CN103242447B - 结合tweak的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了抗TWEAK抗体。

Description

结合TWEAK的抗体
本申请是中国申请200680027581.1的分案申请，该母案于2006年5月25日以国际申请号PCT/US2006/019706提交，于2008年1月28日进入中国国家阶段，本分案采用了与该母案一致的发明名称。
交叉引用的相关申请
本申请要求2005年5月27日提交的美国申请60/685,149的优先权，该申请全部内容通过引用并入本文。
背景技术
与肿瘤坏死因子(TNF)-相关的细胞因子都归属于同一个蛋白质超家族，它们具有很多功能，包括涉及免疫调节和凋亡调节的那些功能。TWEAK(TNF-样的诱导凋亡的弱诱导物)是此超家族中的一员。
发明概述
抗TWEAK抗体可用来治疗多种疾病如炎性疾病，神经性疾病或其它本文所述的疾病。当用于治疗人类受试者时，所述抗体优选是人的(HUMAN)、人源化的或是有效人化的(EFFECTIVELYHUMAN)抗体。
一方面，本发明公开了包含第一和第二种免疫球蛋白可变区序列、并结合TWEAK(例如人TWEAK)的蛋白质。所述蛋白质能以，比如，KD低于10-7M，如10-8,10-9,10-10,10-11M或更好的亲和力结合TWEAK。所述蛋白质在本文中也称为“抗TWEAK抗体”。所述第一和第二种免疫球蛋白可变区序列可包括免疫球蛋白可变区中至少足以形成结合TWEAK的抗原结合位点的部分。通常，第一和第二种免疫球蛋白可变区序列分别对应于免疫球蛋白重链和轻链(如成对的或者另外匹配的重链和轻链)的可变区序列。
所述抗体能结合TWEAK上包括由P2D10识别的表位中的至少一个、两个、三个或四个氨基酸残基的表位，能结合P2D10识别的TWEAK的肽(例如长度不足25、20或15个氨基酸的肽)或能结合P2D10所识别的TWEAK的区域。例如，所述抗体特异性结合TWEAK(尤其人TWEAK，例如TWEAK的可溶性区域)的表位，例如线性或构象性表位。所述抗体可与P2D10竞争结合TWEAK，例如人TWEAK。所述抗体可竞争性抑制P2D10结合TWEAK，如人TWEAK。一个实施方案中，所述抗体可结合与P2D10的表位重叠的表位，如与P2D10表位有至少一个、两个、三个或四个氨基酸相同，或通过结合而在空间上(sterically)阻碍TWEAK与P2D10相互作用的表位。
例如，抗TWEAK抗体能结合TWEAK并调控(例如抑制)TWEAK和TWEAK受体如Fn14(如人Fn14)之间的相互作用(如结合)。所述抗体也可降低TWEAK受体的信号传导活性。所述抗体可靶向TWEAK、隔离(sequester)TWEAK、和/或调控TWEAK的体内稳定性。
一个实施方案中，所述抗体特异性结合TWEAK上与Fn14(如人Fn14)接触的相互作用位点的至少一部分。所述抗体可与Fn14竞争结合TWEAK，如人TWEAK。所述抗体可竞争性抑制Fn14结合TWEAK。所述抗体可与TWEAK上的表位相互作用，所述表位是因与抗体结合而在空间上阻碍TWEAK与Fn14(如人TWEAK与人Fn14)相互作用的表位。
一个实施方案中，所述抗体能抑制一或多种TWEAK-相关活性，其IC50为约50nM-5pM，通常为约100-250pM或更低。例如，所述抗体能抑制TWEAK促进内皮细胞增殖或新血管形成的能力。一个实施方案中，抗TWEAK抗体降低至少一种TWEAK-相关活性，从而例如在将所述抗体给予受试者后能调控炎性疾病。
在其它实施方案中，所述抗体能以103-108M-1s-1，通常104-107M-1s-1的动力学结合(associatewith)TWEAK。另一实施方案中，所述抗体有10-2-10-6s-1，通常10-2-10-5s-1的解离动力学。一个实施方案中，所述抗体以与单克隆抗体P2D10或其修饰形式，如其嵌合形式或人源化形式(如本文所述的人源化形式)类似(如5或10倍以内)的亲和力和/或动力学结合TWEAK，如人TWEAK。可用例如生物传感器技术(BIACORETM)，检测抗TWEAK抗体的亲和力和结合动力学。
一个实施方案中，所述抗体是全长抗体的抗原结合片段，如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段。通常，所述抗体是全长抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或单特异性抗体。例如，所述抗体在包含不足20种其它的抗TWEAK抗体的组合物中，如在不包含其它种类的抗TWEAK抗体的组合物中。
所述抗体可以是有效人化的。“有效人化的”抗体是包含足够数量的人氨基酸位置、因而不在正常人体内激发免疫应答的抗体。优选地，所述蛋白质不引起中和抗体应答，如人抗鼠抗体(HAMA)应答。很多情况下，HAMA会带来问题，如需要重复给予抗体时，如在治疗慢性或复发性疾病时。HAMA反应可以因抗体的血清清除增加(见例如Salehetal.,CancerImmunol.Immunother.,32:180-190(1990))、以及还因潜在的变态反应(见例如LoBuglioetal.(1986)Hybridoma,5:5117-5123)，而使重复给予抗体有可能变得失效。
例如，所述抗体可以是人的、人源化的、CDR-移植的、嵌合的、突变的、亲和力成熟的、脱敏的(deimmunized)、合成的或者体外产生的抗体，及它们的组合。一个实施方案中，抗TWEAK抗体是人源化抗体。
抗TWEAK抗体的重链和轻链可以基本上是全长的。所述蛋白质可包含至少一条、优选两条完整重链，和至少一条、优选两条完整轻链，或可包含抗原结合片段(如Fab,F(ab’)2,Fv或单链Fv片段)。其它实施方案中，所述抗体具有重链恒定区，其选自如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgM,IgA1,IgA2,IgD,和IgE；尤其选自如IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4，更尤其为IgG1(如人IgG1)。通常，重链恒定区是人的或是人恒定区的修饰形式。另一个实施方案中，所述抗体具有轻链恒定区，其选自κ或λ，尤其κ(如人κ)。
一个实施方案中，所述蛋白质包含本文公开的抗体(如P2D10)的轻链或重链可变区的至少一个、两个、优选三个CDR。上下文中，CDR指Chothia超变环所限定的CDR。例如，所述蛋白质在重链可变区序列的CDR区中，可以包含至少1个、2个或3个如下序列：
GFTFSRYAMS(CDR1)(SEQIDNO:1),
EISSGGSYPYYPDTVTG(CDR2)(SEQIDNO:2),
VLYYDYDGDRIEVMDY(CDR3)(SEQIDNO:3),
或具有与上述序列相比有差异(如差异数与CDR长度成比例)的氨基酸序列，所述差异是，每10个氨基酸有不超过4、3、2.5、2、1.5、1或0.5个改变(如取代、插入或缺失)，如每个CDR有至少1个、但不超过2、3或4个改变。重链可变区序列可以将这些CDR序列具体包含在CDR3中，或包含在至少两个CDR(如CDR1和CDR3，CDR2和CDR3)中，或包含在所有三个CDR中。
所述蛋白质的重链可变区序列的CDR区中可包含至少一个、两个或三个如下序列(括号中的氨基酸代表在具体位置的可选氨基酸)：
(i)G-(YF)-(NT)-F-(STDN)-(RY)-Y-A-(MIL)-(HS);(SEQIDNO:4),或
(ii)Y-Y-(PV)-D-(TS)-V-(TK)-G;(SEQIDNO:5)和
(iii)(VL)-(IL)-(YF)-(YF)-D-(YF)-D;(SEQIDNO:6)或
(DE)-(RK)-(ILVM)-(EQD)-(VAL)-M-(DE);(SEQIDNO:7)。
所述蛋白质的轻链可变区序列的CDR区中，可包含至少一个、两个或三个如下序列：
RSSQSLVSSKGNTYLH;(CDR1)(SEQIDNO:8)，
KVSNRFS;(CDR2)(SEQIDNO:9)，和
SQSTHFPRT;(CDR3)(SEQIDNO:10)，
或具有与上述序列相比有差异(如差异数与CDR长度成比例)的氨基酸序列，所述差异是，每10个氨基酸有不超过4、3、2.5、2、1.5、1或0.5个改变(如取代、插入或缺失)，如每个CDR有至少1个、但不超过2、3或4个改变。轻链可变区序列可以将这些CDR序列具体包含在CDR3中，或包含在至少两个CDR(如CDR1和CDR3，CDR2和CDR3)中，或包含在所有三个CDR中。
所述蛋白质的轻链可变区序列的CDR区中可包含至少一个、两个或三个如下序列(括号中的氨基酸代表在具体位置的可选氨基酸)：
(i)(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-S-S-(KR)-G-N-(TN)-Y-L-(EHDNQY);(SEQIDNO:11),
或(RK)-S-S-Q-S-(LI)-V-S-S-(KR)-G-N-(TN)-Y-L-H;(SEQIDNO:12)
(ii)(KE)-(LVI)-S-(NYS)-(RW)-(FAD)-S;(SEQIDNO:13),或
K(LVI)-S-(NYS)-R-(FAD)-S;(SEQIDNO:14),和
(iii)(SM)-Q-(GSA)-(ST)-(HEQ)-(FWL)-P;(SEQIDNO:15)或
S-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-F-P;(SEQIDNO:16)。
在优选的实施方案中，所述蛋白质包含P2D10的所有六个CDR或紧密相关的CDR，如相同的CDR，或具有至少一个、但不超过两个、三个或四个氨基酸改变(如取代、插入或缺失)的CDR，或本文所述其它CDR。
在另一个实施例中，所述蛋白质包含与P2D10有相同的规范结构(canonicalstructures)和对应的ChothiaCDR区的至少一个、两个或三个CDR区，如与P2D10的重链和/或轻链可变区的至少CDR1和/或CDR2相同的规范结构。
所述蛋白质可包含如下序列之一：
·DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:17)
·DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:18)
·DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:19)
·DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:20)
·DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:21)
·DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:22)
·DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:23)
·DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:24)
·DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWLQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:25)
·DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVSSKGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHFPRT(SEQIDNO:26)
或具有少于八个、七个、六个、五个、四个、三个、或两个改变(如取代、插入或缺失，如保守取代或对P2D10、huP2D10-L1或huP2D10-L2对应位置的氨基酸残基的取代)的序列。取代举例在如下Kabat位置之一：2,4,6,35,36,38,44,47,49,62,64-69,85,87,98,99,101和102。所述取代可例如，将P2D10的一或多个氨基酸取代到框架区(如人框架区)的对应位置，如在FR2中(如将根据保守编号的位置46取代为Phe)以及在FR3中(如将位置87取代为Phe)。
所述蛋白质的重链可变区可包括如下序列之一：
·QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:27)
·QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQRLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:28)
·QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQATGQGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:29)
·QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:30)
·QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:31)
·QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPGQALEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCARVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:32)
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·QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQARGQRLEWIGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:34)
·EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:35)
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·EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:47)
·EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSRYAMSWFRQAPGKGLEWVGEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:48)
·EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEYVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYCARVLYYDYDGDRIE(SEQIDNO:49)
或具有少于八个、七个、六个、五个、四个、三个、或两个改变(如取代、插入或缺失，如保守取代或对P2D10中对应位置的氨基酸残基的取代)的序列。取代举例在如下Kabat位置之一：2,4,6,25,36,37,39,47,48,93,94,103,104,106和107。所述取代可例如，将P2D10的一或多个氨基酸取代到框架区(如人框架区)的对应位置。
一个实施方案中，重链框架(如分别的FR1，FR2，FR3，或包含FR1、FR2和FR3、但不包含CDR的序列)包括氨基酸序列，其与如下种系V区段序列之一的重链框架有至少80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%或更高的相同性：DP-25,DP-1,DP-12,DP-9,DP-7,DP-31,DP-32,DP-33,DP-58,DP-54，其它VHI亚组(subgroup)种系序列，其它VHIII亚组种系序列，或另一个V基因，该基因与规范结构等级1-3(见例如Chothiaetal.(1992)J.Mol.Biol.227:799-817;Tomlinsonetal.(1992)J.Mol.Biol.227:776-798)匹配(compatible)。其它与规范结构等级1-3匹配的框架包括具有按照Kabat编号的一或多个如下残基的框架：位置26的Ala,Gly，Thr或Val；位置26的Gly；位置27的Tyr，Phe或Gly；位置29的Phe,Val,Ile或Leu；位置34的Met,Ile,Leu,Val,Thr，Trp或Ile；位置94的Arg,Thr,Ala,Lys；位置54的Gly，Ser，Asn或Asp；和位置71的Arg。
一个实施方案中，轻链框架(如分别的FR1，FR2，FR3，或包含FR1、FR2和FR3、但不包含CDR的序列)包括氨基酸序列，其与VκII亚组种系序列或如下种系V区段序列之一的轻链框架有至少80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%或更高的相同性：A17,A1,A18,A2,A19/A3,A23,VκI亚组种系序列(如DPK9序列)，或另一个V基因，该基因与规范结构等级4-1(见例如Tomlinsonetal.(1995)EMBOJ14:4628)匹配。其它与规范结构等级4-1匹配的框架包括具有按照Kabat编号的一或多个如下残基的框架：位置2的Val,Leu或Ile；位置25的Ser或Pro；位置27b的Ile或Leu；位置29的Gly；位置33的Phe或Leu；和位置71的Phe。另外，按照Kabat编号，位置48可以是Ile或Val。
另一个实施方案中，轻链框架(如分别的FR1，FR2，FR3，或包含FR1、FR2和FR3、但不包含CDR的序列)包含氨基酸序列，其与VκI亚组种系序列(如DPK9序列)的轻链框架有至少80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%或更高的相同性。
一个实施方案中，轻链或重链可变区框架(如至少包含FR1,FR2,FR3,任选包含FR4的区域)可选自如下：(a)轻链或重链可变区框架，其包含至少80%、90%、95%、或优选100%的来自人轻链或重链可变区框架的氨基酸残基，如来自人成熟抗体、人种系序列、人共有序列、或本文所述人抗体的轻链或重链可变区框架残基；(b)轻链或重链可变区框架，其包含20%-80%、40%-60%、60%-90%、或70%-95%的来自人轻链或重链可变区框架的氨基酸残基，如来自人成熟抗体、人种系序列、人共有序列的轻链或重链可变区框架残基；(c)非人框架(如啮齿动物框架)；或(d)已修饰过的非人框架，如用于除去免疫原性或细胞毒性决定簇，如脱敏的，或部分人源化的。一个实施方案中，重链可变区序列包括在一或多个如下位置的人残基或人共有序列残基(优选至少五个、十个、十二个或所有):(在轻链可变区的FR中)4L,35L,36L,38L,43L,44L,58L,46L,62L,63L,64L,65L,66L,67L,68L,69L,70L,71L,73L,85L,87L,98L和/或(在重链可变区的FR中)2H,4H,24H,36H,37H,39H,43H,45H,49H,58H,60H,67H,68H,69H,70H,73H,74H,75H,78H,91H,92H,93H和/或103H(按照Kabat编号)。
一个实施方案中，所述蛋白质包含至少一个非人CDR，如鼠CDR，如P2D10的CDR，或其突变体，和至少一个框架，该框架与P2D10的框架有至少一个氨基酸，如至少5、8、10、12、15或18个氨基酸不同。例如，所述蛋白质包含一个、两个、三个、四个、五个或六个这样的非人CDR，并且在HCFR1、HCFR2、HCFR3、LCFR1、LCFR2和LCFR3的至少三个中有至少一个氨基酸不同。
一个实施方案中，所述蛋白质的重链或轻链可变区序列包含氨基酸序列，它与本文所述抗体(如P2D10、huP2D10-1或huP2D10-2)的可变区序列有至少80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%或更高的相同性；或者与本文所述抗体(如P2D10、huP2D10-1或huP2D10-2)的可变区序列有至少1或5个残基、但少于40、30、20、或10个残基不同。
一个实施方案中，两个可变区中的一个或全部两个包含分别源自鼠抗体(如P2D10)和人源化抗体(如56-84m和K107)或种系序列的框架区氨基酸位置。例如，所述可变区包括一些与鼠抗体和人抗体(或种系序列)都相同的位置，因为后两种抗体在那个位置是相同的。剩余的那些在鼠抗体和人抗体中有不同的框架位置中，至少50、60、70、80或90%的可变区位置优选与人抗体(或种系序列)相同，而不是与鼠抗体相同。这些剩余的框架位置无一、或至少有一个、两个、三个或四个可以与鼠抗体相同，而不是与人抗体相同。例如，HCFR1中的一个或两个这些位置可以是鼠的；HCFR2中的一个或两个这些位置可以是鼠的；FR3中的一个、两个、三个或四个这些位置可以是鼠的；LCFR1中的一个、两个、三个或四个这些位置可以是鼠的；LCFR2中的一个或两个这些位置可以是鼠的；LCFR3中的一个或两个这些位置可以是鼠的。
一个实施方案中，所述蛋白质的重链或轻链可变区序列包含氨基酸序列，该氨基酸序列由本文所述核酸序列编码，或由与本文所述核酸序列(例如具体的核酸序列或编码本文所述氨基酸序列的核酸序列)或其互补链杂交的核酸编码，所述杂交例如在低严谨度、中严谨度、高严谨度、或极高严谨度条件进行。
抗TWEAK抗体可以衍生或连接另一个功能分子，如另一个肽、蛋白质或化合物。例如，所述抗体可以(如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它方式)功能性连接一或多个其它分子实体(entities)，如另一种抗体(如双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、聚合物、细胞毒剂或细胞生长抑制剂等。
另一方面，本发明公开了组合物，如药物组合物，其包含可药用载体和抗TWEAK抗体，例如本文所述抗TWEAK抗体。
另一实施方案中，将抗TWEAK抗体(如其药物组合物)给予受试者，该受试者需要抗TWEAK抗体疗法，或其状况可被该抗体改善。例如，可以将抗TWEAK抗体给予受试者，该受试者已患有或有风险患有炎性疾病、免疫病、自身免疫病、神经性疾病(neuronaldisorder)、瘤形成性疾病(neoplasticdisorder)或本文所述其它疾病。一个实施方案中，本文所述抗TWEAK抗体用于制备治疗炎性疾病、免疫病、自身免疫病、神经性疾病、瘤形成性疾病或其它本文所述疾病的药物。
另一方面，本发明涉及治疗受试者的TWEAK-相关性病症的方法。所述方法包括：给予受试者足够治疗(如改善或预防)TWEAK-相关性病症的量的抗TWEAK抗体。可以将抗TWEAK抗体单独给予受试者，或与其它本文所述的治疗性方式联用。一个实施方案中，该受试者是哺乳动物，如人，例如患有TWEAK-相关性病症(如本文所述病症)的人。所述抗体可用于改善这些病症的一或多种症状。术语“治疗”指以有效的量、方式和/或模式施用疗法，来改善或预防与病症(如本文所述病症)有关的状况、症状或参数，或预防病症的发作、进展或恶化，达到统计学显著的程度或对本领域技术人员而言可检测的程度。因此，治疗可获得治疗性和/或预防性益处。有效的量、方式或模式可因受试者而异并可以为受试者定制(tailor)。一个实施方案中，本文所述抗TWEAK抗体被用于制备治疗TWEAK-相关性病症的药物。
另一方面，本发明涉及调控TWEAK和TWEAK受体蛋白质之间的相互作用的方法。例如，抗TWEAK抗体可用于降低或抑制TWEAK与TWEAK受体如Fn14结合。该方法包括使TWEAK或含TWEAK的复合物与该抗体接触。该方法可用于体外细胞，如培养的细胞，如体外或离体(exvivo)培养的细胞。例如，表达TWEAK受体的细胞能够在体外在培养基中培养，而且可以通过将抗TWEAK抗体加入培养基来实现接触步骤。或者，该方法可以在存在于受试者中的细胞上进行，如作为体内(如治疗性或预防性)方案的一部分。例如，抗TWEAK抗体可以局部或全身递送。一个实施方案中，本文所述抗TWEAK抗体用于制备调控TWEAK和TWEAK受体蛋白质之间的相互作用的药物。
该方法可包括在允许TWEAK与TWEAK受体复合物或其亚基相互作用的条件下，使TWEAK与TWEAK受体复合物或其亚基接触，从而形成TWEAK/TWEAK受体混合物。通常，可以以有效量提供抗TWEAK抗体，从而TWEAK/TWEAK受体混合物与抗TWEAK抗体的接触会调控如干扰(如抑制、阻断或降低)TWEAK和该受体蛋白质之间的相互作用或TWEAK的至少一种功能，如TWEAK介导的信号传导。
本发明公开还涉及包含核苷酸序列的核酸，其编码抗TWEAK抗体的重链和轻链可变区，如本文所述。例如，本发明涉及分别编码P2D10的重链和轻链可变区的第一和第二核酸。另一方面，本发明涉及包含本文所述核酸的宿主细胞和载体。
