CN103200929A - 包含无花果属植物树液级分的生物活性组合物和用于减少皮肤色素沉着过度的出现的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含来源于新鲜无花果属植物叶子的无花果属植物细胞汁液的无花果属植物树液级分的生物活性组合物以及制备无花果属植物树液级分的方法。所述组合物具有能够减少皮肤色素沉着过度的生物活性。

Description

包含无花果属植物树液级分的生物活性组合物和用于减少皮肤色素沉着过度的出现的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年9月10日提交的美国临时专利申请序列号61/381,442的优先权利益，该临时专利申请的公开内容在此整体引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及通过给皮肤局部应用美容化妆用组合物来亮肤(skinlightening)的领域。本发明还涉及包含无花果属植物树液级分(ficus serumfraction)的局部用亮肤组合物。本发明还涉及通过给色素沉着过度区域局部应用美容化妆用组合物以破坏黑色素合成中的一个或多个步骤来减少皮肤色素沉着过度的出现的方法。

发明背景

人类皮肤包括三个主要层：表皮、真皮和皮下脂肪层。表皮包括四层(自上而下)：角质层、颗粒层、棘层(spiny layer)和基底层。单独的第五层——透明层——可以存在于角质层和颗粒层之间。基底层产生逐渐向上迁移形成其它表皮层的细胞。随着这些细胞向上迁移，它们失去中央核并开始产生皮肤蛋白质(角蛋白)和脂肪(脂质)。这些细胞当存在于表皮的较上层时被确定为角质形成细胞。黑素细胞是位于表皮基底层中的另一类细胞。黑素细胞负责产生黑色素，黑色素是皮肤色素沉着的主要因素。

黑色素是由黑素细胞内的一组复杂反应产生的，该反应在基础水平上涉及作为酶的酪氨酸酶和作为底物的L-酪氨酸。酪氨酸酶催化L-酪氨酸向DOPA(L-3，4-二羟苯丙氨酸)的转化和DOPA向多巴醌(dopaquinone)的转化。多巴醌进行进一步转化，形成黑色素。黑色素在称为黑素体的细胞器中聚集，黑素体沿着称为树突的黑素细胞的细长纤丝被转移至角质形成细胞。在黑素体中表达了约1500个基因产物，其中有600个在任意给定的时间表达并且有100个被认为对黑素体而言是唯一的。另外，在黑素体在黑素细胞内的转运和在黑素体向角质形成细胞的转移中，有多种调节元件参与信号传导。

黑色素的产生可以由多种外源性和内源性事件引发。例如，当皮肤接受紫外照射时，黑素细胞产生额外的黑色素。然后，黑色素经由黑素体被转运至角质形成细胞，其然后使皮肤呈现“晒黑”的外观。一旦移除紫外光，黑素细胞恢复至黑色素产生的正常水平。炎症可以通过经由介质如IL-1、内皮素-1和/或干细胞因子直接剌激黑素细胞而引发色素沉着过度。在受损皮肤中产生的或由炎症细胞作为副产物释放的活性氧簇如过氧化物和一氧化氮可以是黑素细胞的刺激剂。

随时间推移，长期UV暴露和其它内源性和外源性衰老因素可以导致在角质形成细胞和/或黑素细胞中出现永久性基因表达变化，导致年龄相关的色素沉着过度斑。据报道，一些黑素生成相关性基因(例如酪氨酸酶、TYRP1)的mRNA水平增加光化学斑(老年斑)。也可能存在表皮内皮素级联的增强和干细胞因子在色素沉着过度中的作用。这些变化可导致黑色素过量生成，继而导致即使当避免了刺激如UV暴露时仍然存在的色素沉着过度斑。即使在色素沉着过度斑之外，长期UV暴露和其它内源性和外源性衰老因素可使肤色产生更微小的变化。通常，这些变化被描述为肤色不均或斑状外观。至少有一项研究提示：老年斑有时可使人的知觉年龄(perceived age)增加10至12岁，并且黑色素分布可驱使肤色依赖性衰老知觉。因此，期望提供可改善色素沉着过度皮肤如老年斑的出现的组合物和处置方法。

近年来，消费者日益需要“天然”的美容化妆用产品。因此，美容化妆品制造商已经向它们的美容化妆用配制物中引入了更多的基于植物的物质。尽管多种植物已经数百年乃至数千年用于各种声称的适应症，但是直到近来仍然不能临床验证所声称的功效或基于植物生物活性的基础科学来识别新的潜在用途。随着科学的最新发展，研究人员现在能够较好地评价直到最近仅仅被民俗传说所支持的植物的功效和/或潜在的新用途。由于科学是新的，并且由于可潜在地用作美容化妆用生物活性物质的植物的数量如此庞大，非常多的植物尚未进行充分的研究。

很多用于从植物中提取植物性组分的方法涉及对植物组织组成和/或该组织中所含的感兴趣的生物活性组分有害的技术。因此，常规提取方法通常不能获得植物细胞内存在的全范围的活性物，因而不能实现基于植物的美容化妆用配制物的所有潜能。另外，很多常规提取方法使用苛刻(harsh)的化学溶剂，它们不是“天然的”，因而是消费者想要避免应用于他们的皮肤上的物质。而且，这些基于溶剂的方法产生了有毒的化学废弃物，它们如果未作为危险废弃物进行适当处理和处置的话可危害环境。

然而，仅仅因为物质是“天然的”并未确保其不含不希望的物质，不含不希望的物质将使得物质适合用于皮肤。例如，很多植物含有光敏剂如脱镁叶绿酸和/或接触性变应原如蛋白质。脱镁叶绿酸和/或蛋白质处于在很多常见植物中天然发现的水平时不会引起大多数人的关注。然而，当植物材料被浓缩成高浓缩形式(例如通过提取)时，这些物质可以以引起皮肤刺激和过敏性反应(包括皮疹)的水平存在。然而，即使当这些物质以其天然水平存在时，仍然有许多敏感个体经历负性皮肤反应。

而且，随着对天然产品的需求增大，就会产生对保护地球天然资源的关注。消费者期望的“天然”成分有很多来源于当被采收用于消费者产品时被耗竭和/或破坏的生物资源。因此，消费者对天然的、对地球更友好的产品的期望可令人啼笑皆非地导致他们所致力于保护的生物资源被破坏。

因此，需要有这样一种天然的、具有生物活性的植物性组合物：其保持了它们的预期生物活性谱，适于局部皮肤应用，并且没有使用苛刻的化学溶剂来进行制备。而且，需要含有有效减少皮肤色素沉着过度区域的这类生物活性物质的美容化妆用组合物。另外，需要可以以生态学上合理的、可持续的方式采收和加工的这类生物活性物质。

根据下述公开内容，本发明的这些和其它目的将变得显而易见。

发明简述

本发明提供了来源于新鲜的无花果属植物(Ficus)叶子细胞汁液的无花果属植物树液级分(Ficus serum fraction)。本发明还提供了包含无花果属植物树液级分的美容化妆用组合物。无花果属植物树液级分以有效获得预期亮肤结果的量存在于组合物中。

本发明还涉及通过给色素沉着过度区域局部应用美容化妆用组合物以破坏黑色素生成中的一个或多个步骤来减少皮肤色素沉着过度的出现的方法。

附图简述

相信本发明由以下说明结合附图将更好地被理解。所引用的附图不意欲被看作限制本发明的范围。

图1是由新鲜无花果属植物叶子制备具有生物活性的树液级分的方法的示意图。

图2是叠加在无花果属植物树液级分的LC/UV色谱图上的常规无花果属植物提取物的LC/UV色谱图，其显示常规提取物含有较高水平的在无花果属植物树液级分中未检测到的迟洗脱(更疏水性)的化合物。

图3是常规无花果属植物提取物的较迟洗脱的化合物的LC/UV色谱图和它们相应的提取的离子色谱图，它们被鉴定为脱镁叶绿酸，即作为叶绿素降解产物的色素化合物。

图4是叠加在无花果属植物树液级分的LC/UV色谱图上的常规无花果属植物提取物的LC/UV色谱图，其显示常规提取物含有较高水平的黄酮醇糖苷。

图5是叠加在无花果属植物树液级分的那些上的常规无花果属植物提取物LC/UV色谱图及相应的提取的离子色谱图的一部分，其显示无花果属植物树液级分含有的儿茶素和相关的缩合鞣质的水平是常规无花果属植物提取物中的约10倍(10x)。

图6是叠加在无花果属植物树液级分的那些上的常规无花果属植物提取物LC/UV色谱图和相应的提取的离子色谱图的一部分，其显示三种氯原酸异构体的水平在两种样品之间未显示出实质上不同。

图7是叠加在无花果属植物树液级分的那些上的常规无花果属植物提取物LC/MS色谱图的一部分，其显示在无花果属植物树液级分中游离酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的水平较高。

图8是来自加速老化研究的两份彩色照片，其显示了干燥叶子无花果属植物提取物相对于FSF(包含不同水平的无花果属植物树液级分和不同防腐剂的两种不同的美容化妆用组合物)的颜色稳定性。

图9是图8的加速老化研究的校准曲线。

图10是来自加速老化研究的彩色照片，其中比较了含有0.55％FSF和不同浓度的防腐剂的载体。

发明详述

本文使用的所有百分数和比例是基于总组合物的重量计算的，所有测定在25℃进行，另有指示除外。

本发明的组合物可以包含本文所述的主要组分以及任选的成分，或者基本上由它们组成，或者由它们组成。如本文所用的“基本上由......组成”指组合物或组分可以包括另外的成分，但是只有当另外的成分不显著改变所要求的组合物或方法的基本特性和新特性时才如此。

如针对组合物所用的术语“应用”指将本发明的组合物应用或涂敷在人皮肤表面如表皮上。

如本文所用的术语“皮肤学可接受的”指所述组合物或组分适用于与人皮肤组织接触而没有过度毒性、不相容、不稳定、变态反应等。

如本文所用的术语“安全有效量”指足以显著引起积极益处的化合物或组合物的量。

如本文所用的术语“炎症后色素沉着过度”指色素沉着响应于暂时性炎性事件而急性增加至长期增加。炎症后色素沉着过度在深色皮肤个体中是特别普遍的，但不限于此。一旦暂时性炎性事件消失，则炎症后色素沉着过度通常会减退。暂时性炎性事件的实例包括但不限于痤疮损伤、向内生毛、抓伤、虫咬、表面活性剂损伤和短期UV暴露。

如本文所用的“色素沉着过度斑”指其中色素沉着由于黑色素局部的和长期的或者全身性的超量产生而大于皮肤临近区域的色素沉着的限定皮肤区域。色素沉着过度斑的直径通常为约2mm至约10mm，但是更小或更大的斑是可能的。色素沉着过度斑可以包括老年斑、晒斑、日光斑、黑素减少性损伤(hypomelanotic lesions)、雀斑和黄褐斑中的一种或多种。

如本文所用的术语“老年斑”指其中色素沉着归因于由内源性或外源性衰老因素引起的黑色素局部和长期超量产生的色素沉着过度斑。

如本文所用的术语“调肤色剂”(skin tone agent)指调节黑色素产生信号、黑色素合成、黑色素在黑素细胞和角质形成细胞之间的系统性转移和/或黑色素降解的物质。调肤色剂可以通过充当亮肤或减少色素沉着的美容化妆用物质来改善不均匀肤色的出现。

如本文所用的术语“肤色”(skin tone)指由黑色素的系统性而非短暂性合成引起的皮肤中黑色素的总体外观。肤色通常在较大的皮肤面积上表征。所述面积理论上可以大于100mm²，但是可以设想更大的面积，例如整个面部皮肤或面部皮肤表面的任意部分。肤色可以通过图像分析来测定。例如，总体亮度可以通过L^＊a^＊b^＊颜色空间(International Commission onIllumination)中的L^＊坐标进行测定。可以使用发色团作图如黑色素作图和黑色素浓度作为整体肤色的指示物。可以由发色团作图数据计算黑色素平均值。另外，可以通过黑色素均匀度确定肤色均匀度，黑色素均匀度也可以由发色团作图数据计算。下文实施例中讨论了适宜的发色团作图技术。

如本文所用的术语“面部皮肤表面”指额、眶周、颊、口周围、颏和鼻皮肤表面中的一者或多者。

如本文所用的术语“常规提取物”指通过从植物材料中用溶剂提取化合物所产生的那些提取物；植物材料可以是脱水(即，干燥的)和/或未脱水(例如，新鲜的或仅仅部分脱水的)的植物材料。

I.组合物

本发明涉及多种组合物，更具体而言，涉及应用于皮肤表面的组合物。组合物可以是多种产品形式，包括但不限于溶液、混悬液、乳液(lotions)、霜剂、凝胶剂、调色剂(toners)、棒状物、笔、喷雾剂、气溶胶、软膏、清洁用液体洗涤剂和固体杆状物、洗发香波和头发调理剂、糊剂、泡沫、粉末、摩丝、剃须膏、擦拭物、条状物、贴剂、电动贴剂、伤口敷料和黏附绷带、水凝胶、成膜产品、面膜和皮肤膜(有和无不溶性片材)、化妆品如粉底、眼线膏和眼影等。组合物形式可以根据所选择的具体的皮肤学可接受的载体(如果在组合物中存在的话)而定。

本发明的组合物可用于减少与黑色素相关的皮肤色素沉着过度的出现。如本文所用的“减少皮肤色素沉着过度的可见出现”包括皮肤增亮。皮肤增亮包括减少皮肤中存在的黑色素和/或使之最少化和/或消除(治疗性)和/或延迟在皮肤中形成黑色素和/或使之最小化和/或阻止在皮肤中形成黑色素(预防性)，包括皮肤的色素沉着过度区域。如本文所用的“色素沉着过度区域”指具有高的黑色素含量的局部区域，包括老年斑、肝痣、斑点(blotchiness)、色斑、黄褐斑、黑斑(chloasma)、雀斑、炎症后色素沉着过度或日光诱导的色素沉着瑕疵。

A.无花果属植物树液级分

无花果属(Ficus)由很多种类组成，并且发现于全世界。无花果属不应当与无花果种类刺梨仙人掌(prickly pear cactus，Opuntia ficus-indica(L.)Mill，仙人掌科(Cactaceae))相混淆(Barbera等人，PAST AND PRESENT ROLEOF THE INDIAN-FIG PRICKLY-PEAR(OPUNTIA FICUS-INDICA(L.)MILLER，CACTACEAE)IN THE AGRICULTURE OF SICILY.Economic Botany46(1)：10-20.1992.)。无花果属中著名的种类包括无花果(Ficus carica，一种常见的无花果)、菩提树(Ficus religiosa，当佛预言“真理”时保护佛的菩提树)、印度榕(Ficus elastica Roxb.exHorneum.，橡胶树)、孟加拉榕(Ficusbehghalensis)(印度榕树)和聚果榕(Ficus racemosa，异名glomerata，巨大簇状树)。

