.2、用药方法及疗程
治疗组口服本发明中药组合物颗粒剂，每日2次，早晚分服。对照组口服对照药物颗粒剂，每日2次，早晚分服。4周为1疗程，共观察1个疗程。
2.3、疗效观察指标
2.3.1、主症“喘憋”+体征“干啰音”的显效率、有效率；
2.3.2、圣·乔治呼吸问卷(SGRQ)
3、疗效评定方法
参照中华医学会呼吸病学分会哮喘学组《支气管哮喘防治指南(2008年)》；国家药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》(试行)2002年版等相关内容制定。
3.1喘憋程度(MRC标准)分级量化标准
O分：无喘憋；
1分：剧烈运动时喘憋；
2分：登楼或爬坡时感喘憋；
3分：与同龄人比较步行时感喘憋；
4分：步行100码(90米)后因感喘憋被迫停止；
5分：不能离开房间或穿脱衣服时感喘憋。
以上单项条目积分为等级资料，按照计量资料处理。
3.2、肺部干啰音分级量化标准
O分：未闻及；
1分：散在；
2分：广泛；
3分：满布。
以上单项条目积分为等级资料，按照计量资料处理。
3.3、主症“喘憋”+体征“干啰音”综合疗效的有效率评价标准(主要比较显效率)
控制：两项临床症状、体征总积分减少≥95％；
显效：两项临床症状、体征总积分减少≥70％，＜95％；
有效：两项临床症状、体征总积分减少≥30％，＜70％；
无效：两项临床症状、体征总积分减少不足30％。
3.4、圣·乔治呼吸问卷(SGRQ)评价标准
依据圣·乔治呼吸问卷(SGRQ)的构成属性及评价要求，该问卷包含50个问题，可划分为三个能区：呼吸症状(咳嗽、咳痰、气喘发作等)、活动受限(爬坡、穿衣、游戏、家务等)、疾病影响(焦虑、痛苦、不安全感、失望等)，每道问题的答案都有特定预先给出的分数，具体评分标准为：每一部分分值等于该部分阳性选项的得分之和与该部分总预计分比值的100倍，总分分值等于所有阳性选项的得分之和与全部问题总预计分比值的100倍。
圣·乔治呼吸问卷(SGRQ)评价标准：分值范围为0-100，分值越低代表患者的健康状况越好；对生活完全无影响为0分，对生活极度影响为100分。
显效：SGRQ总计分较治疗前减少10％以上；
好转：SGRQ总计分较治疗前减少4％-10％；
无效：SGRQ总计分较治疗前减少不足4％。
4、安全性评价方法
4.1、收缩压、舒张压、心率等计量指标比较；
4.2、各研究组实验室指标异常率比较；
4.3、不良反应与相应检测指标的关联性。
5、临床试验结果
5.1两组基线比较
两组生命体征(包括年龄、身高、体重、体温、心率、收缩压、舒张压等指标)、安全性指标(包括红细胞、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐)、主要症状体征(包括喘憋和干啰音)、肺功能均无显著性差异，表明两组基线均衡性较好。
5.2疗效评价结果
5.2.1主症+体征疗效评价
支气管哮喘慢性持续期患者治疗组和对照组的疗效评价P值＝0.001＜0.05，说明支气管哮喘慢性持续期患者两组间的疗效有统计学意义，如表1所示。
表1支气管哮喘慢性持续期患者主症+体征疗效评价
指标项 治疗组 对照组 合计 统计量 P值
Z_Wil＝3.331 P＝0.001
控制(％) 2(3.08) 3(4.62) 5
显效(％) 9(13.85) 1(1.54) 10
有效(％) 26(40.00) 15(23.08) 41
无效(％) 28(43.08) 46(70.77) 74
合计(缺失) 65(0) 65(0) 130
总有效率(％) 37(56.92) 19(29.23)
5.2.2圣·乔治呼吸问卷疗效评价
支气管哮喘慢性持续期患者的圣·乔治呼吸问卷疗效评价P值＝0.005＜0.05，说明支气管哮喘慢性持续期患者的治疗组和对照组的疗效差异有统计学意义，如表2所示。
表2支气管哮喘慢性持续期患者圣·乔治呼吸问卷疗效评价
指标项 治疗组 对照组 合计 统计量 P值
Z_Wil＝2.805 P＝0.005
显效(％) 44(67.69) 31(47.69) 75
有效(％) 9(14.75) 6(9.23) 15
无效(％) 12(19.67) 28(43.08) 40