本发明公开还涉及TWEAK(如人TWEAK)的表位，其被P2D10和能与所述表位相互作用的蛋白质识别。例如，包含该表位的蛋白质和肽可用于产生或筛选其它与所述表位相互作用的可结合化合物，例如蛋白质如抗体或小分子。例如，包含该表位的肽可用作免疫原或筛选表达文库的靶标。也可以评价化合物与所述肽相互作用的能力，或通过确定图谱(mapping)或结构，来评价化合物与所述表位(如在成熟TWEAK中)相互作用的能力。评价例如包含确定在存在竞争性P2D10抗体时所述化合物是否能够与TWEAK相互作用。
本发明还公开了体内将试剂，如药物(包括遗传试剂(geneticagent))或细胞毒剂与抗TWEAK抗体(如P2D10或其它本文所述的抗体)一起，递送或靶向到表达TWEAK的细胞或结构的方法。
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本文所用的术语“抗体”指蛋白质，其包含至少一个免疫球蛋白可变区，如提供免疫球蛋白可变区或免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列。例如，抗体可包含重链(H)可变区(本文缩写为VH)，和轻链(L)可变区(本文缩写为VL)。在另一个例子中，抗体包含两个重链(H)可变区和两个轻链(L)可变区。术语“抗体”包含抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、和dAb片段)以及全长抗体，如全长的IgA,IgG(如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4),IgE,IgD,IgM(及其亚型)类型的免疫球蛋白。术语“全长抗体”指被加工去除了任何信号序列的具有天然抗体至少96%长度的抗体。全长抗体能够包含天然抗体的全长，如天然抗体(如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4)从氨基末端残基到羧基末端残基的残基。
“免疫球蛋白可变区序列”指形成免疫球蛋白可变区结构的氨基酸序列。例如，所述序列可以包括所有或部分的天然存在的可变区的氨基酸序列。例如，所述序列可以包含或不包含一个、两个或更多个N-或C-末端氨基酸，或可以包含其它与蛋白质结构的形成匹配的改变。
“分离的组合物”指从含有该组合物的天然样本至少一种组分的至少90%取出的组合物。人工制备的或天然的组合物可以是“至少”具有某种纯度的“组合物”，如果所需的种类或种类群基于重量比(weight-weightbasis)是至少5,10,25,50,75,80,90,95,98或99%纯的。
“表位”指抗体所结合的靶化合物上的位点。当靶化合物是蛋白质时，例如，表位可指抗体所结合的氨基酸(具体为氨基酸侧链)。重叠表位包含至少一个共同的氨基酸残基，如至少2,3,4或5个共同的氨基酸残基。
本文所用的术语“在低严谨度、中严谨度、高严谨度、或极高严谨度条件杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可见于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。此文献中描述了水相和非水相方法，任一种都可用。本文的具体杂交条件如下：1)低严谨度杂交条件是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45°C杂交，之后在0.2XSSC,0.1%SDS中至少在50°C(对于低严谨度条件，洗涤的温度应升高到55°C)洗涤两次；2)中严谨度杂交条件是在6XSSC中在约45°C杂交，之后在0.2XSSC,0.1%SDS中在60°C洗涤一或多次；3)高严谨度杂交条件是在6XSSC中在约45°C杂交，之后在0.2XSSC,0.1%SDS中在65°C洗涤一或多次；并且优选4)极高严谨度杂交条件是在0.5M磷酸钠，7%SDS中在65°C杂交，之后在0.2XSSC,1%SDS中在65°C洗涤一或多次。高严谨度条件(3)是优选的，除特别指出之外应使用该条件。
“TWEAK-相关疾病”是由TWEAK引起或因给予TWEAK阻断剂而改变其状况、症状或发病风险的任何疾病。
除非另外指出，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。如下描述了合适的方法和材料，但在本文所述的实践或试验中也可以使用与本文所述的类似或等同的方法和材料。另外，本发明关于ChothiaCDR所述的实施方案也可用KabatCDR实现。
所有出版物、专利申请、专利和本文所述的其它参考文献都全文引入本文作为参考。如有矛盾，以本发明说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅用于举例并不应起限制作用。
发明内容
P2D10是举例的鼠抗体，其特异性结合人TWEAK并抑制TWEAK功能。也公开了P2D10抗体的变体，包括举例的人源化变体。这些抗体、其它抗TWEAK抗体、及其它TWEAK阻断剂可用于治疗或预防TWEAK-介导的疾病，如炎性疾病及其它本文公开的疾病。
抗TWEAK抗体
本文的公开包括具体举例的抗TWEAK抗体如P2D10、huP2D10-1、和huP2D10-2的序列。可例如，通过制备并表达编码所述(recited)氨基酸序列的合成基因，或者通过突变人种系基因来提供编码所述氨基酸序列的基因，从而制备具体抗体如上述这些抗体。进一步地，这些抗体及其它抗TWEAK抗体可例如用一或多种以下方法来制备。
现有多种获得抗体，尤其人抗体的方法。一种举例的方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。对噬菌体展示的描述见例如美国5,223,409;Smith(1985)Science228:1315-1317;WO92/18619;WO91/17271;WO92/20791;WO92/15679;WO93/01288;WO92/01047;WO92/09690;和WO90/02809。对Fab在噬菌体上展示的描述见例如美国专利5,658,727;5,667,988;和5,885,793。
除了应用展示文库，其它方法也可用于获得结合TWEAK的抗体。例如，可以用TWEAK蛋白质或其肽作为非人动物如啮齿类动物如小鼠、仓鼠或大鼠的抗原。
一个实施方案中，非人动物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可以用人Ig基因座的大片段改造有小鼠抗体生成的缺陷的小鼠品系。用杂交瘤技术，可以制备并选择具有所需特异性的由所述基因衍生的抗原特异性单克隆抗体。参见例如XENOMOUSETM,Greenetal.(1994)NatureGenetics7:13-21,U.S.2003-0070185,WO96/34096，和WO96/33735。
另一个实施方案中，从非人动物获得单克隆抗体，然后进行修饰，如人源化或脱敏。Winter描述了举例的可用于制备本文所述人源化抗体的CDR-移植方法(U.S.5,225,539)。具体人抗体的所有或一些CDR可以用非人抗体的至少部分来置换。可能仅需要置换结合所需的CDR或这些CDR的结合决定簇，来获得结合TWEAK的有效人源化抗体。
人源化抗体可以通过用来自人Fv可变区的等效序列置换不直接参与抗原结合的Fv可变区序列来制备。制备人源化抗体的常用方法见Morrison,S.L.(1985)Science229:1202-1207,Oietal.(1986)BioTechniques4:214,和US5,585,089;US5,693,761;US5,693,762;US5,859,205;和US6,407,213。那些方法包括分离、操作(manipulate)和表达核酸序列，该序列编码来自至少一条重链或轻链的所有或部分的免疫球蛋白Fv可变区。这些核酸的来源是本领域技术人员公知的，并且例如，可以从产生抗预定靶的抗体的杂交瘤(如上述)，从种系免疫球蛋白基因，或从合成的构建体获得。然后将编码人源化抗体的重组DNA克隆到合适的表达载体中。
人种系序列，例如，公开在Tomlinson,I.A.etal.(1992)J.Mol.Biol.227:776-798;Cook,G.P.etal.(1995)Immunol.Today16:237-242;Chothia,D.etal.(1992)J.Mol.Bio.227:799-817；和Tomlinsonetal.(1995)EMBOJ14:4628-4638中。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的全面目录(Tomlinson,I.A.etal.编辑的MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UK)。这些序列也可用作人序列(如框架区和CDR)的来源。例如美国专利6,300,064所述，也可使用共有人框架区。
也可以通过具体缺失人T细胞表位或用WO98/52976和WO00/34317公开的方法“脱敏”，来修饰非人的结合TWEAK的抗体，简而言之，可以分析抗体的重链和轻链可变区中结合MHCII类的肽；这些肽代表潜在的T-细胞表位(如WO98/52976和WO00/34317所限定)。为了检测潜在的T-细胞表位，可以应用称为“肽联系(threading)”的计算机建模方法，另外可以在人MHCII类结合肽的数据库中检索在VH和VL序列中存在的基序，如WO98/52976和WO00/34317所述。这些基序结合18个主要MHCII类DR同种异型(allotype)中的任一个，由此构建潜在的T细胞表位。可以通过取代可变区中的少量氨基酸残基，或优选通过多个单氨基酸取代，去除所检测的潜在T-细胞表位。尽可能地进行保守取代。通常，但不是绝对地，可以使用在人种系抗体序列的位置常见的氨基酸。在确定了脱敏性改变后，通过诱变或其它合成方法(如从头合成，盒式置换等)构建编码VH和VL的核酸。诱变后的可变区序列可任选与人的恒定区，如人IgG1或κ恒定区融合。
在一些情况下，潜在的T细胞表位可包括已知或据预测对抗体功能重要的残基。例如，潜在的T细胞表位通常偏向(biased)CDR。另外，潜在的T细胞表位可出现在对于抗体结构和结合重要的框架残基上。导致去除这些潜在表位的那些改变有时需要更多检查(scrutiny)，如通过制备并测试有无此改变的链来检查。如果可以，与CDR重叠的潜在T细胞表位可以通过CDR区域外的取代来除去。有时，CDR区域内的改变是唯一选择，因此可以测试有无此取代的变体。其它时候，去除潜在T细胞表位所需的取代是位于框架内可能对抗体结合关键的残基位置上。此时，测试有无此取代的变体。因此，有时设计多种用不同方式脱敏的重链和轻链可变区，并测试多种重链/轻链组合，来鉴定最佳脱敏抗体。然后，通过考虑不同变体的结合亲和力及脱敏程度，尤其可变区中仍存在的潜在T细胞表位数，来选择最终的脱敏抗体。可用脱敏修饰任何抗体，如包含非人序列的抗体，如合成抗体、鼠抗体、其它非人单克隆抗体，或从展示文库分离的抗体。
也可使用其它人源化抗体的方法。例如，其它方法可以依赖于抗体的三维结构，在结合决定簇的三维结构附近的框架位置，以及免疫原性肽序列。参见例如WO90/07861;美国专利5,693,762;5,693,761;5,585,089;5,530,101;和6,407,213;Tempestetal.(1991)Biotechnology9:266-271。还有另一种方法称为“人源化改造(humaneering)”，对其的描述见例如U.S.2005-008625。
所述抗体可包含人Fc区，如野生型Fc区或包含一或多个改变的Fc区。一个实施方案中，改变如突变恒定区以修饰所述抗体的性质(如提高或降低如下的一或多个：Fc受体结合，抗体糖基化，半胱氨酸残基数目，效应细胞功能，或补体功能)。例如，人IgG1恒定区可在一或多个残基，如残基234和237之一或多个发生突变。抗体可在重链CH2区有突变，所述突变降低或改变效应功能，如Fc受体结合和补体活化。例如，抗体可有美国专利5,624,821和5,648,260所述的突变。抗体也可有稳定免疫球蛋白两条重链之间二硫键的突变，如IgG4铰链区中的突变，这在本领域已经公开(如Angaletal.(1993)Mol.Immunol.30:105-08)。也见例如U.S.2005-0037000。
亲和力成熟。一个实施方案中，例如通过诱变修饰抗TWEAK抗体，来提供经修饰的抗体的库(pool)。然后评价这项经修饰的抗体，来鉴定功能性特征发生改变(如结合提高，稳定性提高，抗原性降低或体内稳定性提高)的一或多种抗体。一个方案(implementation)中，用展示文库技术来选择或筛选经修饰的抗体的库。然后，例如通过使用较高的严谨度或更有竞争力的结合和洗涤条件从第二文库中鉴定出具有较高亲和力的抗体。也可使用其它筛选技术。