在果实的一般种类内，无花果是隐头花序的实例，隐头花序是具有特征性的“翻转”结构的聚合果(multiple fruits)。这些包括druplets的聚合，druplets是肉质中空花托，各自在顶端具有称为空口(ostiole)的小开口。微小的花聚集在壁内，从外部看不见。

作为最古老的已知人类食物之一，无花果属(Ficus spp.)(无花果)具有长期确立的安全特性。有史以来，无花果的新鲜或干燥果实、树皮、叶子、小枝、胶乳和嫩枝已经被用于各种目的。这些历史用途中的一些包括治疗疮、溃疡、癌性生长、肿瘤、脓肿、痛风、久咳、肺部问题、慢性腹泻、便秘、风湿病、淋病、痔、糖尿病、呕吐、湿疹(excema)、麻风和疣。

本发明的无花果属植物树液级分(下文称为“FSF”)来源于新鲜无花果属植物叶子的细胞汁液。将从新鲜叶子经机械分离的细胞汁液采用pH调节、聚焦微波照射、离心分离和灭菌过滤进行分级，得到不含脱镁叶绿酸和不含蛋白质的无花果属植物树液级分。所得的无花果属植物树液级分基本上由无花果属植物叶子细胞的细胞质组成。在特定的实施方案中，无花果属植物细胞汁液来源于选自如下的无花果属植物种类：孟加拉榕(F.benghalensis)、无花果(F.carica)、印度榕(F.elastica)、榕树(F.microcarpa)、F.trigonata及其组合。

本发明的组合物包含安全有效量的无花果属植物树液级分。该组合物可以含有基于组合物重量计0.01％至50％、在一项实施方案中0.05％至20％、在另一项实施方案中0.2％至10％的量的FSF。在另一项实施方案中，组合物包含基于总组合物重量计1％至5％、在另一项实施方案中1％至3％的FSF。

本发明的研究者已经发现：当局部应用于皮肤时，无花果属植物树液级分与常规无花果属植物提取物相比产生了优良的亮肤作用，包括使哺乳动物皮肤中的色素沉着过度区域增亮。本发明不受缚于理论，但是相信它通过抑制参与黑色素产生(黑素生成)的过程起作用，包括阻止黑素细胞的活性氧/氧自由基刺激(氧化应激)，该刺激导致引发黑素细胞内的黑色素产生途径(例如，其可随着UV暴露或日光暴露而发生)。

无花果属植物树液级分的制备

用于从植物材料中分离化合物的方法(例如通过用溶剂提取)决定了分离哪些化合物。与“相似相溶”的一般原理一致，提取溶剂的选择很大程度上决定了由任意特定提取技术得到的化合物的类型和数量。例如，采用极性溶剂提取出极性化合物，而采用非极性溶剂则提取出非极性化合物。这导致从可能存在的化合物的总范围中仅仅分离出窄范围的化合物。下表1x概括了使用不同极性范围内的常用溶剂所通常提取出的不同化合物类型。

表1x

常规溶剂提取

本发明的无花果属植物树液级分不是通过溶剂提取制备的，而是通过将在植物叶子中发现的新鲜细胞汁液与植物材料的其余部分分离来制备的。这种细胞汁液因为没有进行提取过程而含有在新鲜无花果属植物叶子中发现的全范围的化合物。相反，提取物仅含有采用特定溶剂可以分离的窄范围的化合物。因此，与提取物相比，所得的无花果属植物树液级分含有宽得多的范围的潜在具有活性的化合物。

而且，很多提取物不是从新鲜叶子制备的，而是从干燥植物材料制备的，干燥植物材料由于脱水而进行了降解。在脱水期间，细胞壁被破坏，导致化合物经由诸如水解、氧化、聚合、美拉德反应和异构化的机理而被降解。当干燥叶子进行提取时，如此所得的提取物含有最初在新鲜植物材料中不存在的这些降解产物；而且，该提取物仅含有通过特定溶剂可以分离的化合物范围。因此，所得干燥叶子提取物的组成极大地不同于无花果属植物树液级分的组成。

制备无花果属植物树液级分组合物的方法包括如下步骤：(a)从干净新鲜的未萎蔫的无花果属植物叶子中分离出无花果属植物细胞汁液，得到新鲜的无花果属植物细胞汁液，其中在所述分离之前或期间没有加入外来液体；(b)过滤所述新鲜的无花果属植物细胞汁液，得到不含纤维的细胞汁液；和(c)使所述不含纤维的细胞汁液进行分级，得到无花果属植物树液级分。分级步骤包括如下步骤：(1)从所述不含纤维的细胞汁液中除去叶绿素，得到上清液I；(2)从上清液I中除去色素和蛋白质，形成无花果属植物树液级分；和(3)任选地向所述无花果属植物树液级分中加入稳定剂。

在一些实施方案中，稳定剂选自抗氧化剂、螯合剂、防腐剂及其混合物。在特定实施方案中，稳定剂选自焦亚硫酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金甲酯钠、戊二醇及其混合物。

在特定实施方案中，从不含纤维的细胞汁液中除去叶绿素的步骤包括：(i)调节所述不含纤维的细胞汁液的pH至约3，得到pH被调节的不含纤维的细胞汁液；(ii)将所述pH被调节的不含纤维的细胞汁液加热至约90℃达约1分钟；(iii)将所述pH被调节的不含纤维的细胞汁液冷却至约30℃；和(iv)将所述pH被调节的不含纤维的细胞汁液分离成沉淀物I和上清液I。

在特定实施方案中，从上清液I中除去色素和蛋白质包括：(i)调节上清液I的pH至7.5，形成pH被调节的上清液I；(ii)将pH被调节的上清液I分离成沉淀物II和上清液II；(iii)调节上清液II的pH至3.6，形成pH被调节的上清液II；和(iv)将pH被调节的上清液II分离成沉淀物III和无花果属植物树液级分。

使用新鲜的无花果属植物叶子制备无花果属植物树液级分。本文的制备方法保持了无花果属植物叶子中固有存在的生物活性组分的完整性，产生了具有优良活性的无花果属植物树液级分。在采收和运输期间注意保护叶子的完整性，以便使环境因素如水分损失和生物降解最小化。所有步骤在最短的可能时间段内完成，以使新鲜叶子与日光、高温和其它不利环境因素的接触最小化。

在特定实施方案中，无花果属植物叶子选自由孟加拉榕(F.benghalensis)、无花果(F.carica)、印度榕(F.elastica)、榕树(F.microcarpa)、F.trigonata及其组合组成的无花果属植物种类。

采收(例如通过手或机械切割进行采收)以避免使叶子切碎、捣碎、压碎或遭受其它类型损伤的方式或使之最小化的方式进行。采收和运输应当以避免由于水分损失而萎蔫的方式进行。在一项实施方案中，用于制备无花果属植物树液级分的新鲜无花果属植物叶子含有至少90％的其原始水分含量、在另一项实施方案中含有至少95％、在另一项实施方案中至少98％的在采收时存在的原始水分含量。

因为一次可以采收至多30％的无花果属植物叶子而不会不利地影响该植物的生存力，所以对同一株植物而言叶子再生长以供将来采收可以发生多次。因此，在其整个自然寿命内，无花果属植物可以继续生长并且是周围生态系统的一部分，同时提供重复的叶子采收用于制备具有生物活性的美容化妆用组合物。该采收方法是优选的，因为它促进了自然资源的可持续性。

虽然不是优选的，但是也可以使用可持续性较差的收集方法，例如采用大规模机械采收，其除去了植物的主体并且没有留下可存活的部分以供再生长。但是，即使采用这种更具有攻击性的采收方法，也应当注意使无花果属植物叶子的损伤最小化，无花果属植物叶子的损伤可在所收集的叶子中导致微生物生长、水分损失、氧化增强、聚合、异构化和水解过程(例如不想要的分解代谢过程)。例如，在本发明的一项实施方案中，无花果属植物作为整株植物被手工切割和收集。在另一项实施方案中，采用采收装置切割植物叶子。

将切割的植物材料运输至加工设备的时间和叶子在日光、高温和其它不利环境因素中的暴露应当被最小化，以防止如上文所述的不想要的分解过程的影响。例如，在本发明的一项实施方案中，运输植物用于进一步加工的时间从切割时开始计算不超过30分钟。在另一项实施方案中，对进行长距离运输的植物进行切割后操作，所述切割后操作包括立即将无花果属植物叶子放入含有冷冻凝胶包袋的聚苯乙烯泡沫塑料(Styrofoam)冷却器中以帮助在运输至加工设备的夜晚期间维持新鲜度和天然水分含量。也可以使用可以获得上述结果的其它切割后操作。

然后将无花果属叶子进行温和洗涤以在加工之前除去污染颗粒和其它碎屑。在一项实施方案中，在防止引起细胞汁液从叶子中释放、引起损伤或除去有价值的组分的条件下采用低压冲洗短的时间完成洗涤。例如，在本发明的一项实施方案中，用低于或等于1kg/cm²的水压在少于或等于5分钟的时间完成无花果属植物叶子的洗涤。残留的水洗涤液应当不含有任何绿色或黄色色素；不存在这类色素表明不存在后来的损害。然后，从经洗涤的叶子中除去过量的水以保持干物质含量尽可能地与天然水平接近。

然后，将经洗涤的新鲜无花果属植物叶子进行机械分离以从富含纤维的材料(其主要含有细胞壁)中释放出细胞汁液(其含有实质细胞的大多数细胞内物质)。重要的是，在分离过程期间未加入外来溶剂(例如水、己烷、丙酮、乙醇)。如本文所用的“外来溶剂”指不是固有地存在于植物材料中、而是为了从植物材料中分离(例如提取)化合物的目的而被放置与植物材料接触的任意溶剂。

从经洗涤的叶子中释放出细胞汁液包括研磨、浸渍和施压以获得液体细胞内物质(即细胞汁液)和将其与富含纤维的材料分离。在一项实施方案中，使用具有5HP发动机和一套筛的锤磨机(Model VS35，VincentCorporation，Tampa，FL)来研磨叶子以在最短的时间内和不显著增加生物质温度的情况下产生具有适宜小的尺寸的叶子组织颗粒。在该实施方案中，锤磨机被设置成在≤10秒的处理期间产生≤2.0厘米的经浸渍叶子颗粒的最大尺寸，其中经浸渍新鲜叶子的温度增加低于或等于仅≤2℃。

如上文所述，使经研磨和浸渍的无花果属植物叶子的暴露最小化以阻止不想要的分解代谢过程的影响。无花果属植物叶子在短时间和不显著增加温度的情况下进行加工。在研磨和浸渍后，立即对无花果属植物叶子施压以获得来自经浸渍的新鲜叶子的细胞汁液。在一项实施方案中，这采用装配有通过压缩空气支持的锥的卧式连续螺杆压力机(Compact Press“CP-6”，Vincent Corporation，Tampa，FL)来实现。在该实施方案中，锥上的压力维持在高于或等于15kg/cm²的水平，螺杆速度为12rpm，细胞汁液温度增加少于或等于5℃。

该处理产生了富含纤维的物质和细胞汁液。然后，从细胞汁液冲除去残留的小纤维颗粒，因为它们可吸收有价值的细胞汁液组分以及可阻塞装置软管和泵。例如，这些颗粒可以通过过滤或低速离心来除去。在一项实施方案中，这些颗粒通过采用具有全自动排出部件的连续流动离心机(Model12-413V，AML Industries，Inc.，Hatboro，PA)进行澄清来除去。在2升/分钟的流速，在≤2,250g的细胞汁液澄清的保留时间为≥100秒。该方案产生了不含纤维的细胞汁液。收集含有小纤维颗粒的沉淀物，与在压榨新鲜叶子后产生的富含纤维的物质的其余部分合并。

在此时如果希望的话，可以将细胞汁液冷冻在气密的非反应性容器中保存以供后来的加工。在一项实施方案中，将细胞汁液迅速放置入密闭的15升长方形HDPE容器中并于-30℃冷冻。将固态冷冻细胞汁液保持在该低温下供进一步使用。

然后，将冷冻的细胞汁液转化回液态，优选通过液化历经短时间(例如小于或等于2分钟)和在液化期间细胞汁液温度增加最小(例如小于或等于20℃)的情况下进行。短的液化时间和低的温度增加使得对细胞汁液的变性和氧化损伤都最小化。这使得细胞汁液具有与冷冻之前测量的那些基本上相同的生理化学和生物化学性质。

细胞汁液包括三种主要的组分类型：(i)膜结合的叶绿体、线粒体、内质网、细胞核、溶酶体、过氧化物酶体、液泡、高尔基体；和(ii)非膜结合的核糖体、微管；和(iii)与上述无关的组分，如细胞质。由于在细胞汁液中存在细胞器及其片段以及不想要的色素和蛋白质，需要进行分级来产生具有功能性质(包括但不限于颜色、溶解性、透明度、稳定性和体外活性)的预期组合的个人护理成分。

采用各种处置、包括pH调节、聚焦微波照射、离心分离和真空过滤对细胞汁液进行分级。然后，将所得的分离的细胞汁液树液级分用防腐剂和抗氧化剂稳定，得到最终的无花果属植物树液级分。

将细胞汁液的pH调节至≥3.0(pH调节1)。在一项实施方案中，利用滴定法、采用5.0N盐酸(HCl)调节细胞汁液pH(接近于中性(7.0))以降低细胞汁液的pH至≥3.0(pH调节1)。

然后，从经调节的细胞汁液中除去叶绿素。除了在美容化妆用成分中不希望存在该色素外，叶绿素可以转化为脱镁叶绿酸，脱镁叶绿酸被认为是毒性化合物(Bergstrom，L.C.，Vucenik，I.，Hagen，I.K.，ChernomorskyS.A.，Poretz R.D，In-vitro photocytotoxicity of lysosomotropicimmunoliposomes containing pheophorbide a with human bladdercarcinoma cells.-J.Photochem.Photobiol.，24，1，17-23，1994)，并且引起皮肤刺激(Kato T.，Yamada K.Relationship between appearance ofphotosensitization and total pheophorbide level in spirulina powder.-J.Food Hyg.Soc.Japan，36，632-634，1995)。