合计(缺失) 65(0) 65(0) 130
总有效率(％) 53(81.54) 37(56.92)
表1、表2反映了本研究治疗组患者的主症+体征和圣·乔治呼吸问卷在总体或按疾病分层后，P值均＜0.05，差异有统计学意义，说明本发明中药组合物疗效明显优于对照药物。
5.2.3针对具体结局的疗效评价
5.2.3.1依据主要结局指标“主症(喘憋)+体征(干啰音)”的肺病喘憋疗效评价，包括有效率、显效率
(1)主症+体征显效率
支气管哮喘慢性持续期患者的显效率P值均＜0.05，说明支气管哮喘慢性持续期患者的治疗组和对照组的显效率差异有统计学意义，如表3所示。
表3支气管哮喘慢性持续期患者主症+体征显效率评价
指标项 治疗组 对照组 合计 统计量 P值
chisq＝3.941 P＝0.042
显效(％) 11(16.92) 4(6.15) 15
非显效(％) 54(83.08) 61(93.85) 115
合计 65 65 130
(2)主症+体征有效率
支气管哮喘慢性持续期患者主症+体征的有效率P值均＜0.05，说明支气管哮喘慢性持续期患者的治疗组和对照组的主症+体征有效率差异有统计学意义，如表4所示。
表4支气管哮喘慢性持续期患者主症+体征有效率评价
指标项 治疗组 对照组 合计 统计量 P值
chisq＝10.164 P＝0.001
有效(％) 37(56.92) 19(29.23) 56
无效(％) 28(43.08) 46(70.77) 74
合计 65 65 130
表3、表4反映了治疗组和对照组患者的主症+体征在总体或按疾病分层后显效率和有效率P值均＜0.05，说明治疗组患者主症+体征的疗效优于对照组患者。
5.2.3.2以“圣·乔治呼吸问卷(SGRQ)”为疗效指标的肺病生命质量评价
(1)肺病生命质量的综合评价，包括显效率、有效率
①圣·乔治呼吸问卷显效率
支气管哮喘慢性持续期患者的圣·乔治呼吸问卷显效率P＜0.05，说明支气管哮喘慢性持续期患者的圣·乔治呼吸问卷治疗组和对照组的显效率差异有统计学意义，如表5所示。
表5支气管哮喘慢性持续期患者圣·乔治呼吸问卷显效率评价
指标项 治疗组 对照组 合计 统计量 P值
chisq＝5.326 P＝0.016
显效(％) 44(67.69) 31(47.69) 75
非显效(％) 21(32.31) 34(52.31) 55
合计 65 65 130
②圣·乔治呼吸问卷有效率
支气管哮喘慢性持续期患者的圣·乔治呼吸问卷有效率P＜0.05，说明支气管哮喘慢性持续期患者的圣·乔治呼吸问卷治疗组和对照组的有效率差异有统计学意义，如表6所示。
表6支气管哮喘慢性持续期患者圣·乔治呼吸问卷有效率评价
指标项 治疗组 对照组 合计 统计量 P值
chisq＝9.244 P＝0.002
有效(％) 53(81.54) 37(56.92) 90
无效(％) 12(18.46) 28(43.08) 40
合计 65 65 130
(2)区分维度、条目的疗效关联性分析
①量表评分情况
疗前支气管哮喘慢性持续期患者圣·乔治呼吸问卷各维度评分P＞0.05，说明疗前支气管哮喘慢性持续期患者的治疗组和对照组患者圣·乔治呼吸问卷差异无统计学意义；疗后支气管哮喘慢性持续期患者圣·乔治呼吸问卷症状和总评分的P＜0.05，说明疗后支气管哮喘慢性持续期患者治疗组和对照组患者圣·乔治呼吸问卷症状和总评分差异有统计学意义，说明治疗组患者的生存质量高于对照组，即使差异无统计学意义的(P＞0.05)。
②圣·乔治呼吸问卷各领域评分组内比较
支气管哮喘慢性持续期患者治疗组自身疗前和疗后圣·乔治呼吸问卷各领域评分P＜0.05，说明支气管哮喘慢性持续期患者治疗组自身疗前和疗后圣·乔治呼吸问卷差异有统计学意义，如表7所示。
表7治疗组自身疗后与疗前比较
指标项 N(缺失) 均数±标准差 统计量 P值
症状
基线 65(0) 49.21±20.71 - -
4周 65(0) 36.47±14.59 S＝570.5 ＜.0001
活动
基线 65(0) 42.23±21.26 - -
4周 65(0) 33.21±16.66 S＝410.5 ＜.0001
影响
基线 65(0) 31.57±18.77 - -
