CN103163294B - 乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法 - Google Patents

Abstract

乙肝5项化学发光检测试剂盒及其制备方法，涉及一种用于乙肝检测的试剂盒。试剂盒，包括包被的微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、中和试剂、校准品、发光底物液和浓缩清洗液。分别制备链霉亲和素预包被反应板、校准品系列、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、中和试剂、发光底物液、浓缩清洗液，组装乙肝5项化学发光定量检测试剂盒。制备的乙肝5项化学发光检测试剂盒不仅可以灵敏检测出乙肝5项，并且可以对其进行精确的定量鉴定，价格便宜，操作简单，结果准确，环保无污染，具有长远的好处。

Description

乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于乙肝检测的试剂盒，尤其是涉及一种采用酶标记生物素-链霉亲和素技术的乙肝5项化学发光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染引起的一种严重危害人们身体健康的传染病，据WHO报告，全世界HBV携带者约3.5亿人。我国是乙肝高发区，据统计，我国人群乙肝表面抗原(HBsAg)的检出率达10.09％，HBsAg携带者达1．2亿，男性高于女性（10.3%对7.29%），农村高于城市（10.2%对7.9%），总感染率高达35.5%～61.1%，其中慢性肝炎占56%。全球每年有一百万人死于肝衰或肝癌，乙肝已经成为全球第9位死亡原因。对于乙肝病毒的检测与预防是我国目前首要任务之一。

乙肝5项，包括乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙肝病毒表面抗体（Hepatitis B surface antibody，抗HBs）、乙肝病毒e抗原（Hepatitis Be Antigen，HBeAg）、乙肝病毒e抗体（Hepatitis B e Antibody，抗HBe）以及乙肝病毒核心抗体（HepatitisB core antibody，抗HBc）是目前最常用的乙肝检测手段。常用的方法检测出HBsAg阴性的人群中，有11.0%HBV-DNA呈阳性反应，也就是说，常规的检测方法可能有11.0%的漏检率，究其原因主要是由于抗原含量低于现行方法的可检出水平。另外，传统的检测方法只能提供定性结果，最高也只能进行滴度的分析，在临床使用上有一定的局限性，特别是在疗效观察和疫苗注射后抗体产生情况的观察上存在着明显的不足，故需要一种新的既灵敏快捷准确又不太昂贵的方法来填补这一缺陷。因此对于乙肝5项的定量研究变得尤为重要。

目前，国内针对乙肝5项的定量检测大多采用国外进口试剂盒，价格昂贵，成本花费巨大，而我国人口众多，对于乙肝5项检测的需求量很多，长期使用进口试剂盒不仅在经济上是高额的负担，也不利于大量的使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用酶标记生物素-链霉亲和素技术的乙肝5项化学发光检测 试剂盒及其制备方法。

本发明所述乙肝5项化学发光检测试剂盒，包括包被的微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、中和试剂、校准品、发光底物液和浓缩清洗液。

所述微孔反应板为包被有链霉亲和素的微孔板，所述微孔反应板的材料为聚苯乙烯；

所述生物素标记物共有5种生物素标记物，分别为生物素标记的乙肝表面抗体、生物素标记的乙肝表面体原、生物素标记的乙肝e抗体1、生物素标记的乙肝e抗体2和生物素标记的乙肝核心抗原，所述生物素标记的乙肝e抗体1和生物素标记的乙肝e抗体2的分子成份相同，工作浓度不同，所述生物素标记的乙肝e抗体1用于乙肝e抗原检测，生物素标记的乙肝e抗体2用于乙肝e抗体检测；

所述碱性磷酸酶标记物共有5种碱性磷酸酶标记物，分别为乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物、乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物，乙肝e抗体碱性磷酸酶标记物1，乙肝e抗体碱性磷酸酶标记物2和乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物，所述碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体1和碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体2的分子成份相同，工作浓度不同，所述碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体1用乙肝e抗原检测，碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体2用于乙肝e抗体检测；

