KR101882881B1

KR101882881B1 - 피커스 세럼 분획을 포함하는 생활성 조성물 및 피부의 과색소 침착 외양을 완화하는 방법

Info

Publication number: KR101882881B1
Application number: KR1020137009061A
Authority: KR
Inventors: 마이클 코가노브
Original assignee: 아이에스피 인베스트먼츠 엘엘씨
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2018-07-27
Also published as: BR112013005640A2; WO2012034060A3; JP5938803B2; EP2613764B1; KR20130110164A; NZ607796A; WO2012034060A2; MX345409B; EP2613764A2; CA2810428A1; CL2013000634A1; ES2645983T3; JP2013539748A; CN103200929B; AU2011299087A1; CN103200929A; JP2016121148A; AU2016265959A1; US20130243710A1; MY164969A

Abstract

본 발명은 피커스 생잎의 피커스 세포즙으로부터 유래된 피커스 세럼 분획을 포함하는 생활성 조성물과 상기 피커스 세럼 분획의 제조 방법을 제공한다. 상기 조성물은 피부의 과색소 침착을 완화할 수 있는 생물학적 활성을 가진다.

Description

피커스 세럼 분획을 포함하는 생활성 조성물 및 피부의 과색소 침착 외양을 완화하는 방법 {BIOACTIVE COMPOSITIONS COMPRISING FICUS SERUM FRACTION AND METHODS TO REDUCE THE APPEARANCE OF SKIN HYPERPIGMENTATION}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2010년 9월 10일자 미국 가출원번호 제 61/381,442에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 화장료 조성물을 피부에 국소 적용하는 피부 미백(skin lightening) 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 피커스 세럼 분획을 포함하는 피부의 국소 미백 조성물에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 멜라닌생성 과정 중 한 단계 이상을 교란하기 위해 과색소 침착된 부위에 화장료 조성물을 국소 적용함으로써 피부의 과색소 침착 외양을 완화하는 방법에 관한 것이다.

인간의 피부는 기본적인 3개의 층, 즉 표피, 진피 및 피하 지방층으로 이루어져 있다. 표피는 4개의 층, 즉, (위에서 밑으로) 각질층, 과립층(granular layer), 유극층(spiny layer) 및 기저층으로 구성되어 있다. 각질층과 과립층 사이에는 별개의 제5층, 즉 투명층이 존재할 수도 있다. 기저층은 점차적으로 위로 이동하여 표피의 또 다른 층을 형성하는 세포가 된다. 이들 세포가 위로 이동하면서, 중심 핵을 소실하게 되고, 피부 단백질 (케라틴)과 지방 (지질)을 생성하기 시작한다. 이들 세포가 표피의 상층에 존재할 때, 케라티노사이트로 지칭된다. 멜라노사이트는 표피의 기저층에 위치하는 또다른 세포 유형이다. 멜라노사이트는 피부 색소 침착의 주요 원인인 멜라닌을 생성하는 역할을 담당한다.

멜라닌은 기저 수준에서 티로시나제 효소와 기질로서 L-티로신이 참여하는 멜라노사이트에서의 복잡한 일련의 반응을 통해 생성된다. 티로시나제는 L-티로신을 DOPA (L-3,4-디하이드록시페닐알라닌)로, DOPA를 도파퀴논으로 변환하는 과정을 촉매한다. 도파퀴논은 다시 변환을 거쳐 멜라닌이 된다. 멜라닌은 멜라노솜으로 알려져 있는 세포 기관에 축적되고, 이 멜라노솜은 수상 돌기(dendrite)라고 하는 멜라노사이트의 가는 필라멘트를 따라 케라티노사이트로 이동하게 된다. 멜라노솜에서 발현되는 유전자 산물은 대략 1500개인데, 이중 600개는 임의의 소정의 시기에 발현되고, 100개는 멜라노솜에 고유한 것으로 생각된다. 아울러, 시그널링, 멜라노사이트내에서의 멜라노솜의 이동, 및 멜라노솜의 케라티노사이트로의 이동에도 다수의 조절인자들이 관여한다.

멜라닌 생성은 다양한 외적 및 내적 현상들로 인해 촉발될 수 있다. 예를 들어, 멜라노사이트는 피부가 UV 방사선에 노출되었을 때 추가적으로 멜라닌을 생산하게 된다. 그 후, 멜라닌은 멜라노솜을 통해 케라티노사이트로 이동하여, 피부를 "태닝된" 상태로 만든다. 일단 UV 광이 차단되면, 멜라노사이트에서의 멜라닌 생성 수준은 정상으로 회복된다. 염증(inflammation)은 IL-1, 엔도텔린-1 및/또는 줄기 세포 인자 등의 매개체에 의한 멜라노사이트의 직접 자극을 통해 과색소 침착을 개시시킬 수 있다. 손상된 피부에서 생성되거나 또는 염증 세포에서 부산물로서 방출되는 슈퍼옥사이드 및 산화 질소와 같은 반응성 산소 종들도 멜라노사이트에 대한 자극인자가 될 수 있다.

장기간 UV 노출 및 기타 선천적인 및 외인적인 노화 인자들도 케라티노사이트 및/또는 멜라노사이트에서 영구적으로 유전자 발현을 변화시킴으로써, 노화성 과색소 침착을 발생시킬 수 있다. 일부 멜라닌생성 관련 유전자들 (예, 티로시나제, TYRP1)의 mRNA 수준이 광선 흑점(actinic lentigos) (노화 반점)을 증가시키는 것으로 보고되었다. 또한, 과색소 침착에 있어 표피의 엔도텔린 케스케이드와 줄기 세포 인자의 역할이 중요할 수도 있다. 이러한 변화는, UV 노출과 같은 손상으로부터 차단되었을 때에도 계속적으로 이루어지는 멜라닌 과다 생산과 이로 인한 과색소 침착 반점의 형성을 야기할 수 있다. 장기간의 UV 노출과 기타 선천적인 및 외인적인 노화 인자들은, 과색소 침착된 반점 이외에도, 피부 톤에 보다 미세한 변화를 야기할 수 있다. 이러한 변화들은 흔히 고르지 않은 피부 톤이나 얼룩덜룩한 외모로 묘사된다. 한가지 이상의 연구들에서, 노화 반점이 때로는 사람의 인지 연령을 10 내지 12년 높일 수 있으며, 멜라닌 분포가 피부 톤으로 나이를 인지할 수 있게 하는 요인이라는 것이 제시되었다. 따라서, 노화 반점과 같이 과색소 침착된 피부의 외양을 개선시킬 수 있는 조성물 및 처치 방법이 요망되고 있다.

최근 들어, 소비자들의 "천연" 화장품에 대한 수요가 증가하고 있다. 그 결과, 화장품 제조사들은 보다 식물-기반의 물질들을 화장용 제형에 투입하게 되었다. 수백년간, 심지어 수천년간 다양한 식물들이 잘 알려져 있는 그들의 다양한 기능들로 인해 이용되어 왔지만, 최근까지는 소문으로만 떠도는 효능을 임상적으로 검증하거나 식물의 생활성을 기반으로 과학에 입각하여 새로운 잠재적인 용도를 개발하는 것이 불가능하였다. 최근 과학의 발달로 인해, 연구자들은 최근까지 민간에서만 통용되고 있던 식물들에 대해 효능 및/또는 잠재적인 새로운 용도를 더 잘 분석할 수 있게 되었다. 과학이 등장한지 얼마되지 않았고, 화장료의 생활성 성분으로서 활용될 수 있는 식물의 수가 엄청나게 많아, 대다수의 식물들은 아직까지 충분히 평가받지 못하고 있다.

식물성 성분(botanical component)을 식물에서 추출하는데 사용되는 다수 방법들은, 식물 조직 조성 및/또는 조직에 함유된 관심의 대상인 생활성 성분에 유해한 기법을 사용한다. 그 결과, 전통적인 추출 방법들은 대개 식물 세포에 내재된 전체 활성 스펙트럼을 보여주지 못하며, 따라서 식물성 화장료 제형의 충분한 잠재성을 구현하지 못하고 있다. 또한, 다수의 전통적인 추출 방법들은 유해한 화학 용매를 사용하는데, 이들 용매는 "천연적이지" 않으며, 소비자가 자신의 피부에 적용되지 않길 바라는 물질들이다. 아울러, 이들 용매-기반의 공정들은 독성 폐기물로서 적절하게 취급 및 폐기되지 않는다면 환경에 유해할 수 있는 독성의 화학 폐기물들을 배출한다.

그러나, 재료가 오직 "천연적"이라는 이유가, 재료에 바람직하지 못한 성분들이 함유되어 있지 않아 피부에 사용하기에 적합하다는 것을 보증하는 것은 아니다. 예를 들어, 다수의 식물들은 페오포르비드(pheophorbide)와 같은 광감작제(photosensitizer) 및/또는 단백질 등의 접촉 알레르기원들을 함유하고 있다. 페오포르비드 및/또는 단백질은, 대부분의 일반 식물들에서 천연적으로 발견되는 수준에서는, 대부분의 사람들에게 문제가 되지 않는다. 그러나, 식물 재료를 추출 등의 과정을 통해 고도로 농축된 형태로 농축하였을 때에는, 이들 재료들이 홍반 등의 피부 자극과 알레르기성 반응을 야기하는 수준으로 존재될 수 있다. 심지어 이들 재료들이 천연적인 수준으로 존재하는 경우에도, 좋지 않은 피부 반응을 경험하는 매우 민감한 사람들도 많이 있는 실정이다.

나아가, 천연 제품에 대한 수요가 증대됨에 따라, 지구의 천연 자원에 대한 보호 측면에서도 우려가 되고 있다. 소비자가 원하는 많은 "천연" 성분들은, 소비자 제품에 사용하고자 수확하였을 때 고갈되거나 및/또는 파괴되는 생물자원으로부터 유래된다. 따라서, 소비자의 천연적인, 보다 지구 친화적인 제품에 대한 요구는 아이러니하게도 이들이 보존하고자 하는 생물자원의 파괴로 이어질 수 있다.

이에, 바람직한 생활성 스펙트럼을 유지하며, 피부의 국소 적용에 적합하며, 해로운 화학 용매를 이용하여 제조되지 않은, 천연 생활성의 식물성 조성물이 요구되고 있다. 아울러, 피부의 과색소 침착 부위를 줄이는데 유효한 상기한 생활성 성분을 포함하는 화장료 조성물이 요구되고 있다. 또한, 생태학적으로 건전하고 지속가능한 방식으로 수확 및 가공할 수 있는, 상기한 생활성 물질들이 요구되고 있다.

본 발명의 이러한 과제와 기타 과제들은 아래 설명을 통해 명확하게 기술될 것이다.

본 발명은 피커스 생잎 세포즙으로부터 유래된 피커스 세럼 분획을 제공한다. 또한, 본 발명은 피커스 세럼 분획을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 피커스 세럼 분획은 바람직한 피부 미백 성과를 달성하는데 유효한 양으로 상기 조성물에 존재한다.

또한, 본 발명은 과색소 침착된 부위에 화장료 조성물을 국소 적용하여 멜라닌생성 과정 중 한 단계 이상을 교란함으로써 피부의 과색소 침착 현상을 완화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조로 후술하는 상세한 설명을 통해 더 잘 이해될 것이다. 참조된 도면들이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
도 1은 피커스 생잎으로부터 생활성 세럼 분획을 제조하는 공정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 전통적인 피커스 추출물의 LC/UV 크로마토그램을 피커스 세럼 분획의 크로마토그램과 겹친 것으로, 전통적인 추출물에는, 피커스 세럼 분획에서는 검출되지 않는 (소수성이 보다 높은) 후기-용출 화합물이 높은 수준으로 함유되어 있음을 보여준다.
도 3은 전통적인 피커스 추출물의 후기-용출 화합물의 LC/UV 크로마토그램과 이들 각각의 이온 크로마토그램으로서, 이들은 엽록소 분해 산물인 색소 화합물, 즉 페오포르비드로 동정되었다.
도 4는 전통적인 피커스 추출물의 LC/UV 크로마토그램을 피커스 세럼 분획의 크로마토그램과 겹친 것으로, 전통적인 추출물에는 플라보놀 글리코시드가 더 높은 수준으로 함유되어 있음을 보여준다.
도 5는 전통적인 피커스 추출물의 LC/UV 크로마토그램 및 대응된 추출된 이온 크로마토그램에 각각 피커스 세럼 분획의 대응 크로마토그램들을 겹친 것으로서, 피커스 세럼 분획에는 카테킨 및 관련된 축합 탄닌이 전통적인 피커스 추출물에 비해 약 10배 (10x) 많이 함유되어 있음을 보여준다.
도 6은 전통적인 피커스 추출물의 LC/UV 크로마토그램 및 대응된 추출된 이온 크로마토그램에 각각 피커스 세럼 분획의 대응 크로마토그램들을 겹친 것으로서, 3종의 카페오일퀴닉산 이성질체의 농도가 2개의 다른 샘플들 간에 실질적으로 상이하지 않음을 보여준다.
도 7은 전통적인 피커스 추출물의 LC/MS 크로마토그램의 일부를 피커스 세럼 분획의 크로마토그램과 겹친 것으로, 유리 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판의 농도가 피커스 세럼 분획에서 더 높음을 보여준다.
도 8은 가속 노화 실험 (accelerated aging study)의 2색 사진으로서, 여러가지 농도의 피커스 세럼 분획과 여러가지 보존제가 포함된 2종의 화장료 조성물에서의, 건잎의 피커스 추출물 대 FSF의 색 안정성을 보여준다.
도 9는 도 8의 가속 노화 실험에 대한 캘리브레이션 그래프이다.
도 10은 0.55% FSF와 다양한 농도의 보존제가 포함된 비히클을 비교한 가속 노화 실험의 컬러 사진이다.

본원에 사용되는 모든 퍼센트와 비율들은 총 조성물에 대한 중량이며, 모든 측정은 다른 언급이 없는 한 25℃에서 이루어진다.

본 발명의 조성물은, 필수 성분과 본원에 기술된 선택 성분으로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 본원에서, "필수적으로 구성된"은 조성물 또는 구성 성분이 부가적인 성분들을 포함할 수 있지만, 부가적인 성분들이 청구한 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특징들을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 의미한다.

조성물에 대해 사용되는 용어 "적용한다" 또는 "적용"은 본 발명의 조성물을 표피와 같은 인간 피부 표면 위에 도포 또는 바르는 것을 의미한다.

본원에서, 용어 "피부학적으로 허용가능한"은 기술된 조성물 또는 구성 성분이 과도한 독성, 혼용불능성, 불안정성, 알레르기 반응 등 없이 인간 피부 조직에 접촉시키는 방식으로 사용하는데 적합하다는 의미이다.

본원에서, 용어 "안전하고 유효한 양"은 긍정적인 효과를 유의적으로 유도하는데 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 의미한다.

본원에서, 용어 "염증 후 과색소 침착"은 일시적인 염증 현상에 대한 반응으로서 갑작스러운 내지 만성적인 색소 침착 증가를 지칭한다. 염증 후 과색소 침착은 특히 피부색이 어두운 개체가 일반적이나, 이로 한정되지 않는다. 염증 후 과색소 침착은 전형적으로 일시적인 염증 현상이 소실되면 진정된다. 일시적인 염증 현상의 예로는 여드름 병변, 안쪽으로 자라는 체모, 생채기, 벌레 물림, 계면활성제 상해 및 단기 UV 노출을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

본원에서, 용어 "과색소 침착된 반점"은 색소 침착이 멜라닌의 국소 만성적인 또는 전신 과다 생산으로 인해 인접 피부의 색소 침착 보다 더 많이 이루어진 한정된 피부 영역을 지칭한다. 과색소 침착된 반점은 전형적으로 직경이 약 2 mm 내지 약 10 mm이나, 이 보다 더 작거나 큰 반점도 가능하다. 과색소 침착된 반점은 하나 이상의 노화 반점, 선 스팟, 일광 흑색점, 멜라닌저하 병변 (hypo-melanotic lesion), 주근깨 및 흑반을 포함할 수 있다.

본원에서, 용어 "노화 반점"은 선천적인 또는 외인적인 노화 인자에 의해 야기되는 국소적이고 만성적인 멜라닌 과다 생산으로 인해 색소 침착이 이루어진 과색소 침착된 반점을 지칭한다.

본원에서, 용어 "피부 톤 개선제(skin tone agent)"는 멜라닌 생성 신호, 멜라닌 합성, 멜라노사이트와 케라티노사이트 간의 체계적인 이동, 및/또는 멜라닌 분해를 조절하는 제제를 지칭한다. 피부 톤 개선제는 미백 또는 색소 침착 저하용 화장료 제제로서 작용함으로써 불균일한 피부 톤 외양을 개선시킬 수 있다.

본원에서, 용어 "피부 톤"은 일시적이라기 보다는 조직적인 멜라닌 합성에 의해 유발되는 피부에서의 전체적인 멜라닌 외양을 지칭한다. 피부 톤은 전형적으로 넓은 피부 면적에서 특정된다. 면적은 이상적으로는 100 mm² 이하일 수 있지만, 이 보다 넓은 면적, 예컨대 얼굴 피부 전체 또는 얼굴 피부 표면의 임의 영역일 수도 있다. 피부 톤은 이미지 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 전체 밝기(lightness)는 L*a*b* 색 공간에서 L* 좌표로 측정할 수 있다 (국제 조명 위원회). 멜라닌 맵핑 및 멜라닌 농도 등의 발색단 맵핑도 전체 피투 톤의 지표로서 사용할 수 있다. 멜라닌 평균은 발색단 맵 데이타로부터 계산할 수 있다. 부가적으로, 피부 톤 균일성은 발색단 맵 데이타로부터 계산할 수 있는 멜라닌 균일성으로 측정할 수 있다. 적합한 발색단 맵핑 기법들은 아래 실시예에서 논의된다.

본원에서, 용어 "얼굴 피부 표면"은 이마, 눈 주변, 볼, 입 주변, 턱 및 코 피부 표면 중 하나 이상을 지칭한다.

본원에서, 용어 "전통적인 추출물"은 식물 재료로부터 화합물의 용매 추출에 의해 제조되는 추출물을 지칭하며, 식물 재료는 탈수된 (예, 건조) 및/또는 비탈수된 (예, 프레쉬 또는 일부만 탈수된) 식물 재료일 수 있다.

I. 조성물

본 발명은 다양한 조성물, 보다 상세하게는 피부 표면에 적용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 조성물은, 비제한적인 예로서, 용액, 현탁액, 로션, 크림, 겔, 토너, 스틱, 펜슬, 스프레이, 에어로졸, 연고, 클렌징 액체 세정제 및 고형 바, 샴푸 및 헤어 컨디셔너, 페이스트, 폼, 파우더, 무스, 면도 크림, 와이프, 패치, 프트립, 패치, 전기 동력식 패치(electrically-powered patch), 상처 드레싱 및 접착 붕대, 하이드로겔, 막-형성 제품, (불용성 시트가 구비 또는 비구비된) 얼굴 및 피부 마스크, 메이크업 제품, 예컨대 파운데이션, 아이라이너 및 아이 새도우 등을 비롯하여, 매우 다양한 제품 형태를 취할 수 있다. 조성물 형태는 조성물에 존재하는 경우 선택된 특정 피부학적으로 허용가능한 담체를 수반할 수 있다.

본 발명의 조성물은 멜라닌 관련 피부 과색소 침착 외양을 완화시키는데 유용하다. 본원에서, "가시적인 피부 과색소 침착 외양의 완화"는 피부 미백을 포함한다. 피부 미백은, 과색소 침착된 피부 영역을 비롯하여, 피부내 (치료학적) 존재하는 멜라닌의 감소, 최소화 및/또는 제거, 및/또는 피부내 (예방학적) 멜라닌 생성의 지연, 최소화 및/또는 예방을 포함한다. 본원에서 "과색소 침착된 영역"은 멜라닌 함유량이 높은 국소 부위를 의미하며, 반점, 갈색 기미(liver spot), 얼룩덜룩함(blotchiness), 얼룩(mottling), 흑반(흑피증), 간반(기미), 기미, 염증 후 과색소 침착 또는 광-유발성 색소 침착된 흉터(sun-induced pigmented blemish)를 포함한다.

A. 피커스 세럼 분획

fig 속의 피커스는 많은 종들로 구성되어 있으며, 전세계적으로 발견되고 있다. 피커스 속은 피커스 종들, 즉, 가시 덮인 배모양의 선인장 오푼티아 피커스-인디카(Opuntia ficus-indica) (L.) Mill, 선인장과(Cactaceae) (Barbera et al., Past and Present Role of the Indian-fig Prickly-Pear (Opuntia ficus-indica (L.) Miller, Cactaceae) in the Agriculture of Sicily. Economic Botany 46(1):10-20. 1992)와는 혼동하지 않아야 한다. fig 속에 속하는 주목할만한 종으로는, 피커스 카리카(Ficus carica) (일반명 fig), 피커스 렐리지오사(Ficus religiosa) (부다가 진리를 깨우칠 때 거처한 인도 보리수나무), 피커스 엘라스티카(Ficus elastica) Roxb. exHorneum. (고무나무), 피커스 벵갈렌시스 (Ficus behghalensis) (반얀나무) 및 피커스 라세모사(Ficus racemosa) (이명: 글로메라타(glomerata), 자이언트 클로스터 트리(the giant cluster tree))를 포함한다.