4周 65(0) 20.97±12.49 S＝595.5 ＜.0001
总分
基线 65(0) 41.00±17.63 - -
4周 65(0) 30.22±12.20 S＝753 ＜.0001
支气管哮喘慢性持续期患者对照组自身疗前和疗后圣·乔治呼吸问卷各领域评分P＜0.05，说明支气管哮喘慢性持续期患者对照组自身疗前和疗后圣·乔治呼吸问卷差异有统计学意义，如表8所示。
表8对照组自身疗后与疗前比较
指标项 N(缺失) 均数±标准差 统计量 P值
症状
基线 65(0) 48.30±18.76 - -
4周 65(0) 44.20±18.31 S＝279.5 0.0057
活动
基线 65(0) 42.23±22.39 - -
4周 65(0) 36.21±19.63 S＝262.5 ＜.0001
影响
基线 65(0) 31.55±19.45 - -
4周 65(0) 24.71±18.12 S＝478 ＜.0001
总分
基线 65(0) 40.69±17.25 - -
4周 65(0) 35.04±16.13 S＝600.5 ＜.0001
表7-表8反映了患者组内疗前疗后比较情况，总体或按疾病分层后，治疗组和对照组均有疗效，但从均数±标准差可看出，治疗组的生存质量还是优于对照组。
5.3安全性结果
治疗组在疗前、疗后舒张压、血、尿、便常规、大便潜血、肝肾功能各方面差异均无统计学意义(P＞0.05)，收缩压和心率虽有统计学差异，但检测值均在临床正常范围内，并未显示临床异常。同时，本试验过程中未见不良反应发生，表明本发明中药组合物使用安全。
以上研究结果表明，治疗组在主症、体征和生存质量评分在显效率、有效率方面均较对照组有明显优势，存在显著的统计学差异；并且圣·乔治呼吸问卷的各个部分的疗效也有一定程度的提高，且有统计学差异。该研究结果表明：本发明中药组合物在治疗支气管哮喘慢性持续期疗效方面是有优势的。
实施例25颗粒剂制备方法考察
本发明采用湿法制粒
1润湿剂的选择
湿法制粒的常用润湿剂为乙醇，故选择乙醇为润湿剂，并考察不同乙醇浓度对制粒情况的影响。
2辅料种类考察
对浸膏粉与辅料混合后的吸湿性考察结果可知，糊精、乳糖、可溶性淀粉三种辅料均能降低浸膏粉的吸湿性，故以颗粒成型率、软材性状、制粒难易程度等为考察指标，进一步优选湿法制粒辅料。
将浸膏粉与糊精、乳糖、可溶性淀粉分别按3∶2混匀，喷入95％乙醇制粒，以软材性状、颗粒的成型率、制粒难易程度以及颗粒的色泽、细粉、粘结情况等为评价指标，结果见表9。
颗粒成型率％＝合格颗粒的重量/(干膏粉的重量+辅料的重量)×100％。
合格颗粒：参照2015版《中国药典》一部(附录IC)颗粒剂项下制剂通则要求，收集能通过一号筛且不能通过五号筛的颗粒。
组合物浸膏粉的制备：
桂枝、干姜(破碎成一角硬币大小)和肉桂(破碎成黄豆大小)用水蒸气蒸馏法提取挥发油，药材不浸泡、加8倍量水提取12h，水提取液滤过，备用；收集挥发油，用β-环糊精进行包合，挥发油(mL)与β-CD(g)比例为1∶10，包合温度为40℃，包合3h；
黄芪、白术、苏子、厚朴、白芥子、白芍、五味子、甘草这八味药加水10倍量，提取3次，每次2小时，煎液滤过，滤液与上述蒸馏后的水溶液合并，浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃)，加乙醇调节醇沉浓度到60％，静置过夜，抽滤，适当浓缩(测定黄芪甲苷的转移率为90.45％，芍药苷的转移率为88.29％)，于70℃真空干燥箱内完全干燥，粉碎成细粉，加入之前的挥发油包合物，充分混合，得组合物浸膏粉。
表9辅料种类考察
Figure BDA0001856543930000211
由结果可知，三种辅料均能使颗粒成型，制粒容易，但加入糊精时颗粒的成型率最高，且糊精相比乳糖和可溶性淀粉价格低廉、稳定性好，流动性好，故选择糊精为辅料。
3辅料的用量及润湿剂乙醇浓度的考察
将适量浸膏粉与糊精分别按2∶1、3∶2、1∶1的比例混合均匀，分别喷适量浓度为90％、93％、95％的乙醇制粒，制粒情况结果见表10。
表10颗粒剂成型工艺优选试验结果
Figure BDA0001856543930000212