所述碱性磷酸酶标记物共有5种碱性磷酸酶标记物，分别为乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物、乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体碱性磷酸酶标记物1、乙肝e抗体碱性磷酸酶标记物2和乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物，所述碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体1和碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体2的分子成份相同，工作浓度不同，所述碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体1用于乙肝e抗原检测，碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体2用于乙肝e抗体检测；

所述中和试剂为中和试剂乙肝e抗原；

所述校准品包括乙肝病毒表面抗原校准品、乙肝病毒表面抗体校准品、乙肝病毒e抗原校准品、乙肝病毒e抗体校准品和乙肝病毒核心抗体校准品共5种校准品，其中乙肝病毒表面抗原校准品的浓度包括200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL共6个浓度，乙肝病毒表面抗体校准品的浓度包括1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6个浓度，乙肝病毒e抗原校准品的浓度包括40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、0NCU/mL共6个浓度，乙肝病毒e抗体校准品的浓度包括0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL共6个浓度，乙肝病毒c抗体校准品的浓度包括4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL共6个浓度；

所述发光底物液为金刚烷胺衍生物CSPD。

所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）制备链霉亲和素预包被反应板

链霉亲和素用包被缓冲液稀释，取反应板，将稀释的链霉亲和素加入反应板中，预包被后，甩去包被缓冲液，再加入封板缓冲液，置37℃恒温放置2h，去掉封板缓冲液，烘干后，加干燥剂密封，得链霉亲和素预包被反应板；

2）制备校准品系列

（1）配制乙肝表面抗原校准品

将高值乙肝表面抗原用校准品稀释液稀释，用国家标准品（购自中国生物制品检定所）重复标定3次，3次标定值，取均值作为标定的表面抗原乙肝表面抗原浓度，所述校准品稀释液由0.05mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01mmol/L的氯化钠的1%的牛血清白蛋白及10%新生牛血清组成，pH值7.4，乙肝表面抗原作标准品浓度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，分装成0.5mL/瓶，2～8℃或－20℃存放备用；

（2）配制乙肝表面抗体校准品

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL；

（3）配制乙肝e抗原校准品

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、0NCU/mL；

（4）配制乙肝e抗体校准品

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL；

（5）配制乙肝c抗体校准品

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL；

3）制备生物素标记物

（1）制备乙肝表面抗体生物素标记物

将1mg乙肝表面抗体溶于0.1mol/L，pH8.8的硼酸盐缓冲液0.5ml配成浓度为2mg/ml乙肝表面抗体溶液中，将生物素用二甲亚砜配制成浓度为1mg/ml生物素溶液，按照30～80μg/mg的比率，将生物素加入到乙肝表面抗体溶液中，避光振荡反应4h，10℃，按照每250μg生物素加20μL的量，加入新鲜配制1mol/L的NH4Cl溶液，避光震荡反应10min后，用PBS避光 透析过夜，根据终体积计算抗体的浓度，加入甘油制备乙肝表面抗体生物素标记物；

（2）制备乙肝表面抗原生物素标记物、乙肝e抗体生物素标记物和乙肝核心抗原生物素标记物

方法同步骤（1）乙肝表面抗体生物素标记物的制备，所不同的是乙肝表面抗原的浓度为4mg/ml，乙肝e抗体的浓度为1mg/ml，乙肝核心抗原的浓度为0.5mg/ml；

4）制备碱性磷酸酶标记物

（1）制备乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物

采用改良过碘酸钠-乙二醇法进行乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记，将获得的乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS缓冲液按1∶1000稀释成工作液，保存于－20℃；

（2）制备乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体1碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体2碱性磷酸酶标记物和乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物

方法同步骤（1）乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物的制备；

5）制备中和试剂

将乙肝e抗原配制成1mg/ml浓度作为中和试剂乙肝e抗原；

6）制备发光底物液

取底物稀释缓冲液450mL，增强剂(10×)50mL，1mol/L MgCl₂500μL，加发光底物金刚烷胺衍生物CSPD8000μL于灭活容器中，振荡混匀，避光，密封2～8℃保存，得发光底物液508.5mL；