일반적인 열매 범주에서, fig는 특징적인 "인사이드-아웃" 구조를 가진 무화과(syconia)의 다화과(multiple fruit)의 일예이다. 이들은 소공(ostiole)이라고 하는 선단부에 소형 개구부를 각각 구비한 다육질의 속 빈 형태(hollow receptacle)인 소핵과 집합을 구성한다. 작은 꽃이 내측벽 상에 밀집되어 있으며, 외부에서는 보이지 않는다.

가장 오래된 인간 식품으로 알려져 있는 것 중 하나로서, 피커스 spp. (figs)는 장기 안전성 프로파일을 나타낸다. 역사적으로 다양한 목적으로 fig의 생과(fresh fruit) 또는 건과(dry fruit), 나무 껍질, 잎, 잔가지, 라텍스 및 어린 가지들이 이용되어 왔다. 이들 역사적인 일부 용도로는 상처, 궤양, 암 증식, 종양, 농양, 통풍, 만성 기침, 폐 질환, 만성적인 설사, 변비, 류마티스, 임질, 치질, 당뇨병, 구토, 습진, 나병 및 사마귀에 대한 치료를 포함한다.

본 발명의 피커스 세럼 분획 (이하, "FSF"로 칭함)은 피커스 생잎의 세포즙으로부터 유래된다. 생잎을 기계적으로 분리시킨 세포즙은 pH 조정, 집중식 마이크로웨이브 조사(focused microwave radiation), 원심분리에 의한 분리 및 제균 여과를 이용하여 분별하여, 페오포르비드와 단백질이 함유되지 않은 피커스 세럼 분획을 수득한다. 제조되는 피커스 혈청 분획은 피커스 잎 세포 세포질(Ficus leaf cell cytoplasm)로 필수적으로 구성된다. 특정 구현예에서, 피커스 세포즙은 피커스 벵갈렌시스(F. benghalensis), 피커스 카리카(F. carica), 피커스 엘라스티카(F. elastica), 피커스 마이크로카르파(F. microcarpa), 피커스 트리고나타(F. trigonata) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 피커스 속에 속하는 종들(Ficus species)로부터 유래된다.

본 발명의 조성물은 피커 세럼 분획을 안전하고 유효한 양으로 포함한다. 조성물은, FSF를, 조성물에 대해, 0.01 중량% 내지 50 중량%로, 일 구현예에서, 0.05 중량% 내지 20 중량%로, 다른 구현예에서, 0.2 중량% 내지 10 중량%의 양으로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조성물은, 총 조성물에 대해, 1 중량% 내지 5 중량%로, 또 다른 구현예에서, 1 중량% 내지 3 중량%로 FSF를 포함한다.

본 발명의 연구자들은, 피커스 세럼 분획을 피부에 국소 적용하였을 때, 포유류의 피부에서 과색소 침착된 부위가 미백되는 등의, 전통적인 피커스 추출물에 비해, 우수한 피부 미백 효과를 달성한다는 것을 알게 되었다. 본 발명을 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 멜라노사이트에서 (예를 들어, UV 또는 광 노출시 발생할 수 있는) 멜라닌 생성 경로를 개시시키는, 멜라노사이트의 반응성 산소/산소 라디칼 자극 (산화 스트레스)을 방지하는 것을 비롯하여, 멜라닌 생성 (멜라논합성)에 관여하는 과정들을 저해함으로써, 작동하는 것으로 생각된다.

피커스 세럼 분획의 제조

용매 추출에 의한 방법과 같이, 식물 재료로부터 화합물을 분리하기 위해 사용하는 방법이, 분리될 화합물을 결정한다. "같은 종류끼리 용해된다(like dissolves like)"라는 일반적인 원칙에 부합하여, 추출 용매의 선택은 대체적으로 임의의 특정 추출 기법으로 수득할 화합물의 유형과 수를 결정짓는다. 예를 들어, 극성 화합물은 극성 용매에 의해 추출되며, 무극성 화합물은 무극성 용매에 의해 추출된다. 이로써 존재할 수 있는 화합물 전체 스펙트럼에서 일부 범주의 화합물만 분리된다. 아래 표 1x는 다양한 극성도 범위에서 일반적인 용매에 의해 전형적으로 추출되는 화합물의 유형들을 요약 개시한다.

표 1x

전통적인 용매 추출

본 발명의 피커스 세럼 분획은 용매 추출물에 의해 제조하기 보다는, 식물 잎에서 확인되는 생잎 세포즙을 식물의 다른 부분들로부터 분리함으로써 제조한다. 이러한 세포즙은, 추출 공정을 거치지 않기 때문에, 피커스 생잎에서 확인되는 전체 스펙트럼의 화합물들을 포함한다. 반면에, 추출물은 특정 용매로 분리할 수 있는 일부 범주의 화합물들만 포함한다. 이에, 제조되는 피커스 세럼 분획은 추출물에 비해 잠재적인 활성 화합물의 범주가 훨씬 더 넓다.

아울러, 다수의 추출물은 생잎이 아니라 탈수로 인해 분해 과정을 거친 식물 건조물로부터 제조한다. 탈수 공정 중에 세포벽이 손상되어, 가수분해, 산화, 중합, 마이야르 반응(Maillard reaction) 및 이성체화 등의 기전을 통해 화합물의 분해가 야기된다. 건조된 잎에서 추출하는 경우, 제조되는 추출물에는 신선한 식물체에 본래 존재하지 않는 이들 분해 산물들이 포함되게 되고; 아울러, 추출물에는 특정 용매에 의해 분리할 수 있는 범주의 화합물만 포함된다. 따라서, 제조되는 건조 잎의 추출물의 조성은 피커스 세럼 분획의 조성과 상당히 다르다.

피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법은, (a) 깨끗하고, 신선하며, 시들지 않은 피커스 잎으로부터 피커스 세포즙을 분리하여, 분리 전 또는 분리 중에 외부 액체의 첨가없이, 피커스 세포 생즙을 수득하는 단계; (b) 상기 피커스 세포 생즙을 여과하여, 섬유질-무함유 세포즙을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 섬유질-무함유 세포즙을 분별하여, 피커스 세럼 분획을 수득하는 단계를 포함한다. 분별 단계는, (1) 상기 섬유질-무함유 세포즙에서 엽록소를 제거하여, 상층물 I을 수득하는 단계; (2) 상층물 I에서 색소 및 단백질을 제거하여, 피커스 세럼 분획을 수득하는 단계; 및 (3) 선택적으로, 상기 피커스 세럼 분획에 안정화제를 첨가하는 단계를 포함한다.

일부 구현예들에서, 안정화제는 항산화제, 킬레이트제, 보존제 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 안정화제는 소듐 메타바이설파이트, 포타슘 소르베이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 메틸 파라벤, 펜틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 섬유질-무함유 세포즙에서 엽록소를 제거하는 단계는, (i) 상기 섬유질-무함유 세포즙의 pH를 약 3으로 조정하여, pH-조정된 섬유질-무함유 세포즙을 수득하는 단계; (ii) 상기 pH-조정된 섬유질-무함유 세포즙을 약 1분간 약 90℃로 가열하는 단계; (iii) 상기 pH-조정된 섬유질-무함유 세포즙을 약 30℃로 냉각시키는 단계; 및 (iv) 상기 pH-조정된 섬유질-무함유 세포즙을 침전물 I 및 상층물 I으로 분리하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, 상층물 I에서 색소 및 단백질을 제거하는 단계는, (i) 상층물 I의 pH를 7.5로 조정하여, pH-조정된 상층물 I을 수득하는 단계; (ii) 상기 pH-조정된 상층물 I을 침전물 II 및 상층물 II로 분리하는 단계; (iii) 상층물 II의 pH를 3.6으로 조정하여, pH-조정된 상층물 II를 수득하는 단계; 및 (iv) 상기 pH-조정된 상층물 II를 침전물 III 및 피커스 세럼 분획으로 분리하는 단계를 포함한다.

피커스 생잎을 사용하여, 피커스 세럼 분획을 제조한다. 본원의 제조 방법은 피커스 잎에 선천적으로 존재하는 생활성 성분들을 그대로 유지시켜, 활성이 우수한 피커스 세럼 분획을 제조한다. 수분 감소 및 생물학적 분해 등의 환경적인 요인을 최소화하기 위해, 수확 및 이동시에 잎을 그대로 보존하는데 주의를 기울인다. 모든 단계들은 광, 고온 및 기타 부정적인 환경 인자에 생잎이 노출되는 것을 최소화하기 위해 가능한 단기간내에 완료한다.

특정 구현예에서, 피커스 잎은 피커스 벵갈렌시스(F. benghalensis), 피커스 카리카(F. carica), 피커스 엘라스티카(F. elastica), 피커스 마이크로카르파(F. microcarpa), 피커스 트리고나타(F. trigonata) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 피커스 종으로부터 선택된다.

수동 또는 기계적 절단에 의해서와 같은 수확는 다지기(chopping), 찧기(mashing), 분쇄(crushing) 또는 기타 유형의 잎 손상을 금지하거나 최소화하는 방식으로 이루어진다. 수확 및 이동은 수분 소실로 인한 시듦을 방지하는 방식으로 수행되어야 한다. 일 구현예에서, 피커스 생잎을 사용하여, 본래의 수분 함량의 90% 이상, 다른 구현예로 95% 이상, 또 다른 구현예로 수확 시기에 존재하는 본래 수준의 98% 이상으로 함유하는, 피커스 세럼 분획을 제조한다.

피커스 식물은 잎의 최대 30%가 식물의 생존성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 한번에 수확할 수 있어, 동일 식물에서 여러번 향후 수확하기 위한 잎을 재생장시킬 수 있다. 따라서, 피커스 식물은, 전체 자연 수명 기간 동안, 계속적으로 자라 주변 생태계의 일부를 구성할 수 있으며, 동시에 생활성 화장료 조성물을 제조하기 위한 잎을 반복적으로 수확할 수 있다. 이러한 수확 방법은 천연 자원의 지속가능성을 촉진하므로, 바람직한 방법이다.

바람직한 것은 아니지만, 지속가능성이 낮은 수집 방법, 예를 들어, 식물의 대부분을 제거하고 재생을 위한 생존 부위를 남기지 않는 대규모 기계적 수확을 이용한 방법도 사용할 수도 있다. 그러나, 보다 과감한 수확 방법을 이용하더라도, 수집한 잎에서의 미생물 증식, 수분 감소, 산화 강화, 중합, 이성체화 및 가수분해 공정 (즉, 원치않은 이화 과정)을 일으킬 수 있는 피커스 잎의 상패를 최소화하는데 주의를 기울여야 한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 피커스 식물은 전체 식물을 수동으로 절단 및 채집한다. 다른 구현예에서, 식물의 잎은 수확 장치를 이용하여 자른다.

절단한 식물 재료를 처리 시설로 이동하는 운반 시간과 잎이 광, 고온 및 기타 부정적인 환경 인자에 노출되는 것은, 전술한 바와 같은 원치않은 분해 과정이 작동되지 않도록 최소화하여야 한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 식물을 추가적으로 가공하기 위해 운반하는 시간은 절단 시점에서 30분을 넘지 않는다. 다른 구현예에서, 장거리 수송된 식물은, 가공 시설로 밤새 운반하는 중에 신선함과 본래의 수분 함량을 유지하도록 보조하기 위해, 피커스 잎을 냉동 젤 팩 백이 든 스티로폼 쿨러에 즉시 넣는 후-절단 과정으로 처리된다. 전술한 결과를 달성하는 기타 후-절단 과정도 물론 사용할 수 있다.

그런 후, 피커스 잎을 조심스럽게 세척하여, 흙 입자와 기타 찌꺼기를 가공하기 전에 제거한다. 일 구현예에서, 세척은, 잎에서 세포즙 방출이 이루어지지 않도록 방지하거나, 손상 발생을 방지하기 위해, 또는 유용한 성분의 소실을 방지하기 위해, 단기간 저압 헹굼으로 달성된다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 피커스 잎의 세척은 수압 1 kg/cm² 이하에서 5분 이하의 시간 동안 수행한다. 물 세척 잔류물에는 어떠한 녹색 또는 노란색의 색소가 포함되지 않아야 하며; 이러한 색소가 없다는 것은 후속적인 손상이 없다는 것을 의미한다. 그런 후, 가능한 천연적인 잎에 가깝게 건물 함량 (dry matter content)을 유지하기 위해, 세척 잎에서 과잉의 물은 제거한다.

그 후, 세척한 피커스 생잎을 기계적으로 분쇄하여, 유조직 세포의 대부분의 세포내 물질을 포함하는 세포즙을 주로 세포벽이 함유된 섬유질이 풍부한 물질로부터 분리시킨다. 중요한 점은, 외부 용매 (예, 물, 헥산, 아세톤, 에탄올)가 분리 공정 중에 첨가되지 않는다는 것이다. 본원에서, "외부 용매"는 식물 재료에 선천적으로는 존재하지 않지만, 식물 재료로부터 화합물을 분리 (예, 추출)하기 위한 목적으로 식물과 접촉되게 배치되는, 모든 용매를 의미한다.

세척한 잎에서 세포즙을 분리하는 단계는 갈기(grinding), 침용 연화(maceration), 및 액상 세포내 함유물 (즉, 세포즙)을 수득하여 섬유질이 풍부한 물질을 분리하기 위한 압착(pressing)을 포함한다. 일 구현예에서, 5 HP 엔진과 스크린 한 세트가 구비된 해머 밀 (Model VS 35, Vincent Corporation, Tampa, FL)을 사용하여 잎을 갈아, 최단 시간 안에 바이오매스 온도를 현저하게 높이지 않으면서 적당하게 작은 크기의 잎 조직 입자를 만든다. 이러한 구현예에서, 10초 이하의 처리로 최대 크기가 2.0 cm 이하인 침용 연화된 잎 입자가 만들어지도록, 해머 밀을 설정하며, 이때 침용 연화된 생잎의 온도 증가분은 2℃ 이하에 불과하다.

갈고 침용 연화된 피커스 잎은, 전술한 바와 같이, 원치않은 이화 대사 공정의 작동을 방지하기 위해, 노출을 최소화한다. 피커스 잎을 단시간내에 현저한 온도 상승 없이 처리한다. 갈고, 침용 연화한 후 즉시, 피커스 잎을 압착하여 침용 연화된 생잎으로부터 세포즙을 수득한다. 일 구현예에서, 이는 압축 공기에 의해 유지되는 콘이 장착된 수평 배치된 연속적인 스크류 프레스 (Compact Press "CP-6", Vincent Corporation, Tampa, FL)를 이용하여 달성한다. 본 구현예에서 콘 상의 압력은 15 kg/cm² 이상의 수준으로 유지되며, 스크류 속도는 12 rpm이고, 세포즙의 온도 증가분은 5℃ 이하이다.

이러한 처리로 섬유질이 풍부한 물질과 세포즙이 만들어진다. 나머지 소형 섬유질 입자는 유용한 세포즙 구성성분을 흡착할 수 있으며, 또한 장치 호스와 펌프를 막을 수 있으므로, 세포즙에서 제거한다. 예를 들어, 이들 입자는 여과 또는 저속 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 일 구현예에서, 이들 입자는 연속 플로우 원심분리기 (Model 12-413V, AML Industries, Inc., Hatboro, PA)와 완전-자동화된 배출 유닛(discharge unit)을 이용한 청징(clarification)에 의해 제거한다. 유속 2 L/분에서, ≤ 2,250 g의 세포즙을 청징하기 위한 체류 시간은 100초 이상이다. 이러한 방법으로 섬유질이 함유되지 않은 세포즙이 만들어진다. 소형 섬유질 입자가 포함된 침전물을 수집하고, 이를 생잎 압착 후 수득되는 섬유질이 풍부한 나머지 물질과 조합한다.

이 시점에 바람직하다면, 세포즙을 공기 밀폐된, 무-반응성 용기에 넣고 냉동하여, 이후 가공을 위해 보관할 수 있다. 일 구현예에서, 세포즙을 엄격하게 밀봉된 15L 장방형 HDPE 용기에 신속하게 넣고, -30℃에서 냉동한다. 고형 상태의 냉동된 세포즙은 나중에 사용하기 위해 저온에서 유지한다.

냉동 세포즙은 바람직하게는 단시간 동안 (예, 2분 이하)의 유동화를 통해 다시 액체 상태로 전환시킬 수 있으며, 유동화 과정 중에서의 세포즙의 온도 상승 (예, 20℃ 이하)은 최소화한다. 단기간의 유동화와 저온은 세포즙의 변성과 산화적 손상을 최소화한다. 이로써, 냉동 전에 측정한 물리화학적 특성 및 생화학적 특성과 본질적으로 동일한 특성을 가진 세포즙이 준비된다.

세포즙은 3가지 주요 구성 성분을 포함한다: (i) 막 결합형 엽록체, 미토콘드리아, 소포체(endoplasmic reticulum), 핵, 리소좀, 퍼옥시좀(peroxysome), 액포, 골지 기관; (ii) 막 비결합형 리소좀, 미소관; 및 (iii) 상기한 군에 포함되지 않는 요소, 예컨대 세포질. 세포즙에 세포 기관 및 이의 단편 뿐만 아니라 원치않은 색소 및 단백질이 존재하므로, 비제한적인 예로서 색, 가용성, 투명성, 안정성 및 시험관내 활성을 비롯하여, 기능적인 특성들을 바람직한 조합으로 구비한 퍼스널 케어 구성 (personal care ingredient)을 만들기 위한 분별 과정(fractionation)이 필요하다.

세포즙은 pH 조정, 집중식 마이크로웨이브 조사, 원심분리에 의한 분리 및 진공 여과를 비롯한 다양한 처리로 분별한다. 그에 따라 수득되는 분리된 세포즙 세럼 분획을 보존제와 항산화제를 첨가하여 안정화하여, 최종 피커스 세럼 분획을 제조한다.

세포즙의 pH는 3.0 이상으로 조정한다 (pH 조정 1). 일 구현예에서, 세포즙의 pH는 중성 (7.0)에 가까우며, 5.0 N 염산 (HCl)을 이용한 적정법으로 조정하여, 세포즙의 pH를 3.0 이상으로 조정한다 (pH 조정 1).

그런 다음, 조정된 세포즙에서 엽록소를 제거한다. 화장료 구성에 이러한 색소가 원치않게도 존재할 뿐만 아니라, 엽록소는 독성 화합물로 간주되며 (Bergstrom, L.C., Vucenik, I., Hagen, I.K., Chernomorsky S.A., Poretz R.D. In-vitro photocytotoxicity of lysosomotropic immunoliposomes containing pheophorbide a with human bladder carcinoma cells. - J. Photochem. Photobiol., 24, 1, 17 - 23, 1994), 피부 자극에 원인이 되는 (Kato T., Yamada K. Relationship between appearance of photosensitization and total pheophorbide level in spirulina powder. - J. Food Hyg. Soc. Japan, 36, 632 - 634, 1995), 페오포르비드로 변환될 수 있다.

일 구현예에서, 엽록소의 제거는, 조정된 세포즙을 가열한 다음 냉각시킨 후, 침전물을 상층물로부터 분리함으로써, 달성된다. 특정 구현예에서, 조정된 세포즙은 주파수 2,450 MHz의 집중식 마이크로웨이브 조사에 의해 즉각적으로 처리한다. 집중식 마이크로웨이브 처리 (FMP)를 수행하는 동안에, 세포즙의 온도는 즉시 90℃로 상승되며, 이 온도에서 1분 유지시킨 후, 세포즙의 온도를 즉시 30℃ 이하로 떨어뜨린다. 그 후, 처리된 세포즙을 연속 플로우 원심분리기 CEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Germany)에서 15,000 rpm 및 체류 시간 ≥ 30초로 사용하여 즉시 분리한다. 처리된 세포즙의 분리를 통해, 녹색을 띠는 페이스트형 침전물 ("침전물 I")과 연갈색의 약간 유백광을 띠는 액체 상층물 ("상층물 I")이 제조된다. 상기 상층물 I은 추가적인 분별에 사용한다.

상층물 I을 추가로 처리하여, 잔류 단백질을 비롯한 갈색 색소와 기타 원치않은 화합물을 상당히 제거한다. 이러한 처리에는 pH 조정과 분리가 포함된다. 상층물 I은 pH가 약 7.5로 높아지도록 pH를 조정한다 (pH 조정 2). 일 구현예에서, pH 조정 2는 50% 수산화나트륨 (NaOH)을 이용한 적정법을 통해 세포즙 상층물 I의 pH를 ~3.0 내지 ~7.5로 높임으로써 달성된다 (pH 조정 2). 상기 pH 조정 2를 통해 물질은 더 진해지고 유백광을 띄게 되며, 이후 분리에 의해 청징 처리한다. 일 구현예에서, 청징은 연속적인 플로우 원심분리기 CEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Germany)를 15,000 rpm으로 30초 이상의 체류시간으로 이용함으로써 달성된다. 이러한 분리를 통해 갈색 페이스트 침전물 (침전물 II)과 갈색에 약간 유백광을 띄는 상층물 (상층물 II)이 수득된다.