一些方案中，所述诱变靶向那些已知或很有可能位于结合界面的区域。例如，如果所鉴定的结合蛋白质是抗体，那么诱变可以针对本文所述重链或轻链的CDR区。进一步地，诱变可以针对邻近或邻接CDR的框架区，如特别是在与CDR相距(junction)10、5或3个氨基酸残基范围内的框架区。对于抗体，诱变也可限于一或数个CDR，如进行逐步改进。
一个实施方案中，用诱变来使抗体更类似一或多个种系序列。一种举例的种系化方法包括：鉴定与所述分离的抗体的序列类似(具体数据库中最类似)的一或多个种系序列。然后在该分离的抗体中以增加方式(incrementally)、组合方式或两种方式一起(在氨基酸水平)进行突变。例如，制备核酸文库，使其包含编码一部分或所有可能的种系突变的序列。然后评估被突变的抗体，从而例如鉴定相比于分离的抗体具有一或多个其它种系残基、且仍有效(如具有功能许不敢活性)的抗体。一个实施方案中，向分离的抗体中引入尽可能多的种系残基。
一个实施方案中，用诱变将一或多个种系残基取代或插入到CDR区中。例如，种系CDR残基可以来自与被修饰的可变区类似(如最类似)的种系序列。诱变后，可以评估所述抗体的活性(结合或其它功能活性)，来确定所述一或多个种系残基是否被耐受。在框架区可进行类似诱变。
可以以不同方式选择种系序列。例如，选择符合预定的可选性或相似性标准的种系序列，所述标准为，例如与供体非人抗体相比有至少某个百分比的同一性，如至少75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或99.5%的同一性。可用至少2,3,5,或10个种系序列进行选择。对于CDR1和CDR2，鉴定相似的种系序列包括选择一个这样的序列。对于CDR3，鉴定相似的种系序列包括选择一个这样的序列，但也可包括使用两个分别构成氨基末端部分和羧基末端部分的种系序列。其它方案中，使用超过一个或两个种系序列，从而例如形成共有序列。
其它实施方案中，可修饰所述抗体，使之具有改变的糖基化模式(即从原来的或天然的糖基化模式发生改变)。本文中的“改变”指缺失了一或多个碳水化合物部分和/或将一或多个糖基化位点添加到原来的抗体中。将糖基化位点加入迄今公开的抗体中可通过改变氨基酸序列、使其包含糖基化位点共有序列而实现；这些技术是本领域公知的。其它增加抗体上的碳水化合物部分数目的方法是通过化学方法或酶促方法将糖苷与抗体的氨基酸残基偶联。对这些方法的描述见WO87/05330和AplinandWriston(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.22:259-306。可以如本领域所述通过化学方法或酶促方法去除在抗体上存在的任何碳水化合物部分(Hakimuddinetal.(1987)Arch.Biochem.Biophys.259:52;Edgeetal.(1981)Anal.Biochem.118:131;和Thotakuraetal.(1987)Meth.Enzymol.138:350)。美国专利5,869,046介绍了一种修饰，其通过提供拯救受体结合表位来延长体内半寿期。
一个实施方案中，抗体具有与P2D10的CDR序列非实质区别的CDR序列。非实质区别包括次要氨基酸改变，如CDR，如Chothia或KabatCDR序列中任何通常的5-7个氨基酸中有1或2个被取代。通常氨基酸被具有相似电荷、疏水性或立体化学特征的相关氨基酸取代。这些取代在本领域一般技术人员了解的范围内。与CDR中不同，可以在结构框架区(FR)进行更为实质许不敢的改变而不会负面影响抗体的结合性质。对FR的改变包括但不限于，人源化非人衍生的框架或改造那些对抗原接触或稳定结合位点重要的框架残基，如改变恒定区的类或亚类，改变那些可能改变效应功能如Fc受体结合功能的具体氨基酸残基(Lundetal.(1991)J.Immun.147:2657-62;Morganetal.(1995)Immunology86:319-24)，或改变该恒定区的来源物种。
抗TWEAK抗体可以是全长抗体形式，或是抗体片段形式，如Fab,F(ab’)2,Fd,dAb和scFv片段。其它片段包括包含单个可变区的蛋白质，如camel或camelizeddomain。参见例如U.S.2005-0079574和Daviesetal.(1996)ProteinEng.9(6):531-7。
抗体制备。可以在细菌细胞如大肠杆菌细胞中制备一些抗体如Fab。也可以在真核细胞中制备抗体。一个实施方案中，抗体(如scFv)在毕赤酵母(Pichia)(参见，例如Powersetal.(2001)JImmunolMethods.251:123-35)、汉逊酵母(Hanseula)或糖酵母(Saccharomyces)等酵母细胞中表达。
在优选的实施方案中,抗体在哺乳动物细胞中产生。表达抗体的哺乳动物宿主细胞例如包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，见UrlaubandChasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220，使用DHFR选择标记，例如见KaufmanandSharp(1982)Mol.Biol.159:601-621)、淋巴细胞系例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、以及转基因动物(例如转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞是哺乳动物上皮细胞。
重组表达载体除了携带编码多样化免疫球蛋白结构域的核酸序列，还可以携带其它序列，如调节宿主细胞中的载体复制的序列(如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于选出引入了所述载体的宿主细胞(参见，例如美国专利4,399,216,4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择性标记基因赋予已经引入载体的宿主细胞对药物，如G418、潮霉素或甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性。
在一例抗体表达系统中，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞。在该重组表达载体内，所述抗体的重链和轻链基因各自与增强子/启动子调节元件(如源自SV40、CMV、腺病毒等，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)可操作连接，来驱动所述基因的高水平转录。重组表达载体也携带DHFR基因，其允许通过甲氨蝶呤选择/扩增来选出转染了所述载体的CHO细胞。对选出的转化宿主细胞进行培养，使之表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收所述抗体。用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选出转化体，培养宿主细胞，并从培养基回收所述抗体。例如，可以利用蛋白A或蛋白G偶联基质通过亲和层析分离一些抗体。
对于一些含Fc区的抗体，抗体制备系统优选合成含糖基化Fc区的抗体。例如，IgG分子的Fc区在CH2区的天冬酰胺297处糖基化。该天冬酰胺是用双触角型寡糖(biantennary-typeoligosaccharide)进行修饰的位置。已证实，这种糖基化是Fcγ受体和补体C1q介导的效应功能所必需的(BurtonandWoof(1992)Adv.Immunol.51:1-84;Jefferisetal.(1998)Immunol.Rev.163:59-76)。在一个实施方案中，Fc区可以在哺乳动物表达系统中产生，从而使对应于天冬酰胺297的残基适当糖基化。所述抗体的Fc区或其它区域也可包括其它真核翻译后修饰。
抗体也可以由转基因动物产生。例如，美国专利5,849,992描述了在转基因哺乳动物乳腺中表达抗体的方法。构建转基因，使其含有乳特异性启动子、编码目标抗体的核酸序列、以及用于分泌的信号序列。由这类转基因哺乳动物中的雌性动物产出的乳汁含有分泌至其中的目标抗体。所述抗体可以从乳汁中纯化，或在一些情况下直接使用。
鉴定
抗体的结合特性可以用任何标准方法如下述方法之一来测量：BIACORETM分析，酶联免疫吸附试验(ELISA)，荧光共振能量转移(FRET)，X线晶体成像技术，序列分析和扫描诱变。可以在体外或在患如本文所述疾病的动物模型中评价蛋白质抑制TWEAK的一或多种活性的能力。优选地，所述抗体具有统计学显著的效果，这表明所述抗体抑制TWEAK的一或多种活性。
一个实施方案中，评价抗体对TWEAK刺激皮肤成纤维细胞中IL-8、MMP-1、PGE2、IL-6、IP-10和RANTES生成的能力的抑制。合适的实验条件参见Chicheporticheetal.(2002)ArthritisRes.4(2):126-133。
另一个实施方案中，评价抗体抑制TWEAK刺激内皮细胞增殖的能力。见例如U.S.2003-0211993，其描述了如下进行的增殖试验(及其它可用的实验)：将HVEC接种在96孔微滴板中达到亚汇合(subconfluence)(4000细胞/孔)，并在不加供应商的生长补充物(suppliergrowthsupplement)的CS-C培养基中过夜培养。将培养基换成完全培养基或基础培养基。在基础培养基中培养细胞，该培养基中含或不含TWEAK(100ng/ml)，bFGF(1/500至1/1000稀释的bFGF生长补充物(Clonetics)或1ng/ml(R&DSystems))，VEGF(10ng/ml)或这些因子的组合。在指定情况下，也加入10μg/ml的被测抗体或对照抗体。细胞在37°C、5%CO2温育3天，用3H-胸苷脉冲最后10小时的培养物来测量增殖。用BETAPLATETM(EG&GWallac,Gaithersburg,Md.)测量结合细胞的放射性。由TWEAK或由TWEAK与bFGF组合介导的增殖下降表明，所述抗体有效阻断TWEAK活性。
表面等离子体共振(SPR)。目标蛋白质与靶(如TWEAK)的结合相互作用可用SPR分析。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)实时检测生物特异性相互作用，而无需标记任何相互作用物(interactant)。在BIA芯片结合表面的质量改变(指示发生了结合)导致邻近表面的光折射率的改变(表面等离子体共振(SPR)的光学现象)。折射率的改变产生了可检测信号，测定该信号作为生物分子之间的实时反应的指标。对使用SPR的方法的描述见例如美国专利5,641,640;Raether(1988)SurfacePlasmonsSpringerVerlag;SjolanderandUrbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338-2345;Szaboetal.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705和BIAcoreInternationalAB(Uppsala,Sweden)提供的网上资源。来自SPR的信息可用于提供对生物分子与靶结合的平衡解离常数(Kd)及动力学参数包括Kon和Koff的准确定量测量。
可以用BIAcore层析技术通过评估不同抗体彼此竞争结合TWEAK(如人TWEAK，尤其可溶性人TWEAK)的能力来直接定位表位，所述技术参见PharmaciaBIAtechnologyHandbook,"EpitopeMapping",Section6.3.2,(May1994);也参见Johneetal.(1993)J.Immunol.Methods,160:191-198。在例如Western印迹和免疫沉淀试验中评价抗体的其它一般指导可参见Antibodies:：ALaboratoryManual,ed.byHarlowandLane,ColdSpringHarborpress(1988))。
TWEAK-相关疾病