实验结果显示，以软材形状、制粒难易、成型率为指标考察药辅比和乙醇浓度，可以看出，乙醇浓度为90％时，药辅比1∶1优于3∶2，优于2∶1；乙醇浓度为93％时，药辅比3∶2优于1∶1，优于2∶1；乙醇浓度为95％时，药辅比3∶2优于1∶1，优于2∶1。但整体的成型率95％优于93％优于90％，故选择乙醇浓度为95％；药辅比为3∶2，1∶1时，颗粒成型率均大于75％，故选用吸湿率为指标，进一步确定最佳药辅比。
4药辅比例的确定
以颗粒的吸湿性为评价指标，筛选颗粒的最优药辅比例，称取浸膏粉和糊精适量，分别按照3∶2和1∶1昆匀，以95％乙醇为润湿剂进行制粒，测定其吸湿百分率，绘制吸湿曲线。
从颗粒的吸湿性结果可以看出，制粒后颗粒的吸湿性相较于浸膏粉均得到改善，比较药辅比为3∶2与1∶1的颗粒，吸湿率差别不大，且1∶1制粒松散不易成型，综合制粒和吸湿情况，最终选择药辅比为3∶2，95％乙醇为润湿剂，制粒容易，且颗粒成型率高。
实施例26中药组合物颗粒剂的含量测定
1色谱条件的建立
色谱条件：Waters symmetryshieldTM RP18色谱柱(4.6mm× 150mm，5μm)；乙腈-0.1％磷酸(11∶89)为流动相，流速1.0mL.min-1，柱温30℃，进样量为10μL，检测波长：230nm。
2溶液的制备及测定
(1)对照品溶液的制备
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷0.05776mg的溶液即得。
(2)供试品溶液的制备
取实施例制备的中药组合物颗粒剂，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，密塞，称定重量，超声处理(功率100W，频率40KHZ)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)阴性供试品溶液的制备
自制不含白芍的空白样品，制备成阴性供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各10μL注入液相色谱仪，依法测定。
3方法学考察
(1)专属性实验
分别精密吸取对照品溶液、阴性供试品溶液和供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定。结果见图1-3。
结果表明，阴性样品在与芍药苷对照品相同的保留时间内，无色谱峰，故认为阴性没有干扰。
(2)线性关系考察
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷1.0128mg的溶液，即得对照品储备液。精密吸取芍药苷储备液适量，置5ml容量瓶，加甲醇稀释成浓度分别为0.01040mg/mL、0.02080mg/mL、0.03119mg/mL、0.05198mg/mL、0.05776mg/mL、0.08086mg/mL、0.11588mg/mL的标准品溶液。分别精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪，测定，绘制芍药苷标准曲线，得芍药苷的回归方程为y＝1*107x-13953(R2＝0.99972)。结果表明芍药苷在0.01040mg/mL～0.11588mg/mL内线性关系良好。
(3)精密度试验
精密吸取芍药苷对照品溶液10μL，连续进样6次，测定对照品的峰面积，结果见表11。
表11精密度试验结果(n＝6)
Figure BDA0001856543930000231
结果表明：相对标准偏差RSD＜3％，表明精密度良好。
(4)稳定性试验
取中药组合物颗粒剂(研细)，取约4g，精密称定，依法制备中药组合物颗粒剂供试品溶液，分别在制备后的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时进样分析，在24小时内芍药苷含量的平均值为4.3241mg/g，RSD＝1.91％，表明样品在24小时内稳定性良好，结果见表12。
表12稳定性试验结果
Figure BDA0001856543930000241
(5)重现性试验