在一项实施方案中，通过加热、然后冷却经调节的细胞汁液、接着分离沉淀物和上清液来完成叶绿素除去。在特定实施方案中，通过频率为2,450MHz的聚焦微波照射迅速地处理经调节的细胞汁液。在该聚焦微波加工(FMP)期间，细胞汁液温度暂时升高至90℃，在此温度保持1分钟，然后细胞汁液温度立即降低至≤30℃。然后，采用连续流动离心机CEPA LE(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，德国)在15,000rpm和≥30秒的保留时间下快速分离经处理的细胞汁液。对经处理的细胞汁液的分离产生了绿色糊状沉淀物(“沉淀物I”)和浅褐色略微有乳光的液体上清液(“上清液I”)。该上清液I用于进行进一步分级。

将上清液I进行进一步处理以显著除去褐色色素和其它不想要的化合物、包括残余的蛋白质。该处理包括pH调节和分离。调节上清液I的pH以使pH增加至约7.5(pH调节2)。在一项实施方案中，pH调节2是经由滴定法、采用50％氢氧化钠(NaOH)以使细胞汁液上清液I的pH由～3.0提高至～7.5(pH调节2)来完成的。pH调节2使物质产生较深颜色，并且呈现出乳光，然后经由分离使之净化。在一项实施方案中，净化是使用连续流动离心机CEPA LE(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，德国)在15,000rpm和≥30秒的保留时间下完成的。该分离产生了褐色糊状沉淀物(沉淀物II)和褐色略微有乳光的上清液(上清液II)。

然后，将上清液II进行pH调节(pH调节3)和过滤。调节上清液II的pH以降低pH至约3.6(pH调节3)。在一项实施方案中，采用5.0N盐酸(HCl)对上清液II进行滴定以降低pH值至pH～3.6(pH调节3)。该处理产生了较浅颜色的经滴定上清液II，虽然其乳光略微增加。将pH经调节的上清液II通过经由孔尺寸为0.2微米的膜进行的灭菌过滤进行处理。所得滤液是浅色透明的无花果属植物树液级分(FSF)。FSF基本上由无花果属植物叶子细胞的细胞质组成。

可以通过加入抗氧化剂、稳定剂、螯合剂和防腐剂获得树液级分的进一步稳定。在一项实施方案中，将下述添加剂加入到无花果属植物树液级分中：0.2％焦亚硫酸钠、0.1％山梨酸钾、0.1％苯甲酸钠和0.1％尼泊金甲酯钠。在该实施方案中，将混合物培育直至添加剂完全溶解(≥30分钟)。然后，向混合物中加入1.9％戊二醇。

FSF的性质

所得的FSF表现出使其对于用作美容化妆用成分而言更期望的性质。这些性质包括稳定性、水溶性、没有不期望的物质如脱镁叶绿酸和蛋白质、较浅颜色、较高固体含量和存在较高水平的期望化合物如苯丙氨酸。

稳定性研究表明，由来自这些方法的FSF产生的美容化妆用成分在室温下稳定至少6个月。如本文所用的“稳定”表示组合物在STP(标准温度和压力：25℃，1atm)下在黑暗干燥区域中贮存时其物理或化学性质历经指定的时间期限没有显著变化。这些性质包括颜色和化学组成。在一些实施方案中，FSF和包含它的组合物稳定至少6个月，在其它一些实施方案中稳定至少12个月，在另一些实施方案中稳定至少24个月。在特定实施方案中，组合物稳定6至24个月、12至24个月或6至12个月。

水溶性

本发明的FSF也是水溶性的。如本文所用的“水溶性”指FSF以任意比例与水互溶(在STP下)。因为FSF是水溶性的，所以在配制包含无花果属植物的组合物中允许有更大的灵活性。例如，水基配制物由于它们的不油腻感、有利的铺展性、亮肤感和易于从皮肤表面除去(例如冲洗)而通常是消费者所希望的。

然而，采用溶剂提取的非水溶性常规无花果属植物提取物可以显示出配制困难，例如相分离、沉降、结晶和整个水基组合物中活性浓度不均匀。为了克服与非水溶性活性物有关的配制问题，通常使用更复杂的配制物如乳剂(其通常将油性和/或油性感觉的物质引入组合物中)。这产生了具有油腻、厚重和/或发粘皮肤感觉的组合物(这种组合物不容易从皮肤表面除去)和更昂贵和/或复杂的制备方法。在许多情况中，这些配制物还可妨碍活性物向皮肤的递送。

然而，因为FSF是完全水溶性的，所以其可以掺入到水基配制物中而没有之前提及的与非水溶性常规无花果属植物提取物相关的问题。这产生了更大的配制灵活性，因而能够递送具有消费者期望的优良特性的无花果属植物组合物。

而且，因为FSF是完全水溶性的，所以其相对于不是完全水溶性的溶剂提取物而言生物利用性更好。这使得来自FSF的活性组分能更有效地递送到皮肤。

另外，由于常规溶剂提取物不溶于水，测量它的许多潜在生物学活性是不可行的。例如，因为它们不溶于水，所以在本发明的研究中不能测定溶剂提取物的IC₅₀值。

安全性/变应原性

FSF还基本上不含脱镁叶绿酸和蛋白质，脱镁叶绿酸和蛋白质是在植物、包括无花果属植物中常见的物质。已知这些物质产生安全性问题，例如毒性和/或在敏感个体中的变态反应。这些物质当处于在植物中通常发现的水平时通常不引起问题。但是，当植物材料被浓缩、例如通过加工被浓缩时，存在的相对浓度显著增加并可产生安全性问题。因此，不含这些物质的组合物是高度优选的。

脱镁叶绿酸是色素化合物，它是叶绿素降解产物。除了引起产品变色外，还已知这些色素是生物毒素和皮肤光敏剂(Bergstrom，L.C.，Vucenik，I.，Hagen，I.K.，Chernomorsky S.A.，Poretz R.D.In-vitro photocytotoxicity oflysosomotropic immunoliposomes containing pheophorbide a with humanbladder carcinoma cells.-J.Photochem.Photobiol.，24，1，17-23，1994)；(Kato T.，Yamada K.Relationship between appearance ofphotosensitization and total pheophorbide level in spirulina powder.-J.Food Hyg.Soc.Japan，36，632-634，1995)。

如图2所示，(实施例3的)常规无花果属植物提取物含有在(实施例1的)FSF中未检测到的迟洗脱(即，更疏水的)化合物。如图3所示，常规无花果属植物提取物的迟洗脱化合物的LC/UV色谱图及其相应的提取的离子色谱图鉴定这些化合物是脱镁叶绿酸(参见实施例5)。

蛋白质、包括植物如无花果属植物中的蛋白质可引起敏感个体的蛋白质接触性皮炎。在与原因性的蛋白质物质接触后不久，这类个体可经历诸如皮肤急性荨麻疹或小泡疹的症状，经常伴有瘙痒、灼痛和/或刺痛(V.Janssens等人，“Protein contact dermatitis：myth or reality？”，BritishJournal of Dermatology1995；132：1-6)。因此，高度期望皮肤护理物质含有尽可能少的蛋白质。

采用凯氏法(Kjeldahl method)测试了FSF的总蛋白质含量(实施例1，表3)。在FSF中没有检测到蛋白质。如本文所用的“基本上不含蛋白质”指采用凯氏法测定总蛋白质含量低于1％(0％至1％)。在一些实施方案中，蛋白质含量为FSF的0％至1％，在其它实施方案中为0％至0.5％，在其它实施方案中为0％至0.25％。

颜色/颜色稳定性

FSF的颜色比常规无花果属植物提取物的颜色浅。FSF具有的加德纳(Gardner)颜色值小于8，在一些实施方案中小于7.5。特定实施方案具有的加德纳颜色值为5至8，在其它实施方案中为6至8，在其它实施方案中为6.5至8。图8显示了在14天加速老化研究中FSF相对于干燥叶子无花果属植物提取物的颜色差异。图10显示了0.55％FSF在具有不同水平的稳定剂/防腐剂的载体中的颜色差异。图9是对图8的加速老化研究分析所构建的校准表。

本发明的研究者已经鉴定了常规提取物中一些感兴趣的组分，它们在FSF中不存在和/或以低得多的水平存在，这可以解释它们之间的颜色和颜色稳定性差异。例如，图4显示常规提取物含有较高量的可能是黄酮醇糖苷的物质。黄酮醇糖苷可以与鞣质(在FSF和常规提取物中均有发现)结合形成聚合色素。因此，较高水平的黄酮醇糖苷可以导致在常规提取物中形成较高水平的色素化合物。而且，类黄酮与鞣质的多酚结构使得它们对诸如氧化、热和光的因素相当敏感，这可潜在地解释在常规提取物中存在的色素随时间推移而增加。

固体含量

固体含有FSF或提取物的生物活性部分。因此，固体含量越高，则植物活性越高。FSF与常规的水溶性无花果属植物提取物相比具有较高的固体含量。基于FSF的重量，FSF具有大于5％重量、在特定实施方案中5％至20％或5％至10％的固体(干物质)含量。

FSF生物活性

FSF显示出至少四种不同的被认为调节皮肤色素沉着产生的作用机制。这些机制为酪氨酸酶抑制、胰蛋白酶抑制、COX-2抑制和抗氧化活性。在一项实施方案中，FSF具有下述色素沉着减少活性中的至少一种、在其它实施方案中具有下述色素沉着减少活性中的至少两种或者至少三种：0.003至0.06的酪氨酸酶抑制IC50(％DM)；0.02至0.5的胰蛋白酶抑制IC50(％DM)；0.02至1的COX-2抑制IC50(％DM)；和当通过DPPH分析(1/x DM)来测定时为1至15和/或当通过ORAC分析(1/x DM)来测定时为0.2至5的抗氧化剂超氧化物清除能力。如本文所用的“DM”是干物质(“固体”)，“ORAC”是氧自由基吸收能力，“DPPH”是自由基清除能力的度量。

而且，如通过实施例6的B16黑色素抑制分析所证实的那样，FSF在抑制黑色素产生方面比常规无花果属植物干燥叶子溶剂提取物更有效。例如，在0.01的浓度下，FSF引起黑色素合成抑制的程度(48.1％黑色素抑制)是常规提取物(23％黑色素抑制)的两倍以上。

因此，本发明提供了调节皮肤中黑素生成(即黑色素抑制)的方法。涉及皮肤中黑色素集中的各种形式的色素沉着过度(例如雀斑、老年斑、肝痣、斑点、斑驳的色素沉着等)被相信是由于在表皮中存在的黑素细胞和角质形成细胞的变化引起的。位于表皮基底的黑素细胞随着老化而丧失其正常调节过程，产生过量色素。这种过量产生导致在表皮内的角质形成细胞中形成稠密的黑色素核周团块，产生色素沉着过度区域。

色素沉着过度皮肤的常规疗法包括应用某些抑制黑色素形成的亮肤剂。在本领域已经提议的这些物质的作用机制为酪氨酸酶抑制和/或黑色素合成中其它步骤的抑制。酪氨酸酶存在于表皮黑素细胞中的黑素体内，催化由酪氨酸形成黑色素的关键步骤(参见Goldsmith，L.A.，PHYSIOLOGY，BIOCHEMISTRV，AND MOLECULAR BIOLOGY OF THE SKIN，牛津大学出版社，第873-903页，N.Y.1991)。酪氨酸酶催化酪氨酸的羟基化和DOPA向DOPA醌(奎宁)的氧化。因此，抑制剂与酪氨酸酶活性部位的结合导致黑色素形成减少。通常参见Prota，G.Melanins and Melanogenesis，Academic Press，Inc.，(San Diego1992)。

氧化过程参与黑色素生成的非酶促步骤。DOPA醌向黑色素的转化经由非酶促或自发化学反应发生，其中一些反应涉及活性氧簇(ROS)或氧自由基。黑素细胞的氧化应激(例如通过刺激活性氧/氧自由基种类，例如其可以采用UV或日光暴露发生)导致引发黑素细胞内的黑色素产生途径。已经使用了各种抗氧化剂/游离基清除剂帮助破坏这些过程，从而获得亮肤益处。

已知衍生自花生四烯酸的代谢物充当皮肤的强效炎性介质，特别是响应于环境攻击如UV、烟雾及其它这类刺激物。在该途径中，膜磷脂通过磷脂酶A2转化为花生四烯酸(AA)。一旦形成AA，通过两个竞争性生物途径——环加氧酶(COX)途径或5-脂肪氧化酶途径——利用AA。COX炎症途径中最相关的酶为COX-2，其催化花生四烯酸转化为PGH2，PGH2是一种快速转化为前列腺素如PGE2的短暂分子。前列腺素是自分泌或旁分泌的，其充当负责在刺激部位引发炎性应答的局部信使。

无花果属植物树液级分吸收到皮肤中抑制COX-2，阻止衍生自花生四烯酸的代谢物转化为前列腺素。净效应是基础的和诱导的前列腺素池减少。前列腺素水平降低导致炎性应答直接减少以及所有产生的下游信使活动降低。这些信使活动中的两种包括黑素细胞中黑色素合成的活化和成纤维细胞中胶原蛋白生成的抑制。

已知前列腺素通过增加酪氨酸酶(一种负责黑色素产生的酶)的量来刺激黑素细胞。黑素细胞的刺激和黑色素的超量产生导致色素沉着过度，这表现为皮肤区域变黑。因此，炎症引起的变色(称为炎症后色素沉着过度)来自于前列腺素对黑素细胞的直接剌激。由无花果属植物树液级分抑制COX2引起的前列腺素产生减少将导致黑色素产生较少和皮肤色泽更均匀。

已经证明前列腺素PGE₂对于降低各种细胞、包括人皮肤成纤维细胞、大鼠肾小球膜细胞和肝星形细胞中的I型和/或III型胶原蛋白合成具有显著作用[refs]。因为I型和III型是构成皮肤真皮的胶原蛋白的主要形式，所以这支持了PGE₂响应炎症而水平升高将导致胶原蛋白合成的抑制。已经证明AA和PGE₂对胶原蛋白合成具有抑制作用。加入天然来源的COX-2抑制剂、包括ω-3脂肪酸EPA和DHA能够补偿PGE₂引起的胶原蛋白合成的抑制，导致胶原蛋白合成净增加。因此，无花果属植物树液级分可通过抑制COX2(COX2抑制减少了引起胶原蛋白抑制的前列腺素的形成)来改善皮肤纹理。

已经出人意料地发现：当局部应用于皮肤时，无花果属植物树液级分与常规无花果属植物提取物相比获得了优良的亮肤作用，包括使哺乳动物皮肤的色素沉着过度区域增亮。而且，分析试验已经证明：本发明的无花果属植物树液级分经由多种作用机制破坏黑色素合成，既影响酶促途径、也影响非酶促途径。与常规无花果属植物提取物相比，FSF具有增强的生物活性，包括酶抑制活性、自由基清除活性、抗氧化剂活性和黑色素合成抑制活性中的一种或其组合。酶抑制活性包括但不限于酪氨酸酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶和环加氧酶-2(“COX-2”)抑制活性中的一种或其组合。抗氧化剂活性包括但不限于氧自由基吸收能力。