抗TWEAK抗体(例如本文所述抗体)可用于治疗多种病症，如TWEAK-相关性疾病。例如，所述抗体可用于治疗患者的炎性、免疫性或自身免疫性疾病，以及瘤形成疾病。炎性TWEAK-相关疾病的例子包括，类风湿性关节炎，银屑病关节炎(psoriaticarthritis)，强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)，炎性肠病(inflammatoryboweldisease)(包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)和克隆病(Crohn’sdisease))，银屑病(psoriasis)或炎性肌炎(inflammatorymyositis)。可治疗的炎性疾病的其它例子包括，郎格汉斯细胞(Langerhans-cell)的组织细胞增多症(histiocytosis)，成人呼吸窘迫综合征(adultrespiratorydistresssyndrome)/闭塞性细支气管炎(bronchiolitisobliterans)，韦格纳肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)，脉管炎(vasculitis)，恶病质(cachexia)，口炎(stomatitis)，特发性肺纤维化(idiopathicpulmonarybrosis)，皮肌炎(dermatomyositis)或多肌炎(polymyositis)，非传染性巩膜炎(non-infectiousscleritis)，牵累肺的慢性结节病(chronicsarcoidosiswithpulmonaryinvolvement)，脊髓增生异常综合征/有过多的未成熟细胞的难治性贫血(myelodysplasticsyndrome/refractoryanemiawithexcessblasts)，溃疡性结肠炎，中度到重度的慢性阻塞性肺病和巨细胞动脉炎(giantcellarteritis)。
可以给有风险、已确诊、或患有这些疾病之一的受试者施用抗TWEAK抗体，其用量和施用时间导致提供总体(overall)治疗效果。抗TWEAK抗体可以单独施用或与其它药剂联用。例如，USSN60/679,518描述了联用TWEAK阻断剂与TNF-α阻断剂的方法。在组合疗法的情况中，施用的量和时间可以提供，例如协同治疗效果。进一步地，可以将施用TWEAK阻断剂(有或无第二种药剂)作为初步(primary)治疗，例如一线治疗(firstlinetreatment)，或作为第二步(secondary)治疗，例如在受试者对之前施用的疗法(即除了用TWEAK阻断剂的疗法之外的疗法)反应不足的情况下。
类风湿性关节炎(RA)
抗TWEAK抗体(如本文所述抗体)可用于治疗类风湿性关节炎及相关疾病。类风湿性关节炎("RA")是导致要见于关节的痛、肿(swelling)、僵硬(stiffness)和功能丧失的慢性炎性疾病。RA常始于滑膜，即围绕关节产生保护性囊的膜。在很多患RA的个体中，白细胞从循环浸润到滑膜造成持续的异常炎症(如滑膜炎(synovitis))。因此，滑膜发炎，引起发热(warmth)、红、肿和痛。软骨中的胶原蛋白(collagen)逐渐被破坏，使关节腔变窄，并最终破坏骨。炎症导致病变区的侵蚀性骨破坏。在这个阶段，滑膜的细胞异常地生长分裂，使正常的薄滑膜变厚，并导致关节触之肿胀且浮肿(puffy)。
随RA进展，异常的滑膜细胞侵入并破坏关节内的软骨和骨。支持并稳定关节的周围肌肉、韧带和肌腱(tendon)可变弱，不能正常工作。RA也可引起更广泛的骨流失(loss)，这可导致骨质疏松(osteoporosis)，使骨变脆和更易折断。所有这些作用都导致与RA有关的痛、损害(impairment)和变形(de幻rmities)。会受影响的区域包括腕、指节(knuckle)、膝和足跖球(theballofthefoot)。通常，多个关节可受牵涉，甚至脊柱(spine)都可受累。在约25%患RA的人中，小血管的炎症可在皮下引起类风湿小结，或肿块(lump)，它们常形成于紧靠关节处。随疾病进展，还可积液，尤其是在踝(ankle)。很多患RA的患者也发生贫血，或红细胞正常数目降低。
RA包括多种疾病亚型，如费尔蒂综合征(Felty'ssyndrome)，血清阴性的RA，"经典(classical)"RA，进展性和/或复发性RA，和伴有脉管炎的RA。一些专家将此病分为1型和2型。1型较不常见，最多持续数月，不留下永久残疾。2型是慢性的，持续数年，有些例子中持续终生。RA也能表现为皮下类风湿小结，内脏结节(visceralnodule)，脉管炎导致的腿溃疡或多发性单神经炎(mononeuritismultiplex)，胸腔或心包积液(pleuralorpericardialeffusions)，淋巴结病(lymphadenopathy)，费尔蒂综合征，干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)和巩膜外层炎(episcleritis)。这些疾病亚型以及显示一或多种上述症状的受试者可用本文所述抗体来治疗。
RA可用多种临床衡量标准(measure)来评价。一些指标(indicia)举例包括总Sharp得分(TSS)，Sharp侵蚀得分，及HAQ残疾指数(index)。本文的方法可用于改进这些指标的至少一项。用于治疗RA的抗TWEAK抗体的治疗性能可以在动物模型上评估，如用小鼠胶原蛋白诱导的关节炎(mCIA)模型(参见例如Stuartetal.,J.Clin.Invest.69:673-683(1982)。
多发性硬化
抗TWEAK抗体(如本文所述抗体)可用于治疗多发性硬化(MS)及相关疾病。MS是中枢神经系统疾病，其特征为炎症和脱髓鞘(lossofmyelinsheath)。
MS患者可用诊断临床确诊的(definite)MS的标准来鉴定，该标准是由诊断MS的工作室(workshop)确立的(Poseretal.,Ann.Neurol.(1983)13:227)。简单的说，患临床确诊的MS的个体已有两次发病(attack)，并有任何(either)两种损害(lesion)的临床实证(clinicalevidence)，或一种损害的临床实证以及另一种损害的能产生临床症状体征的解剖或生化异常(paraclinical)的实证。确诊的MS也可以用两次发病的实证、脑脊液中IgG的寡克隆(oligoclonal)带，或发病、两种损害的临床实证及脑脊液中IgG的寡克隆带的组合来诊断。
对多发性硬化的有效治疗可用多种不同方式来检验。用如下参数来评定(gauge)治疗的有效性。使用三个主要标准：EDSS(残疾状况拓展量化表)、恶化表现或MRI(磁共振成像(magneticresonanceimaging))。EDSS是给MS所致的临床损伤(impairment)分级的工具(Kurtzke(1983)Neurology33:1444)。评价8个功能系统的神经学损伤的种类和严重程度。主要地，在治疗前，评价患者如下系统的损伤：锥体(pyramidal)，小脑，脑干，感觉，肠和膀胱，视觉，大脑等等。以指定的(defined)间隔进行随访。评分从0(正常)到10(MS致死)。EDSS下降表示治疗有效(Kurtzke(1994)Ann.Neurol.36:573-79)。
多发性硬化的动物模型例如实验性自身免疫性脑炎(autoimmuneencephalitis，EAE)小鼠模型，如Tuohyetal.(J.Immunol.(1988)141:1126-1130),Sobeletal.(J.Immunol.(1984)132:2393-2401)和Traugott(CellImmunol.(1989)119:114-129)所述。可在诱导EAE前给小鼠施用本文所述抗体。用特征性(characteristic)标准评价小鼠来确定所述抗体的效力。
中风
抗TWEAK抗体(如本文所述抗体)可用于治疗(如在最近的48,24,12,8或2小时内)患中风如血栓栓塞性(thromboembolic)或出血性(hemorrhagic)中风的受试者，或预防中风，例如在有中风风险的受试者中预防中风。方法例如参见USSN60/653,811所述。中风是由血管病导致的急性脑损伤的统称。中风可分为至少两大类：出血性中风(由血液渗漏到正常血管外导致)和缺血性中风(由于供血不足导致的脑缺血)。一些可导致缺血性中风的事件包括血栓症(thrombosis)，栓塞(embolism)，和全身性灌注不足(systemichypoperfusion)(导致缺血和低氧(hypoxia))。
中风通常由于缺氧(oxygendeprivation)和继发事件导致神经性死亡和脑损伤。由于缺乏供血或其它损害导致死亡的脑区域被称为梗死(infarct)。有时，本文所述治疗可用于缩小梗死范围或使之最小化，如通过减少引起神经性死亡或损伤的继发事件来实现。
由在脑动脉壁上形成的血栓导致的脑动脉阻塞通称为脑血栓形成。在脑栓塞中，阻断(blocking)脑动脉的栓塞性(occlusive)物质来自(arisesdownstream)循环(如血栓从心脏被运到脑动脉)。因为难于分辨中风是由于血栓还是栓塞，使用术语血栓栓塞(thromboembolism)来包括这两种中风。全身性灌注不足可能是血量(bloodlevel)下降，红细胞压积下降，低血压或心脏不能充分泵血的结果。
而且，抗TWEAK抗体可用作预防性中风疗法或为其一部分，例如施用到经历过短暂性缺血发作(transientischemicattack，TIA)或正表现出TIA症状的受试者。
神经性疾病
抗TWEAK抗体(如本文所述抗体)可用于治疗或预防神经性疾病，如机械性神经性创伤(mechanicalneuronaltrauma)和神经变性(neurodegenerative)疾病。机械性神经性创伤例如有脊髓损伤(SCI)和创伤性脑损伤(TBI)。神经变性疾病例如有肌萎缩性侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)，进行性球麻痹(progressivebulbarpalsy，PBP)，原发性侧索硬化(primarylateralsclerosis，PLS)，进行性肌萎缩(progressivemuscularatrophy，PMA)，帕金森病(Parkinson'sdisease)，亨廷顿病(Huntington'sdisease，HD)，和阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease)。参见例如USSN60/653,813。一个实施方案中，神经性疾病主要特征为神经细胞的破坏或死亡，所述神经细胞如运动神经元(如ALS)，基底神经节(basalganglia)的纹状体神经元(striatalneuron)和/或皮质(cortical)神经元(如亨廷顿病)，黑质(substantianigra)神经元(如帕金森病)。
癌症
TWEAK及其受体可参与至少一些类型的癌症如胰腺癌的发病。抗TWEAK抗体(如本文所述抗体)可用于治疗或预防癌症(如腺癌)及其它瘤形成性疾病。参见例如2005年5月27日提交的“TREATMENTOFCANCER,”USSN60/685,465。
药物组合物
抗TWEAK抗体(如本文所述抗体)可以配制成药物组合物给受试者施用，用于如治疗本文所述的疾病。药物组合物通常含有可药用载体。本文所用的“可药用载体”包括任何及所有溶剂、分散介质(dispersionmedia)、包衣(coating)、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等生理相容性试剂。该组合物可包括可药用盐，如酸加成盐或碱加成盐(参见例如Berge,S.M.,etal.(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。
药物配制是公知技术，并且进一步描述在例如Gennaro(ed.),Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20uhed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472);Anseletal.,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,7uhEd.,LippincottWilliams&WilkinsPublishers(1999)(ISBN:0683305727);andKibbe(ed.),HandbookofPharmaceuticalExcipientsAmericanPharmaceuticalAssociation,3rded.(2000)(ISBN:091733096X)中。