상층물 II는 이후 pH 조정 (pH 조정 3)하고, 여과한다. 상층물 II는 pH를 약 3.6으로 낮아지게 pH를 조정한다 (pH 조정 3). 일 구현예에서, 상층물 II는 5.0 N 염산 (HCl)을 이용한 적정을 수행하여, pH를 ~ 3.6으로 떨어뜨린다 (pH 조정 3). 이러한 처리로 적정한 상층물 II의 색은 좀더 밝아지지만 유백광은 약간 강해진다. pH-조정된 상층물 II을 포어 크기가 0.2 ㎛인 막을 통한 제균 여과 처리한다. 수득되는 여과물은 연한 색을 띠는 투명한 피커스 세럼 분획 (FSF)이다. FSF는 피커스 잎 세포의 세포질로 필수적으로 구성된다.

세럼 분획에 항산화제, 안정화제, 킬레이트제 및 보존제를 첨가함으로써, 추가적인 안정화를 달성할 수 있다. 일 구현예에서, 아래 첨가제들을 피커스 세럼 분획에 첨가한다: 0.2% 소듐 메타바이설파이트, 0.1% 포타슘 소르베이트, 0.1% 소듐 벤조에이트 및 0.1% 소듐 메틸파라벤. 본 구현예에서, 혼합물은 첨가제들이 완전히 용해될 때까지 인큐베이션한다 (30분 이상). 그런 후, 1.9 % 펜틸렌 글리콜을 혼합물에 첨가하였다.

FSF 특성

제조되는 FSF는 화장료 성분으로 사용하기에 바람하게 만드는 특성을 나타낸다. 이러한 특성들은 안정성, 수용성, 페오포르비드 및 단백질 등의 부적절한 물질의 무 함유성, 더 연한 색상, 높은 고형 함유량 및 페닐알라닌 등의 바람직한 화합물의 고수준으로의 함유이다.

안정성 실험을 통해, 상기한 방법들을 통해 FSF로부터 수득되는 화장료 성분들이 실온에서 적어도 6개월간 안정적인 것으로 확인되었다. 본원에서, "안정적인"은, STP (표준 온도 및 압력; 25℃, 1 atm)에서 암 및 건조 조건에서 보관하였을 때, 조성물의 물리적 특성 또는 화학적 특성이 명시된 기간 동안 현저하게 변하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 특성으로는 색상 및 화학적 조성을 포함한다. 일부 구현예들에서, FSF 및 이를 포함하는 조성물은 적어도 6개월간, 다른 예로 적어도 12개월간, 또 다른 예로는 적어도 24개월간 안정적이다. 특정 구현예에서, 조성물은 6 내지 24개월간, 12 내지 24개월간, 또는 6 내지 12개월간 안정적이다.

수용해도

본 발명의 FSF는 또한 수용성이다. 본원에서, "수용성"은 FSF가 임의 비율로도 (STP에서) 물에 혼화가능하다는 의미이다. FSF가 수용성이므로, 피커스를 포함하는 조성물을 제형화하는데 있어 유연성이 보다 향상된다. 예를 들어, 소비자는 비유분감(non-greasy feel), 바람직한 퍼짐성, 밝은 피부-느낌 및 피부 표면에서의 제거 용이성 (예, 세정성)으로 인해 대개 수계 제형을 원한다.

그러나, 용매를 이용하여 추출된 수불용성의 전통적인 피커스 추출물은 상 분리, 침전(settling out), 결정화 및 수계 조성물 전체적인 활성 성분의 농도 불균일성과 같은 제형화 문제점들을 볼일 수 있다. 수불용성 활성 성분과 관련있는 제형화 이슈들을 해결하기 위해, (전형적으로 오일성 물질 및/또는 유분감 물질을 조성물에 도입한) 에멀젼과 같이 보다 복잡한 제형이 전형적으로 사용된다. 이는, 유분감, 무거운 느낌, 끈적거리는 피부감을 가진 조성물, 피부 표면에서 쉽게 제거되지 않는 조성물, 및 보다 비용이 많이 들거나 및/또는 복잡한 제조 공정을 야기한다. 여러 경우들에서, 이들 제형은 피부에 활성 성분을 전달하는 것을 방해할 수도 있다.

FSF는 완전히 수용성이기 때문에, 전술한 수불용성의 전통적인 피커스 추출물과 관련된 문제점들 없이 수계 제형으로 만들 수 있다. 이로써, 제형화의 유연성이 개선되어, 소비자가 원하는 우수한 특성을 지닌 피커스 조성물을 전달할 수 있다.

아울러, FSF는 완전히 수용성이므로, 완전히 수용성이 아닌 용매 추출물에 비해 생체이용성이 우수하다. 이로써 FSF의 활성 성분들은 피부에 보다 효과적으로 전달된다.

또한, 전통적인 용매 추출물의 잠재적인 생물학적 활성도, 수불용성이기 때문에 측정하기 어려울 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실험에서 용매 추출물은 수불용성이기 때문에 IC₅₀ 값을 측정할 수 없었다.

안전성/알레르기 유발성

또한, FSF에는 피커스를 비롯한 식물들에서 흔히 발견되는 물질인 페오포르비드와 단백질이 실질적으로 결여되어 있다. 이들 물질들은 독성 및/또는 민감성 개체에서의 알레르기 반응과 같은 안전성 문제를 야기하는 것으로 알려져 있다. 이들 물질은 식물에서 통상적으로 발견되는 수준에서는 전형적으로 문제를 야기하지 않는다. 그러나, 식물 물질이 가공 처리를 통해서와 같이 농축되었을 때에는, 상대적인 농도가 급격하게 증가되어 안전성 문제를 일으킬 수 있다. 따라서, 이들 물질이 함유되지 않은 조성물이 특히 바람직하다.

페오포르비드는 엽록소 분해 산물인 색소 화합물이다. 이들 색소는 제품에 변색을 유발할 뿐만 아니라, 생물학적 독소이며 피부 광감작제인 것으로 알려져 있다 (Bergstrom, L.C., Vucenik, I., Hagen, I.K., Chernomorsky S.A., Poretz R.D. In-vitro photocytotoxicity of lysosomotropic immunoliposomes containing pheophorbide a with human bladder carcinoma cells. - J. Photochem. Photobiol., 24, 1, 17 - 23, 1994); (Kato T., Yamada K. Relationship between appearance of photosensitization and total pheophorbide level in spirulina powder. - J. Food Hyg. Soc. Japan, 36, 632 - 634, 1995).

도 2에 나타낸 바와 같이, (실시예 3의) 전통적인 피커스 추출물은 FSF에서 검출되지 않는 후기-용리되는 (즉, 소수성이 보다 높은) 화합물을 포함한다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 전통적인 피커스 추출물의 후기 용리되는 화합물의 LC/UV 크로마토그램과 그 각각의 추출한 이온 크로마토그램을 통해, 이들 화합물들은 페오포르비드로서 동정되었다 (실시예 5 참조).

피커스 등의 식물의 단백질을 비롯하여, 단백질은 민감한 개체에서 단백질 접촉성 피부염을 야기할 수 있다. 이들 개체는, 원인이 되는 단백질성 물질과 접촉한 후, 즉각적으로, 피부에서 급성 두드러기 또는 수포성 발진(vesicular eruption) 등의 증상을 대체로 가려움, 화한 느낌 및/또는 찌르는 듯한 느낌을 동반하여 경험할 수 있다 (V. Janssens, et al., "Protein contact dermatitis: myth or reality?", British Journal of Dermatology 1995; 132: 1-6). 따라서, 피부 케어 재료는 가능한 단백질을 적게 포함하는 것이 매우 바람직하다.

FSF를 대상으로 킬달(Kjeldahl) 방법을 이용하여 총 단백질 함량 (실시예 1, 표 3)을 테스트하였다. FSF에서는 단백질이 검출되지 않았다. 본원에서, "단백질이 실질적으로 결여된"은 킬달 방법에 따른 총 단백질 함량이 1% 미만 (0% 내지 1%)이라는 의미이다. 일부 구현예에서, 단백질 함량은 FSF의 0% 내지 1%, 다른 예로, 0% 내지 0.5%, 또 다른 예로 0% 내지 0.25%이다.

색/색 안정성

FSF는 전통적인 피커스 추출물 보다 색이 연하다. FSF의 가드너 색 지수(Gardner color value)는 8 미만이며, 일부 구현예에서는 7.5 미만이다. 특정 구현예에서, 가드너 색 지수는 5 내지 8, 다른 예로 6 내지 8, 또 다른 예로 6.5 내지 8이다. 도 8은 14일 가속 노화 실험에서 FSF의 색 변화를 피커스 건조 잎 추출물과 비교하여 보여준다. 도 10은 안정화제/보존제를 다양한 수준을 포함하는 비히클 중의 0.55% FSF 조성물의 색 차이를 보여준다. 도 9는 도 8의 가속 노화 실험 분석으로 작성한 캘리브레이션 차트이다.

본 발명의 연구자들은, FSF에 존재하지 않거나 및/또는 매우 낮은 수준으로 존재하며, 전통적인 추출물과 FSF 간의 색 차이 및 색 안정성 차이를 설명해 줄 수 있는, 수종의 대상 구성성분들을 전통적인 추출물에서 동정하였다. 예를 들어, 도 4는, 전통적인 추출물이 플라보놀 글리코시드로 추정되는 것을 보다 많이 포함하고 있음을 보여준다. 플라보놀 글리코시드는 (FSF와 전통적인 추출물 둘다에서 발견되는) 탄닌과 조합하여, 폴리머 색소를 형성할 수 있다. 따라서, 더 높은 수준의 플라보놀 글리코시드는 전통적인 추출물에서의 색소 화합물의 형성을 더 증가시킬 수 있다. 아울러, 플라보노이드 및 탄닌의 폴리페놀 구조는 산화, 열 및 광 등의 인자들에 대한 고도 민감성을 부여하며, 이는 전통적인 추출물내 색소 함유량의 경시적인 증가가 잠재적인 원인일 수 있다.

고형물 함량

고형물은 FSF 또는 추출물의 생물학적 활성의 일부를 차지한다. 즉, 고형물의 함량이 높을 수록, 식물성 활성은 높아진다. FSF는 전통적인 수용성 피커스 추출물에 비해 고형물 함량이 높다. FSF의 고형물 (건물) 함량은, FSF에 대해 5 중량% 이상, 특정 구현예에서, 5 중량% 내지 20 중량% 또는 5 중량% 내지 10 중량%이다.

FSF 생활성

FSF는 피부에서의 색소 침착을 조절하는 것으로 파악된 4가지 이상의 작동 기전을 나타낸다. 이러한 기전은 티로시나제 저해, 트립신 저해, COX-2 저해 및 항산화제 활성이다. 일 구현예에서, FSF는 하기 색소 침착 완화 활성들 중 한가지 이상, 다른 예로 2가지 이상, 또 다른 예로 3가지 이상의 활성을 가진다: 티로시나제 저해 IC50 (%DM) 0.003 내지 0.06; 트립신 저해 IC50 (%DM) 0.02 내지 0.5; COX-2 저해 IC50 (%DM) 0.02 내지 1; 및 DPPH 분석 (1/x DM)으로 측정시 항산화 슈퍼옥사이드 소거력 (antioxidant super-oxide scavenging ability) 1 내지 15, 및/또는 ORAC 분석으로 (1/x DM) 측정시 항산화 슈퍼옥사이드 소거력 0.2 내지 5. 본원에서, "DM"은 건물 ("고형물")이고, "ORAC"는 산소 라디칼 흡착력(oxygen radical absorbance capacity)이고, "DPPH"는 유리 라디칼 소거력(free radical scavenging ability) 측정이다.

아울러, 실시예 6의 B16 멜라닌 억제 분석에 의해 입증된 바와 같이, FSF는 전통적인 피커스 건조 잎의 용매 추출물 보다 멜라닌 생성을 억제하는데 보다 효과적이다. 예를 들어, FSF는 0.01 농도에서 전통적인 추출물 (멜라닌 저해율 23%) 보다 멜라닌 합성 저해 수준이 2배 이상이다 (멜라닌 저해율 48.1%).

이에, 본 발명은 피부에서 멜라닌합성 조절 (즉, 멜라닌 억제) 방법을 제공한다. 피부에서의 멜라닌 농축과 관련된 다양한 형태의 과색소 침착 (예, 주근깨, 노화 반점, 갈색 기미, 얼룩덜룩함, 얼룩형 색소 침착 등)은 표피에 존재하는 멜라노사이트와 케라티노사이트내 변화가 원인인 것으로 생각된다. 표피 기저에 위치한 멜라노사이트는, 노화에 따라 정상적인 조절 프로세스를 상실하여, 색소를 과다 생산하게 된다. 이러한 과다 생산으로 표피내 케라티노사이트 내부에 핵주위 멜라닌 고밀도 클럼프들이 생겨나, 과색소 침착 영역이 발생하게 된다.

과색소 침착된 피부에 대한 전통적인 치료법은 멜라닌 형성을 저해하는 특정 피부 미백 제제를 적용하는 것이다. 당해 기술 분야에서 제안된 이러한 물질의 작용 기전은 티로시나제 저해 및/또는 멜라닌 합성의 기타 단계의 저해이다. 티로시나제는 표피 멜라노사이트내 멜라노솜 안에 존재하며, 티로신으로부터 멜라닌을 형성하는 개입 단계를 촉매한다 (참조: Goldsmith, L. A., Physiology, Biochemistrv, and Molecular Biology of the Skin, Oxford University Press, pp. 873-903, N.Y. 1991). 티로시나제는 티로신의 하이드록시화와 DOPA에서 DOPA 퀴닌으로의 산화를 촉매한다. 티로시나제 활성부에 저해제가 결합하면 멜라닌 생성이 줄어들게 된다. 전반적으로 Prota, G. Melanins and Melanogenesis, Academic Press, Inc., (San Diego 1992)를 참조한다.

산화적 프로세스에는 멜라닌 생성의 비효소적인 단계들이 관여한다. DOPA 퀴논을 멜라닌으로 변환하는 과정은 비효소적 또는 자발적인 화학적 반응을 통해 이루어지며, 이들 반응 중 일부 반응에는 반응성 산소 종 (ROS) 또는 산소 라디칼이 참여한다. (예를 들어, UV 또는 광 노출시 발생할 수 있는) 반응성 산소/산소 라디칼 종의 자극에 의해서 등과 같은, 멜라노사이트에 대한 산화 스트레스로, 멜라노사이트에서 멜라닌 생성 경로가 개시되게 된다. 이러한 프로세스의 교란을 도와 피부 미백 효과를 달성하기 위해, 다양한 항산화제/라디칼 스캐빈저(radical scavenger)들이 사용되고 있다.

아라키돈산-유래 대사산물은 피부에서, 특히 UV, 스모그 및 기타 자극제 등의 환경적인 상해에 반응하여 강력한 염증 매개체로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 이러한 경로에서, 막 인지질이 포스포리파제 A2에 의해 아라키돈산 (AA)으로 변환된다. AA가 일단 생성되면, AA는 2가지의 경쟁적인 생물학적 경로들 중 한가지 경로에 사용된다: 사이클로옥시게나제 (COX) 경로 또는 5-리폭시게나제 경로. COX 염증 경로에서 가장 문제가 되는 효소는 COX-2로서, 이 효소는 아라키돈산이 PGH2로 변환되는 것을 촉매하며, PGH2는 PGE2와 같은 프로스타글란딘으로 빠르게 변환되는 일시적인 분자이다. 프로스타글란딘은 자극 부위에서 염증 반응을 도출하는 작용을 하는 국소 메신저로서 작용하는 오토크린 또는 파라크린이다.

피커스 세럼 분획을 피부에 흡수시키면, COX-2를 저해하여, 프로스타글란딘으로의 아라키돈산-유래 대사산물의 변환이 방지된다. 순 효과(net effect)는 기본적인 프로스타글란딘 풀 감소 및 유도성 프로스타글란딘 풀 감소이다. 프로스타글란딘 수준 감소는 염증 반응의 직접 경감 뿐만 아니라 그로 인해 형성되는 하류 메신저 전체 활성의 감소로 이어진다. 이들 메신저의 2가지 활성은 멜라노사이트에서의 멜라닌 합성 활성화와 섬유모세포에서의 콜라겐 생산 저해이다.

프로스타글란틴은 멜라닌 생성을 담당하는 효소인 티로시나제의 양을 증가시켜 멜라노사이트를 자극하는 것으로 알려져 있다. 멜라노사이트의 자극과 멜라닌의 과다생산은 과색소 침착으로 이어지며, 이는 피부 부위의 다크닝(darkening)으로 관찰된다. 염증 후 과색소 침착으로 칭해지는 염증으로 인한 변색은, 따라서, 멜라노사이트에 대한 프로스타글라딘의 직접 자극이 원인이다. 피커스 세럼 분획의 COX2 저해에 의해 유발되는 프로스타글란딘 생산 감소로 멜라닌 생성은 낮아지고 피부 톤은 보다 균일해질 것이다.

프로스타글란딘 PGE₂는 인간 진피 섬유모세포, 랫 흔적 세포(rat mesangial cell) 및 간의 방사상 세포를 비롯한 다양한 세포들에서 I형 및/또는 III형 콜라겐 합성을 감소시키는데 현저한 효과를 나타내는 것으로 입증된 바 있다. I형 및 III형은 피부 진피를 구성하는 주된 콜라겐 형태이므로, 염증으로 인한 PGE₂ 농도 증가가 콜라겐 합성을 저해할 것임을 뒷받침해준다. AA와 PGE₂는 콜라겐 합성에 저해 효과를 나타내는 것으로 확인된 바 있다. 오메가-3 지방산 EPA 및 DHA 등의 천연 유래 COX-2 저해제를 첨가하면, PGE₂로 인한 콜라겐 합성 저해가 상쇄되어, 콜라겐 합성을 순 증가시킬 수 있다. 따라서, 피커스 세럼 분획은, 콜라겐 저해를 야기하는 프로스타글란딘 생성을 낮추는 COX-2를 저해함으로써 피부결을 향상시킬 수 있을 것이다.

피커스 세럼 분획이, 피부에 국소 적용하였을 때, 전통적인 피커스 추출물에 비해, 포유류 피부에서의 과색소 침착된 부위에서의 미백을 비롯하여, 피부 미백 효과가 우수한 것으로, 예상치못 하게도 확인되었다. 아울러, 분석 실험을 통해, 본 발명의 피커스 세럼 분획이 효소적 및 비효소적 경로에 영향을 미치는 복수의 작용 기전을 통해 멜라닌 합성을 교란하는 것으로 입증되었다. FSF는 전통적인 피커스 추출물에 비해 강화된 생활성, 예컨대 효소 저해 활성, 유리 라디컬 소거 활성, 항산화 활성 및 멜라닌 합성의 저해 활성 중 한가지 또는 이들의 조합 활성을 가진다. 효소 저해 활성으로는, 티로시나제, 엘라스타제, 트립신 및 사이클로옥시게나제-2 ("COX-2") 저해 활성들 중 한가지 또는 이들의 조합이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 항산화 활성으로는 산소 라디칼 흡착력(oxygen radical absorbance capacity)이 있으나, 이로 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 연구자들은 전통적인 피커스 추출물이 과색소 침착에 효과를 전달할 수 있다는 것을 예로서 확인하였지만, 이들 전통적인 추출물은 효과적이지 않으며, 화장료 조성물에 사용하는데 적합성이 낮아, 바람직하지 않은 특성을 가진다.

도 5에 나타낸 바와 같이, FSF는 카테킨과 관련 축합된 탄닌의 수준이 높다 (약 10x). 카테킨과 같은 축합된 탄닌 (프로안토시아니딘)은 플라보놀의 한가지 유형이다. 프로안토시아니딘은 기본적으로 카테킨과 같은 플라보노이드의 폴리머 체인이다. 탄닌은 인체에서 생물학적 항산화제 (유리 라디칼 스캐빈저)로서 기능하는 것으로 생각되며, 노화에 의해 유발되는 손상과 같은 피부에 대한 산화적 손상을 방지하는데 효과적인 것으로 널리 용인되고 있다. 아울러, 항산화제는 담배 흡연 및 오염과 같은 내부적 스트레스와 환경 스트레스의 작용을 방지하는데 일조할 수 있을 뿐만 아니라 정상적인 신체 대사 과정을 보조할 수 있다 (Kehrer, J.P. Crit. Rev. Toxicol. 1993, 23, 21). 또한, 도 7은, FSF가 필수 아미노산인 유리 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판을 보다 높은 수준으로 함유하고 있음을 보여준다. 그러나, 검출된 3종의 카페오일퀸산 이성질체들의 농도는, 도 6에 나타낸 바와 같이, 2가지 샘플들 간에 실질적인 차이가 없었다.