虽然本发明的研究者也已经通过举例的方式证明常规无花果属植物提取物可以带来色素沉着过度益处，但是这些常规提取物不是那么有效，并且它们具有的性质使得它们较不适合用于美容化妆用组合物并且因而对于用于美容化妆用组合物而言是较不期望的。

如图5所证实的那样，FSF具有较高水平(约10x)的儿茶素和相关缩合鞣质。缩合鞣质(原花色素)如儿茶素是一类黄烷醇。原花色素本质上是类黄酮如儿茶素的聚合物链。据信鞣质在人体中作为生物抗氧化剂(自由基清除剂)起作用，并且被普遍相信其在抗击对皮肤的氧化损伤、例如老化引起的氧化损伤方面有效。而且，抗氧化剂可以帮助抵抗内源性应激和环境应激如香烟烟熏和污染的影响以及支持正常身体代谢过程(Kehrer，J.P.Crit.Rev.Toxicol.1993，23，21)。图7也证实FSF含有较高水平的游离酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，它们都是必需氨基酸。然而，如图6所证实的那样，所检测到的三种氯原酸异构体的水平没有显示在两种样品之间有显著差异。

B.调肤色剂(Skin Tone Agent)

在一些实施方案中，可以期望在与FSF相关的组合物中包含调肤色剂。可以包括调肤色剂以进一步改善整体肤色。当存在调肤色剂时，本发明的组合物基于组合物的重量计含有至多约50％、40％、30％、20％、10％、5％或3％的调肤色剂。当存在调肤色剂时，本发明的组合物基于组合物的重量计含有至少约0.001％、0.01％、0.1％、0.2％、0.5％或1％的调肤色剂。适宜的范围包括所述下限和上限的任意组合，包括基于组合物的重量计约0.1％至约50％、约0.2％至约20％或约1％至约10％的调肤色剂。本文列出的量仅用作指导，调肤色剂的最佳量将取决于所选择的特定活性物，因为活性物的功效变化相当大。

适宜的调肤色剂包括但不限于糖胺、维生素B3化合物、熊果苷、脱氧熊果苷、1，3-二羟基-4-烷基苯如己雷琐辛、蔗糖二月桂酸酯(sucrosedilaurante)、bakuchoil(4-[(1E，3S)-3-乙烯基-3，7-二甲基-1，6-辛二烯基]苯酚或单萜酚(monterpene phenol)、pyrenoine(可从法国Biotech Marine获得)、稷(panicum miliaceum)种子提取物、十八烷基烯二酸(arlatone dioic acid)、肉桂酸、阿魏酸、achromaxyl、甲基烟酰胺、油溶性甘草提取物、叶酸、十一烯酸(即十一碳烯酸)、十一烯酸锌、硫胺(维生素B1)及其盐酸盐、L-色氨酸、向日葵(helianthus annus)和葡萄(vitis vinifera)叶提取物、肌肽(即dragosine)、龙胆酸甲酯、1，2-己二醇和1，2-辛二醇(即，由德国Symrise AG作为Symdiol68销售的组合)、肌醇、十一碳烯酰基苯丙氨酸(例如由法国Seppic以商品名Sepiwhite销售)、koijic acid、己脒定化合物、水杨酸和类视色素、包括视黄醇和丙酸视黄酯。

在一些实施方案中，另外的调肤色剂选自维生素B3化合物、糖胺、己脒定化合物、水杨酸、1，3-二羟基-4-烷基苯如己雷琐辛和类视色素。如本文所用的“维生素B₃化合物”指下式化合物：

其中R为-CONH₂(即烟酰胺)、-COOH(即烟酸)或-CH₂OH(即烟醇)；其衍生物；及任意前述物质的盐。如本文所用的“糖胺”包括糖胺及其盐(例如HCl盐)和衍生物的异构体和互变异构体。糖胺的实例包括葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺其异构体(例如立体异构体)和盐(例如HCl盐)。如本文所用的“己脒定化合物”指下式化合物：

其中R¹和R²是任选的或者是有机酸(例如磺酸等)。在一项实施方案中，己脒定化合物是己脒定二羟乙磺酸盐。

C.抗炎剂

色素沉着过度可以由皮肤炎症导致。触发色素沉着过度、更特别是炎症后色素沉着过度的暂时性炎性事件包括但不限于痤疮损伤、向内生毛、抓伤、虫咬、表面活性剂损伤、变应原和短期UV暴露。炎症诱导的色素沉着过度、包括炎症后色素沉着过度可以通过向本发明的组合物中加入抗炎剂来控制。当存在抗炎剂时，本发明的组合物基于组合物的重量计含有至多约20％、10％、5％、3％或1％的抗炎剂。当存在抗炎剂时，本发明的组合物基于组合物的重量计含有至少约0.001％、0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％或1％的抗炎剂。适宜的范围包括所述下限和上限的任意组合。适宜的抗炎剂包括但不限于非甾体抗炎剂(NSAIDS，包括但不限于布洛芬、萘普生、氟芬那酸、依托芬那酯、阿司匹林、甲芬那酸、甲氯芬那酸、吡罗昔康和联苯乙酸)、甘草酸(也称为甘草甜素、glycyrrhixinic acid和甘草亭酸糖苷)及其盐如甘草酸二钾、甘草次酸(glycyrrhetenic acid)、甘草提取物、没药醇(例如α没药醇)、manjistha(从茜草属(Rubia)、特别是茜草(Rubiacordifolia)中提取)和guggal(从没药属(Commiphora)、特别是印度穆库尔没药(Commiphora mukul)中提取)、可乐(kola)提取物、甘菊、红三叶草提取物和柳珊瑚提取物(从柳珊瑚目(Gorgonacea)的植物提取)、任意上述物质的衍生物及其混合物。

D.防晒活性物

本发明的组合物可以包含一种或多种防晒活性物(或防晒剂)和/或紫外光吸收剂。在本文中，“防晒活性物”一起包括防晒活性物、防晒剂和/或紫外光吸收剂。防晒活性物即包括防晒剂、又包括物理遮光剂。防晒活性物可以是有机物或无机物。适宜的防晒活性物的实例在个人护理产品协会(Personal Care Product Council)的International Cosmetic IngredientDictionary andHandbook(第13版)中作为“防晒剂”公开。特别适宜的防晒活性物有对甲氧基肉桂酸2-乙基己基酯(可作为PARSOL^TM MCX购买获得)、4，4′-叔丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷(可作为PARSOL^TM1789购买获得)、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、辛基二甲基对氨基苯甲酸、二棓酰三油酸酯、2，2-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮、4-(二(羟基丙基))氨基苯甲酸乙酯、2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸2-乙基己基酯、水杨酸2-乙基己基酯、对氨基苯甲酸甘油基酯、水杨酸3，3，5-三甲基环己基酯、邻氨基苯甲酸薄荷基酯、对二甲氨基苯甲酸或氨基苯甲酸酯、对二甲氨基苯甲酸2-乙基己基酯、2-苯基苯并咪唑-5-磺酸、2-(对二甲氨基苯基)-5-磺基苯并噁唑酸、奥克立林(octocrylene)、氧化锌、亚苄基樟脑及其衍生物、二氧化钛及其混合物。

在一项实施方案中，组合物基于组合物的重量计可以包含约1％至约20％或者约2％至约10％的防晒活性物。精确量将根据所选的防晒活性物和预期的防晒因子(SPF)而不同，这属于本领域技术人员的知识范围之内。

E.任选的组分

本发明的组合物可以含有各种其它成分，条件是它们不会不可接受地改变本发明的益处。当存在任选的组分时，本发明的组合物基于组合物的重量计可以含有约0.0001％至约50％、约0.001％至约20％或者约0.01％至约10％的任选的组分。本文列出的量仅用作指导，在组合物中使用的任选的组分的最佳量将取决于所选择的特定活性物，因为它们的功效变化相当大。因此，可用于本发明的一些任选组分的量可以在本文列出的范围之外。

任选的组分当掺入组合物中时应当适用于与人皮肤组织接触而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、变态反应等。本发明的组合物可以包括诸如以下的任选组分：抗痤疮活性物、剥脱活性物、抗脂肪团剂、螯合剂、类黄酮、晒黑活性物、非维生素抗氧化剂和游离基清除剂、毛发生长调节剂、抗皱活性物、抗萎缩活性物、矿物质、植物甾醇和/或植物激素、N-酰基氨基酸化合物、抗微生物或抗真菌活性物及其它有用的皮肤护理活性物，它们在美国申请公布号US2006/0275237A1和US2004/0175347A1中有进一步详细的记载。

个人护理产品协会的International Cosmetic Ingredient Dictionary andHandbook(第十三版)记载了大量在皮肤护理工业中常用的非限制性的美容化妆用和药用成分，它们是适用于本发明的组合物中的任选组分。这些成分类型的实例包括：磨料、吸附剂、美观性组分如香料、色素、色料/着色剂、精油、防结块剂、消沫剂、抗微生物剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、美容化妆用收敛剂、美容化妆用杀生物剂、变性剂、药用收敛剂、柔润剂、外用镇痛剂、成膜剂或膜物质、遮光剂、pH调节剂、防腐剂、抛射剂、还原剂、多价螯合剂、皮肤清凉剂、皮肤保护剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素及其组合。

F.皮肤学上可接受的载体

本发明的组合物还可以包含用于组合物的皮肤学上可接受的载体(其可以称为“载体”)。如本文所用的短语“皮肤学上可接受的载体”指所述载体适于局部应用于角质组织、具有良好美观性质、与组合物中的活性物相容并且将不会引起任何不合理的安全或毒性问题。在一项实施方案中，基于组合物的重量计，载体以约50％至约99％、约60％至约98％、约70％至约98％或者约80％至约95％的水平存在。

载体可以是各种形式。非限制性实例包括简单的溶液(例如水溶液、有机溶剂溶液或油基)、乳剂和固体形式(例如凝胶剂、棒状物、可流动固体或非晶体物质)。在一些实施方案中，皮肤学上可接受的载体为乳剂形式。乳剂通常可以分为具有连续水相(例如水包油型和水包油包水型)或连续油相(例如油包水型和油包水包油型)。本发明的油相可以包含硅氧烷油、非硅氧烷油如烃油、酯、醚等及其混合物。

水相通常包含水。然而，在其它实施方案中，水相可以包括除水之外的组分，包括但不限于水溶性保湿剂、调理剂、抗微生物剂、湿润剂和/或其它水溶性皮肤护理活性物。在一项实施方案中，组合物的非水组分包括湿润剂如甘油和/或其它多元醇。然而，应当认识到所述组合物可以是基本上无水的(即低于1％水)或者是完全无水的。

选择适宜的载体产生预期的产品形式。而且，组分(例如FSF、防晒活性物、另外的组分)的溶解性或可分散性可以确定载体的形式和特性。在一项实施方案中，水包油型或油包水型乳剂是优选的。

乳剂可以进一步包含乳化剂。所述组合物可以包含足以乳化载体的任意适宜百分比的乳化剂。适宜的重量范围基于组合物的重量计包括约0.1％至约10％或约0.2％至约5％的乳化剂。乳化剂可以是非离子的、阴离子的或阳离子的。适宜的乳化剂在例如美国专利3,755,560、美国专利4,421,769和McCutcheon′s Detergents and Emulsifiers(北美版，第317-324页，1986)中有公开。适宜的乳剂可以具有宽范围的粘度，这取决于预期的产品形式。

载体可以进一步包含本领域熟知的增稠剂以提供具有适宜粘度和流变学特性的组合物。

G.示例性的组合物

以下是本发明的组合物的非限制性实例。给出这些实例仅仅是为了解释说明的目的，而不应被看作是本发明的限制，因为在不背离本发明的宗旨和范围的情况下进行多种变通是可能的，这是本领域技术人员所认同的。在实例中，所有浓度均以重量百分比给出，另有说明除外，并且可以排除次要物质如稀释剂、填充剂等。因此，所列的配制物包含所列的组分和与该组分相关的任意次要物质。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些次要物质的选择将根据被选择用于实施如本文所述的本发明的具体成分的物理和化学特性而改变。

所有实例均可用于处置或改善一个或多个色素沉着过度斑的出现。本发明可以进一步涉及如下方案：所述方案包括通过第一组合物(例如实施例A或B)局部处置一个或多个色素沉着过度斑和通过第二组合物(例如实施例C、D和E)进行更宽的或全面的面部皮肤处置，第二组合物可以在局部处置之前或之后应用以改善面部肤色。

^＊1-由纽约Integrated Botanical Technologies生产

^＊2-可从法国SEPPIC获得的Sepiwhite

^＊3-可从Cognis GmbH获得的Emulgade PL68/50

^＊4-可从法国SEPPIC获得的Sepigel305

^＊5-可从Dow Corning，Inc.，Midland，MI获得的Dow Corning DC1503

本发明的组合物通常通过常规方法、例如制备局部用组合物领域中已知的方法来制备。这类方法通常包括在有或无加热、冷却、应用真空等的情况下以一个或多个步骤将成分混合至相对均匀的状态。通常，如下制备乳剂：首先将水相物质和脂肪相物质分别混合，然后酌情将两相合并以产生预期的连续相。组合物优选被制备成使活性物质的稳定性(物理稳定性、化学稳定性、光稳定性)和/或递送最佳化。该最佳化可以包括适当的pH(例如小于7)、排除可与活性剂络合且因而不利地影响稳定性或递送的物质(例如排除污染的铁)、使用阻止复合物形成的手段(例如适当的分散剂或双隔室包装)、使用适当的光稳定手段(例如引入防晒剂/遮光剂、使用不透明包装)等。

本发明的组合物优选含有约0.01％至约10％的无花果属植物树液级分、更优选约0.05％至约5％、最优选约0.1％至约5％、例如2％的无花果属植物树液级分。

H.增亮皮肤的方法

本发明的组合物可用于增亮哺乳动物皮肤(尤其是人类皮肤、更尤其是面部和手部皮肤)。该组合物尤其可用于增亮皮肤的色素沉着过度区域。

增亮皮肤(包括色素沉着过度区域)的方法包括给皮肤局部应用安全有效量的本发明的组合物。在一项实施方案中，本发明的美容化妆用组合物可以包含0.01％至10％的无花果属植物树液级分。组合物的应用量、应用频率和使用时间将在很大程度上取决于所给组合物中无花果属植物树液级分和/或其它组分的水平以及预期的增亮水平，例如，根据个体中出现的皮肤色素沉着的水平和进一步皮肤色素沉着的速率。