药物组合物可以为多种形式。这些形式包括例如，液体、半固体及固体剂型，如溶液(如注射液和灌注(infusion)液)、分散体(dispersion)或悬浮液(suspension)、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式可以取决于用药模式和治疗目的。通常，本文所述试剂的组合物采用注射液或灌注液的形式。
一个实施方案中，抗TWEAK抗体与赋形剂物质，如氯化钠，七水磷酸氢二钠(sodiumdibasicphosphateheptahydrate)、磷酸二氢钠(sodiummonobasicphosphate)，以及稳定剂一起配制。它可以以例如缓冲溶液中的合适浓度提供，并可以贮存在2-8°C。
这些组合物可以经非肠胃方式施用(如静脉，皮下，腹腔或肌内注射)。本文所使用的术语“非肠胃施用”指除了肠道施用和局部表面施用以外的施用模式，通常经注射而施用，包括但不限于经以下模式注射和输注：静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、动脉内(intraarterial)、鞘内(intrathecal)、囊内(intracapsular)、眼眶内(intraorbital)、心内(intracardiac)、皮内(intradermal)、腹腔(intraperitoneal)、经气管(transtracheal)、皮下(subcutaneous)、表皮下(subcuticular)、关节内(intraarticular)、被膜下(subcapsular)、蛛网膜下(subarachnoid)、脊柱内(intraspinal)、硬膜外(epidural)以及胸骨内(intrasternal)。
可以将组合物配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其它适于在高浓度稳定贮存的有序结构。将合适的溶剂中的所需量的本文所述试剂，根据需要掺入上文所列的一种或多种成分，再过滤除菌，可以制得无菌注射液。通常，将本文所述试剂掺入含有基本分散介质和上文所列的所需其它成分的无菌媒介物(vehicle)中，可制得分散体。在制备无菌注射液所用的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干，其从本文所述试剂和任何其它所需成分的事先过滤除菌的溶液产生粉末。溶液的适当流动性(properfluidity)可以通过以下方法维持，例如，利用卵磷脂之类的包衣、在分散体的情况下维持所需的粒径(particlesize)、以及利用表面活性剂。注射组合物通过在组合物中包含单硬脂酸盐和明胶之类的延迟吸收剂，可延长吸收时间。
在一些实施方案中，抗TWEAK抗体可以与保护该化合物免于快速释放的载体(carrier)一起制备，如控释配制剂，包括植入体(implant)以及微囊递送体系(microencapsulateddeliverysystem)。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙酯(ethylenevinylacetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸(polyglycolicacid)、胶原蛋白、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸(polylacticacid)。制备这类配制剂的多种方法已有专利或者是众所周知的。参见，例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork(1978)。
抗TWEAK抗体可以用例如改进其在循环(如血液、血清)或其它组织中的稳定性和/或滞留时间的组分(moiety)进行修饰，所述改进例如是改进至少1.5、2、5、10或50倍。可以评估被修饰的抗体是否到达炎症位置如关节。
例如，抗TWEAK抗体可以与聚合物缔合(如偶联)，所述聚合物例如基本上无抗原性的聚合物，如聚环氧烷烃(polyalkyleneoxide)或聚环氧乙烷(polyethyleneoxide)。合适的聚合物分子量可以差别很大。可以采用分子量平均约200-约35,000道尔顿(或约1,000-约15,000、以及2,000-约12,500)的聚合物。
例如，抗TWEAK抗体可以与水溶性聚合物偶联，所述聚合物例如亲水聚乙烯聚合物，如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。这类聚合物的例子包括，聚环氧烷烃均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylenatedpolyols)、它们的共聚物和嵌段共聚物，只要维持所述嵌段共聚物的水溶性即可。其它可用的聚合物包括，聚氧化烯(polyoxyalkylenes)如聚氧化乙烯(polyoxyethylene)、聚氧化丙烯(polyoxypropylene)、以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylates)；丙烯酸共聚物(carbomer)；以及分支或非分支多糖。
在一些方案中，抗TWEAK抗体也可以偶联或缔合标记物或其它试剂如其它的治疗剂如细胞毒剂或细胞生长抑制剂，但在很多实施方案中，此构型是不必要的。细胞毒剂和化疗剂举例包括紫杉醇(taxol)、松胞菌素B(cytochalasinB)、短杆菌肽D(gramicidinD)、长春花碱(vinblastine)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)(如美登木醇(maytansinol)或DM1美登木素生物碱、美登素(maytansine)的含巯基衍生物)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素(actinomycin)D、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素类，普鲁卡因(procaine)、紫杉烷(taxane)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)以及它们的类似物或同系物。
当抗TWEAK抗体与第二种试剂(如抗-TNF-α抗体或其它试剂)联用时，这两种试剂可以分开或一起配制。可以以协同(synergistically)有效的量配制或者使用所述试剂。也可以使用一或全部两种所述试剂，但它们的量比各自单用的量低。例如，可以在例如施用前，混合各种药物组合物并一起施用，或可以分开施用，如在相同或不同的时间施用。
也可以使用其它TWEAK阻断剂，如USSN60/679,518所述的试剂。所述试剂可以是能够给受试者施用的任何类型化合物(如有机或无机小分子、核酸、蛋白质或肽模拟物(peptidemimetic))。一个实施方案中，所述阻断剂是生物学的，如分子量在5-300kDa之间的蛋白质。例如，TWEAK阻断剂可抑制TWEAK与TWEAK受体的结合。除结合TWEAK的抗体之外的TWEAK阻断剂举例包括，结合TWEAK-R的抗体及与细胞表面的TWEAK-R竞争结合TWEAK的可溶形式的TWEAK-R(如Fn14)。也可以例如用常规方法或本文所述方法提供药物组合物形式的本文所述其它治疗剂。
给药
可以用多种方法将抗TWEAK抗体施用给受试者，如人类受试者。在很多应用中，施用途径是下述之一：静脉注射或灌注(IV)，皮下注射(SC)，腹腔(IP)或肌肉注射。也可以使用关节内递送。也可以使用其它非肠胃施用模式。这些模式例如包括：动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射。有些情况下，施用可以直达炎症位置如关节或其它发炎的位置。
施用所述抗体的途径和/或模式也可以根据个案定制，如通过监测受试者，如使用断层成像(tomographicimaging)，神经学检查(neurologicalexam)，及与具体疾病有关的标准参数，如评价类风湿性关节炎的标准来定制。
可以按固定剂量(fixeddose)，或者按mg/kg剂量施用所述抗体。也可以选择剂量来降低或避免产生针对抗TWEAK抗体的抗体。可以对剂量方案(dosageregimen)进行调整，以产生所需反应，例如治疗反应或组合治疗效应(combinatorialtherapeuticeffect)。通常，抗TWEAK抗体(以及可选的第二种试剂)的用量可以给受试者提供生物可利用的(bioavailable)量的所述试剂。例如，可以施用0.1-100mg/kg，0.5-100mg/kg，1mg/kg-100mg/kg，0.5-20mg/kg，0.1-10mg/kg，或1-10mg/kg的剂量。也可以使用其它剂量。
本文所用的单位剂量(Dosageunitform)或“固定剂量”指物理离散单位，是适合对受治受试者施用的单次药剂(unitarydosage)；每一单位含有预定量的活性化合物和所需的药用载体，还可以任选含有其它试剂，所述活性化合物的预定量是经过计算可以产生所需治疗效应的量。可以给予单一或多重剂量。可选地或另外地，所述抗体可经连续灌注来施用。
例如，可以在一段时间(一个疗程)内以定期间隔(periodicinterval)施用抗TWEAK抗体，所述一段时间足以包括至少2次(dose)，3次，5次，10次，或更多，如每日1或2次，或每周约1-4次的给药，或优选每周，每两周，每月，如约1-12周，优选2-8周，更优选约3-7周，甚至更优选约4、5或6周给药。可能影响有效治疗受试者所需的剂量的因素和时间(timing)，包括如疾病或病症严重程度，配制剂，递送途径，治疗史，受试者的总体健康状况和/或年龄，以及其它存在的疾病。另外，用治疗有效量的化合物治疗受试者可包括单次治疗或，优选包括系列治疗(seriesoftreatment)。也可用动物模型来确定有用的剂量，如起始剂量或方案。
如果受试者有发生炎症或其它本文所述疾病的风险，所述抗体可以在疾病完全发作前施用，如作为预防措施。此种预防性治疗的持续时间可以是所述抗体的单个剂量，或者所述治疗可以持续(如多重剂量)。例如，对有疾病风险或有发病倾向的受试者，可以用所述抗体治疗数日，数周，数月或甚至数年，从而避免疾病的发生或暴发(fulminate)。
药物组合物可包含“治疗有效量”的本文所述试剂。这些有效量可以基于所施用试剂的效用，或在使用一种以上的试剂时试剂的组合效用来确定。试剂的治疗有效量也可以因个体的疾病状态、年龄、性别、体重，以及该化合物在该个体体内激发所需反应的能力等因素而有不同，所述能力例如改进至少一个疾病参数或改进该疾病的至少一种症状。治疗有效量也可以是，治疗有益效果超过该组合物的任何毒副作用或有害作用的量。
用于治疗的设备和试剂盒
可以利用医疗设备(medicaldevices)来施用包含抗TWEAK抗体的药物组合物。所述设备可设计具有以下性能：例如便携性(portability)，室温贮藏(storage)，以及使用简易性，从而可以在紧急条件下使用它，如由未受训者或本领域急救人员从医疗设备和其它医疗装备正取出。该设备可以包括，如用于贮存含有抗TWEAK抗体的药物制剂的一或多个腔(housing)，并可被构建(configure)成递送所述抗体的一或多个单位剂量的形状。可以进一步构建该设备的形状来施用第二种试剂，如抗-TNF-α抗体，为另外还包含抗TWEAK抗体的单一药物组合物或为两种分开的药物组合物。
例如，药物组合物可以用无针式皮下注射设备(needlelesshypodermicinjectiondevice)来施用，所述设备参见例如美国专利5,399,163,5,383,851,5,312,335,5,064,413,4,941,880,4,790,824或4,596,556。众所周知的植入体和模块(module)有：美国专利4,487,603公开了一种可植入的显微-输注泵，用于以控制速率分配(dispensing)药物；美国专利4,486,194公开了一种治疗设备，用于穿过皮肤施用药物；美国专利4,447,233公开了一种药物输注泵，用于以精确的输注速率递送药物；美国专利4,447,224公开了一种可变流植入型输注装置，用于连续递送药物；美国专利4,439,196公开了一种渗透型药物递送体系，其具有多室隔间(multi-chambercompartment)；美国专利4,475,196公开了一种渗透型药物递送体系。当然，多种其它的设备、植入体、递送体系和模块也是已知的。
可以用试剂盒形式提供抗TWEAK抗体。一个实施方案中，所述试剂盒包括(a)装有组合物的容器，所述组合物含有抗TWEAK抗体，还可以含有(b)信息材料(informationalmaterial)。所述信息材料可以是描述性(descriptive)、指导性(instructional)、商品广告性(marketing)或其它性质的材料，它们与本文所述方法和/或使用所述试剂的治疗益处有关。