B. 피부 톤 개선제

일부 구현예에서, 조성물에 FSF와 조합된 형태로 피부 톤 개선제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 피부 톤 개선제는 전체 피부 톤을 보다 개선시키기 위해 포함시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은, 피부 톤 개선제를, 존재하는 경우, 조성물의 최대 약 50 중량%, 40 중량%, 30 중량%, 20 중량%, 10 중량%, 5 중량% 또는 3 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물은, 피부 톤 개선제를, 존재하는 경우, 조성물의 최소 약 0.001 중량%, 0.01 중량%, 0.1 중량%, 0.2 중량%, 0.5 중량% 또는 1 중량%로 포함한다. 적정 범위는 상한 및 하한의 임의 조합을 포함하며, 예로, 피부 톤 개선제의 적정 범위로서 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 50 중량%; 약 0.2 중량% 내지 약 20 중량%; 또는 약 1 중량% 내지 약 10 중량%를 포함한다. 성분의 효과는 상당히 달라 선택한 특정 활성에 따라 피부 톤 개선제의 최적량이 달라질 수 있으므로, 본원에 열거된 양은 가이드로서만 사용된다.

적합한 피부 톤 개선제로는 당 아민, 비타민 B3 화합물, 알부틴(arbutin), 데옥시알부틴, 1,3-디하이드록시-4-알킬벤젠, 예컨대 헥실레조르시놀, 슈크로스 디라우란트(sucrose dilaurante), 바쿠코일(bakuchoil) (4-[(1E,3S)-3-에테닐-3,7-디메틸-1,6-옥타디에닐] 페놀 또는 몬테르펜 페놀), 피레노인 (pyrenoine) (프랑스 바이오테크 마린에서 구입), 기장 (panicum miliaceum) 시드 추출물, 아르라톤 디오익산(arlatone dioic acid), 신남산, 페룰산(ferulic acid), 아크로막실(achromaxyl), 메틸 니코틴아미드, 지용성 감초 추출물, 엽산, 운데실린산(undecylenic acid) (즉, 운데세노익산), 아연 운데실레네이트(zinc undecylenate), 티아민 (비타민 B1) 및 이의 염산염, L-트립토판, 헬리안투스 아누스(helianthus annuus) (해바라기) 및 비티스 비니페라(vitis vinifera) (포도) 잎 추출물, 카르노신 (즉, 드라고신), 메틸 젠티세이트, 1,2-헥산디올 및 1,2-옥탄디올 (즉, 독일 Symrise AG 사에서 Symdiol 68로 판매하는 조합물), 이노시톨, 데실레노일페닐알라닌 (예, 프랑스 Seppic 사에서 상표 Sepiwhite로 판매하고 있음), 코지산, 헥사미딘 화합물, 살리실산 및 레티노이드, 예컨대 레티놀 및 레티닐 프로피오네이트를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

특정 구현예에서, 추가적인 피부 톤 개선제는 비타민 B3 화합물, 당 아민, 헥사미딘 화합물, 살리실산, 1,3-디하이드록시-4-알킬벤젠, 예컨대 헥실레조르시놀 및 레티노이드로부터 선택된다. 본원에서, "비타민 B₃ 화합물"은 하기 식을 가지는 화합물; 이의 유도체; 및 전술한 임의 물질의 염을 의미한다:

상기 식에서, R은 -CONH₂ (즉, 니아신아미드), -COOH (즉, 니코틴산) 또는 -CH₂OH (즉, 니코티닐 알코올)이다. 본원에서, "당 아민"은 화합물의 이성질체와 호변이성질체 및 이의 염 (예 HCl 염)과 유도체를 포함한다. 당 아민의 예로는 글로코사민, N-아세틸 글루코사민, 만노스아민, N-아세틸 만노스아민, 갈락토스아민, N-아세틸 갈락토스아민, 이의 이성질체 (예, 입체 이성질체) 및 이의 염 (예, HCl 염)을 포함한다. 본원에서, "헥사미딘 화합물"은 아래 식을 가진 화합물을 의미한다:

상기 식에서, R¹ 및 R²는 옵션이거나 또는 유기산 (예, 설폰산 등)이다. 일 구현예에서, 헥사미딘 화합물은 헥사미딘 디이세티오네이트(hexamidine diisethionate)이다.

C. 항염증제

과색소 침착은 피부 염증으로 인한 것일 수 있다. 일시적인 염증 현상에 의해 촉발되는 과색소 침착, 보다 구체적으로는 염증 후 과색소 침착으로는, 여드름 흉터, 안으로 자라는 체모, 스크레치, 벌레 물림, 계면활성제 상해, 알레르겐 및 단기간 UV 노출이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 염증 후 과색소 침착을 비롯한 염증 유발성 과색소 침착은 본 발명의 조성물에 항염증제를 혼합함으로써 조처할 수 있다. 본 발명의 화합물은 항염증제를 함유하는 경우 조성물의 최대 약 20 중량%, 10 중량%, 5 중량%, 3 중량%, 또는 1 중량%로 항염증제를 포함한다. 본 발명의 화합물은 항염증제를 함유하는 경우 조성물의 최소 약 0.001 중량%, 0.01 중량%, 0.1 중량%, 0.2 중량%, 0.3 중량%, 0.5 중량%, 또는 1 중량%로 항염증제를 포함한다. 적정 범위는 상한 및 하한의 임의 조합을 포함한다. 적합한 항염증제로는 비스테로이드계 항증염제 (NSAIDS, 비제한적인 예로서, 이부프로펜, 나프록센, 플루페남산, 에토페나메이트, 아스피린, 메페남산, 메클로페남산, 피록시캄 및 펠비낙), 글리시리즈산 (글리시리진, 글리시릭신산 및 글리시레틴산 글리코시드라고도 함) 및 디포타슘 글리시리제이트와 같은 염, 글리시레텐산, 감초 추출물, 비스아볼롤 (bisabolol) (예, 알파 비스아볼롤), 만지스타(manjistha) (속명 루비아, 특히 루비아 코르디폴리아(Rubia cordifolia) 식물에서 추출) 및 구갈 (guggal) (속명 코미포라, 특히 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 식물에서 추출), 콜라 추출물, 카모마일, 레드 클로버 추출물 및 시시윕(sea whip) 추출물 (목명 고르고나시아(Gorgonacea) 식물에서 추출), 이들의 임의의 것의 유도체, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.

D. 선스크린 활성제 (Sunscreen Actives)

본 발명의 조성물은 하나 이상의 선스크린 활성제 (또는 선스크린제) 및/또는 자외선 흡광제를 포함할 수 있다. 본원에서, "선스크린 활성제"는 총체적으로 선스크린 활성제들, 선스크린 제제 및/또는 자외선 흡광제를 포함한다. 선스크린 활성제는 선스크린제와 물리적 선블록제를 둘다 포괄한다. 선스크린 활성제는 유기 또는 무기성일 수 있다. 적합한 선스크린 활성제의 예들은 Personal Care Product Council's International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Thirteenth Edition에 "선스크린제"로서 기술되어 있다. 특히 바람직한 선스크린 활성제로는 2-에틸헥실-p-메톡시신나메이트 (PARSOL™ MCX로 시판됨), 4,4'-t-부틸메톡시디벤조일-메탄 (PARSOL™ 1789로 시판됨), 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논, 옥틸디메틸-p-아미노벤조산, 디갈로일트리올리에이트, 2,2-디하이드록시-4-메톡시벤조페논, 에틸-4-(비스(하이드록시프로필))아미노벤조에이트, 2-에틸헥실-2-시아노-3,3-디페닐 아크릴레이트, 2-에틸헥실-살리실레이트, 글리세릴-p-아미노벤조에이트, 3,3,5-트리-메틸사이클로헥실살리실레이트, 멘틸 안트라닐레이트, p-디메틸-아미노벤조산 또는 아미노벤조에이트, 2-에틸헥실-p-디메틸-아미노-벤조에이트, 2-페닐벤지이미다졸-5-설폰산, 2-(p-디메틸아미노페닐)-5-설폰 벤조옥사조익산, 옥토크릴렌, 아연 산화물, 벤질리덴 캄퍼 및 이의 유도체, 티타늄 이산화물 및 이의 혼합물이 있다.

일 구현예에서, 조성물은 선스크린 활성제를 조성물의 약 1 중량% 내지 약 20 중량%로, 다른 예로 약 2 중량% 내지 약 10 중량%로 포함할 수 있다. 정확한 양은 선정한 선스크린 활성과 원하는 자외선 차단 지수 (SPF)에 따라 달라질 것이며, 이는 당해 기술 분야의 당업자의 능력에 해당된다.

E. 선택 성분

본 발명의 조성물은 본 발명의 유용성을 허용불가한 수준으로 변형시키지 않는 한 다른 다양한 성분들을 포함할 수 있다. 이들 성분들이 포함되는 경우, 본 발명의 조성물은 선택 성분들을 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 50 중량%로, 약 0.001 중량% 내지 약 20 중량%로, 또는 다른 예로 약 0.01 중량% 내지 약 10 중량%로 포함할 수 있다. 성분의 효과는 상당히 달라 선택한 특정 활성에 따라 선택 성분의 최적량이 달라질 수 있으므로, 본원에 열거된 양은 가이드로서만 사용된다. 그래서, 본 발명에서 사용가능한 일부 선택 성분의 양은 본원에 기술된 범위를 벗어날 수도 있다.

선택 화합물은, 본 조성물에 병합되는 경우, 과도한 독성, 상용불가성, 불안정성, 알레르기 반응 등을 유발하지 않으면서 인간 피부 조직에 접촉 사용하는데 적합하여야 한다. 본 발명의 조성물은 항-여드름 활성제, 박피 활성제, 항-셀룰라이트 활성제, 킬레이트제, 플라보노이드, 태닝 활성제, 비-비타민 항산화제 및 라디컬 스캐빈저, 체모 성장 조절제, 항-주름 활성제, 항-퇴화 활성제(anti-atrophy actives), 미네랄, 피토스테롤 및/또는 식물 포르몬, N-아실 아미노산 화합물, 항미생물 활성제, 항진균 활성제, 및 기타 유용한 피부 케어 활성제 등의 선택 성분을 포함할 수 있으며, 이들에 대해서는 미국 출원 공개번호 US2006/0275237A1와 US2004/0175347A1에 보다 상세하게 기술되어 있다.

The Personal Care Product Council's International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Thirteenth Edition에는, 피부 케어 산업에서 통상적으로 사용되는 비제한적인 화장료 및 제약 성분들이 광범위하게 기술되어 있으며, 이들은 본 발명의 조성물에 사용하는데 적합한 선택 성분들이다. 이러한 성분 유형의 예로는, 연마재, 흡수제, 향료와 같은 미적 성분, 색소, 착색제/채색제, 에센셜 오일, 케이킹 방지제(anti-caking agent), 소포제, 항균제, 바인더, 생물학적 첨가제, 완충화제, 벌킹제, 킬레이트제, 화학 첨가제, 채색제, 코스메틱 수렴제, 코스메틱 살생물제, 변성제, 약물 수렴제, 연화제, 외용 진통제(external analgesics), 막 형성제 또는 막 재료, 불투명화제, pH 조절제, 보존제, 추진제, 환원제, 격리제, 피부 쿨링제, 피부 보호제, 증점제, 점성 변형제, 비타민 및 이들의 조합을 포함한다.

F. 피부학적으로 허용가능한 담체

본 발명의 조성물은 또한 조성물에 피부학적으로 허용가능한 담체 ("담체"로 지칭될 수 있음)를 포함할 수 있다. "피부학적으로 허용가능한 담체"라는 표현은, 본원에서, 담체가 케라틴 조직에 국소 적용하기에 적합하며, 미학적 특성이 우수하며, 조성물에서 활성 성분과 혼용가능하며, 적절치 않은 어떠한 안전성 또는 독성 문제를 야기하지 않은 것이라는 의미이다. 일 구현예에서, 담체는 조성물에 대해 약 50 중량% 내지 약 99 중량%, 약 60 중량% 내지 약 98 중량%, 약 70 중량% 내지 약 98 중량%, 또는 다른 예로, 약 80 중량% 내지 약 95 중량%의 수준으로 존재한다.

담체는 매우 다양한 형태일 수 있다. 비제한적인 예로는 단순 용액 (예, 수계, 유기 용매, 또는 오일계), 에멀젼 및 고형 형태 (예, 겔, 스틱, 유동 고체 또는 비정질 물질)를 포함한다. 특정 구현예에서, 피부학적으로 허용가능한 담체는 에멀젼 형태이다. 에멀젼은 일반적으로 연속 수상 (예, 수중유 및 수중유중수) 또는 연속 오일상 (예, 유중수 및 유중수중유)을 가지는 것으로 분류할 수 있다. 본 발명의 오일상은 실리콘 오일, 비-실리콘 오일, 예를 들어 탄화수소 오일, 에스테르, 에테르 등 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

수상은 전형적으로 물을 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서는, 수상은 물이 아닌 성분을 포함할 수 있는데, 그 예로는 수용성 보습제, 컨디셔닝제, 항균제, 습윤제 및/또는 기타 수용성 피부 케어 활성제가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 조성물의 비-수계 성분은 글리세린 및/또는 기타 폴리올 등의 습윤제를 포함한다. 그러나, 조성물은 실질적으로 (즉, 수분량 1% 미만) 또는 완전히 무수일 수 있다는 것을 인지하여야 한다.

적정 담체는 원하는 제품 형태를 구현하도록 선택된다. 나아가, 구성 성분 (예, FSF, 선스크린 활성제, 추가적인 구성 성분)의 용해도 또는 분산성이 담체의 형태와 특징을 결정할 수 있다. 일 구현예예에서, 수중유 또는 유중수 에멀젼이 바람직하다.

에멀젼은 유화제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 담체를 충분히 유화시키는데 적합한 임의의 비율로 유화제를 포함할 수 있다. 유화제의 적정 중량 범위는 조성물의 중량을 기준으로 약 0.1% 내지 약 10% 또는 약 0.2% 내지 약 5%이다. 유화제는 비이온성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다. 적합한 유화제들은 예를 들어 미국 특허 3,755,560, 미국 특허 4,421,769, 및 McCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition, pages 317-324 (1986)에 기술되어 있다. 적정 에멀젼은 원하는 제품 형태에 따라 매우 다양한 점도를 가질 수도 있다.

담체는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 증점제를 추가로 포함하여, 적합한 점성과 유동학적 특징을 가진 조성물을 만들 수 있다.

G. 조성물의 예

하기 내용은 본 발명의 조성물에 대한 비제한적인 예들이다. 예들은 예시하기 위한 목적으로 제공되는 것일 뿐, 당해 기술 분야의 당업자는 본 발명의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 다수의 변형이 가능하다는 것을 알 것이므로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되진 않는다. 예들에서, 농도는 다르게 언급되어 있지 않은 한 모두 중량%로 기재되며, 희석제, 충전제 등과 같은 미량 물질은 제외할 수 있다. 따라서, 열거된 제형들은 열거된 성분들과 이들 성분과 조합되는 임의의 미량 물질을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 이들 미량 물질의 선택은 본원에 기술된 본 발명을 구현하기 위해 선택되는 특정 구성 성분들의 물리적 및 화학적 특징에 따라 결정될 것이다.

모든 예들은 한 곳 이상의 과색소 침착된 반점의 외양을 치료 또는 개선시키는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 제1 조성물 (예, A 예 또는 B 예)로 한 곳 이상의 과색소 침착된 반점을 국소 처리하고, 국소 처리 전 또는 후에 얼굴 전체의 피부 톤을 개선시키기 위해 적용할 수 있는, 제2 조성물 (예, C 예, D 예 및 E 예)을 보다 넓거나 전체 얼굴 피부에 처리하는 요법에 관한 것이다.

구성 성분	A	B	C	D	E
피커스 세럼 분획	0.55	1.000	1.000	1.000	1.000
N-아세틸글루코사민	0	0	2.000	0	0
헥사미딘 디이세티오네이트	0			0.090	0.090
운데실레노일-페닐알라닌 *2 (중성화됨)	0	1.000	0.500	0	0
디포타슘 글리시리제이트	0	0.300	0.100	0.100	0.100
니아신아미드	5.000	5.000	5.000	5.000	5.000
이소헥사데칸	3.000	3.000	3.000	3.000	3.000
이소프로필 이소스테아레이트	1.330	1.330	1.330	1.330	1.330
슈크로스 폴리코턴시데이트 (sucrose polycottonseedate)	0.670	0.670	0.670	0.670	0.670
폴리메틸-실세스퀴옥산	0.250	0.250	0.250	0.250	0.250
세테아릴 글루코시드 + 세테아릴 알코올 *3	0.200	0.200	0.200	0.200	0.200
베헤닐 알코올	0.400	0.400	0.400	0.400	0.400
세틸 알코올	0.320	0.320	0.320	0.320	0.320
스테아릴 알코올	0.480	0.480	0.480	0.480	0.480
토코페릴 아세테이트	0.500	0.500	0.500	0.500	0.500
PEG-100 스테아레이트	0.100	0.100	0.100	0.100	0.100
글리세린	7.000	7.000	7.000	7.000	7.000
티타늄 다이옥사이드	0.604	0.604	0.604	0.604	0.604
폴리아크릴아미드 + C13-14 이소파라핀 + 라우레트-7 *4	2.000	2.000	2.000	2.000	2.000
알란토인	0.200	0.200	0.200	0	0
판테놀	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000
디소듐 EDTA	0.100	0.100	0.100	0.100	0.100
벤질 알코올	0.400	0.400	0.400	0.400	0.400
디메티콘/ 디메티코놀 *5	2.000	2.000	2.000	2.000	2.000
호모살레이트	0	0	0	0	9.000
아보벤존	0	0	0	0	3.000
옥토크릴렌	0	0	0	0	2.600
옥시벤존	0	0	0	0	1.000
옥티살레이트	0	0	0	0	4.500
물	QS	QS	QS	QS	QS
총	100	100	100	100	100

*1 - 뉴욕 Integrated Botanical Technologies 사에서 제조.

*2 - 프랑스 SEPPIC 상에서 판매하는 Sepiwhite.

*3 - Cognis GmbH 사에서 판매하는 Emulgade PL 68/50

*4 - 프랑스 SEPPIC 사에서 판매하는 Sepigel 305.

*5 - 미시시건 미드랜드 Dow Corning, Inc. 사에서 판매하는 Dow Corning DC1503.

본 발명의 조성물은 일반적으로 국소 조성물 제조 분야에 공지된 바와 같이 통상적인 방법으로 제조한다. 이러한 방법은 전형적으로 열처리를 가하거나 하지 않으면서 구성 성분들을 하나 이상의 단계로 상대적으로 균일한 상태로 혼합하는 단계, 냉각 단계, 진공 적용 등을 포함한다. 전형적으로, 에멀젼은 지방상의 물질과 수상 물질들을 각각 1차 혼합한 다음, 이들 2가지 상을 적절하게 조합하여, 바람직한 연속 상을 제조함으로써, 제조한다. 조성물은 바람직하게는 활성 물질들의 안정성 (물리적 안정성, 화학적 안정성, 광안정성) 및/또는 전달을 최적화하도록 제조된다. 이러한 최적화는 적정 pH (예, <7), 활성 제제에 착화하여, 안정성 또는 전달에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 물질의 제외 (예, 오염원 철의 제거), 복합체 형성을 방지하기 위한 방식 이용 (예, 적절한 분산제 또는 듀얼 구획 패킹), 적합한 광안정성 방식의 사용 (예, 선스크린/선블럭 첨가, 불투명 포장 사용)을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 피커스 세럼 분획을 약 0.01% 내지 약 10%, 더 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 5%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 5%, 예, 2%로 포함한다.

H. 피부 미백 방법

본 발명의 조성물은 포유류 피부 (특히 인간 피부, 보다 구체적으로는 얼굴과 손의 피부)를 미백화하는데 유용하다. 조성물은 피부의 과색소 침착된 영역을 미백화하는데 특히 유용하다.

(과색소 침착된 영역을 비롯한) 피부 미백 방법은 전형적으로 본 발명의 조성물을 안전하고 유효한 양으로 피부에 국소 적용하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 화장료 조성물은 피커스 세럼 분획을 0.01% 내지 10%로 포함할 수 있다. 조성물의 적용 양, 적용 횟수 및 사용 기간은, 피커스 세럼 분획의 농도 및/또는 소정의 조성물의 기타 구성 성분들 및 원하는 미백 수준에 따라, 예컨대 개체에 존재하는 피부 색소침착 수준과 피부 색소침착율에 따라, 상당히 달라질 것이다.

바람직한 구현예에서, 조성물은 피부에 장기간 적용한다. "장기간 국소-적용"은 개체의 일생 동안 장기간 동안, 바람직하게는 적어도 약 1주일, 더 바람직하게는 적어도 약 1달, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 3달, 더더 바람직하게는 적어도 약 6달, 더 바람직하게는 적어도 약 1년의 장기간 동안 조성물을 실질적으로 연속하여 국소 적용하는 것을 의미한다. 다양한 최대 사용 기간 (예, 2년, 5년, 10년 또는 20년) 경과 후에 효과를 수득할 수 있지만, 개체의 일생 동안 장기적으로 계속 적용하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 적용은 상기한 장기간 동안 하루에 약 1회 또는 2회 수준일 것이나, 적용 빈도는 예를 들어 주당 약 1회, 최대 1일 당 약 3회 또는 그 이상의 횟수로 다양할 수 있다.