在优选的实施方案中，将所述组合物长期应用于皮肤。“长期局部应用”指在个体的一生中历经延长的时间、优选至少约一周的时间、更优选至少约一个月的时间、甚至更优选至少约三个月的时间、甚至更优选至少约六个月的时间、还更优选至少约一年的时间基本上连续地局部应用组合物。虽然在各个最长使用时间(例如两年、五年、十年或二十年)之后可获得益处，但是优选在个体的整个一生中长期连续应用。通常，应用将是历经这类延长的时间每天应用约一次或两次的级别，但是，应用速率可以不同，例如从约每周一次直至约每天三次或更频繁。

可以应用宽范围量的本发明的组合物以提供皮肤增亮益处。对每次应用而言通常所应用的本发明的组合物的量为约0.1mg/cm²皮肤至约10mg/cm²皮肤。特别有用的应用量为约2mg/cm²皮肤。

如本文所用的术语“局部应用”指将本发明的组合物应用或涂敷在皮肤表面上。优选的本发明的组合物是旨在局部应用后保持与皮肤接触延长的时间(例如数小时)的形式，例如典型地使用霜剂、乳液、增湿剂等。

增亮皮肤的方法优选通过局部应用皮肤乳液、霜剂、美容化妆品等形式的组合物来实施，所述形式出于美容、预防、治疗或其它益处而旨在保留在皮肤上。在给皮肤应用组合物后，其优选保留在皮肤上达至少约15分钟、更优选至少约30分钟、甚至更优选至少约1小时、最优选至少数小时、例如至多约12小时的时间。

更通常地，本发明的组合物还可用于调节哺乳动物皮肤状况(尤其是人类皮肤，更尤其是面部和/或手部皮肤)，包括皮肤老化迹象以及与皮肤老化相关的皮肤中可见和/或能触知的不连续状况。该调节包括预防性和/或治疗性调节。调节皮肤状况包括给皮肤局部应用安全有效量的本发明的组合物。组合物的应用量、应用频率和使用时间将在很大程度上取决于所给组合物中无花果属植物树液级分和/或其它组分的水平以及预期的调节水平，例如，根据个体中出现的皮肤老化水平和进一步皮肤老化的速率。

I.无花果属植物树液级分的生物活性

本发明还涉及减少皮肤色素沉着过度的出现的方法，该方法通过给色素沉着过度区域局部应用美容化妆用组合物以破坏黑素生成(黑色素合成)中的一个或多个步骤。该美容化妆用组合物实施酶抑制(胰蛋白酶抑制活性和/或酪氨酸酶抑制活性)、抗氧化剂活性(ORAC和DPPH)和/或COX-2抑制，由此破坏黑素生成中的一个或多个步骤。

制备具有生物活性的植物美容化妆用组合物的方法比目前可用的方法有利，因为其得到了具有植物细胞中所含的全部范围的活性的植物提取物。如实施例6中所示，本发明的无花果属植物提取物具有比通过常规方法提取的无花果属植物高得多的生物活性。

在本发明的一项实施方案中，增亮哺乳动物皮肤的方法包括局部施用包含有效量的无花果属植物树液级分的美容化妆用组合物以抑制胰蛋白酶活性。

本发明的另一项实施方案包括通过抑制哺乳动物皮肤中的酪氨酸酶活性来增亮哺乳动物皮肤的方法，该方法包括给哺乳动物局部施用包含有效量的无花果属植物树液级分的美容化妆用组合物。

正常肤色是由黑色素形成的，黑色素是一种还决定头发和眼睛颜色的天然色素。在皮肤中，酪氨酸酶对于负责将氨基酸酪氨酸转化为黑色素的生物化学途径而言是必需的。当产生太多黑色素时出现色素沉着过度，并在皮肤中形成沉积。产生该色素的细胞称为黑素细胞。它们位于表皮的基底层中。黑素细胞产生黑素体，黑素体被向上传递给其它表皮细胞并前进至皮肤上层。黑色素的合成仅仅在黑素体中进行。当产生太多黑色素时，形成沉积物并在皮肤中出现色素沉着过度。

酪氨酸酶是一种含铜的单加氧酶，其催化单酚向相应儿茶酚的邻羟基化(单酚酶或甲酚酶活性)和单酚向相应邻苯醌的氧化(二酚酶或儿茶酚酶活性)。酪氨酸酶的这些功能在黑素生成期间黑色素色素的形成中起重要作用。黑色素产生主要负责皮肤颜色，并且在防止日光诱导的皮肤损伤方面起重要作用。然而，皮肤中黑色素产物的异常蓄积可引起色素沉着过度，包括黄褐斑、黑斑病、雀斑和老年斑，它们可导致不期望的美学外观(Jeon等人，(2005)Bull.Korean Chem.Soc，第26卷：1135-1137)。

概括而言，本发明涉及抑制至少一种负责哺乳动物皮肤组织内皮肤色素沉着或着色的酶的活性。无花果属植物树液级分可以抑制胰蛋白酶以及酪氨酸酶和其它酪氨酸酶样酶的活性。而且，本发明还涉及实施色素相关性抗氧化剂活性(ORAC和DPPH)、包括过氧化物清除活性以及COX-2抑制。

源自树液的美容化妆用组合物具有ICR50值为约50至190μg干物质/ml的过氧化物清除效价。如本申请所用的术语“ICR50值”表示50％抑制细胞色素C减少所需的在细胞树液级分中含有的干物质的浓度。

化合物可以以每日数次的频率施用于哺乳动物，或者其可以以较低的频率施用如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或者甚至是更低的频率如每几个月一次或甚至是每年一次或更低频率。施用频率对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且将取决于任意数目的因素、例如但不限于待治疗疾病的类型和严重性、动物的类型和年龄等。

J.任选的组分

本发明的组合物可以含有在给定产品类型中惯常使用的各种其它成分，条件是它们不会不被接受地改变本发明的益处。组合物可以包含皮肤学上可接受的载体。

任选的组分当被掺入到组合物中时应当适用于与人皮肤组织接触而在合理的判断范围内没有过度毒性、不相容性、不稳定性、变态反应等。CTFA Cosmetic Ingredient Handbook(CTFA美容化妆用成分手册)，第二版(1992)记载了在皮肤护理工业中常用的各种非限制性美容化妆用和药用成分，它们适用于本发明的组合物。这些成分类型的实例包括：磨料、吸附剂、美观性组分如香料、色素、色料/着色剂、精油、防结块剂、消沫剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、美容化妆用收敛剂、美容化妆用杀生物剂、变性剂、药用收敛剂、外用镇痛剂、成膜剂或膜物质如聚合物(帮助组合物的成膜性质和直接性)(例如二十碳烯和乙烯基吡咯烷酮的共聚物)、遮光剂、pH调节剂、抛射剂、还原剂、多价螯合剂和增稠剂。

在一些实施方案中，可以期望在组合物中与FSF组合地包括第二种、第三种或第四种调肤色剂。可以包括第二种、第三种或第四种调肤色剂以进一步改善整体肤色。当存在另外的调肤色剂时，本发明的组合物优选含有约0.1％至约50％、更优选约0.2％至约20％、甚至更优选约1％至约10％组合物重量的另外的调肤色剂。本文列出的量仅用作指导，另外的调肤色剂的最佳量将取决于所选择的特定活性物，因为活性物的功效变化相当大。优选的调肤色剂包括但不限于N-乙酰基葡糖胺、维生素B3和十一碳烯酰基苯丙氨酸(例如由法国Seppic以商品名Sepiwhite销售)。在一些实施方案中，可以使用一种组合物(例如表#1中的组合物#1)作为一个或多个色素沉着过度斑的局部治疗，而在专门治疗之前和之后可以将一种或多种其它组合物(例如表#1中的组合物#2、#3和#4)更广泛地用于面部皮肤表面以改善面部肤色。

本发明的局部用组合物可以以各种形式提供，包括但不限于乳液、奶液(milks)、摩丝、浆液(serums)、喷雾剂、气雾剂、泡沫、棒状物、笔、凝胶剂、霜剂和软膏剂。在一项实施方案中，组合物为溶液形式，在另一项实施方案中，组合物为乳液形式。

K.组合物的制备

本发明的组合物通常通过常规方法、例如制备局部用组合物领域中已知的那些方法来制备。这类方法通常包括在有或无加热、冷却、应用真空等的情况下以一个或多个步骤将成分混合至相对均匀的状态。组合物优选被制备成使活性物质的稳定性(物理稳定性、化学稳定性、光稳定性)和/或递送最佳化。该最佳化可以包括适当的pH(例如小于7)、排除可与活性剂络合且因而不利地影响稳定性或递送的物质(例如排除污染的铁)、使用阻止复合物形成的手段(例如适当的分散剂或双隔室包装)、使用适当的光稳定手段(例如引入防晒剂/遮光剂、使用不透明包装)等。

L.治疗方法

在一项实施方案中，使用者选择用于治疗的色素沉着过度斑，将第一种组合物应用于色素沉着过度斑至少每天一次、更优选每天两次，应用至少约4周。在另一项实施方案中，将第一种组合物应用于所选的色素沉着过度斑达至少约8周的时间。第一种组合物可以是任意形式。在一项实施方案中，组合物是可以用滴眼管局部应用于色素沉着过度斑上的溶液形式。可以使用可将第一种组合物局部应用于色素沉着过度斑的其它施药器。例如，可以使用能可释放性地装载第一种组合物(例如溶液、乳液或本文所述的其它形式)的泡沫或或棉头施药器将组合物应用于色素沉着过度斑。在另一项实施方案中，将组合物应用于一个或多个色素沉着过度斑，更通常地同时(即，在同一治疗周期内)应用于一个或多个面部皮肤表面。

在某些情况下，治疗方法包括选择多个色素沉着过度斑用于在一个治疗周期内通过第一种组合物进行局部治疗。如本文使用的治疗周期指组合物向预期皮肤表面的单次应用。例如，在合理短的时间内(例如历经1至30分钟的时间)第一种组合物向一个或多个色素沉着过度斑的单次应用将构成单个治疗周期。相反，每天两次将第一种组合物单次应用于一个或多个色素沉着过度斑构成两个治疗周期，其中所述应用彼此相隔较长时间(例如相隔1至12小时)。

在一项实施方案中，治疗方法包括与第二种组合物组合地应用第一种组合物，所述第二种组合物在第一种组合物之前或之后应用，其中第二种组合物更通常应用于一个或多个面部皮肤表面以改善面部皮肤的整体肤色外观。第二种组合物可以应用于额、口周围、颏、眶周、鼻和颊皮肤表面的一者或多者。在一项实施方案中，在单个治疗周期中将第二种组合物同时应用于至少颊、额和颏/口周围皮肤表面。与色素沉着过度斑的局部治疗相比，应用第二种组合物的表面积更大。

虽然本文所述的一些方法关注了用施药器应用本发明的组合物，但是可以理解，施药器不是必需的，本发明的组合物也可以直接应用或使用手指(或以一些其它方式)应用。而且，虽然本发明的一项实施方案关注了将组合物局部应用于色素沉着过度斑，但是可以理解，本发明的组合物可以更通常地应用于一个或多个面部皮肤表面以减少在那些面部皮肤区域内分布的色素沉着过度斑的出现。

提供下述实施例以解释说明本发明的各项实施方案的一些特征和优点，它们不应当被看作是限制其范围。

实施例

现在参照下述实施例描述了本发明。提供这些实施例仅仅是用于解释说明的目的，本发明决不应当被看作限于这些实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任意和所有变通方式。

实施例1

源自孟加拉榕(Ficus benghalensis)新鲜叶子的 具有生物活性的树液级分的制备

图1是显示由新鲜无花果属植物叶子制备具有生物活性的树液级分的方法的一项实施方案的示意图。

收集足量的新鲜孟加拉榕叶子以得到约100kg干物质。新鲜叶子中干物质的水平测定为32.01％，这要求收集约312.4kg新鲜植物叶子以得到100kg干物质。小心地保存新鲜叶子的固有水分含量和避免由于水分损失引起的萎蔫。以避免对所收集新鲜叶子的任何损害或使之最小化的方式进行收集。所有步骤在最短的可能时间内完成，以使新鲜叶子与日光、高温和其它不利环境因素的接触最小化。

然后，在进一步加工之前，将收集的叶子以≤1kg/cm²的水压洗涤≤5分钟，以除去叶子的土粒及其它碎片。残余的水洗涤液不含有任何绿色或棕色色素，表明叶子组织完整、水压和洗涤持续时间适当。从经洗涤的叶子除去过量的水。然后，将经洗涤的新鲜无花果属植物叶子机械分离，其有效地使含有实质细胞的大部分胞内物质的不含纤维的细胞汁液与富含纤维的物质(其主要含有细胞壁)分离开。在分离过程之前或期间，没有加入任何外来溶剂或水。

将经洗涤的叶子进行研磨、浸渍和施压，得到液体细胞内物质(即细胞汁液)，将其与富含纤维的物质分离开。使用具有5HP发动机和一套筛的锤磨机(Model VS35，Vincent Corporation，Tampa，FL)来研磨叶子以在最短的时间内和不显著增加生物质温度的情况下产生具有适宜小的尺寸的叶子组织颗粒。锤磨机被设置成在≤10秒的处理期间产生≤2.0厘米的经浸渍叶子颗粒的最大尺寸。经浸渍新鲜叶子的温度升高仅≤2℃。

立即使用装配有通过压缩空气支持的锥的卧式连续螺杆压力机(Compact Press“CP-6”，Vincent Corporation，Tampa，FL)从经浸渍的新鲜叶子获得细胞汁液。锥上的压力维持在≥15g/cm²的水平，螺杆速度为12rpm。在这些条件下，细胞汁液的温度升高仅≤5℃。

该处理得到富含纤维的物质和细胞汁液。通过用具有全自动卸料元件的连续流动离心机(Model12-413V，AML Industries，Inc.，Hatboro，PA)进行净化，从细胞汁液中另外除去残余的小纤维微粒。在2升/分钟的流速下，在≤2,250g下净化细胞汁液的保留时间为≥100秒。上述方案产生了不含纤维的细胞汁液。收集含有小纤维微粒的沉淀物，与在压制新鲜叶子后产生的富含纤维的物质的其它部分合并。

上述方法允许产生160.9kg干物质含量为9.29％的细胞汁液和151.5kg干物质含量为56.14％的富含纤维的物质。将细胞汁液迅速放入密闭的15升矩形HDPE容器中，于-30℃冷冻。将固态冷冻的细胞汁液保持在该低温下供进一步利用。