取同一批中药组合物颗粒剂样品，按照中药组合物颗粒剂供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，平行操作6份，进HPLC分析，记录对应峰面积，计算芍药苷含量，结果见表13。
表13重现性试验结果(n＝6)
Figure BDA0001856543930000251
结果表明：测得供试品中芍药苷的含量平均值为4.4191mg/g，其RSD＜3％，表明重现性良好。
(6)加样回收率试验
取6份已知含量的中药组合物颗粒剂样品，研细，每份约0.25g，精密称定，分别加入芍药苷对照品1.108mg，制备成供试品溶液，测定含量，计算加样回收率，结果见表14。
表14加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0001856543930000252
芍药苷的平均加样回收率为101.14，RSD＝0.57％，n＝6，表明该法加样回收率符合要求。
结论：综上，芍药苷的方法学符合要求，说明该含量测定方法稳定可行。

Claims (10)

1.一种中药组合物制剂的检测方法，其特征在于，所述方法高效液相色谱法，具体包括如下步骤：
测定条件：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(10～15)∶(85～90)为流动相；
对照品溶液的配制：取芍药苷对照品，有机溶剂溶解，得对照品溶液；
供试品溶液的配制：取中药组合物制剂，有机溶剂提取，得供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；
其中，所述中药组合物制剂由如下原料药制成：黄芪6-40重量份、桂枝4-28重量份、白术5-32重量份、干姜4-28重量份、紫苏子4-28重量份、厚朴4-28重量份、肉桂2-18重量份、白芥子1-8重量份、白芍5-32重量份、五味子3-24重量份、甘草3-24重量份。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿中的任意一种；优选为甲醇。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取方法选自超声提取、回流提取、冷浸提取、渗漉提取或微波提取。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液制备采用甲醇超声提取。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(11∶89)。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述中药组合物制剂由如下原料药制成：黄芪18重量份、桂枝9重量份、白术12重量份、干姜9重量份、紫苏子9重量份、厚朴9重量份、肉桂5重量份、白芥子3重量份、白芍12重量份、五味子6重量份、甘草6重量份。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述中药组合物制剂按如下方法制备：
步骤a，取桂枝、干姜、肉桂三味提取挥发油，得到挥发油A和水提液B；
步骤b，取黄芪、白术、苏子、厚朴、白芥子、白芍、五味子、甘草八味，加常规溶剂提取，得到提取液C；
步骤c，将步骤b的提取液C与步骤a的水提液B合并，浓缩，加入步骤a的挥发油A，制成颗粒剂。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤a得到的挥发油A用倍他环糊精包合，挥发油(mL)与倍他环糊精(g)的比例为1∶(6-10)，包合温度为30℃～50℃，包合时间为1～3h。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤b所述常规溶剂包括水、甲醇、乙醇；优选采用水提取。
10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤c将提取液合并后还包括醇沉除杂的过程，即提取液浓缩后加乙醇至含醇量为50％～70％，取滤液回收乙醇。
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