피부 미백 효과를 제공하기 위해 본 발명의 조성물을 광범위한 양으로 사용할 수 있다. 전형적으로 1회 적용시 적용되는 본 발명의 양은 약 0. 1 mg/cm² 피부 내지 약 10 mg/cm² 피부이다. 특히 유용한 적용 양은 약 2 mg/cm² 피부이다.

용어 "국소 적용"은, 본원에서, 피부의 표면 위에 본 발명의 조성물을 도포하거나 펴 바르는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 조성물은 국소 적용 후 장기간 (예, 수시간) 피부에 접촉된 상태로 있도록 의도된 형태의 조성물이며, 예컨대 전형적인 크림, 로션, 모이스쳐라이저 등의 사용이다.

피부 미백 방법은 바람직하게는 조성물을 일부 미적, 예방적, 치료학적 또는 기타 이점을 위해 피부 위에 있도록 고안된 피부 로션, 크림, 코스메틱 등의 형태로 국소 적용함으로써 수행된다. 조성물을 피부에 적용한 후, 바람직하게는 피부 위에서 적어도 약 15분, 더 바람직하게는 적어도 약 30분, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 1시간, 가장 바람직하게는 적어도 수 시간, 예를 들어 최대 약 12시간 동안 방치한다.

또한, 본 발명의 조성물은, 피부 노화 신호 및 피부 노화와 관련된 피부에서의 가시적인 및/또는 촉지가능한 불연속 등의, 포유류의 피부 (특히 인간 피부, 보다 구체적으로 얼굴 및/또는 손의 피부) 상태를 보다 균일하게 조절하는데 유용하다. 이러한 조절은 예방적 및/또는 치료학적 조절을 포함한다. 피부 상태 조절은 본 발명의 조성물을 안전하고 유효한 양으로 피부에 국소 적용하는 것을 포함한다. 조성물의 적용 양, 적용 횟수 및 사용 기간은 피커스 세럼 분획의 농도 및/또는 소정의 조성물의 다른 성분들 및 원하는 조절 수준, 예를 들어 개체에 존재하는 피부 노화 수준과 추가적인 피부 노화 속도에 비추어, 크게 달라질 것이다.

I. 피커스 세럼 분획의 생-활성

또한, 본 발명은, 멜라닌생성(멜라닌 합성)의 하나 이상의 단계를 교란하기 위해 화장료 조성물을 과색소 침착된 부위에 국소 적용함으로써, 피부의 색소 침착 외양을 완화하는 방법에 관한 것이다. 화장료 조성물은 효소 저해 (트립신 저해 활성 및/또는 티로시나제 저해 활성), 항산화 활성 (ORAC 및 DPPH) 및/또는 COX-2 저해 효과를 발휘하여, 멜라닌생성과 관련된 한가지 이상의 단계를 교란한다.

생활성의 식물성 화장료 조성물의 제조 방법은, 식물 세포에 함유된 전체 활성 스펙트럼을 획득한 식물 추출물을 수득한다는 점에서 현재 이용가능한 방법들에 비해 유익하다. 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 피커스 추출물은 전통적인 방식을 통해 추출한 피커스 보다 생활성이 훨씬 높다.

본 발명의 일 구현예에서, 포유류의 피부를 미백화하는 방법은 피커스 세럼 분획을 트립신 활성을 저해하는데 유효한 양으로 포함하는 화장료 조성물을 국소 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예는 유효량의 피커스 세럼 분획을 포함하는 화장료 조성물을 포유류에게 국소 투여하는 단계를 포함하는, 포유류 피부에서 티로시나제 활성을 저해함으로써 포유류의 피부를 미백화하는 방법을 포함한다.

정상적인 피부색은 체모와 눈의 색상을 결정하는 천연 색소인 멜라닌에 의해 형성된다. 피부에서, 효소 티로시나제는 아미노산 티로신을 멜라닌으로 변환시키는 담당 생화학적 경로에 필수적인 효소이다. 멜라닌이 너무 많이 생산되어 피부에 퇴적물을 형성하였을 때, 과색소 침착이 발생한다. 색소를 만드는 세포를 멜라노사이트라고 칭한다. 이것은 표피의 기저에 위치한다. 멜라노사이트는 멜라노솜을 생산하는데, 멜라노솜은 표피의 다른 세포 위로 이동하여 피부 최상층까지 움직인다. 멜라닌 합성은 멜라노솜에서만 이루어진다. 맬라닌이 너무 많이 생산되면, 퇴적물이 형성되고, 피부에 과색소 침착이 나타난다.

티로시나제는 모노페놀을 대응되는 카테콜로의 o-수산화 (모노페놀라제 또는 크레솔라제 활성)와, 모노페놀의 대응되는 o-퀴논으로의 산화 (디페놀라제 또는 카테콜라제 활성)를 촉매하는, 구리-함유 모노옥시게나제이다. 티로시나제의 이러한 기능들은 멜라닌생성시에 멜라닌 색소 형성에 중요한 역할을 수행한다. 멜라닌 생성은 원칙적으로 피부의 색을 결정하며, 태양으로 인한 피부 손상을 방지하는데 중요한 역할을 한다. 그러나, 피부내 멜라닌의 비정상적인 생성은, 바람직하지 않은 미적 외양을 유발할 수 있는, 흑피증(melasma), 기미(chloasma), 주근깨(freckle), 및 노인성 흑색점을 비롯한 과색소 침착의 원인이다 (Jeon et al. (2005) Bull. Korean Chem. Soc, Vol. 26: 1135-1 137).

본 발명은 일반적으로 포유류의 피부 조직내 색소 침착 또는 피부 발색을 담당하는 하나 이상의 효소의 활성 저해에 관한 것이다. 피커스 세럼 분획은 트립신 뿐만 아니라 티로시나제와 그외 티로시나제-유사 효소의 활성을 저해할 수 있다. 아울러, 본 발명은 슈퍼옥사이드 스캐빈저 활성 (ORAC 및 DPPH) 및 COX-2 저해를 비롯하여, 색소-관련 항산화 활성에 대한 효과에 관한 것이다.

세럼 유래 화장료 조성물은 ICR50 값이 약 50 - 190 ㎍ 건물/ml 범위인 슈퍼옥사이드 스캔빈저 효능을 가진다. 본원에서, 용어 "ICR50 값"은 사이토크롬 C 환원을 50% 저해하는데 필요한 세포 세럼 분획이 함유된 건물의 농도이다.

화합물은 포유류에게 매일 수회로 자주 투여하거나, 또는 1일 1회, 1주 1회, 2주에 1회, 매달 1회, 또는 그 보다는 적은 빈도와 같이 매우 적은 빈도로, 예컨대, 수 개월에 1회 또는 심지어 1년에 1회 또는 그 미만으로 투여할 수 있다. 투약 빈도는 당해 기술 분야의 당업자에게 매우 자명할 것이며, 비제한적인 예로서 치료 중인 질병의 타입과 중증도, 동물의 타입과 연령 등과 같은 임의의 다수의 인자에 따라 결정될 것이다.

J. 선택 성분

본 발명의 조성물은 소정의 제품 타입에 통상적으로 사용되는 다양한 다른 성분들을 포함할 수 있지만, 단, 이들 성분들은 본 발명의 효능을 허용 불가한 수준으로 변형시키지 않는 것이다. 본 조성물은 피부학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.

선택 성분은, 조성물에 병합하는 경우, 과도한 독성, 상용불가성, 불안정성, 알레르기 반응 등을 유발하지 않으면서 본 발명의 범위내에서 인간 피부 조직에 접촉 사용하는데 적합하여야 한다.

The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992)에는, 피부 케어 산업에서 통상적으로 사용되는 비제한적인 화장료 및 제약 성분들이 광범위하게 기술되어 있으며, 이들은 본 발명의 조성물에 사용하는데 적합하다. 이러한 성분 유형의 예로는, 연마재, 흡수제, 향료와 같은 미적 성분, 색소, 착색제/채색제, 에센셜 오일, 케이킹 방지제(anti-caking agent), 소포제, 바인더, 생물학적 첨가제, 완충화제, 벌킹제, 킬레이트제, 화학 첨가제, 채색제, 코스메틱 수렴제, 코스메틱 살생물제, 변성제, 약물 수렴제, 외용 진통제(external analgesics), 막 형성제 또는 막 재료, 예, 막 형성 특성 및 조성물의 직접성(substantivity)을 보조하기 위한 폴리머 (예, 에이코센과 비닐 피롤리돈의 공중합체), 불투명화제, pH 조절제, 추진제, 환원제, 격리제 및 증점제를 포함한다.

일부 구현예에서, FSF와 조합하여 조성물에 제2, 제3 또는 제4 피부 톤 개선제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 제2, 제3 또는 제4 피부 톤 개선제는 전체적인 피부 톤을 추가로 개선시키기 위해 포함시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은, 추가적인 피부 톤 개선제를, 존재하는 경우, 조성물에 대해 (중량%로) 약 0.1% 내지 약 50%, 더 바람직하게는 약 0.2% 내지 약 20%, 보다 더 바람직하게는 약 1% 내지 약 10%로 포함한다. 추가적인 피부 톤 개선제의 최적량은 효능이 상당히 다르기 때문에 선택되는 구체적인 활성 성분에 따라 다르므로, 본원에 열거된 양은 단지 가이드로서 사용되어야 한다. 바람직한 피부 톤 개선제로는, N-아세틸글루코사민, 비타민 B3 및 운데실레노일페닐알라닌 (예, 프랑스 Seppic 사에서 상표 Sepiwhite로 판매됨)이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 한가지 조성물 (표 #1에서 조성물 #1)은 하나 이상의 과색소 침착된 반점에 대한 국소 치료로서 사용하고, 하나 이상의 다른 조성물 (예, 표 #1에서 조성물 #2, #3, 및 #4)을 특수 처리 전 또는 후에 얼굴 전체의 피부 톤을 개선시키기 위해 얼굴 피부 표면에 보다 넓게 적용할 수 있다.

본 발명의 국소 조성물은, 비제한적인 예로서, 로션, 밀크, 무스, 세럼, 스프레이, 에어로졸, 폼, 스틱, 펜슬, 젤, 크림 및 연고 등의 다양한 형태로 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 용액 형태이고, 다른 구현예에서, 조성물은 로션 형태이다.

K. 조성물 제조

본 발명의 조성물은 국소 조성물 제조 분야에 공지된 방법과 같은 통상적인 방법으로 일반적으로 제조한다. 이러한 방법은 전형적으로 열처리를 가하거나 하지 않으면서 구성 성분들을 하나 이상의 단계로 상대적으로 균일한 상태로 혼합하는 단계, 냉각 단계, 진공 적용 등을 포함한다. 전형적으로, 조성물은 바람직하게는 활성 물질들의 안정성 (물리적 안정성, 화학적 안정성, 광안정성) 및/또는 전달을 최적화하도록 제조된다. 이러한 최적화는 적정 pH (예, <7), 활성 제제에 착화하여, 안정성 또는 전달에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 물질의 제외 (예, 오염원 철의 제거), 복합체 형성을 방지하기 위한 방식 이용 (예, 적절한 분산제 또는 듀얼 구획 패킹), 적합한 광안정성 방식의 사용 (예, 선스크린/선블럿 첨가, 불투명 포장 사용) 등을 포함할 수 있다.

L. 치료 방법

일 구현예에서, 사용자는 치료하기 위한 과색소 침착된 반점을 선정하고, 제1 조성물을 1일 1회 이상, 보다 바람직하게는 1일 2회 이상으로 약 4주 이상의 기간 동안 과색소 침착된 반점에 적용한다. 다른 구현예에서, 제1 조성물은 약 8주 이상의 기간 동안 선택한 과색소 침착된 반점에 적용한다. 제1 조성물은 임의 형태일 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 과색소 침착된 반점에 점안기로 국소적으로 적용한다. 제1 조성물을 과색소 침착된 반점에 국소적으로 적용할 수 있는 다른 어플리케이터도 사용할 수 있다. 예를 들어, 용액, 로션 또는 본원에 기술된 다른 형태와 같은 제1 조성물을 방출가능하게 보유하는 폼 또는 코튼 팁형의 어플리케이터를, 과색소 침착된 반점에 조성물을 적용하기 위해 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 과색소 침착된 반점에 적용되며, 보다 일반적으로는 하나 이상의 얼굴 피부 표면에 동시에 (즉, 동일한 처리 사이클로) 적용된다.

일부 예들에서, 치료 방법은 제1 조성물을 1회 처리 사이클로 국소 처리하기 위한 과색소 침착된 복수의 반점을 선정하는 단계를 포함한다. 본원에서, 처리 사이클은 의도한 얼굴 표면에 조성물을 1회 적용하는 것을 의미한다. 예를 들어, 합리적으로 단기간에 연속하여 하나 이상의 과색소 침착된 반점에 제1 조성물을 단회 적용하는 방식은 단회 처리 사이클일 것이다. 대조적으로, 하나 이상의 과색소 침착된 반점에 제1 조성물을 1일 2회로 단회 적용하는 방식은 2회 처리 사이클로서, 이때 적용은 보다 긴 간격 (예, 1 내지 12시간의 간격)으로 각각 이루어진다.

일 구현예에서, 치료 방법은 제1 조성물을, 제1 조성물 전 또는 후에 적용되는 제2 조성물과 조합하여 적용하는 것을 포함하며, 이때 제2 조성물은 얼굴 피부의 전체 톤 관련 외양을 개선시키기 위해 하나 이상의 얼굴 피부 표면에 보다 전체적으로 적용한다. 제2 조성물은 이마, 입 주변, 턱, 눈 주변, 코 및 볼 피부 표면 중 하나 이상에 적용할 수 있다. 일 구현예에서, 제2 조성물은 단회 처리 사이클로 적어도 볼, 이마 및/또는 턱/입 주변 피부 표면에 동시에 적용한다. 과색소 침착된 반점의 국소 처리에 비해 제2 조성물이 적용되는 표면적은 더 넓다.

본원에 기술된 몇가지 방법들은 어플리케이터를 사용하여 본 발명의 조성물을 적용하는 것을 고려하지만, 어플리케이터가 필요하지 않으며, 본 발명의 조성물을 직접 또는 사용자의 손가락을 이용하여 (또는 일부 기타 방식으로) 적용할 수 있다는 것도 알 것이다. 나아가, 본 발명의 일 구현예는 과색소 침착된 반점에 국소 조성물을 적용하는 것을 고려하지만, 본 발명의 조성물을 얼굴 피부 영역내에 침착된 과색소 침착된 반점들의 외양을 완화하기 위해 하나 이상의 얼굴 피부 표면에 보다 전체적으로 적용할 수 있음을 알 것이다.

아래 실시예들은 본 발명의 임의 특징들과 효과들을 제공하지만, 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

본 발명은 아래 실시예들을 참조하여 이하 설명된다. 이들 실시예들은 단지 예시하기 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로도 실시예로 제한되는 것으로 해석되진 않아야 하며, 본원에 제시된 교시 내용의 결과로서 자명해지는 임의의 변형과 모든 변형들을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.

실시예 1

피커스 벵갈렌시스 ( Ficus benghalensis )의 생잎 유래의 생활성 분획의 제조

도 1은 피커스 생잎으로부터 생활성 세럼 분획을 제조하는 방법의 일 구현예를 나타낸 계략도이다.

피커스 벵갈렌시스 생잎을 충분한 양으로 채집하여, 건물 약 100 kg을 수확하였다. 생잎의 건물 함량은 32.01%로 측정되었는데, 건물 100 kg을 회수하기 위해서는 식물 생잎 약 312.4 kg을 수확하여야 한다. 생잎의 본래의 수분량을 유지하면서 수분 감소로 인한 시듦을 방지하도록 주의를 기울여야 한다. 채집은 채집한 생잎에 어떠한 손상도 가해지지 않거나 최소화하는 방식으로 수행하였다. 모든 공정들은 생잎의 태양, 고온 및 기타 부정적인 환경 요인으로의 노출을 최소화하기 위해 가능한 최단 시간내에 완료하였다.

채집한 잎을 5분 이하의 시간내에 ≤ 1 kg/cm²의 수압으로 세척하여, 추가로 처리하기 전에 잎에서 흙 입자와 그외 찌꺼기를 제거하였다. 물 세척 잔류물에는 어떠한 녹색 또는 갈색 색소가 함유되어 있지 않았는데, 이는 잎 조직의 완전성, 수압의 적절함 및 세척 시간의 적절함을 의미한다. 과량의 물을 세척한 잎에서 제거하였다. 세척한 피커스 생잎을 기계적으로 해리하여, 주로 세포벽을 포함하는 섬유질이 풍부한 물질로부터 유조직 세포의 세포내 물질 대부분이 함유된 섬유질 무함유 세포즙을 효율적으로 분리하였다. 해리 공정 전 또는 중에는 외부 용매나 물은 첨가하지 않았다.

세척한 잎을 갈기, 침용 연화 및 압착하여, 액상 세포내 함유물 (즉, 세포즙)을 수득하고, 이를 섬유질이 풍부한 물질로부터 분리시켰다. 5 HP 엔진과 한세트의 스크린이 구비된 해머 밀 (Model VS 35, Vincent Corporation, Tampa, FL)을 사용하여, 잎을 갈아 단시간 안에 생중량 온도를 현저하게 상승시키지 않으면서 적합하게 작은 크기의 잎 조직 입자를 만들었다. 해머 밀은 10초 이하의 처리 시간 동안 최대 크기 2.0 cm 이하의 침용 연화된 잎 입자가 제조되도록 설정하였다. 침용 연화한 생잎의 온도는 단지 2℃ 이하로 증가되었다.

압축 공기에 의해 유지되는 콘이 장착된 수평 배치된 연속적인 스크류 프레스 (Compact Press CP-6, Vincent Corporation, Tampa, FL)를 즉시 사용하여, 침용 연화시킨 생잎으로부터 세포즙을 수득하였다. 콘 상의 압력은 15 kg/cm² 이상의 수준으로 유지시켰고, 스크류 속도는 12 rpm이었다. 이 조건에서 세포즙의 온도는 단지 5℃ 이하로 증가되었다.

이러한 처리로, 섬유질이 풍부한 물질과 세포즙이 만들어졌다. 연속 플로우 원심분리기 (Model 12-413V, AML Industries, Inc., Hatboro, PA)와 완전-자동화된 배출 유닛(discharge unit)을 이용한 청징(clarification)에 의해, 세포즙에서 남아있는 작은 섬유질 입자를 추가로 제거하였다. 유속 2 L/분에서, ≤ 2,250 g의 세포즙을 청징하기 위한 체류 시간은 100초 이상이었다. 이러한 방법으로 섬유질이 함유되지 않은 세포즙을 제조하였다. 소형 섬유질 입자가 포함된 침전물을 수집하고, 이를 생잎 압착 후 수득되는 섬유질이 풍부한 나머지 물질과 조합하였다.

전술한 공정들로, 건물 함량 9.29%의 세포즙 160.9 kg과 건물 함량 56.14%의 섬유질 풍부 물질 151.5 kg을 생산할 수 있었다. 세포즙은 바로 밀폐된 15L 장방향 HDPE 용기에 넣어, -30℃에서 냉동시켰다. 고상의 냉동된 세포즙을 이후 사용하기 위해 이 온도에서 보관하였다.

세포즙에는 주요 성분 3종이 포함되어 있다: (i) 막 결합형 엽록체, 미토콘드리아, 소포체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 액포, 골지 기관; (ii) 막 비결합형 리소좀, 미소관; 및 (iii) 상기한 군에 포함되지 않는 요소, 예컨대 세포질. 세포즙에 세포 기관 및 이의 단편 뿐만 아니라 원치않은 색소와 단백질이 존재하기 때문에, 비제한적인 예로서 색, 가용성, 투명성, 안정성 및 시험관내 활성을 비롯하여, 기능적인 특성들을 바람직한 조합으로 구비한 퍼스널 케어 구성 (personal care ingredient)을 만들기 위한 분별 과정(fractionation)이 필요하였다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 세포즙을 세포즙 유동화, pH 조정, 집중식 마이크로웨이브 조사, 원심분리에 의한 분리 및 진공 여과 등의 다양한 처리를 통해 분별하였다. 분리한 세포즙 세럼 분획을 보존제와 항산화제를 첨가하여 안정화하였다.

세포즙 처리 기간과 강도는 산화 스트레스, 가수분해, 변성, 이성체화, 중합 및 기타 원치않은 공정을 생략하기 위해 최소화하였다.