细胞汁液包括三种主要的组分类型：(i)膜结合的叶绿体、线粒体、内质网、细胞核、溶酶体、过氧化物酶体、液泡、高尔基体；和(ii)非膜结合的核糖体、微管；和(iii)与上述无关的组分，如细胞质。由于在细胞汁液中存在细胞器及其片段以及不想要的色素和蛋白质，需要进行分级来产生具有功能性质(包括但不限于颜色、溶解性、透明度、稳定性和体外活性)的预期组合的个人护理成分。为了达到这些目的，采用各种处置、包括细胞汁液液化、pH调节、聚焦微波照射、离心分离和真空过滤对细胞汁液进行分级。然后，将所分离的细胞汁液树液级分用防腐剂和抗氧化剂稳定。

使细胞汁液处理的时间和强度最小化，以消除氧化应激、水解、变性、异构化、聚合化及其它不想要的过程。

通过历经≤2分钟的液化，完成了细胞汁液在15升容器中由冷冻状态向初始液体状态的转化。在该处理期间，细胞汁液温度升高仅≤20℃。该处理的时间短允许使变性过程和氧化损伤均最小化。在其冷冻和液化后细胞汁液的物理化学性质和生物化学性质与其在从新鲜叶子分离细胞汁液的期间测量的相应性质相同。这些性质包括但不限于其干物质含量、pH、导电性、氧化还原潜能、渗透压和IR光谱。

然后，利用滴定法、采用5.0N盐酸(HCl)调节接近中性的细胞汁液的pH以降低细胞汁液的pH至≥3.0(pH调节1)。通过频率为2,450MHz的聚焦微波照射迅速地处理经调节的细胞汁液。在该聚焦微波加工(FMP)期间，细胞汁液温度暂时升高至90℃，在此温度保持1分钟，然后细胞汁液温度立即降低至≤30℃。然后，采用连续流动离心机CEPA LE(Carl PadbergZentrifugenbau GmbH，德国)在15,000rpm和≥30秒的保留时间下快速分离经处理的细胞汁液。分离15.0kg经处理的细胞汁液产生了1.37kg绿色糊状沉淀物(“沉淀物I”)和13.63kg干物质含量为6.75％的浅褐色略微有乳光的液体上清液(“上清液I”)。该上清液I用于进行进一步分级。

表1显示了与在pH经调节的细胞汁液的FMP处理期间获得的最高温度(Tmax)对上清液I的干物质含量及其颜色和叶绿素a和叶绿素b(分别通过在662nm和642nm处的光吸收量度来测定)的影响有关的数据。

表1.FMP Tmax对上清液I的所选参数的影响

表1的数据显示，在Tmax＝90℃时获得的上清液I具有较高的干物质含量并且不含有任何叶绿素。虽然在Tmax＝60℃后获得的上清液I的加德纳标度值较低，但是该制备物具有显著较低的干物质含量并且含有较高残余量的叶绿素。除了在美容化妆用成分中不希望存在该色素外，叶绿素可以转化为脱镁叶绿酸，脱镁叶绿酸被认为是毒性化合物(Bergstrom，L.C.，Vucenik，I.，Hagen，I.K.，Chernomorsky S.A.，Poretz R.D.In-vitrophotocytotoxicity of lysosomotropic immunoliposomes containingpheophorbide a with human bladder carcinoma cells.-J.Photochem.Photobiol.，24，1，17-23，1994)并引起皮肤刺激(Kato T.，Yamada K.Relationship between appearance of photosensitization and totalpheophorbide level in spirulina powder.-J.Food Hyg.Soc.Japan，36，632-634，1995)。

基于上述原因，选择pH经调节的细胞汁液的FMP Tmax＝90℃作为获得随后用于进一步分级的上清液I的优选方案，目的是改善个人护理成分的功能性质、包括但不限于颜色、透明度和稳定性。应当指出：上清液I具有预期的体外活性，例如(i)酶抑制活性，包括但不限于酪氨酸酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、环加氧酶-2(COX-2)抑制活性，(ii)自由基清除活性，和(iii)抗氧化剂活性，包括但不限于氧自由基吸收能力。考虑到所有上述体外活性的关键重要性，它们不应当受到改善预期个人护理成分的功能性质所需要的进一步处理的影响。关于组合物的改善，上清液I应当另外进行处理以显著除去褐色色素及其它不想要的化合物、包括残余的蛋白质。

为了达到该目的，将上清液I进行进一步处理、包括pH调节和分离。利用滴定法、采用50％氢氧化钠(NaOH)开始第一次处理，以使细胞汁液上清液I的pH从～3.0升高至～7.5(pH调节2)。应当指出：在高于pH＝7.5时，上清液II丧失预期的弹性蛋白酶和胰蛋白酶抑制活性。pH调节2使物质颜色变深，并且呈现乳光，将其立即采用连续流动离心机CEPA LE(CarlPadberg Zentrifugenbau GmbH，德国)在15,000rpm和≥30秒的保留时间下进行净化。上述分离产生了0.53kg褐色糊状沉淀物(下文称为沉淀物II)和13.10kg干物质含量为6.59％的褐色略微有乳光的上清液(下文称为上清液II)。

然后，使上清液II进行利用5.0N盐酸(HCl)进行的滴定以降低pH值至pH～3.6(pH调节3)。该处理导致经滴定的上清液II的颜色更浅，虽然其乳光略微增加。将该物质通过孔尺寸为0.2微米的膜进行灭菌过滤处理。得到新鲜无花果属植物叶子的浅色透明的树液级分。

树液级分的色值(加德纳标度值＝7.0)比上清液I的色值(加德纳标度值＝8.5)低。应当指出：树液级分的加德纳标度色值始终低于在不同FMP Tmax条件下得到的相应上清液I的色值(表2)。

表2.用于细胞汁液处理的FMP Tmax对上清液I和树液级分的颜色(加德纳标度)的影响

由细胞汁液在其液化、pH调节(在3.0至7.0的pH范围内)、聚焦微波辐射(FMP Tmax＝90℃达1分钟)、离心分离和灭菌过滤后得到的树液级分显示出所有预期的酶抑制活性、自由基清除活性和抗氧化剂活性。

关于测定含有能够干扰比色分析的酚化合物的树液级分中的残余蛋白质含量，使用了凯氏法来可靠地检测了树液级分及其超滤液中的氮含量。使用不同的膜将树液级分分离成分子量分别为≤15、≤10和≤5千道尔顿(kD)的三种滤液。表3给出了与样品中氮含量有关的数据。

表3.超滤条件对过滤树液级分中氮含量的影响

样品	氮含量(凯氏法)％
		树液级分(对照)	0.064
树液级分的≤15kD滤液	0.063
		树液级分的≤10kD滤液	0.060
树液级分的≤5kD滤液	0.059

数据显示：在甚至通过低分子量截留膜进行超滤后，氮含量没有显著变化，这表明实际上树液级分中所有的氮都是非蛋白质的，即树液级分不含蛋白质。

通过加入抗氧化剂、稳定剂、螯合剂和防腐剂达到树液级分的进一步稳定。以下是用于稳定如本发明的实施例1中所述的树液级分的添加剂组合物：0.2％焦亚硫酸钠、0.1％山梨酸钾、0.1％苯甲酸钠、0.1％尼泊金甲酯钠。将混合物培育直至达到完全溶解(≥30分钟)。然后，向混合物中加入1.9％戊二醇。

树液级分含有约6.38％干物质，其由新鲜无花果属植物叶子计算的产率为约36％。由100kg初始新鲜无花果属植物叶子的干物质获得的树液级分的干物质的产量为约7.2kg。

表4和表5给出了树液级分的所选的特性及其体外活性。

表4.由孟加拉榕获得的树液级分的所选的特性

^＊)干物质(％)是在加入稳定剂之前针对产物而报告的

表5.基于干物质百分数计算的树液级分的所选的体外活性

活性	结果
		酪氨酸酶抑制活性(IC50，mg/ml)	0.362
弹性蛋白酶抑制活性(IC50，mg/ml)	0.067
		胰蛋白酶抑制活性(IC50，mg/ml)	0.342

环加氧酶-2抑制活性(IC50，mg/ml)	5.40
		自由基清除活性(1/X)＊	2.57
氧自由基吸收能力(1/Y)＊＊	0.98

^＊)X-完全清除1单位干重DPPH的测试物的单位干重数

^＊＊)Y-产生与1单位干重(R)-Trolox甲醚的作用相等的抗氧化剂作用的测试物的单位干重数

实施例2

由孟加拉榕(Ficus benghalensis)的细胞汁液获得的 树液级分的特性和体外活性的比较

收集不同地方的新鲜无花果属植物叶子，如实施例1中所述加工成细胞汁液。将该细胞汁液在密闭的15升矩形HDPE容器中于-30℃冷冻和贮存。使用与实施例1所述相同的方法，一次将一个或多个容器加工成树液级分。

表6和表7所列的数据显示了由在不同时期的相同冷冻细胞汁液来源的多份级分获得的以及由来自不同冷冻细胞汁液来源的级分获得的树液级分的所选的特性和体外活性的变化。

表6.由孟加拉榕的细胞汁液获得的树液级分的所选特性

^＊)干物质(％)是在加入稳定剂之前针对产物而报告的

^＊＊)在一些样品中可以根据具有不同设置的光谱分析鉴定肩峰。

表7.基于干物质百分数计算的树液级分的所选的体外活性

活性	结果
		酪氨酸酶抑制活性(IC50，mg/ml)	0.133-0.437
弹性蛋白酶抑制活性(IC50，mg/ml)	0.067-0.103
		胰蛋白酶抑制活性(IC50，mg/ml)	0.342-1.003

实施例3

干燥孟加拉榕叶子的水提取物的制备

将50g风干的孟加拉榕叶子(由在实施例1中使用的同一批叶子收集)用GM200Grindomix切碎机(Retsch，德国)研磨，得到尺寸＜300微米的颗粒。研磨包括以2,500rpm研磨20秒，接着以2,500rpm研磨10秒，然后以10,000rpm研磨10秒。采用OMNI Programmable Digital Homogenizer(OMNI International，Kennesaw，GA)、用去离子水使经研磨的叶子进行匀化。将35g经研磨的叶子与490g水混合，放入均化器平台上的冰浴中。采用20mm匀化器发生器以15,000rpm进行匀化15min。然后，在Initiator2Focused Microwave Processor(Biotage AB，Uppsala，瑞典)中使匀化物于90℃进行微波处理1分钟。接着，将微波处理的物质以3,200g离心30分钟。然后，将上清液经三层2号Whatman滤纸真空过滤，滤液用盐酸(HCl)滴定至pH4.0。将经滴定的物质以3,200g离心30分钟，然后将上清液经0.2微米除菌滤器进行真空过滤。向样品中加入稳定剂：0.2％焦亚硫酸钠、0.1％山梨酸钾、0.1％柠檬酸、0.1％苯甲酸钠。将混合物培育直至达到完全溶解(≥30分钟)。将所得的干燥叶子水提取物放入玻璃小瓶中，在室温下于暗处贮存。表8给出了干燥无花果属植物叶子的水提取物的所选的特性和体外活性。

表8.干燥孟加拉榕叶子的水提取物的所选的特性和体外活性

^＊)列出的体外活性是基于干物质百分数计算的。

^＊＊)X-完全清除1单位干重DPPH的测试物的单位干重数

^＊＊＊)Y-产生与1单位干重(R)-Trolox甲醚的作用相等的抗氧化剂作用的测试物的单位干重数

在宽范围的测试浓度内，干燥无花果属植物叶子的水提取物没有显示出弹性蛋白酶、胰蛋白酶和环加氧酶-2抑制活性。表9给出了由同一批孟加拉榕叶子获得的水提取物和树液级分的所选的特性和体外活性的比较。

表9.由同一批孟加拉榕叶子获得的水提取物和树液级分的所选的特性和体外活性^＊的比较

^＊)列出的体外活性是基于干物质百分数计算的。

^＊＊)X-完全清除1单位干重DPPH的测试物的单位干重数

^＊＊＊)Y-产生与1单位干重(R)-Trolox甲醚的作用相等的抗氧化剂作用的测试物的单位干重数

实施例4

由不同无花果属植物种类和地方获得的树液级分的特性和体外活性

除了在印度和佛罗里达(USA)收集的孟加拉榕新鲜叶子外，使用以下无花果属植物种类的新鲜叶子进行分级以获得树液级分：无花果(Ficuscarica)、印度榕(Ficus elastica)、榕树(Ficus microcarpa)和Ficus trigonata。除了在波多黎各生长的Ficus trigonata，这些无花果属植物在美国佛罗里达州生长。

通过实施例1所述的方法获得树液级分。就它们的产率、所选的物理化学性质和体外活性比较了所有这些级分(表10、表11和表12)。

表10.新鲜无花果属植物叶子的分级分离产物的比较

以上数据显示：在不同的无花果属植物种类之间，新鲜叶子的干物质含量、细胞汁液的产率和树液级分的产率以及它们的干物质含量、颜色和pH非常显著地改变。在印度和佛罗里达生长的两种孟加拉榕之间的相应差异表现得比不同无花果属植物种类之间的差异小。

与由不同无花果属植物种类获得的树液级分的所选的物理化学特性(表11)和体外活性(表12)的比较相关的另外数据支持了该结论。

表11.由不同无花果属植物种类获得的树液级分的比较

表12.由不同无花果属植物种类获得的无花果属植物树液级分的所选的体外活性^＊

^＊)列出的活性是基于干物质百分数计算的。

^＊＊)X-完全清除1单位干重DPPH的测试物的单位干重数

^＊＊＊)Y-产生与1单位干重(R)-Trolox甲醚的作用相等的抗氧化剂作用的测试物的单位干重数

实施例5

常规无花果属植物提取物与无花果属植物树液级分(孟加拉榕)的 LC/UV/MS色谱比较

在C18柱LC分离后，通过240-500nm的UV检测和通过电雾化质谱以正离子(m/z150-1150)和负离子(m/z100-1100)方式检测了无花果属植物提取物和FSF的组分。由于在四极MS上使用高扫描速率，在质谱图中仅观察到主要组分和/或具有高离子化效率的组分。通过TOF/MS对来自无花果属植物树液级分的无花果属植物提取物，结构归属以该精确质量和源内裂解(in-source fragmentation)数据为基础。