一个实施方案中，所述试剂盒包括用于治疗炎性疾病的第二种试剂，如抗-TNF-α抗体。例如，所述试剂盒包括装有包含抗TWEAK抗体的组合物的第一个容器，和装有该第二种试剂的第二个容器。
试剂盒中的信息物质其形式不限。在一个实施方案中，所述信息物质包含关于该化合物的制备、该化合物的分子量、浓度、有效期、批号或生产地信息等等的信息。在一个实施方案中，所述信息物质涉及，例如以合适的剂量(dose)、剂型、或施用模式(如本文所述剂量、剂型、或施用模式)施用抗TWEAK抗体的方法，来治疗患有炎性疾病或其它本文所述疾病或有相关风险的受试者。所述信息物质可以以多种形式提供，包括印刷的文字(text)、计算机可读形式、视频记录、或声频记录，或提供实质性材料的链接(link)或地址(如在互联网上)的信息。
试剂盒的组合物中，除了含有所述抗体，还可以含有其它成分，如溶剂或缓冲液、稳定剂、或保存剂(preservative)。所述抗体可以以任何形式，例如液体、干燥形式或冻干形式，优选基本纯的和/或无菌的形式提供。当所述试剂以溶液形式提供时，该溶液优选是含水溶液。当所述试剂以干燥形式提供时，一般加入合适的溶剂来重建。所述溶剂，例如无菌水或缓冲液，可以选择包含在试剂盒中。
所述试剂盒可以包括一或多个容器用于装载含有所述试剂的一或多种组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包括相互分隔的容器、分隔体(divider)或分隔室(compartment)，用于装载组合物和信息材料。例如，可以将组合物装在大瓶(bottle)、小瓶(vial)或注射器(syringe)中，将信息材料装在塑料的套(sleeve)或包(packet)中。在其它实施方案中，将试剂盒的不同组件装在一个不分隔的容器中。例如，将组合物装在大瓶、小瓶或注射器中，而所述大瓶、小瓶或注射器上贴有标签形式的信息材料。在一些实施方案中，试剂盒包括一组(aplurality)(如一包(pack))容器，其中每一容器装有一或多个单位剂型(如本文所述剂型)的所述试剂。所述容器可以包括一个组合(combination)单位剂量(unitdosage)，例如含有抗TWEAK抗体和第二种试剂(如按所需比例)的单位。例如，所述试剂盒包括一组注射器、安瓿(ampules)、箔制包(foilpacket)、带气泡的包装袋(blisterpack)、或医疗设备，例如每一个都容纳一个单位剂量。试剂盒中的这些容器可以是隔绝空气的(airtight)、防水的(waterproof)(如湿度或蒸发引起的变化都无法透过)、和/或避光的(light-tight)。
所述试剂盒还可以选择含有适于施用所述组合物的装置，例如注射器或其它合适的递送装置。所述装置可以预先装载所述试剂的一或全部两种，或者也可以是空的但适于装载试剂。
靶向表达TWEAK的细胞
本文所述的抗TWEAK抗体可用于将其所携带的有效物质(payload)靶向表达TWEAK的细胞或组织或其它与TWEAK有关的结构。例如，所述抗体可以与能递送外源基因的病毒或病毒样颗粒(如用于基因疗法)或脂质体(如包容有治疗剂或外源基因的脂质体)连接。用抗体靶向病毒的方法举例见Rouxetal.(1989)ProcNatlAcadSciUSA(1989)86:9079-9083所述。也参见例如CurrGene7her.(2005)5:63-70,HumGeneTher.(2004)15:1034-1044。
本发明的抗-TWEAKAb也可以连接到含治疗剂如化疗剂的脂质体上。抗体与脂质体的连接可以用任何已知的交联剂来实现，如广泛用于将毒素或化疗剂与抗体偶联来进行定向递送的异源双功能(heterobifunctional)交联剂。例如，与脂质体偶联可以用定向碳水化合物的交联试剂4-(4-马来酰亚氨苯基)丁酸酰肼(4-(4-maleimidophenyl)butyricacidhydrazide，MPBH)来实现(Duzgunesetal.(1992)J.Cell.Biochem.Abst.Suppl.16E77)。含脂质体的抗体也可用公知方法制备(参见例如DE3,218,121;Epsteinetal.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-92;Hwangetal.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-34;U.S.4,485,045和4,544,545)。
诊断用途
抗TWEAK抗体可在检测有无TWEAK的体外(如生物样本，如组织，活检标本)或体内(如受试者的体内成像)诊断方法中使用。例如，可以将人的或有效人化的抗TWEAK抗体施用到受试者来检测该受试者内的TWEAK。例如，所述抗体可用，例如MRI可检测标记物或放射性标记物来标记。该受试者可用检测该可检测标记物的工具来评价。例如，可以扫描该受试者来评价所述抗体在受试者体内的定位。例如，该受试者可以用例如NMR或其它断层工具来成像。
用于诊断成像的标记物举例包括放射性标记物，如131I,111In,123I,99mTc,32P,33P,125I,3H,14C,和188Rh，荧光标记物如荧光素(fluorescein)和罗丹明(rhodamine)，核磁共振活性标记物，用正电子发射断层摄影术(“PET”)扫描仪可检测的发射正电子的同位素，化学发光物(chemiluminescer)，如萤光素(luciferin)，和酶标标记物如过氧化物酶或磷酸酶。也可使用短程辐射源(short-rangeradiationemitter)，如用近程检测探针可检测的同位素。可用这些试剂用已知技术标记蛋白质配体。例如，涉及放射性标记抗体的技术参见WenselandMeares(1983)RadioimmunoimagingandRadioimmunotherapy,Elsevier,NewYork，和Colcheretal.(1986)Meth.Enzymol.121:802-816。
可以用已知技术如放射性核素扫描技术，用如γ照相机或发射断层摄影术(emissiontomography)给受试者体内“造影”。见例如A.R.Bradwelletal.,“DevelopmentsinAntibodyImaging”,MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy,R.W.Baldwinetal.,(eds.),pp65-85(AcademicPress1985)。或者，当放射性标记物(如11C,18F,15O,及13N)发射正电子时，可以使用正电子发射横断面(transaxial)断层摄影术扫描仪，如位于BrookhavenNationalLaboratory的PetVI。
MRI造影剂(contrastagent)。磁共振成像(MRI)利用NMR来观察活体受试者的内部特征，并用于预后、诊断、治疗和手术。MRI的明显益处在于其不使用放射性示踪化合物。对一些MRI技术的总结见于EP0502814A。一般利用不同环境中与水质子弛豫(relaxation)时间常数T1和T2相关的差异来成像。然而，这些差异不足以提供清晰的高分辨率的影像。
这些弛豫时间常数的差异可以用造影剂改善。这些造影剂的例子包括多种磁性剂(magneticagent)，顺磁性剂(paramagneticagent)(主要改变T1)和铁磁性或超磁性物质(主要改变T2反应)。螯合剂(如EDTA,DTPA和NTA螯合剂)可用于一些顺磁性物质(如Fe3+,Mn2+,Gd3+)的连接(和毒性降低)。其它试剂可以呈颗粒状，如直径小于10μm至约10nm)。颗粒可以具有铁磁性，反铁磁性，或超磁性。颗粒可以包括，如磁铁矿(Fe3O4),γ-Fe2O3,铁酸盐，及属于过渡元素的其它磁性矿物化合物。磁性颗粒可包括含及不含非磁性物质的一或多种磁性晶体。非磁性物质可包含合成的或天然的聚合物(如Sepharose，葡聚糖，糊精，淀粉等)。
抗TWEAK抗体也可用指示基团标记，所述基团包含NMR-活性19F原子，或多种这类原子，因为(i)基本上所有的天然富含氟的原子是19F同位素，因此，基本所有的含氟化合物具有NMR-活性；(ii)多种化学活性多氟化合物，如三氟乙酸酐可以用较低价格买到，并且(iii)已发现很多氟化化合物是医疗上可用于人的，如全氟多醚(perfluorinatedpolyether)作为血红蛋白替代物来运送氧。在一段时间的温育后，用如Pykett(1982)ScientificAmerican,246:78-88所述的装备之一进行全身MRI，来定位并造影TWEAK的分布。
另一方面，本发明提供了检测体外样本(如生物样本，如血清，血浆，组织，活检标本)中TWEAK的存在的方法。所述方法可用于诊断疾病，如免疫细胞相关性疾病。所述方法包括：(i)使样本或对照样本与抗TWEAK抗体接触；和(ii)评价样本中TWEAK的存在，如通过检测抗TWEAK抗体与TWEAK形成的复合物，或者通过检测所述抗体或TWEAK的存在来评价。例如，可以将所述抗体固定在例如支持物上，检测被留在支持物上的抗原，和/或反之。可以包括对照样本。相对于对照样本，试验样本中复合物形成的统计学显著改变可以指示样本中TWEAK的存在。通常，抗TWEAK抗体可用于包括荧光极化(polarization)、显微镜检、ELISA、离心、层析和细胞分选(如荧光活化细胞分选)在内的应用。
实施例1
鼠P2D10重链可变区的序列(CDR用下划线标记)是：
1EVQLVESGGGLVRPGGSLKLFCAASGFTFSRYAMSWVRQSPEKRLEWVAE
51ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLKSEDTAMYYCARVL
101YYDYDGDRIEVMDYWGQGTAVIVSS(SEQIDNO：50)
这是鼠亚组3D重链可变区。
鼠P2D10轻链可变区的序列(CDR用下划线标记)是：
1DVVMTQSPLSLSVSLGDQASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPK
51FLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVAAEDLGVYFCSQSTHFP
101RTFGGGTTLEIK(SEQIDNO：51)
这是鼠亚组2kappa轻链。
为huP2D10选择如下的人接受体框架：人56-84m亚组3重链可变区(NCBIdatabaseaccessionnumberGI:33318898,Scamurraetal.,directsubmission)。序列(CDR用下划线标记)如下：
1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVAN
51IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDP
101MTTVVKPSLATNDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO：52)
人K107亚组2轻链可变区的序列(NCBIdatabaseaccessionnumberGI:21669075,Akahorietal.,directsubmission)(CDR用下划线标记)是：
1DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQ
51LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP
101LTFGGGTKVEIK(SEQIDNO：53)
在显示的人接受体序列中，CDR(下划线标记的)与muP2D10可变区中的那些具有相同长度和规范等级。
如下显示鼠P2D10(上)和人接受体56-84m(下)重链可变区的序列比对(68.8%相同)：
··
1EVQLVESGGGLVRPGGSLKLFCAASGFTFSRYAMSWVRQSPEKRLEWVAE50
1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWYRQAPGKGLEWVAN50
51ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLKSEDTAMYYCARVL100
51IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDP100
101YYDYDGDRIEVMDYWGQGTAVIVSS125(SEQIDNO：54)