2분 이하의 시간 동안 유동화하여, 15 L 용기내 세포즙을 냉동 상태에서 처음 액체 상태로 전환시켰다. 이러한 처리 중에, 세포즙의 온도는 불과 20℃ 이하까지만 증가되었다. 이러한 단시간내 처리로 변성 공정과 산화적 손상 둘다를 최소화할 수 있었다. 세포즙의 냉동 및 유동화 이후의 물리화학적 특성과 생화학적 특성은 생잎으로부터 세포즙을 분리하는 중에 측정한 이의 대응 특성들과 동일하였다. 이러한 특성으로는 이의 건물 함량, pH, 전도도, 환원-산화 전위, 삼투질 농도(osmolality) 및 IR 스펙트럼을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

중성에 가까운 세포즙의 pH를 5.0 N 염산 (HCl)을 이용한 적정법으로 세포즙의 pH를 3.0 이상으로 낮추었다 (pH 조정 1). 조정된 세포즙을 주파수 2,450 MHz의 집중식 마이크로웨이브 조사에 의해 즉각적으로 처리하였다. 집중식 마이크로웨이브 처리 (FMP)를 수행하는 동안에, 세포즙의 온도는 즉시 90℃로 상승하였으며, 이 온도에서 1분간 유지시킨 후, 세포즙의 온도를 즉시 30℃ 이하로 떨어뜨렸다. 그런 후, 처리한 세포즙을 연속 플로우 원심분리기 CEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Germany)에서 15,000 rpm 및 체류 시간 ≥ 30초로 사용하여 즉시 분리하였다. 처리한 세포즙 15.0 kg을 분리하여, 녹색을 띠는 페이스트형 침전물 ("침전물 I") 1.37 kg과, 건물 함량이 6.75%이고 연갈색의 약간 유백광을 띠는 액체 상층물 ("상층물 I")을 수득하였다. 이 상층물 I을 추가적인 분별에 사용하였다.

표 1은 pH 조정한 세포즙의 FMP 처리 (Tmax) 중에 달성되는 최고 온도가, 상층물 I의 건물 함량과 이의 색상 및 엽록소 a와 엽록소 b의 존재(각각 662 nm 및 642 nm에서 흡광 측정하여 결정함)에 미치는 효과 데이타를 나타낸다.

표 1. 상층물 I의 선택 파라미터에 대한 FMP Tmax 효과

FMP Tmax ℃	건물 함량%	색 (가드너 체계)	662 nm에서의 흡광	642 nm에서의 흡광
20 (대조군)	6.19	6.5	0.044	0.032
60	6.45	8.0	0.017	0.014
90	6.95	8.5	< 0.005	< 0.005
120	6.39	9.0	< 0.005	< 0.005
140	6.35	10.5	< 0.005	< 0.005
150	6.33	12.5	< 0.005	< 0.005
170	5.72	14.5	< 0.005	< 0.005
200	5.44	18.5	< 0.005	< 0.005

표 1 데이타는 Tmax = 90℃에서 수득한 상층물 I이 건물 함량이 더 높으며, 엽록소는 함유하지 않는 것으로 보여준다. 가드너 체계의 값은 Tmax = 60℃에서 수득한 상층물 I이 더 낮았지만, 이 조제물은 건물 함량이 상당히 더 낮았고, 엽록소 잔류량이 더 높았다. 화장료 성분에 엽록소가 존재하는 것은 원치않은 일일 뿐만 아니라, 이 색소는 독성 화합물로 간주되며 (Bergstrom, L.C., Vucenik, I., Hagen, I.K., Chernomorsky S.A., Poretz R.D. In-vitro photocytotoxicity of lysosomotropic immunoliposomes containing pheophorbide a with human bladder carcinoma cells. - J. Photochem. Photobiol., 24, 1, 17 - 23, 1994) 피부 자극의 원인인 (Kato T., Yamada K. Relationship between appearance of photosensitization and total pheophorbide level in spirulina powder. - J. Food Hyg. Soc. Japan, 36, 632 - 634, 1995), 페오포르비드로 변환될 수 있다.

상기한 이유로, pH 조정한 세포즙의 FMP Tmax = 90℃를 상층물 I을 수득하기 위한 선호 용법으로서 선정하였고, 비제한적인 예로서 퍼스날 케어 성분의 색, 투명도 및 안정성을 비롯한 기능적인 특성을 개선하기 위한 추가적인 분별에 사용하였다. 상층물 I은, (i) 비제한적으로 티노시나제, 엘라스타제, 트립신, 사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 저해 활성 등의 효소 저해 활성, (ii) 유리 라디컬 스캐빈저 활성, 및 (iii) 비제한적인 예로서 산소 라디칼 흡착력 등의 항산화 활성 등의 시험관내 활성 측면에서 적합하다는 것에 유념하여야 한다. 시험관내 활성에서 상기 모든 매우 중요한 사항을 고려하여, 적합한 퍼스날 케어 성분의 기능적인 특성을 개선시키기 위해 필요한 추가적인 처리들은 영향을 미치지 않아야 한다. 조성물의 개선과 관련하여, 상층물 I은 갈색 색소와 잔류 단백질 등의 원치않은 기타 화합물들을 상당히 제거하기 위해 추가적으로 처리하여야 한다.

이를 위해, 대상 상층물 I을 pH 조정 및 분리를 비롯한 추가적인 처리를 수행하였다. 1차 처리는 50% 수산화나트륨 (NaOH)을 이용한 적정법으로 세포즙 상층물 I의 pH를 ~ 3.0에서 ~ 7.5로 증가시켰다 (pH 조정 2). pH = 7.5 이상에서, 상층물 II에서 바람직한 엘라스타제 및 트립신 저해 활성이 상실됨에 유념하여야 한다. pH 조정 2로, 색상은 더 진해지고 유백광을 띄게 되었으며, 이는 연속적인 플로우 원심분리기 CEPA LE (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Germany)를 15,000 rpm으로 30초 이상의 체류시간으로 이용하여 즉각적으로 청징 처리하였다. 이러한 분리를 통해 갈색 페이스트 침전물 (이후 침전물 II라 함) 0.53 kg과 갈색에 약간 유백광을 띄고 건물 함량이 6.59%인 상층물 (이후 상층물 II라 함) 13.10 kg을 수득하였다.

그 후, 상층물 II를, 5.0 N 염산 (HCl)을 이용한 적정을 수행하여, pH를 ~ 3.6으로 떨어뜨린다 (pH 조정 3). 이러한 처리로 적정한 상층물 II의 색은 좀더 밝아졌지만 유백광은 약간 강해졌다. 이 물질을 포어 크기가 0.2 ㎛인 막을 통한 제균 여과 처리하였다. 이로써 피커스 생잎의 연한 색을 띠는 투명한 세럼 분획이 수득되었다.

세럼 분획의 색 지수 (가드너 체계 수치 = 7.0)는 상층물 I의 색 지수 (가드너 체계 수치 = 8.5) 보다 낮았다. 세럼 분획의 가드너 체계 색 지수가 다른 FMP Tmax 조건들에서 수득한 대응되는 상층물 I의 색 지수 보다 항상 낮았음에 유념하여야 한다 (표 2).

표 2. 세포즙 처리에 사용된 FMP Tmax의 상층물 I과 세럼 분획의 색 (가드너 체계)에 미치는 효과

FMP Tmax, ℃	상층물 I	세럼 분획
20 (대조군)	6.5	6.5
60	8.0	7.0
90	8.5	7.0
120	9.0	7.5
140	10.5	7.5
150	12.5	10.5
170	14.5	13.5
200	18.5	15.5

유동화, pH 조정 (pH 점위 3.0 - 7.0), 집중식 마이크로웨이브 조사 (FMP Tmax = 90℃, 1분간), 원심분리에 의한 분리 및 제균 여과 수행 후, 세포즙으로부터 수득한 세럼 분획에서는, 모든 바람직한 효소 저해 활성들, 유리 라디칼 스캐빈저 활성 및 항산화 활성이 확인되었다.

색도계 분석을 간섭할 수 있는 페놀계 화합물이 함유된 세럼 분획내 잔류 단백질의 함량을 측정하기 위해, 킬달 방법을 이용하여 세럼 분획과 이의 한외여과물내 질소 함량을 합리적으로 검출하였다. 여러가지 멤브레인을 사용하여, 분자량이 각각 ≤ 15, ≤ 10 및 ≤ 5 킬로달톤 (kD)인 3종의 여과물로 세럼 분획을 분리하였다. 샘플의 질소 함량 데이타를 표 3에 나타낸다.

표 3. 한외여과 조건이 세럼 분획 여과물내 질소 함량에 미치는 효과

샘플	질소 함량 (킬달 방법) %
세럼 분획 (대조군)	0.064
세럼 분획의 ≤ 15 kD 여과물	0.063
세럼 분획의 ≤ 10 kD 여과물	0.060
세럼 분획의 ≤ 5 kD 여과물	0.059

데이타는, 질소 함량이 심지어 저분자량 컷오프 막을 통한 한외여과를 수행한 후에도 현저히 변하지 않다는 것을 보여주며, 이는 세럼 분획내 모든 질소들이 실질적으로 비-단백질성임을, 즉 세럼 분획에 단백질이 함유되어 있지 않음을 의미한다.

세럼 분획의 추가적인 안정화를, 항산화제, 안정화제, 킬레이트제 및 보존제를 첨가하여 달성하였다. 실시예 1에 존재하는 것으로 개시된 세럼 분획을 안정화하기 위해 이용된 첨가제들의 조성을 아래에 나타낸다: 0.2 % 소듐 메타바이설파이트, 0.1 % 포타슘 소르베이트, 0.1 % 소듐 벤조에이트, 0.1 % 소듐 메틸 파라벤. 혼합물은 완전히 용해될 때까지 인큐베이션하였다 (≥ 30분). 그 후, 혼합물에 1.9 % 펜틸렌 글리콜을 첨가하였다.

세럼 분획은 건물을 약 6.38%로 함유하고 있었으며, 이의 피커스 생잎으로부터의 수율은 약 36%였다. 처음 피커스 생잎 건물 100 kg으로부터 수득한 세럼 분획은 약 7.2 kg이었다.

세럼 분획과 이의 시험관내 활성에 대한 선택 특징들을 표 4와 5에 나타낸다.

표 4. 피커스 벵갈렌시스로부터 수득한 세럼 분획의 선택 특징들

특징	결과
외양	맑은 노란색 액체
냄새	특유의 향
수용성	어떠한 비율에서도 용해됨
색 (가드너 체계)	7.0
건물 (%)*	6.38
굴절 지수 (nD)	1.3479
pH	4.03
삼투질 농도 (mOsm/kg)	874
UV 스펙트럼 특징 (nm)	Max 200 숄더형 ~264 숄더형 ~320
총 플레이트 카운트(Total Plate Count) (CFU/ 10 g)	< 10
곰팡이 & 효모 (CFU/ 10 g)	< 10
E. coli (CFU/g)	없음
살모넬라 sp. (CFU/g)	없음
스타필로코커스 아우레우스 (CFU/g)	없음
슈도모나스 sp. (CFU/g)	없음

*) 건물 (%)은 안정화제를 첨가하기 전에 제품에서 기록함.

표 5. 건물 퍼센트를 토대로 계산한 세럼 분획의 시험관내 선택 활성

활성	결과
티로시나제 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.362
엘라스타제 저해 활성 IC50, mg/ml)	0.067
트립신 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.342
사이클로옥시게나제-2 저해 활성 (IC50, mg/ml)	5.40
유리 라디칼 스캐빈저 활성 (1/X)*	2.57
산소 라디칼 흡착력 (1/Y)**	0.98

*) X - 1 유닛의 건중량 DPPH를 완전히 포착하기 위한 시험 물질의 건중량 유닛 수.

**) Y - 1 유닛의 건중량 (R)-트롤록스 메틸 에테르와 동일한 항산화 효과를 발생시키는 시험 물질의 건중량 유닛 수.

실시예 2

피커스 벵갈렌시스의 세포즙으로부터 수득한 세럼 분획의 특징과 시험관내 활성 비교

여러 곳에서 피커스 생잎을 채집하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 세포즙으로 가공하였다. 이 세포즙을 밀폐된 15 L 장방형 HDPF 용기에 넣어 냉동하여 -30℃에 보관하였다. 실시예 1에 기술된 공정과 동일한 공정으로 하나 이상의 용기를 한번에 세럼 분획으로 가공 처리하였다.

표 6과 표 7의 데이타는, 동일한 냉동 세포즙 소스를 다른 횟수로 여러번 분별한 세럼 분획과 다른 냉동 세포즙 소스로부터 분별하여 수득한 세럼 분획들의 선택 특징과 시험관내 활성의 가변성을 보여준다.

표 6. 피커스 벵갈렌시스 세포즙으로부터 수득한 세럼 분획의 선택 특징들

특징	결과
외양	맑은 노란색 내지 노란색-적색을 띠는 액체
냄새	특유의 향
수용성	모든 비율에서 용해됨
색 (가드너 체계)	6.0 - 7.5
건물 (%)*	6.08 - 7.05
굴절 지수 (nD)	1.3479 - 1.3488
pH	3.88 - 4.03
삼투질 농도 (mOsm/kg)	860 - 972
UV 스펙트럼 특징 (nm)	Max 200 숄더형 ~264 숄더형 ~280 숄더형 ~320**

*) 건물 (%)은 안정화제를 첨가하기 전에 제품에서 기록함.

**) 숄더형는 여러 설정 조건에서의 스펙트럼 분석에 따라 일부 샘플에서 동정할 수 있음.

표 7. 건물 퍼센트를 토대로 계산한 세럼 분획의 시험관내 선택 활성

특징	결과
티로시나제 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.133 - 0.437
엘라스타제 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.067 - 0.103
트립신 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.342 - 1.003

실시예 3

피커스 벵갈렌시스 건조 잎의 수추출물 제조

공기 중에 건조한 피커스 벵갈렌시스 잎 50 g (실시예 1에서 사용된 잎과 동일 배치에서 채집함)을 GM200 Grindomix 나이프 밀 (Retsch, Germany)로 갈아, 크기가 < 300 ㎛인 입자를 제조한다. 그라인딩은 2,500 rpm으로 20초 -> 2,500 rpm으로 10초 -> 10,000 rpm으로 10초로 수행하는 과정이다. 간 잎들을 OMNI Programmable Digital Homogenizer (OMNI International, Kennesaw, GA)를 사용하여 탈이온수로 균질화하였다. 간 잎 35 g을 물 490 g과 혼합하여, 호모게나이저 플랫폼 위에서 얼음조 안에 넣었다. 균질화는 15,000 rpm으로 15분간 20 mm 호모게나이저 제너레이터를 사용하여 수행하였다. 이후, 균질물에 이니시에이터 2 집중식 마이크로웨이브 프로세서 (Biotage AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 1분간 90℃에서 마이크로웨이브를 처리하였다. 마이크로웨이브 처리한 물질을 30분간 3,200 g로 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 진공 하에 와트만 2번 페이퍼 3층으로 여과하고, 여과물을 염산 (HCl)으로 pH 4.0으로 적정하였다. 적정한 물질을 30분간 3,200 g로 원심분리하고, 상층액을 진공 하에 0.2 ㎛ 제균 필터로 여과하였다. 샘플에 안정화제를 첨가하였다: 0.2% 소듐 메타바이설파이트, 0.1% 포타슘 소르베이트, 0.1% 시트르산, 0.1% 소듐 벤조에이트. 혼합물을 완전히 용해될 때까지 인큐베이션하였다 (≥ 30분). 수득한 건조 잎의 수 추출물을 유리 바이얼에 넣어, 실온 암조건에서 저장하였다. 건조한 피커스 잎의 수 추출물에 대한 선택 특징과 시험관내 활성을 표 8에 나타낸다.

표 8. 피커스 벵갈렌시스 건조 잎의 수 추출물에 대한 선택 특징들과 시험관내 활성들

특징 또는 활성*	결과
외양	적갈색 액체
냄새	특유의 향
수용성	모든 비율에서 용해됨
색 (가드너 체계)	13.0
건물 (%)	2.23
굴절 지수 (nD)	1.3373
pH	3.98
삼투질 농도 (mOsm/kg)	261
UV 스펙트럼 특징 (nm)	Max 200 숄더형 ~278 숄더형 ~320
티로시나제 저해 활성 (IC50, mg/ml)	1.45
유리 라디칼 스캐빈저 활성 (1/X)**	3.40
산소 라디칼 흡착력 (1/Y)***	1.04

*) 제시한 시험관내 활성은 건물 퍼센트를 토대로 계산함.

**) X - 1 유닛의 건물 DPPH를 완전히 포착하기 위한 시험 제품의 건중량 유닛 수.

***) Y - 1 유닛의 건중량 (R)-트롤록스 메틸 에테르와 동일한 항산화 효과를 발생시키는 시험 제품의 건중량 유닛 수.

피커스 건조 잎의 수 추출물은, 시험한 광의의 농도 범위내에서, 엘라스타제, 트립신 및 사이클로옥시게나제-2 저해 활성을 나타내지 않았다. 피커스 벵갈렌시스의 동일 잎 배치에서 수득한 수 추출물과 세럼 분획의 선택 특징 및 시험관내 활성을 비교하여 표 9에 나타낸다.

표 9. 피커스 벵갈렌시스의 동일 잎 배치에서 수득한 수 추출물과 세럼 분획의 선택 특징과 시험관내 활성 비교*

특징 또는 활성	수 추출물	세럼 분획
외양	적갈색 액체	투명한 노란색 액체
냄새	특유의 향	특유의 향
수용성	모든 비율에서 용해됨	모든 비율에서 용해됨
색 (가드너 체계)	13.0	7.0
건물 (%)	2.23	6.38
굴절 지수 (nD)	1.3373	1.3479
pH	3.98	4.03
삼투질 농도 (mOsm/kg)	261	874
UV 스펙트럼 특징 (nm)	Max 200 숄더형 ~278 숄더형 ~320	Max 200 숄더형 ~264 숄더형 ~320
티로시나제 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.72	0.362
엘라스타제 저해 활성 (IC50, mg/ml)	검출 안됨	0.067
트립신 저해 활성 (IC50, mg/ml)	검출 안됨	0.342
사이클로옥시게나제-2 저해 활성 (IC50, mg/ml)	검출 안됨	5.40
유리 라디칼 스캐빈저 활성 (1/X)**	3.40	2.57
산소 라디칼 흡착력 (1/Y)***	1.04	0.98

*) 제시한 시험관내 활성은 건물 퍼센트를 토대로 계산함.

실시예 4

상이한 피커스 종과 지역에서 수득한 세럼 분획들의 특징 및 시험관내 활성

인도와 플로리다 (미국)에서 채집한 피커스 벵갈렌시스 생잎 외에도, 아래 피커스 종들의 생잎들을 세럼 분획 제조용 분별화에 사용하였다: 피커스 카리카(Ficus carica), 피커스 엘라스티카(Ficus elastica), 피커스 마이크로파르파(Ficus microcarpa) 및 피커스 트리고나타(Ficus trigonata). 푸에르토 리코에서 자란 피커스 트리고나타를 제외하고는, 상기한 피커스 종들은 미국 플로리다에서 재배하였다.

실시예 1에 기술된 공정을 통해 세럼 분획을 수득하였다. 이들 분획들 모두 수율, 선택된 물리-화학적 특징 및 시험관내 활성에 대해 비교하였다 (표 10, 표 11 및 표 12).

표 10. 피커스 생잎의 분별화에 따른 제품들의 비교

피커스 종들	생잎 건물 %	세포즙 수율 %	세포즙 건물 %	세포즙 색	세포즙 pH	세럼 분획 수율 %	세럼 분획 건물 %
피커스 벵갈렌시스 (인도)	32.01	51.5	9.29	연녹색	6.31	36.0	6.38
피커스 벵갈렌시스 (플로리다)	32.21	41.1	9.53	연녹색	6.08	32.2	7.05
피커스 카리카 (플로리다)	16.25	66.1	6.38	진갈색	6.71	51.6	5.14
피커스 엘라스티카 (플로리다)	19.63	60.6	6.03	갈색	5.60	40.6	5.43
피커스 마이크로카르파 (플로리다)	28.76	46.2	9.13	녹색	6.74	30.1	8.06
피커스 트리고나타 (푸에르토-리코)	25.12	44.2	5.67	진녹색	5.71	32.4	5.39

상기 데이타는, 여러가지 피커스 종들에서 생잎내 건물 함량, 세포즙의 수율 및 세럼 분획의 수율 뿐만 아니라 이의 건물 함량, 색 및 pH가 매우 크게 다르다는 것을 보여준다. 인도와 플로리다에서 재배한 2종의 피커스 벵갈렌시스 간의 대응되는 차이들은 다른 피커스 종들에서의 차이 보다 적게 나타났다.

이러한 결론은 여러가지 피커스 종들에서 수득한 세럼 분획의 선택된 물리-화학적 특징 (표 11)과 시험관내 활성 (표 12) 비교와 관련된 추가적인 데이타에 의해 ?받침된다.

표 11. 상이한 피커스 종들에서 수득한 세럼 분획들의 비교.