如图2所示，常规无花果属植物提取物含有更迟洗脱(更疏水)的化合物，所述化合物在FSF中未检测到。如图3所示，一组迟洗脱的化合物显示是脱镁叶绿酸，其为叶绿素降解产物。图4显示，常规提取物含有更高量的可能是黄酮醇糖苷的物质。如图5所证实的那样，FSF具有较高水平(约10x)的儿茶素和相关的缩合鞣质。然而，如图6所证实的那样，三种氯原酸异构体的水平在两种样品之间未显示出实质上不同。图7证实FSF含有较高水平的游离酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

方法：

无花果属植物树液级分样品的制备：

如实施例1所述制备FSF。将FSF样品用90∶10的水∶DMSO稀释50倍(20uL样品+100uL DMSO+880uL水)，通过LC/UV/MS按照下述条件进行分析。最终样品中的近似固体含量为～1.26mg/mL。

常规样品的制备：

称重10.64mg样品加入4ml玻璃小瓶中。将1.064mL DMSO加入到小瓶中，超声处理30分钟，不时地涡旋进行混合。将100uL该样品加入到4mL玻璃小瓶中，用900uL水稀释。最终样品中的近似固体含量为～1mg/mL。

HPLC条件：

HPLC：Waters Acquity UPLC Binary Solvent Manager S/N M05UPB601MWaters Acquity UPLC Sample Manager S/N M05UPS632MWaters Acquity UPLC PDA Detector S/N M05UPD879N

MS：Waters Micromass Quattro Premier MS S/NVAA-219

LC柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，1.7mm，2.1x100mm，部件#186002352，批#0150371861

流动相：A：含0.1％甲酸的水

B：含0.1％甲酸的乙腈

分离：梯度(参见表格)

时间(min)	流速	％A	％B	曲线
					初始	0.400mL/min	95.0	5.0
0.5	0.400mL/min	95.0	5.0	6
					6.5	0.400mL/min	70	30	6
13.5	0.400mL/min	0.0	100.0	6
					17.5	0.400mL/min	0.0	100.0	6
18.0	0.400mL/min	95.0	5.0	6
					19.0	0.400mL/min	95.0	95.0	6

进样体积：7.5uL partial loop with needle overfill

柱温＝25℃

PDA240-500nm，20点/秒，过滤器时间常数0.2秒，暴露时间＝自动，分辨率1.2nm

MS条件：

	电雾化(+)	电雾化(-)
			毛细管(kV)	3.0	3.0
锥孔(V)	30	40
			提取器(V)	2	3
RF透镜(V)	0.2	1.0
			源温	120℃	120℃
去溶剂化温度	350℃	350℃
			锥孔气流量	50L/h	50L/h
去溶剂化气流量	900L/h	800L/h
			扫描质量范围	150-1150	100-1100
扫描持续时间	0.300sec	0.300sec
			中间扫描延迟	0.025sec	0.025sec

实施例6

黑色素合成

在测定中使用了B16-F1小鼠黑素瘤细胞系。B16-F1细胞从美国典型培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection，Virginia，USA)获得。测定中所用的细胞培养介质包含500mL Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium(DMEM)、50mL胎牛血清(FBS)和5mL青霉素-链霉素液体。在该介质中培养并生长至90％以上汇合的B16-F1细胞合成黑色素。不意欲受限于任何理论，据推测，黑色素合成受到培养介质和/或由生长至高汇合所诱导的应激的刺激。DMEM和FBS可从美国典型培养物保藏中心获得，青霉素-链霉素液体可从Invitrogen Inc.California，USA获得。在该测定中使用的装置包括CO₂保育箱，例如Therma Scientific，Massachusets，USA的Forma Series Model3110；血细胞计数器，例如Hauser Scientific，Pennsylvania，USA的Bright Line型；和UV-可见光谱平板读数器，例如来自Molecular Devices，California，USA的SpectraMax250。测定步骤包括：

第0天——细胞生长：将细胞培养介质温热至37℃，取29mL放入T-150烧瓶中。向T-150烧瓶中加入约1×10⁶B16-F11代小鼠细胞，在37℃、5％CO₂、90％相对湿度下培养3天，直到～80％汇合；

第3天——引入96孔板：在第3天，将来自T-150烧瓶的细胞进行胰蛋白酶处理，采用血细胞计数器测定细胞浓度。引入96孔板，在100uL细胞培养介质中每孔2,500个细胞。将该板在37℃、5％CO₂、90％相对湿度下培养2天，直到至少20％至40％汇合；

第5天——从板中移除细胞培养介质，替换为新鲜培养介质(每孔100ul)。加入1uL稀释在[水或DSMO]溶剂中的[测试化合物]。可以测试多个稀释比例以产生剂量响应曲线，其中优选地用每个稀释比例处理三个孔。对照包括含有细胞培养介质、B16-F1细胞和溶剂的孔(对照#1)；包含细胞培养介质和溶剂的孔(对照#2)；和包含细胞培养介质、溶剂和[测试化合物]的任选的孔，当必要时作为[测试化合物]背景颜色的对照(对照#3)；

第7天——测定黑色素产生：细胞应当具有大于～90％的汇合。如果未达到，则不使用该数据点。向每孔中加入100uL0.75％氢氧化钠溶液。使用UV-Vis平板读数器在410nm读取96孔板，以光学测定用[测试化合物]处理的孔和未经处理的对照孔之间产生的黑色素的含量。其中生成黑色素的孔显示出褐色。其中几乎不生成黑色素的孔显示出澄清至浅紫色。通过下述等式计算黑色素合成抑制的百分数：

其中OD410是通过UV-Vis光谱平板读数器测定的在410nm处的光密度。

当使用对照#3时，黑色素合成抑制百分数的公式为：

通常使用上述测定，FSF处理的B16-F1细胞中的黑色素合成与对照细胞相比受到抑制，如下表13所示。

表13a-FSF B16数据

FSF浓度(w/v％)

1％

0.2％

0.04％

0.008％

0.0016％

0.000064％

抑制％

48.1％

11.4％

5.5％

5.5％

-3％

-1.6％

汇合(目测检查)

＞90％

＞90％

＞90％

＞90％

＞90％

＞90％

表13b-无花果属植物干燥叶子溶剂提取物

干燥叶子溶剂提取物	％抑制
		稀释	Ficus R
0.01	23
		0.005	8
0.0025	1
		0.00125	-8
0.000625	-3
		0.0003125	-2
0.00015625	2
		0.000078125	2

虽然考虑到诸如皮肤内黑色素产生和转移的复杂性和测试化合物的皮肤渗透能力的不同而不是必然预示就人面部色素沉着过度斑而言的体内结果，但是该测定确实证实了物质如FSF潜在地影响酪氨酸酶活性的能力。

实施例7

酪氨酸酶抑制

酪氨酸酶是黑色素生物合成中的一种重要的酶。该测定可以鉴定可干扰蘑菇酪氨酸酶将L-酪氨酸转化为L-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)的能力的物质。

试剂和供应商

酪氨酸酶：蘑菇酪氨酸酶，可从Sigma-Aldrich，Missouri，USA获得；

酶底物：L-酪氨酸，可从Sigma-Aldrich，Missouri，USA获得；

缓冲液：磷酸盐缓冲盐水(PBS)，可从Invitrogen，California，USA获得；

阳性对照：4-羟基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(熊果苷)，可从Sigma-Aldrich，Missouri，USA获得；

二甲亚砜(DSMO)，可从Sigma-Aldrich，Missouri，USA获得；

1172Microtesttm非组织培养物处理的透明平底96孔板；

潜在的酪氨酸酶抑制剂；

孔平板读数器：Spectra MAX Plus，可从Molecular Devices，California，USA获得；

数据获取和分析软件：SoftMax Pro，可从Molecular Devices，California，USA获得；

工作溶液浓度            测试中的最终浓度

酪氨酸酶：              26个单位/mL    13个单位/mL

L-酪氨酸底物：          1mM            0.5mM

熊果苷阳性对照：        20mM           200uM

测定方案：

制备试剂和阳性对照

通过将.01812g L-酪氨酸加入到100mL 1X PBS中制备1mM的酶底物工作溶液。进行超声处理直至L-酪氨酸溶解。根据需要进行涡旋。当不使用时于4℃贮存。

通过将.0544g熊果苷加入到1mL DMSO中制备0.2M熊果苷阳性对照的储备溶液。涡旋和超声处理1分钟直至熊果苷溶解。通过将100uL该溶液加入900uL DMSO中将其稀释1∶10，得到20mM熊果苷的工作溶液。于室温贮存备用。

应当在DMSO中制备潜在的酪氨酸酶抑制剂。测试化合物在测定中的最终体积为2μl，所以工作溶液通常以5-40mM(100X)制备，其在测定中产生50-400μM的最终浓度。

用冷1X PBS以1000 U/ml重构酪氨酸酶。将该储备溶液以1mL等分试样于-20℃避光保存直到需要时。通过将1ml解冻的储备溶液(1000 U/ml)加入到37.5冷1X PBS缓冲液中制备26 U/ml的酶工作溶液。这足够运行四块96孔板。避光保存在冰上直到在测定中使用。

运行测定

在每块测试板上一式三份孔中加入200uL1X PBS缓冲液作为适当的空白。

向一式三份孔中加入2uL DMSO作为赋形剂对照。

向一式三份孔中加入2uL熊果苷作为阳性对照。

向一式三份孔中加入2uL潜在的酪氨酸酶抑制剂。

除空白外，向每孔中加入98uL酪氨酸酶工作溶液。通过向上&向下抽吸两次或短暂涡旋使化合物与酶混合。

加入100uL/孔的L-酪氨酸底物。

选择在SpectraMax250平板读数器上的动态沉降，记录每1分钟在475nm处的吸收读数，记录1小时。

采用数据获取软件计算对照和测试化合物的斜率。

通过下式计算酪氨酸酶抑制的百分数：

通常使用上述测定，下表14显示了FSF抑制的酪氨酸酶活性。

表14

浓度(w/v％)	酪氨酸酶抑制
		1％	60％
0.5％	64％
		0.25％	73％
0.125％	77％

虽然考虑到诸如皮肤内黑色素产生和转移的复杂性和测试化合物的皮肤渗透能力的不同而不是必然预示就人面部色素沉着过度斑而言的体内结果，但是该测定确实证实了物质如FSF潜在地影响酪氨酸酶活性的能力。

实施例8

色素沉着过度斑减少和黑色素均匀度的体内试验

使用循环的、赋形剂对照的、半脸(split face)方案对270名受试者进行9周体内研究，包括1周标准化期。按照包括以下内容的纳入/排除标准筛选270名受试者：

纳入

·在面部双侧的颊和/或眶周区域周围具有色素沉着过度斑。

·在他们面部每侧的颊区域具有至少一个直径为8-10mm的色素沉着过度斑、4个直径为4-6mm的斑或10个直径为2-3mm的斑(日光斑、雀斑或黄褐斑)或等同的斑面积。

·愿意通过使用提供的UV乳液和物理UV阻断物如帽子来避开日光接触，以避免面部晒伤、晒黑或风灼(wind burn)。

排除

·已经诊断为患有特异反应性、湿疹、银屑病或其它慢性皮肤疾病。

·具有明显的面部皮肤疾病症状(例如5个以上丘疹、红色剥落皮肤区域、浅表细血管等)。

·面部具有显著的变色区域或瘢痕形成。

·面部具有3个以上突出的痣(＜3mm)。

对于该研究招募了270名受试者。约60名受试者在研究期间退出。每名受试者接受两种编码的测试配制物，每日两次应用于每个半边脸。在基线(0周)和在4周和8周处理之后获取面部处理部位的图像，对肤色和斑尺寸及颜色的变化进行分析。产品配制物包括赋形剂对照、载体+0.55％FSF和载体+5％维生素B3化合物(烟酰胺)。

使用非接触性的分光光度皮内分析(SiaScopy，Astron Clinica，UK)采集和分析受试者图像。该方法使用数字照相机(例如Fuji S2digital SLR)作为brand光谱仪和使用闪光灯源(例如Sigma Super闪光灯源)来回收面部发色团信息。将交叉偏振过滤器置于照相机和光源的前面以消除镜面反射。

对真黑色素(黑色素)和氧合血红蛋白的浓度和分布进行发色团作图产生了这些发色团的各自的灰度浓度图。可以使用图像分析软件如Optimas6.5来选择各发色团图中感兴趣的区域，由所述图计算平均灰度值和斑点面积分数。斑点面积分数指黑色素斑占据的总面积作为整个感兴趣区域的百分数。一种类型的发色团作图的说明可以在EP1,810,614和“TheDistribution of Melanin in Skin Determined In Vivo”，British J ournal ofDermatology，2007，第620-628页中找到。

4周后，FSF具有最佳性能，比对照和5％维生素B3组合物更好地显著(p＜＝0.10)减少色素沉着过度斑。8周后，维生素B3组合物具有最佳性能，尽管FSF组合物在减少色素沉着过度斑方面仍然显著地好于对照。表16概括了图像分析数据，其中SAF是平均斑面积分数，ΔSAF是与基线(0周)相比斑面积分数的平均变化。

表16

所用缩略语：SAF＝斑面积分数；sig＝显著(p＜0.1)；dir＝定向(0.1＜p＜0.2)，trend＝(0.2＜p＜0.3)，ns＝不显著(p＞0.3)。

对于SAF而言，FSF显著地好于赋形剂，对于黑色素均匀度而言，其定向地好于赋形剂。

分析方法

使用以下分析方法测定实施例中报告的各种物理和化学性质。

测定干物质的方法

通过将液体样品的重量与蒸发液体组分后干燥残余物的重量进行比较，测定了干物质水平(百分数)。在该过程中使用来自Ohaus Corporation(Pine Brook，新泽西)的用后可弃的铝称量皿Ohaus Explorer E00640天平和来自VWR(West Chester，Pennsylvania)的Shel Lab model1400E烘箱。将样品在设定为105℃的烘箱中干燥12小时。从含有液体样品的皮重中减去皮重，得到“湿”重。从含有干燥后相同样品的皮重中减去皮重，得到“干”重。然后，干物质水平等于“干”重除以“湿”重再乘以100％。

测定颜色的方法

采用Lovibond Comparator3000(Tintometer Limited of Salisbury，UK)装置，按照指导手册中装置的标准方法，通过将透明玻璃试管中的测试物的颜色与置入装置的两个盘中的有色玻璃标准进行比较，测定了颜色(加德纳标度，从0至18)

测定渗透压的方法

通过测定溶液冰点与纯溶剂冰点相比的降低测定了渗透压。按照指导手册中装置的标准方法，在来自Advanced Instruments，Inc.(Norwood，MA)的Advanced Model3250Single-Sample Osmometer上进行了该测定。

测定折射率的方法

按照指导手册中装置的标准方法，在连接有外界温度控制循环器的来自Reichert Analytical Instruments(Depew，NY)的Arias500折射计上测量了折射率。