101MTTVVKPSLATNDYWGQGTLVTVSS125(SEQIDNO：55)
如下显示鼠P2D10(上)和人接受体K107轻链(下)可变区的序列比对(75.9%相同)：
1DVVMTQSPLSLSVSLGDQASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPK50
1DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQ50
51FLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVAAEDLGVYFCSQSTHFP100
51LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP100
101RTFGGGTTLEIK112(SEQIDNO：56)
101LTFGGGTKVEIK112(SEQIDNO：57)
huP2D10轻链有两个版本(L1和L2)。抗体huP2D10-1指包含huP2D10H1和huP2D10L1的抗体。抗体huP2D10-2指包含huP2D10H1和huP2D10L2的抗体。
如下显示56-84m人接受体(上)和huP2D10H1重链(下)可变区的序列比对：
1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVAN50
1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAE50
51IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDP100
51ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVL100
101MTTVVKPSLATNDYWGQGTLVTVSS125(SEQIDNO：58)
101YYDYDGDRIEVMDYWGQGTLVTVSS125(SEQIDNO：59)
下划线标记CDR。huP2D10重链是直接的(straight)CDR移植物(即框架中无回复突变)。
如下显示K107人kappa接受体(上)和huP2D10L1轻链(下)可变区的序列比对：
1DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQ50
1DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQ50
51LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP100
51fLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYfCSQSTHFP100
101LTFGGGTKVEIK112(SEQIDNO：60)
101RTFGGGTKVEIK112(SEQIDNO：61)
下划线标记CDR。huP2D10L1轻链在上面所示框架中有两处用小写字母标出的回复突变：FR2中的L46F和FR3中的Y87F。
如下显示K107人接受体(上)和huP2D10L2轻链(下)可变区的序列比对：
1DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQ50
1DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQ50
51LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP100
51LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFP100
101LTFGGGTKVEIK112(SEQIDNO：62)
101RTFGGGTKVEIK112(SEQIDNO：63)
下划线标记CDR。huP2D10L2轻链是直接的CDR移植物(框架中无回复突变)。
这是成熟huP2D10H1IgG1重链的举例氨基酸序列：
1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAE
51ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVL
101YYDYDGDRIEVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
151GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
201LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
251FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
301EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
351PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
401TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
451LSPG(SEQIDNO：64)
如下显示重链可变区VH区段(SEDIDNO:65)的Kabat编号：
Kabat编号12345678901234567890123456789012345678901234567890
hP2D10EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAE
Kabat编号12a345678901234567890123456789012abc345678901234
hP2D10ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
这是成熟huP2D10L1轻链的举例氨基酸序列：
1DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQ
51FLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHFP
101RTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK
151VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
201VTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO：66)
如下显示此VL区段的Kabat编号(SEQIDNO:67):
KabatNo.123456789012345678901234567abcde890123456789012345
hP2D10DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQ
KabatNo.67890123456789012345678901234567890123456789012345
hP2D10FLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHFP
这是成熟huP2D10L2轻链的举例氨基酸序列：
1DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQ
51LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFP
101RTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK
151VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
201VTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO：68)
如下显示此VL区段的Kabat编号(SEQIDNO:69):
KabatNo.123456789012345678901234567abcde890123456789012345
hP2D10DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQ
KabatNo.67890123456789012345678901234567890123456789012345
hP2D10LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHFP
实施例2
封闭TWEAK的单克隆抗体mP2D10显著降低了多发性硬化、中风和类风湿性关节炎的模型的临床严重程度。针对抗TWEAK单克隆抗体mP2D10在静脉(IV)给药后的药物动力学(PK)建立模型。
经IV注射给予小鼠1、10或100mg/kg的mP2D10。用ELISA测定mP2D10的血清浓度。浓度-时间PK分布图(profile)用二室模型来分析，其采用一级消除动力学(first-orderelimination)或Michaelis-Menten消除动力学，从具有V1体积的中央室进行消除。二室间的速度常数是K12(从1室释放(exiting)到2室)和K21(从2室释放到1室)。对于一级消除动力学模型，消除速度常数是K10。对于Michaelis-Menten消除动力学模型，药物以Vm*C1/(Km+C1)的速度清除，其中C1是在中央室的mP2D10浓度，Vm和Km为常数。用软件ADAPTII(D'Argenio,D.Z.andA.Schumitzky.ADAPTIIUUser′sGuide:Pharmacokinetic/PharmacodynamicSystemsAnalysisSoftware.BiomedicalSimulationsResource,LosAngeles,1997.)，用最大似然估计(MaximumLikelihoodestimation)方法来拟合数据。
对于二室线性消除模型，V1是23.2mL/kg，K10是0.0096h-1，K12是2.501，K21是1.053。曲线下面积(AIC)值为298，Schwarz值为304.2。对于二室非线性消除模型，V1是0.0235。Vm是9.22mg/kg/hr，Km是484.2μg/mL。K12是2.348h-1，K21是0.966h-1。AIC值为269，Schwarz值为276。mP2D10的PK用非线性模型预测比线性模型好。
mP2D10的浓度-时间分布图用应用Michaelis-Menten消除动力学的二室模型预测比应用一级消除动力学的二室模型好。
本领域技术人员仅使用常规试验就能得到或能确认本文所述的具体实施方案的很多等效方案。

Claims (10)

1.分离的抗体，其包含重链可变区序列和轻链可变区序列，它们能形成与人TWEAK结合的抗原结合位点，所述分离的抗体其特征是：
(a)其重链可变区序列和轻链可变区由分别与SEQIDNO:59和63的氨基酸序列相同的序列组成；或
(b)其重链可变区序列和轻链可变区由分别与SEQIDNO:59和61的氨基酸序列相同的序列组成。
2.权利要求1的抗体，其为重组全长IgG。
3.权利要求1的抗体，其包含人的Fc区。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链，其中重链序列由SEQIDNO:64所示氨基酸序列组成。
5.权利要求1或4的抗体，其中所述抗体包含轻链，其中轻链由SEQIDNO:66所示的氨基酸序列组成。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含轻链，其中轻链序列由SEQIDNO:68所示氨基酸序列组成。
7.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含重链，其中重链序列由SEQIDNO:64所示氨基酸序列组成，并且所述抗体包含轻链，其中轻链序列由SEQIDNO:68所示氨基酸序列组成。
8.药物组合物，其包含前述权利要求任一项的抗体和可药用载体。
9.权利要求8的药物组合物在制备治疗受试者的类风湿性关节炎的药物中的用途。
10.权利要求8的药物组合物在制备治疗受试者的多发性硬化的药物中的用途。
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