	피커스 벵갈렌시스 (인도)	피커스 벵갈렌시스 (플로리다)	피커스 카리카	피커스 엘라스티카	피커스 마이크로카르파	피커스 트리고나타
외양	맑은 노란색 액체	맑은 노란색 액체	맑은 오렌지색 액체	맑은 노란색 액체	맑은 노란색 액체	맑은 오렌지색 액체
냄새	특유의 향	특유의 향	특유의 향	특유의 향	특유의 향	특유의 향
수용성	모든 비율에서 용해됨	모든 비율에서 용해됨	모든 비율에서 용해됨	모든 비율에서 용해됨	모든 비율에서 용해됨	모든 비율에서 용해됨
색 (가드너 체계)	7.0	7.5	11.5	7.5	9.5	11.5
건물 (%)	6.38	7.05	5.14	5.43	8.06	5.39
굴절 지수 (nD)	1.3479	1.3488	1.3453	1.3456	1.3515	1.3460
pH	4.03	3.88	3.95	3.86	3.90	3.86
삼투질 농도 (mOsm/kg)	874	972	801	817	913	817
UV 스펙트럼 특징 (nm)	Max 200 숄더형 ~264 숄더형 ~320	Max 200 숄더형 ~264 숄더형 ~320	Max 200 변곡점 210 바닥 237 피크 255 피크 318	Max 200 변곡점 227 피크 256 숄더형 ~316	Max 200 피크 205 피크 268 숄더형 ~310	Max 200 피크 257 피크 317

표 12. 상이한 피커스 종들에서 수득한 피커스 세럼 분획들의 시험관내 선택 활성*

	피커스 벵갈렌시스 (인도)	피커스 벵갈렌시스 (플로리다)	피커스 카리카	피커스 엘라스티카	피커스 마이크로카르파	피커스 트리고나타
티로시나제 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.362	0.437	0.049	0.482	0.482	0.490
트립신 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.342	1.003	1.074	> 100 (효과없음)	1.235	4.010
엘라스타제 저해 활성 (IC50, mg/ml)	0.067	0.092	1.543	1.175	0.549	1.219
COX-2 저해 활성 (IC50, mg/ml)	5.40	3.1	> 200 (효과없음)	> 200 (효과없음)	0.7	> 200 (효과없음)
유리 라디칼 스캐빈저 활성 (1/X)**	2.57	2.82	11.41	11.16	3.27	4.53
산소 라디칼 흡착력 (1/Y)***	0.98	1.01	1.88	2.91	0.54	1.18

*) 제시한 시험관내 활성은 건물 퍼센트를 토대로 계산함.

실시예 5

전통적인 피커스 (피커스 벵갈렌시스) 추출물 대 피커스 세럼 분획의 LC/UV/MS 크로마토그램 비교

피커스 추출물과 FSF의 구성 성분들을, C18 컬럼에서 LC 분리한 후 240-500 nm에서의 UV 검출과 (+)-이온 (m/z 150-1150) 및 (-)-이온 (m/z 100-1100) 모드에서의 전자분무 질량 분광측정법으로 검출하였다. 사중극자 MS(quadrupole MS)에서 이용되는 높은 스캔 속도로 인해, 오직 주요 성분들 및/또는 이온화 성능이 우수한 성분들만 질량 크로마토그램에서 관찰되었다. 피커스 세럼 분획 유래 피커스 추출물을 TOF/MS로 분석하고, 이의 실제 질량과 인-소스(in-source) 단편화 데이타를 토대로 구조를 구하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 전통적인 피커스 추출물에는 FSF에서 검출되지 않은 좀더 후기에 용리되는 (소수성이 보다 강한) 화합물들이 포함되어 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 후기-용출 화합물들의 일군은 엽록소 분해 산물인 페오포르비드인 것으로 보인다. 도 4는, 전통적인 추출물에 플라보놀 글리코시드일 것으로 보이는 물질이 다량 함유되어 있다는 것을 보여준다. 도 5에서 확인된 바와 같이, FSF는 카테킨과 관련 축합된 탄닌들을 높은 수준 (약 10x까지)으로 함유하고 있다. 그러나, 3종의 카페오일퀸산 이성질체들의 수준은 도 6에서 확인된 바와 같이 2가지 샘플들 간에 실질적으로 다른 것으로 나타나지 않았다. 도 7은 FSF에 유리 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판이 보다 높은 수준으로 함유되어 있음을 보여준다.

방법:

피커스 세럼 분획 샘플 프렙:

FSF를 실시예 1에서와 같이 준비하였다. FSF 샘플을 90:10의 물:DMSO에 50배 (20 ㎕ 샘플 + 100 ㎕ DMSO + 880 ㎕ 물)로 희석하고, 아래 조건에서 LC/UV/MS로 분석하였다. 최종 샘플내 대략적인 고형물의 함량은 ~ 1.26 mg/mL이었다.

전통적인 샘플 프렙:

샘플 10.64 mg을 4 ml 유리 바이얼에 측정하여 넣었다. 바이얼에 DMSO 1.064 mL을 넣고, 30분간 음파처리하고, 때때로 볼텍싱하여 혼합하였다. 이 샘플 100 ㎕를 4 mL 유리 바이얼에 넣고, 물 900 ㎕로 희석하였다. 최종 샘플내 대략적인 고형물의 함량은 ~ 1 mg/mL이었다.

HPLC 조건:

HPLC: Waters Acquity UPLC 바이너리 용매 매니저 S/N M05UPB601M

Waters Acquity UPLC 샘플 매니저 S/N M05UPS632M

Waters Acquity UPLC PDA 검출기 S/N M05UPD879N

MS: Waters Micromass Quattro Premier MS S/N VAA-219

LC 컬럼: Waters Acquity UPLC BEH C18, 1.7 mm, 2.1 x 100 mm, part # 186002352, lot # 0150371861

이동상: A: 물 + 0.1% 포름산

B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산

분리: 농도구배 (표 참조)

시간 (분)	유속	%A	%B	Curve
시작	0.400 mL/min	95.0	5.0
0.5	0.400 mL/min	95.0	5.0	6
6.5	0.400 mL/min	70	30	6
13.5	0.400 mL/min	0.0	100.0	6
17.5	0.400 mL/min	0.0	100.0	6
18.0	0.400 mL/min	95.0	5.0	6
19.0	0.400 mL/min	95.0	95.0	6

주입 부피: 7.5 ㎕, 바늘에 가득 차고, 루프 일부까지 충진

컬럼 온도 = 25℃

PDA 240-500 nm, 20 points/sec, 필터 시간 상수 0.2초, 노출 시간 = 자동, 해상도 1.2 nm

MS 조건:

	전기분무 (+)	전기분무 (-)
캐필러리 (kV)	3.0	3.0
콘 (V)	30	40
추출기 (V)	2	3
RF 렌즈 (V)	0.2	1.0
소스 온도	120℃	120℃
탈용매화 온도	350℃	350℃
콘 가스 흐름	50 L/h	50 L/h
탈용매화 가스 흐름	900 L/h	800 L/h
스캐닝 질량 범위	150-1150	100-1100
스캔 기간	0.300 sec	0.300 sec
스캔간 지연	0.025 sec	0.025 sec

실시예 6

멜라닌 합성

B16-F1 마우스 흑색종 세포주를 본 분석에 사용하였다. B16-F1 세포는 미국 버지니아 미국 조직 배양 콜렉션으로부터 입수하였다. 본 분석에 사용되는 세포 배양 배지는 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM) 500 mL, 소 태아 혈청 (FBS) 50 mL 및 페니실린-스트렙토마이신 액체 5 mL로 구성된다. 이 배지에서 배양하여 컨플루언시 90% 이상으로 증식시킨 B16-F1 세포는 멜라닌을 합성한다. 임의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 멜라닌 합성은 고 컨플루언시로 증식시킴으로써 유도되는 스트레스 및/또는 배양 배지에 의해 자극받는 것으로 가정된다. DMEM와 FBS는 미국 조직 배양 콜렉션에서 입수할 수 있으며, 페니실린-스트렙토마이신 액체는 미국 캘리포니아 인비트로겐 사에서 구입할 수 있다. 본 분석에서 사용한 장치로는 CO₂ 인큐베이터, 예컨대 미국 메사추세츠에 위치한 Therma Scientific 사의 Forma Series Model 3110, 미국 펜실베니아에 위치한 Hauser Scientific 사의 Bright Line model; 및 UV-비저블 스펙트럼 플레이트 리더, 예컨대 미국 캘리포니아에 위치한 Molecular Devices 사의 SpectraMax250이다. 분석 단계는 하기와 같다:

0일 - 세포 배양: 세포 배양 배지를 37℃로 데운 후, T-150 플라스크에 29 mL을 넣는다. B16-F1 계대 배양 1 마우스 세포 약 1 x 10⁶을 T-150 플라스크에 넣어, 37℃, 5% CO₂, 90% 상대 습도에서 ~80% 컨플루언시가 될 때까지 3일간 배양한다;

3일 - 96웰 플레이트에서 배양한다: 3일에, T-150 플라스크내 세포에 트립신을 처리하고, 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 세포 농도를 측정한다. 96웰 플레이트에서 웰 당 세포 2,500개로 세포 배양 배지 100 ㎕에 접종한다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂, 90% 상대 습도에서 적어도 20% 내지 40% 컨플루언시가 될 때까지 2일간 배양한다;

5일 - 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거하고, 신선한 배양 배지 (웰 당 100 ㎕)로 교체한다. [물 또는 DMSO] 용매에 희석한 [시험 화합물] 1 ㎕를 첨가한다. 용량 반응 곡선을 작성하기 위해, 여러가지 희석 비율을 테스트할 수 있으며, 바람직하게는 웰 3개에 각 희석 비율로 처리한다. 대조군은 세포 배양 배지, B16-F1 세포 및 용매가 구비된 웰 (대조군 #1); 세포 배양 배지 및 용매가 구비된 웰 (대조군 #2); 및 선택적으로, [시험 화합물] 백그라운드 색에 대한 대조군이 필요한 경우, 세포 배양 배지, 용매 및 [시험 화합물]이 구비된 웰 (대조군 #3)로 구성된다.

7일 - 멜라닌 생성 측정: 세포를 ~90% 이상의 컨플루언시이어야 한다. 그렇지 않다면, 이 데이타 포인트는 사용하지 않는다. 각 웰에 0.75% 수산화나트륨 100 ㎕를 넣는다. 선택적으로 [시험 화합물] 처리 웰과 처리하지 않은 대조군 간에 멜라닌 생성량을 측정하기 위해, 410 nm에서 UV-Vis 플레이트 리더를 사용하여 96웰 플레이트를 판독한다. 멜라닌이 생산된 웰은 갈색을 띤다. 멜라닌이 거의 생산되지 않은 웰은 연보라색으로 투명하게 보인다. 멜라닌 합성 저해율은 하기 식으로 계산한다:

상기 식에서, OD410은 UV-Vis 스펙트럼 플레이트 리더로 측정되는 410 nm에서의 광학 밀도이다.

대조군 #3을 사용하는 경우, 멜라닌 합성 저해율 식은 아래와 같다:

상기에서 개략적으로 기술한 분석을 통상적으로 사용한 바, FSF 처리한 B16-F1 세포에서의 멜라닌 합성은 하기 표 13에 나타낸 바와 같이 대조군 세포에 비해 저해되었다.

표 13a - FSF B16 데이타

FSF 농도 (w/v%)	1%	0.2%	0.04%	0.008%	0.0016%	0.000064%
저해율	48.1%	11.4%	5.5%	5.5%	-3%	-1.6%
컨플루언시 (육안 검사)	>90%	>90%	>90%	>90%	>90%	>90%

표 13b - 피커스 건잎 용매 추출물

건잎 용매 추출물	저해율 %
희석	피커스 R
0.01	23
0.005	8
0.0025	1
0.00125	-8
0.000625	-3
0.0003125	-2
0.00015625	2
0.000078125	2

멜라닌 생성 복잡성, 피부내 전달 및 시험 화합물의 피부 침투력 등의 변수에 비추어, 사람의 얼굴에서 과색소 침착된 반점에 대한 생체내 성과가 반드시 나타나는 것은 아니지만, 이러한 분석으로 FSF와 같은 물질이 티로시나제 활성에 잠재적으로 영향을 미치는 능력이 입증된다.

실시예 7

티로시나제 저해

티로시나제는 멜라닌의 생합성에 있어 중요한 효소이다. 본 분석은 L-티로신을 L-디하이드록시페닐알라닌 (L-DOPA)으로 변환하는 버섯의 티로시나제 효소의 능력을 간섭할 수 있는 제제를 동정할 수 있다.

시약 및 공급처

티로시나제 효소: 버섯의 티로시나제, 미국 미주리주에 위치한 시그마-알드리치 사에서 시판;

효소 기질: L-티로신, 미국 미주리주에 위치한 시그마-알드리치 사에서 시판;

완충액: 포스페이트 완충화된 염수 (PBS), 미국 캘리포니아주에 위치한 인비트로겐 사에서 시판;

양성 대조군: 4-하이드록시페닐-β-D-글루코피라노시드(알부틴), 미국 미주리주에 위치한 시그마-알드리치 사에서 시판;

디메틸 설폭사이드 (DSMO), 미국 미주리주에 위치한 시그마-알드리치 사에서 시판;

팔콘^® 1172 Microtesttm 비-조직 배양물 처리, 투명, 평편한 바닥의 96웰 플레이트;

잠재적인 티로시나제 저해제;

웰 플레이트 리더; Spectra MAX Plus, 미국 캘리포니아주에 위치한 몰리큘러 디바이시스 사에서 시판;

데이타 획득 및 분석 소프트웨어: SoftMax Pro, 미국 캘리포니아주에 위치한 몰리큘러 디바이시스 사에서 시판.

작동 용매 농도 분석에서 최종 농도

티로시나제 효소: 26 Units/mL 13 Units/mL

L-티로신 기질: 1mM 0.5 mM

알부틴 양성 대조군: 20mM 200 uM

분석 프로토콜:

시약 및 양성 대조군 제조

.01812 g L-티로신을 100 mL의 1X PBS에 첨가하여, 효소 기질 작동 용액 1 mM을 제조한다. L-티로신이 용해될 때까지 초음파처리한다. 필요에 따라 볼텍싱 처리한다. 사용하지 않으면 4℃에 보관한다.

.0544g 알부틴을 1 mL DMSO에 넣어, 알부틴 양성 대조군 스톡 용액 0.2 M을 제조한다. 볼텍싱하고, 알부틴이 용해될 때까지 1분간 초음파처리한다. 작동 용액 20 mM 알부틴의 경우, 100 ㎕를 DMSO 900 ㎕에 첨가하여, 용액을 1:10으로 희석한다. 이를 사용하기 전까지 실온에 보관한다.

잠재적인 티로시나제 저해제는 DMSO 중에서 제조하여야 한다. 본 분석에서 시험 화합물의 최종 부피는 2 ㎕이고, 작동 용액은 전형적으로 5-40mM (100X)으로 제조되므로, 분석에서 최종 농도는 50 - 400 μM이다.

티로시나제 효소를 차가운 1X PBS로 1000 U/mL로 재구성한다. 이 스톡 용액을 1 mL 분액물로 분주하여 필요할 때까지 -20℃ 암 차단 조건에서 보관한다. 이 1 mL 스톡 용액을 해동시켜 (1000 U/ml) 차가운 1X PBS 완충액 37.5에 첨가하여, 효소 작동 용액 26 U/mL을 준비한다. 이는 96웰 플레이트 4개에 사용하기에 충분하다. 본 분석에 사용할 때까지 광 차단된 상태로 얼음 위에 둔다.

분석 수행

적절한 블랭크를 위해 각 테스트 플레이트의 웰 3개에 1X PBS 완충액 200 ㎕를 넣는다.

비히클 대조군용으로 웰 3개에 DMSO 2 ㎕를 넣는다.

양성 대조군용으로 웰 3개에 알부틴 2 ㎕를 넣는다.

웰 3개에 잠재적인 티로시나제 저해제 2 ㎕를 넣는다.

블랭크를 제외한 각각의 웰에 티로시나제 효소 작동 용액 98 ㎕를 넣는다. 2번 위 아래로 파이펫팅하거나 짧게 볼텍싱하여, 화합물을 효소와 혼합한다.

L-티로신 기질을 100 ㎕/웰로 첨가한다.

SpectraMax 250 플레이트 리더에서 카이넥틱 세팅을 선택하고, 1시간 동안 1분마다 475 nm에서 흡광 결과를 기록한다.

데이타 획득 소프트웨어를 이용하여 대조군과 시험 화합물에 대해 기울기 (slope)를 계산한다.

티로시나제 저해율%은 아래 식으로 계산한다:

상기에서 개략적으로 기술한 분석을 통상적으로 사용한 바, FSF는 아래 표 14에 나타낸 바와 같이 티로시나제 활성을 저해하였다.

표 14

농도 (w/v%)	티로시나제 저해율
1%	60%
0.5%	64%
0.25%	73%
0.125%	77%

실시예 8

과색소 침착된 반점의 완화 및 멜라닌 균일성에 대한 생체내 검사

9주간의 생체내 실험을 라운드 로빈(round robin) 방식의, 비히클 대조군이 설정된, 면 분할 설계(split face design)로 수행하였으며, 270명이 참여하였고, 1주간의 정상화 기간을 포함시켰다. 270명의 개체를 하기 포함된 포함/제외 기준에 따라 분류하였다:

포함

- 얼굴 양쪽 모두에서 볼 주변 및/또는 눈 주변부에 과색소 침착된 반점들이 있음.

- 얼굴의 각 사이드에 볼 부위에, 직경이 8-10 mm인 과색소 침착된 반점이 1개 이상, 직경이 4-6 mm인 반점이 4개 이상, 또는 직경이 2-3 mm인 반점이 10개 이상 (선 스팟, 주근깨, 또는 흑피증 스팟들) 있거나, 또는 비슷한 반점 부위가 있는 경우.

- 얼굴이 햇볕에 타거나, 태닝되거나 또는 풍상(wind burn)을 입는 것을 피하기 위해, 제공된 UV 로션 및 모자와 같은 물리적 UV 블록제품을 이용하여, 태양에 노출되지 않게 할 의지가 있는 경우.

제외

- 아토피, 습진, 건선 또는 기타 만성적인 피부 질환을 진단받은 적 있는 경우.

- 얼굴 피부 질환에 대한 명백한 증상이 있는 경우 (예, 여드름 5개 이상, 빨간 박피성 피부 영역, 표재성의 얇은 혈관 등).

- 얼굴에 상당 면적의 변색 또는 흉터가 있는 경우.

- 얼굴에 눈에 띄는 사마귀 (<3mm)가 4개 이상인 경우.

270명의 개체가 이 실험에 동원되었다. 약 60명은 실험 중에 이탈하였다. 각 개체는 매일 2번씩 코드 지정된 시험 제형 2개를 각각 얼굴 절반에 적용하였다. 얼굴 처리한 부위의 사진을 베이스라인 (0주), 처리 후 4주 및 8주째에 촬영하였고, 피부색과 스팟의 크기 및 색상에 대한 변화를 분석하였다. 제품 제형은 비히클 대조군, 비히클 + 0.55% FSF, 및 비히클 + 5% 비타민 B3 화합물 (니아신아미드)로 구성된다.

비접촉식 분광광도계에 의한 피내 분석 (SiaScopy, Astron Clinica, UK)을 이용하여, 개체의 이미지를 수집하여 분석하였다. 이 방법에서는 브랜드 분광측정기로서 디지탈 카메라 (예, Fuji S2 디지탈 SLR)와 플래시 광원 (예, Sigma Super 플래시 광원)을 사용하여, 얼굴 발색 정보를 입수하였다. 교차 편광 필터를 카메라 및 광원의 전방에 장착하여, 정반사(specular reflection)를 소거하였다.

유멜라닌 (멜라닌)과 옥시헤모글로빈의 농도 및 분포에 대한 발색을 맵핑하여, 이들 발색단 각각에 대한 그레이 스케일의 농도 맵을 작성한다. 옵티마스 6.5와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 각 발색단 맵에서 대상 영역을 선정하고, 평균 그레이 스케일 값과 스팟 면적 비율(spot area fraction)을 계산한다. 스팟 면적 비율은 전체 대상 영역에 대한 멜라닌 스팟이 존재하는 총 면적의 퍼센트이다. 발색단 맵핑에 대한 한가지 유형에 대한 설명은 EP 1,810,614 및 "The Distribution of Melanin in Skin Determined In Vivo", British Journal of Dermatology, 2007, pp 620-628에서 찾아 볼 수 있다.

FSF는 4주 후 가장 우수한 성능을 나타내었으며, 대조군 및 5% 비타민 B3 조성물에 비해 과색소 침착된 반점들을 유의하게 완화시켰다 (p ≤ 0.10). 8주 후에는, 비타민 B3 조성물이 가장 우수한 성능을 보여주었지만, FSF 조성물 역시 과색소 침착된 반점들을 완화하는데 대조군 보다 우수하였다. 표 16은 이미지 분석 데이타를 요약한 것으로. SAF는 평균 스팟 면적 비율이고, ΔSFA는 베이스라인(0주) 대비 스팟 면적 비율의 평균 변화율이다.

표 16

처리	NC2 SAF				멜라닌 균일성
	비히클		Nia		비히클		Nia
	4주	8주	4주	8주	4주	8주	4주	8주
니아신아미드 (Nia)	ns	Sig p=0.0004			ns	Sig p=0.0027
0.55% FSF	ns	Sig p=0.0402	ns	ns	ns	Dir p=0.1702	ns	ns

사용된 약어: SAF = 스팟 면적 비율; sig = 유의함 (p < 0.1); dir= 지향적(directional) (0.1 < p < 0.2), 추세 = (0.2 < p < 0.3), ns = 유의하지 않음 (p > 0.3).