测量UV光谱参数的方法

通过来自Biochrom Ltd.(英国剑桥)的Ultrospec4300pro UV/可见光分光光度计确定了UV吸收光谱中的峰、谷和拐点，所述分光光度计具有液体套层池支持架并连接有外界温度控制循环器。对于用去离子水稀释的样品，使用光程长度为1cm的石英比色杯。通过来自Biochrom Ltd的SWIFT II软件套装的Wavescan应用提供了仪器控制和数据分析。

测定弹性蛋白酶抑制活性的方法

通过针对来自Corning Incorporated(Corning，NY)的96-孔微量滴定板(Corning3641)和来自BioTek Instruments，Inc.(Winooski，VT)的Synergy2微板读数器而调整的动态比色分析测定了弹性蛋白酶抑制活性。裂解底物的酶活性由黄色的发展来指示，测定为在410nm波长处吸光度增加。N-甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-pNA底物(EPC FH237)和弹性蛋白酶(EPC SE563)从EPC(Elastin Products Company，Inc.，Owensville，MO)获得。各孔的反应体积为200微升，弹性蛋白酶的浓度等于0.87个单位/ml，底物的浓度等于363μM。该过程采用了Elastin Products Company，Inc.Research Biochemicals Catalogue(2004，92页)的第84页的题为“Assay withN-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(EPC No.FH237)as substrate”的方法。

测定环加氧酶-2抑制活性的方法

通过Cayman Chemicals COX抑制剂筛选ELISA测定试剂盒560131测定了环加氧酶-2(COX-2)抑制活性。

测定抗氧化剂活性的方法

通过ORAC测试、采用在来自BioTek的“Performing Oxygen RadicalAbsorbance Capacity(ORAC)Assays with Synergy HT Multi-DetectionMicroplate Reader”应用说明(可从www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay_Application_Note.pdf)中记载的用于与来自BioTekInstruments，Inc.(Winooski，VT)的Synergy2微板读数器一起使用的方法的调整方法测定了抗氧化剂活性。在该测定中，AAPH(2，2′-偶氮双-2-氨基丙烷)产生活性氧簇，其损害荧光探针(荧光素钠)。抗氧化剂如(R)-Trolox甲醚阻止或减缓了该损害，它们的作用可以通过荧光测量来进行定量。在如下条件下读取荧光读数：激发波长设定在485nm，发射波长设定在528nm，反应体积为200微升，AAPH浓度为55mM，荧光素钠浓度为1.33μM，(R)-Trolox甲醚浓度范围为80μM至2μM。荧光素钠(Fluka46960)、AAPH(Sigma440914)和(R)-Trolox甲醚(Fluka93509)从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得。AUC(曲线下面积)值计算为比例(孔的当前荧光读数除以孔的首次荧光读数)之和。从含有(R)-Trolox甲醚的孔和含有测试物的孔的AUC中减去含有去离子水的孔的平均AUC值，得到对应于通过抗氧化剂保留荧光的AUC。产生校正曲线，为孔的氧化剂-相关AUC的函数，显示了(R)-Trolox甲醚重量-等同的ORAC活性。然后计算测试物的ORAC活性，为达到与1单位重量(R)-Trolox甲醚产生的作用相等的抗氧化剂作用所需要的单位重量。

测定清除活性的方法

通过针对来自SUN-Sri(Rockwood，TN)的玻璃涂层的聚丙烯96-孔微量滴定板(目录号400062)和来自BioTek Instruments，Inc.(Winooski，VT)的Synergy2微板读数器而调整的动态比色分析测定了自由基清除活性，即DPPH(2，2-二苯基-1-苦基肼基游离基)自由基清除活性。吸收度在515nm波长下测定。各微板孔中的反应体积为200微升，DPPH的初始浓度等于114μM。L-抗坏血酸用作阳性对照。DPPH(Sigma D9132))和USP L-抗坏血酸(Sigma A-2218)从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)获得。计算反应的化学计量，表示为淬灭1单位重量DPPH所必需的测试物的单位重量。该方法由LWT-Food Science and Technology，第28卷，第1期，1995，第25-30页中出版的W.Brand-Williams等人的文章“Use of a free radical method toevaluate antioxidant activity”中的方法进行调整。

采用温度概况的快速稳定性实验的操作

下文提供了采用温度概况的快速稳定性实验的操作：

1.打开12个加热块并在指定温度下加热，打开冰箱并保持在指定温度下至少4小时，然后开始实验。除了将12份样品放入加热块中以外，将一份样品放置在室温下，将另一份样品冷冻，总共提供14个不同的温度。温度为5℃、室温(～23℃)、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72和75℃。加热块装配有被打磨以适合20ml小瓶的铝嵌入块；这些嵌入块适合加热块的加热套块的内侧。每个加热块应当具有独立的温度控制器和温度传感器，并提供具有0.1℃调节的反应块温度控制。

2.将14个小瓶填充至尽可能少的顶部空间。小瓶的尺寸范围可以是自动采样瓶到闪烁瓶，只要它们的尺寸全部相同。对于该实施例的目的，使用20ml小瓶。

3.给每个小瓶制备具有笔记参考和温度的标签。最好将标签制成尽可能小和窄。如果打算用颜色照片评价颜色的话，制备额外的没有显示小瓶温度的标签。

4.将各标签以不妨碍小瓶中产品视图的方式粘在相应小瓶上。这通常通过将标签轻压在盖子上、产生自上而下阅读的长的垂直飘带来进行。将标签放在盖子上与小瓶上的任何标记相对的一侧，以便当照相时可以显示出标签并具有小瓶中样品的最好视图。

5.如果评价颜色，则用数字照相机获取样品的初始照片。将样品按最低温度至最高温度从左至右排列，使得可以清楚地看到小瓶中的样品(旋转小瓶，以便小瓶上的任何标签或印刷不妨碍视图)。显露出额外的标签以便可以在图像中容易地读取。为了一致，在实验室工作台上对小瓶和照相机的位置做记号，以便以后可以重现其几何位置。推荐关闭闪光。

6.对于这些类型的样品，以如下方式取图：

a.澄清溶液：白色背景，使用闪光，不使用台灯

b.不透明样品：黑色背景，关闭闪光，使用台灯

7.如果进行化学分析，对每个小瓶取样用于初始读数。

8.将样品放入加热块和冰箱中，记录日期与时间。

9.在选择的时间点(默认使用3天、7天和14天)，从加热块和冰箱中取出样品，使其达到室温至少30分钟。

10.如果评价颜色，采用在步骤4中所做的小瓶和照相机位置的标记获取新照片。在每个时间点重复该步骤。

11.如果进行化学分析，则在该时间点对每个小瓶取样。每个时间点重复该步骤。

12.为了评价颜色，选出最好地分辨不同产品的时间点，获取照片并将它们贴在一起，标记每个产品。采用稳定性表，可以在图像上绘制描述6个月和1年室温等同时间的线。在给定时间点在表中发现对应于6个月和2年的加速温度，这决定了对哪些小瓶之间绘制线(参见例如图10)。

13.对于化学分析，在每个时间点将浓度相对于温度绘图。绘制通过这些数据的平滑线，记录达到不可接受的阈值的温度。用该温度参考稳定性表中的时间，得到等效室温。如果采用Lab色尺测定颜色并采用色差代替浓度绘图，则该技术可以用于颜色分析。

14.稳定性表推定活化能为25千卡/摩尔。大多数水解和类似反应都大约是该能量或更高。如果能量更高，则产品将更稳定，稳定性表将预测室温稳定性低于其实际的室温稳定性(一种过度保守的估计)。有时，能量低于该值。为此原因，如果进行化学分析，则推荐采用上文产生的数据并采用Arrhenium作图法计算反应能以确定推定是正确的。

15.附录：从图像获取Lab颜色：

i.将所有照片转移到CD上。采用装有颜色测量软件如Optimas的计算机和任何必需的辅助设施测定每个样品的平均Lab颜色。

ii.从最左侧的5C样品开始，从右上方移动并下拖至左下方，选择具有平均颜色的小瓶的区域。5C样品设定为标准参照(仅仅用5C样品在最初进行该操作)。

iii.记录每个温度样品的L、a、b、Std Dev和dEcmc值。记录每个图像的白点(应当为255，255，255)。

本文公开的尺寸和值不应当理解为严格地限于所述的精确数值。而是，除非另有说明，否则每个该尺寸都意欲表示所述的值和该值周围的功能性等同范围。例如，公开为“40mm”的尺寸意欲表示“约40mm”。

在发明详述中引用的所有文献在相关的部分中引入本文作为参考；任何文件的引用都不意欲被看作是认可它相对于本发明而言是现有技术。对于本申请文件中术语的任意含义或定义与引入作为参考的文件中的同一术语的任意含义或定义相冲突的情形，应当以本申请文件中赋予该术语的含义或定义为准。

虽然已经解释说明和描述了本发明的特定实施方案，但是对本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本发明的宗旨和范围的情况下进行各种其它改变和变通。因此，意欲在所附的权利要求书中覆盖在本发明范围内的所有这类改变和变通。

Claims (34)

1.来源于新鲜无花果属植物叶子汁液的组合物，其中所述组合物是无花果属植物树液级分(Ficus Serum Fraction)。

2.权利要求1的组合物，其中所述无花果属植物细胞树液级分通过包括下述步骤的方法制备：

a.从干净新鲜的未萎蔫的无花果属植物叶子中分离出无花果属植物细胞汁液，得到新鲜的无花果属植物细胞汁液，其中在所述分离之前或期间没有加入外来液体；

b.过滤所述新鲜的无花果属植物细胞汁液，得到不含纤维的细胞汁液；和

c.使所述不含纤维的细胞汁液进行分级，得到无花果属植物树液级分，其中所述分级包括：

(1)从所述不含纤维的细胞汁液中除去叶绿素，得到上清液I；

(2)从上清液I中除去色素和蛋白质，形成无花果属植物树液级分；和

(3)任选地向所述无花果属植物树液级分中加入稳定剂。

3.权利要求2的组合物，其中所述的从上清液I中除去色素和蛋白质包括：

i.调节上清液I的pH至约7.5，形成pH被调节的上清液I；

ii.将pH被调节的上清液I分离成沉淀物II和上清液II；

iii.调节上清液II的pH至约3.6，形成pH被调节的上清液II；

iv.将pH被调节的上清液II分离成沉淀物III和无花果属植物树液级分。

4.权利要求3的组合物，其中所述稳定剂选自抗氧化剂、螯合剂、防腐剂及其混合物。

5.权利要求4的组合物，其中所述稳定剂选自焦亚硫酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金甲酯钠、戊二醇及其混合物。

6.权利要求3的组合物，其中所述组合物在室温下稳定至少6个月。

7.权利要求6的组合物，其中所述组合物在室温下稳定至少12个月。

8.权利要求7的组合物，其中所述组合物在室温下稳定至少24个月。

9.权利要求3的组合物，其中所述无花果属植物叶子选自由孟加拉榕(F.benghalensis)、无花果(F.carica)、印度榕(F.elastica)、榕树(F.microcarpa)、F.trigonata及其组合组成的无花果属植物种类。

10.权利要求9的组合物，其中所述无花果属植物树液级分基本上不含脱镁叶绿酸。

11.权利要求3的组合物，其中，当通过凯氏法测定时，所述无花果属植物树液级分基本上不含蛋白质。

12.权利要求3的组合物，其中所述无花果属植物树液级分为水溶性的。

13.权利要求3的组合物，其中所述无花果属植物树液级分具有的加德纳颜色值小于8。

14.权利要求13的组合物，其中所述加德纳颜色值小于7.5。

15.权利要求1的组合物，其中所述无花果属植物树液级分具有能够减少皮肤色素沉着过度的生物活性。

16.权利要求15的组合物，其中所述生物活性足以破坏黑素生成(黑色素合成)中的一个或多个步骤。

17.权利要求16的组合物，其中所述生物活性足以抑制黑素生成酶活性。

18.权利要求17的组合物，其中所述酶活性是胰蛋白酶活性、酪氨酸酶活性或两者。

19.权利要求16的组合物，其中所述生物活性足以抑制弹性蛋白酶活性。

20.权利要求16的组合物，其中所述生物活性足以抑制COX-2活性。

21.权利要求16的组合物，其中所述生物活性足以提高抗氧化剂活性、自由基清除活性或两者。

22.制备无花果属植物细胞树液级分组合物的方法，所述方法包括：

a.从干净新鲜的未萎蔫的无花果属植物叶子中分离出无花果属植物细胞汁液，得到新鲜的无花果属植物细胞汁液，其中在所述分离之前或期间没有加入外来液体；

b.过滤所述新鲜的无花果属植物细胞汁液，得到不含纤维的细胞汁液；和

c.使所述不含纤维的细胞汁液进行分级，得到无花果属植物树液级分，其中所述分级包括：

(1)从所述不含纤维的细胞汁液中除去叶绿素，得到上清液I；

(2)从上清液I中除去色素和蛋白质，形成无花果属植物树液级分；和

(3)任选地向所述无花果属植物树液级分中加入稳定剂。

23.权利要求22的方法，其中所述的从上清液I中除去色素和蛋白质包括：

i.调节上清液I的pH至约7.5，形成pH被调节的上清液I；

ii.将pH被调节的上清液I分离成沉淀物II和上清液II；

iii.调节上清液II的pH至约3.6，形成pH被调节的上清液II；

iv.将pH被调节的上清液II分离成沉淀物III和无花果属植物树液级分。

24.权利要求23的方法，其中所述稳定剂选自抗氧化剂、螯合剂、防腐剂及其混合物。

25.权利要求24的方法，其中所述稳定剂选自焦亚硫酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金甲酯钠、戊二醇及其混合物。

26.权利要求25的方法，其中所述组合物在室温下稳定至少6个月。

27.权利要求26的方法，其中所述组合物在室温下稳定至少12个月。

28.权利要求27的方法，其中所述组合物在室温下稳定至少24个月。

29.权利要求22的方法，其中所述无花果属植物叶子选自由孟加拉榕(F.benghalensis)、无花果(F.carica)、印度榕(F.elastica)、榕树(F.microcarpa)、F.trigonata及其组合组成的无花果属植物种类。

30.权利要求22的方法，其中所述组合物基本上不含脱镁叶绿酸。

31.权利要求22的方法，其中，当通过凯氏法测定时，所述组合物基本上不含蛋白质。

32.权利要求22的方法，其中所述组合物为水溶性的。

33.权利要求22的方法，其中所述组合物具有的加德纳颜色值小于8。

34.权利要求22的方法，其中所述组合物具有的加德纳颜色值小于7.5。

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