FSF는 SAF의 경우 비히클 보다 유의하게 우수하였고, 멜라닌 균일성에 대해서는 비히클에 비해 지향적으로(directionally) 우수하였다.

분석 방법

아래 분석 방법들로 실시예들에 기록된 다양한 물리적 및 화학적 특성들을 결정한다.

건물 측정 방법

건물 수준 (퍼센트)은 액체 구성 성분들을 증발시킨 후 건조된 잔류물의 중량을 액체 샘플의 중량과 비교하여 결정하였다. 일회용 알루미늄 칭량용 접시, Ohaus Corporation (뉴저지, 파인 브록크) 사의 Ohaus Explorer E00640 저울 및 VWR (펜실베니아 웨스트 체스터) 사의 Shel Lab model 1400E 오븐을 본 과정에 사용하였다. 샘플을 105℃로 설정된 오븐에서 12시간 건조하였다. 액체 샘플이 든 포장 무게에서 포장 무게를 제하여, "습" 중량을 구하였다. 건조 후 동일 샘플이 든 포장 무게에서 포장 무게를 제하여, "건" 중량을 구하였다. 그런 후, "건" 중량을 "습" 중량으로 나누고, 100%을 곱한 값이 건물 함량이다.

색 결정법

지시 매뉴얼에 따른 기기의 표준 절차에 따라, 기기의 휠 2에 설치된 유색 유리 표준물질을 투명한 유리관에 든 시험 물품의 색과 비교함으로써, Lovibond Comparator 3000 (영국, Tintometer Limited of Salisbury)을 이용하여 색 (가드너 체계 0 - 18)을 결정하였다.

삼투질 농도 결정법

순수 용매의 응고점(freezing point) 대비 용액의 응고점 저하를 측정함으로써, 삼투질 농도를 정하였다. 이 측정법은 Advanced Instruments, Inc. (Norwood, MA) 사의 Advanced Model 3250 Single-Sample Osmometer에서 지시 매뉴얼에 따른 기기의 표준 절차에 따라 수행하였다.

굴절 지수 결정법

굴절 지수는 외부 온도 조절 순환기가 장착된 Reichert Analytical Instruments (Depew, NY) 사의 Arias 500 굴절계에서 지시 매뉴얼에 따른 기기의 표준 절차에 따라 수행하였다.

UV 스펙트럼 파라미터 측정 방법

UV 흡광 스펫트럼에서 피크, 바닥 및 변곡을 유체-자켓형 셀 홀더와 외부 온도 조절 순환기가 연결된 Biochrom Ltd. (영국, 캠프리지) 사의 Ultrospec 4300 pro UV / Visible 분광광도계에서 측정하였다. 1 cm 광 통로 길이의 석영 큐벳을 샘플을 탈이온수로 희석하는데 이용하였다. 장치 제어와 데이타 분석은 Biochrom Ltd 사의 SWIFT II 소프트웨어 슈이트의 웨이브스캔 어플리케이션에 의해 수행하였다.

엘라스타제 저해 활성 측정 방법

Corning Incorporated (Corning, NY) 사의 96웰 마이크로타이터 플레이트(Corning 3641)와 BioTek Instruments, Inc. (Winooski, VT) 사의 Synergy 2 마이크로플레이트 리더를 함께 사용하도록 설계된 카이네틱 색도계 분석을 통해 엘라스타제 저해 활성을 측정하였다. 기질을 절단하는 효소적 활성은 410 nm 파장에서의 흡광도 증가로서 측정되는 노란색 발색으로 나타난다. N-메톡시숙시닐-Ala-Ala-Pro-Val-pNA 기질 (EPC FH237) 및 엘라스타제 (EPC SE563)은 EPC(Elastin Products Company, Inc., Owensville, MO)에서 입수하였다. 각 웰의 반응 부피? 200 ㎕이며, 이의 엘라스타제 농도는 0.87 unit/ml이고, 기질은 363 μM이다. 본 과정은 Elastin Products Company, Inc. Research Biochemicals Catalogue (2004, 92 pages) 84페이지의 표제 "기질로서 N-MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (EPC No. FH237)를 이용한 분석" 방법을 개작하였다.

사이클로옥시게나제-2 저해 활성의 측정 방법

사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 저해 활성은 Cayman Chemicals COX 저해제 스크리닝 ELISA 분석 키트 560131로 측정하였다.

항산화 활성 측정 방법

황산화 활성은, BioTek Instruments, Inc. (Winooski, VT) 사의 Synergy 2 마이크로플레이트 리더를 사용하기 위해 (www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay_Application_Note.pdf)에서 이용가능한 BioTek의 "Synergy HT 멀티-검출 마이크로플레이트 리더를 이용한 산소 라디칼 흡착력 (ORAC) 분석 수행" 어플리케이션 노트에 기술된 방법을 개작하여 ORAC 검사를 수행함으로써, 측정하였다. 본 분석에서, AAPH (2,2'-아조비스 2-아미노-프로판)은 형광 프로브 (소듐 플루오레세인)를 손상시키는 반응성 산소종을 발생시킨다. (R)-트롤록스 메틸 에테르와 같은 항산화제는 이러한 손상을 방지하거나 서행시키며, 이러한 효과는 형광 측정에 의해 정량할 수 있다. 형광 판독은 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 528 nm에서 행하였으며, 반응 부피는 200 ㎕, AAPH 농도는 55 mM, 소듐 플루오레세인 농도는 1.33 μM, (R)-트롤록스 메틸 에테르 농도는 80 μM 내지 2 μM이었다. 소듐 플루오레세인 (Fluka 46960), AAPH (Sigma 440914) 및 (R)-트롤록스 메틸 에테르 (Fluka 93509)는 시그마 알드리치 사(미주리주, 세인트루이스)에서 구입하였다. AUC (곡선하 면적) 값은 비율의 합으로써 계산하였다 (각 웰의 현 형광 판독값을 웨의 1차 형광 판독값으로 나눔). 탈이온수가 첨가된 웰의 AUC 평균 값을, (R)-트롤록스 메틸 에테르가 첨가된 웰의 AUC와 시험 물질에 첨가된 웰의 AUC에서 제하여, 항산화제에 의한 형광 보존에 해당되는 AUC 값을 구하였다. 웰의 항산화제-관련 AUC의 함수로서, (R)-트롤록스 메틸 에테르 중량-대응되는 ORAC 활성을 나타내는, 캘리브레이션 그래프를 작성하였다. 시험 물질의 ORAC 활성은 1 단위 중량의 (R)-트롤록스 메틸 에테르에 의해 발생되는 효과와 동일한 항산화 효과를 달성하는데 필요한 시험 물질의 단위 중량으로서 계산하였다.

스캐빈저 활성 측정 방법

유리 라디칼 스캐빈저 활성, 즉,　DPPH (2,2-디페닐-1-피크릴하이드라질) 유리 라디칼 스캐빈저 활성을, SUN-SRi (Rockwood, TN) 사의 유리-코팅된 폴리프로필렌 96웰 마이크로타이터 플레이트 (카다로그 번호 400 062)와 BioTek Instruments, Inc. (Winooski, VT) 사의 Synergy 2 마이크로플레이트 리더를 함께 사용하는데 적합한 카이네틱 색도계 분석을 통해, 측정하였다. 각 마이크로플레이트 웰의 반응 부피는 200 ㎕이고, DPPH의 초기 농도는 114 μM이다. 양성 대조군으로는 L-아스코르브산을 사용하였다. DPPH (Sigma D9132)와 USP L-아스코르브산 (Sigma A-2218)은 시그마 알드리치 사 (미주리 세인트루이스)에서 구입하였다. 반응의 화학량론을 계산하고, 1 단위 중량의 DPPH를 퀀칭하는데 필요한 시험 물질의 단위 중량으로 나타내었다. 이 방법은 WT - Food Science and Technology, Volume 28, Issue 1, 1995, pp 25-30에 공개된 W. Brand-Williams 등의 논문 "항산화 활성을 평가하기 위한 유리 라디칼 방법의 사용"에 기술된 공정을 개작한 것이다.

온도 프로파일링을 이용한 신속한 안정성 검사 공정

아래에 온도 프로파일링을 이용한 신속한 안정성 검사 공정을 나타낸다:

1. 12개의 가열 블록들의 전원을 켜 지정된 온도로 유지시키고, 냉각 장치의 전원을 켜 지정된 온도로 실험을 수행하기 전까지 4시간 이상 유지시킨다. 가열 블롯에 샘플 12개를 장착하고, 샘플 1개는 실온에 두고, 다른 하나는 냉각시켜, 총 14가지의 온도를 제공한다. 온도는 5, 실온 (~23℃), 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72 및 75 ℃이다. 가열 블록에 20 ml 바이얼에 맞게 가공된 알루미늄 인서트 블록을 장착하고; 이들 인서트 블록은 가열 블록의 가열된 포켓 블록 내부에 끼운다. 각 가열 블록은 독립적인 온도 제어기와 온도 센서가 구비되어 있어야 하며, 반응 블록 온도를 0.1℃로 조절할 수 있어야 한다.

2. 바이얼 14개에 가능한 상부 공간을 적게 남기면서 충진한다. 바이얼은 자동샘플러 바이얼에서 신틸레이션 바이얼에 이르는 다양한 크기 범위일 수 있지만, 모두 동일한 크기이어야 한다. 예로 20 ml 바이얼을 사용하였다.

3. 메모 기재 및 온도에 대한 라벨을 각 바이얼에 대해 준비한다. 라벨은 가능한 작고 폭을 좁게 하는 것이 좋다. 색을 컬러 사진으로 측정하고자 한다면 바이얼과 함께 디스플레이하기 위해 온도가 기재되지 않은 여분의 라벨을 만든다.

4. 바이얼 안의 제품 모습을 볼 수 있도록 각 라벨을 해당 바이얼에 붙인다. 이는 통상 라벨을 뚜껑에 붙여, 위에서 아래로 읽는 긴 수직형 탭을 만드는 방식으로 이루어진다. 사진을 촬영하였을 때 바이얼 안 샘플이 가장 잘 보이게 라벨이 디스플레이될 수 있도록, 바이얼 상에서 임의 표시부와 반대쪽 뚜껑 위로 라벨을 둔다.

5. 색을 평가하는 경우, 디지탈 카메라로 샘플의 첫 사진을 촬영한다. 샘플을 좌에서 우로 최저 온도에서 고온 순으로 열 세워, 바이얼 안 샘플을 확실하게 볼 수 있도록 한다 (바이얼 위의 임의의 라벨이나 프린팅이 보는 것을 방해하지 않도록 바이얼을 돌림). 이미지에서 쉽게 판독할 수 있도록 여분의 라벨을 디스플레이한다. 일관성을 위해, 기하학적 배치를 다시 재현할 수 있도록 바이얼과 카메라의 위치를 실험실 작업대 위에 표시한다. 플래시는 꺼는 것이 좋다.

6. 3가지 유형의 샘플에 대해 아래 방식으로 사진을 촬영한다

a. 투명 용액: 백색 배경에서 플래시를 사용하나, 데스크 램프는 사용하지 않음

b. 불투명한 샘플: 블랙 배경에서 플래시를 끄고 데스크 램프를 사용함.

7. 화학적 분석을 수행하는 경우, 각 바이얼의 샘플을 1차 판독한다.

8. 샘플을 가열 블록과 냉각 장치에 넣고, 일시를 기록한다.

9. 선택한 시점 (디폴트 사용 3, 7, 및 14일)에, 가열 블록과 냉각 장치에서 샘플들을 꺼내, 적어도 30분간 실온에 둔다.

10. 색 평가하는 경우, 단계 4에서 표시한 바이얼과 카메라 위치 표시를 이용하여 사진을 다시 촬영한다. 각 시점에 이를 반복 수행한다.

11. 화학적 분석을 수행하는 경우, 각 바이얼 안의 샘플을 이 시점에 분석한다. 각 시점에 반복한다.

12. 색 평가를 위해, 여러가지 제품과 편집한(crop and paste) 사진들을 각 제품의 라벨과 함께 가장 잘 구분할 수 있는 시간대를 선택한다. 6개월 및 1년 실온에 해당되는 시간을 표시하는 선을 안정성 테이블을 이용하여 이미지 위에 그릴 수 있다. 소정의 시점에 테이블 상에 6개월 및 2년에 해당되는 가속화된 온도를 찾고, 이를 선이 그어진 바이얼들에서 결정한다 (예, 도 10 참조)

13. 화학적 분석을 위해 각 시점에 온도에 대한 농도 그래프를 작성한다. 데이타를 연결하는 매끈한 선을 그리고, 허용불가한 역치에 도달하는 온도를 기록한다. 이 온도를 등가의 실온을 구하기 위해 안정성 테이블의 시간에 참조 기재한다. 이 기법은 색을 Lab 색도계로 측정하는 경우 색 분석에 적용할 수 있으며, 농도 대신 색 차이가 플롯팅된다.

14. 안정성 테이블에서 활성화 에너지는 25 kcal/mole로 추정된다. 대부분의 가수분해 반응과 유사 반응들은 거의 이 에너지이거나 그 보다 높은 에너지 반응이다. 에너지가 더 높은 경우, 제품이 더 안정적일 것이며, 실제 보다 낮은 실온 안정성이 테이블에서 예측된다 (과도한 보수적 추정치). 때로는 에너지는 이 보다 낮다. 이로 인해, 화학적 분석을 수행 중인 경우, 상기에서 입수한 데이타를 취하고, 아레니우스 플롯(Arrhenius plot)을 이용하여 반응 에너지를 계산하여, 추정치가 올바른지를 검증한다.

15. 부록: 사진들에서 Lab 컬러 추출법

i. 사진을 모두 CD로 이동시킨다. 옵티마스와 같은 색 측정 소프트웨어와 임의의 필수 주변 장치들이 장착된 컴퓨터를 이용하여 각 샘플의 평균 LAb 컬러를 측정한다.

ii. 제일 왼쪽 5C 샘플에서 시작하여, 상위 우측으로 움직이고, 아래 좌측으로 드래그하여, 평균 컬러를 나타내는 바이얼 영역을 선택한다. 5C 샘플을 표준 참조로 설정한다 (5C 샘플로 시작한 경우에 한함).

iii. 각 온도 샘플에 대해 L, a, b, Std Dev 및 dEcmc 값을 기록한다. 각 사진에서 백색 포인트를 기록한다 (255,255,255이어야 함).

본원에 기술된 크기와 수치는 언급된 실제 수치로 엄격하게 제한되는 것으로 이해되어서는 안된다. 대신, 달리 명시되지 않은 한, 이러한 크기 각각은 언급된 값과 그 값을 포함한 기능적으로 등가의 범위 모두를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "40 mm"로 언급된 크기는 "약 40 mm"를 의미하는 것이다.

본 발명의 상세한 설명에 인용된 모든 문헌들은 원용에 의해 해당 부분이 본원에 포함되며; 임의 문헌에 대한 인용이 본 발명에 대한 종래 기술임을 용인하는 것으로 해석되지 않는다. 본 문헌에서 용어에 대한 임의 의미나 정의가 원용에 의해 포함된 문헌에서의 동일 용어에 대한 임의 의미나 정의와 상충되는 경우, 본 문헌에서 용어에 대해 적용된 의미나 정의가 우선된다.

본 발명의 구체적인 구현예들이 예시되고 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 사상과 범위내에서 다양한 그외의 변형과 수정을 가할 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위에 포함되는 그러한 모든 변형과 수정들은 첨부된 청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims

피커스 세럼 분획(Ficus Serum Fraction)으로부터 유래된 조성물로서,
상기 조성물은,
a. 깨끗하고, 신선하며, 시들지 않은 피커스 잎으로부터 피커스 세포즙을 분리하여, 분리 전 또는 분리 중에 외부 액체의 첨가없이, 피커스 세포 생즙을 수득하는 단계;
b. 상기 피커스 세포 생즙을 여과하여, 섬유질-무함유 세포즙을 수득하는 단계; 및
c. 상기 섬유질-무함유 세포즙을 분별하여, 피커스 세럼 분획을 수득하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되며,
상기 분별이,
(1) 상기 섬유질-무함유 세포즙에서 엽록소를 제거하여, 상층물 I을 수득하는 단계;
(2) 상층물 I에서 색소 및 단백질을 제거하여, 피커스 세럼 분획을 수득하는 단계; 및
(3) 선택적으로, 상기 피커스 세럼 분획에 안정화제를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 상층물 I에서 색소 및 단백질을 제거하는 단계는,
i. 상기 상층물 I의 pH를 7.5로 조정하여, pH-조정된 상층물 I을 제조하는 단계;
ii. 상기 pH-조정된 상층물 I을 침전물 II와 상층물 II로 분리하는 단계;
iii. 상층물 II의 pH를 3.6으로 조정하여, pH-조정된 상층물 II를 제조하는 단계; 및
iv. 상기 pH-조정된 상층물 II를 침전물 III와 피커스 세럼 분획으로 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 안정화제는 항산화제, 킬레이트제, 보존제 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 안정화제는 소듐 메타바이설파이트, 포타슘 소르베이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 메틸 파라벤, 펜틸렌 글리콜 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 피커스 잎이 피커스 벵갈렌시스(F. benghalensis), 피커스 카리카(F. carica), 피커스 엘라스티카(F. elastica), 피커스 마이크로카르파(F. microcarpa), 피커스 트리고나타(F. trigonata) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 피커스 종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 피커스 세럼 분획에는 실질적으로 페오포르비드(pheophorbides)가 함유되어 있지 않은 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 피커스 세럼 분획에는 킬달 방법(Kjeldahl method)으로 측정시 단백질이 실질적으로 함유되어 있지 않은 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 피커스 세럼 분획이 수용성인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 피커스 세럼 분획은 가드너 색 지수(Gardner color value)가 8 보다 낮은 것을 특징으로 하는, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 가드너 색 지수가 7.5 보다 낮은 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피커스 세럼 분획이 피부의 과색소 침착(hyperpigmentation)을 완화할 수 있는 생물학적 활성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제11항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 멜라닌생성(멜라닌합성)의 1 단계 이상을 교란하는데 충분한 것인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 멜라닌생성 효소의 활성을 저해하는데 충분한 것인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제13항에 있어서, 상기 효소의 활성이 트립신 활성, 티로시나제 활성 또는 이들 둘다인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 엘라스타제 활성을 저해하는데 충분한 것인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 COX-2 활성을 저해하는데 충분한 것인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 생물학적 활성이 항산화제 활성, 유리 라디칼 스캐빈저 활성(free radical scavenging activity) 또는 둘다를 증진시키는데 충분한 것인 것을 특징으로 하는, 조성물.
피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법으로서,
a. 깨끗하고, 신선하며, 시들지 않은 피커스 잎으로부터 피커스 세포즙을 분리하여, 분리 전 또는 분리 중에 외부 액체의 첨가없이, 피커스 세포 생즙을 수득하는 단계;
b. 상기 피커스 세포 생즙을 여과하여, 섬유질-무함유 세포즙을 수득하는 단계; 및
c. 상기 섬유질-무함유 세포즙을 분별하여, 피커스 세럼 분획을 수득하는 단계를 포함하며,
상기 분별이,
(1) 상기 섬유질-무함유 세포즙에서 엽록소를 제거하여, 상층물 I을 수득하는 단계;
(2) 상층물 I에서 색소 및 단백질을 제거하여, 피커스 세럼 분획을 수득하는 단계; 및
(3) 선택적으로, 상기 피커스 세럼 분획에 안정화제를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 상층물 I에서 색소 및 단백질을 제거하는 단계는,
i. 상기 상층물 I의 pH를 7.5로 조정하여, pH-조정된 상층물 I을 제조하는 단계;
ii. 상기 pH-조정된 상층물 I을 침전물 II와 상층물 II로 분리하는 단계;
iii. 상층물 II의 pH를 3.6으로 조정하여, pH-조정된 상층물 II를 제조하는 단계; 및
iv. 상기 pH-조정된 상층물 II를 침전물 III와 피커스 세럼 분획으로 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 안정화제는 항산화제, 킬레이트제, 보존제 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제20항에 있어서, 상기 안정화제는 소듐 메타바이설파이트, 포타슘 소르베이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 메틸 파라벤, 펜틸렌 글리콜 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 피커스 잎이 피커스 벵갈렌시스(F. benghalensis), 피커스 카리카(F. carica), 피커스 엘라스티카(F. elastica), 피커스 마이크로카르파(F. microcarpa), 피커스 트리고나타(F. trigonata) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 피커스 종으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 조성물에는 실질적으로 페오포르비드가 함유되어 있지 않은 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 조성물에는 킬달 방법으로 측정시 단백질이 실질적으로 함유되어 있지 않은 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 조성물이 수용성인 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 조성물은 가드너 색 지수가 8 보다 낮은 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
제18항에 있어서, 상기 조성물은 가드너 색 지수가 7.5 보다 낮은 것을 특징으로 하는, 피커스 세럼 분획 조성물의 제조 방법.
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