7）制备浓缩清洗液

配制0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）1000mL，加20mL的吐温-20作为浓缩清洗液；

8）组装乙肝5项化学发光定量检测试剂盒

将包被微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、中和试剂、校准品、发光底物液、浓缩清洗液组装成乙肝5项化学发光定量检测试剂盒。

在步骤1）中，所述包被缓冲液为pH9.6、50mmol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃冲溶液，所述链霉亲和素稀释浓度为8μg/mL；所述稀释的链霉亲和素的加入量可为每反应板150μL；所述预包被的条件可置37℃恒温放置2h进行预包被；所述封板缓冲液的加入量可为每反应板加入150μL封板缓冲液；所述烘干的条件可于37℃干燥室烘干2h；所述封板缓冲液为0.01mol/LTBS-T再加上1%BSA、0.2%明胶；所述干燥室的相对湿度度小于30%。

在步骤6）中，所述底物稀释缓冲液为0.05mol/L Tris-HCl，pH9.5。

本发明应用生物素-链霉亲和素检测系统，实现乙肝5项不同项目使用同样的包被反应 板，根据待测样品选择相应的抗原或抗体，抗原或抗体用生物素标记，在检测的过程中，只要将生物素标记的抗原或抗体加入含有链霉亲和素的微孔板中，就将相应的抗原或抗体固相到了微孔板上，之后再加入待测样品，就可以实现检测过程。通过生物素标记抗原或抗体的方法，使得针对不同样品的检测过程都可以使用同样的含有链霉亲和素的微孔板，而不需要分别制备含有不同抗原或抗体的预包被板。这样不仅使得后期检测过程变得简便易行，更加节省了预包被板过程中人力的花费，更加经济，大大降低了成本，也缩短了检测的时间。

本发明特有的碱性磷酸酶-金刚烷胺发光系统，具有灵敏度高，线性范围宽，检测平台期长等优点，无需进行繁琐的底物使用前的混合操作。且项目利用的手段比其它自动化微孔检测方式操作简单、检测速度快，检测周期短、全自动程度更高，降低了检测成本与人力花费，提高了检测灵敏度，使得检测过程更加人性化。项目开发的产品市场前景广阔，经济和社会与传统方法比较，本发明所提供的乙肝5项化学发光检测试剂盒简化了操作步骤，大大缩短了检测时间；效益显著，意义重大。

通过本发明的应用，得到的链霉亲和素包被板不仅可以用于多种样品的检测，一定程度上减少了预包被板制备过程中抗原或抗体的使用量，而且得到的乙肝5项化学发光检测试剂盒可以取代国外试剂盒来进行乙肝5项的检测。与国外试剂盒相比，本发明制备的乙肝5项化学发光检测试剂盒不仅价格低廉，而且操作简便，灵敏度高，可以长期大量的使用，在经济上减少开支。且本发明制备的乙肝5项化学发光检测试剂盒不仅可以灵敏检测出乙肝5项，并且可以对其进行精确的定量鉴定，价格便宜，操作简单，结果准确，环保无污染，具有长远的好处。

附图说明

图1为本发明试剂盒实施例组装示意图。1为链霉亲和素预包被反应板；2～6为生物素标记物，其中2为乙肝表面抗体生物素标记物、3为乙肝表面抗原生物素标记物、4为乙肝e抗体1生物素标记物、5为乙肝e抗体2生物素标记物、6为乙肝核心抗原生物素标记物；7～11为碱性磷酸酶标记物，其中7为乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物、8为乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物、9为乙肝e抗体1碱性磷酸酶标记物、10为乙肝e抗体2碱性磷酸酶标记物、11为乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物；12为中和试剂乙肝e抗原、13为试剂外包装盒；14～19为乙肝表面抗原200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL和0ng/mL6个浓度的校准品，20～25为乙肝表面抗体1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL和0mIU/mL6个浓度的校准品，26～31为乙肝e抗原40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5 NCU/mL、0.1NCU/mL和0NCU/mL6个浓度的校准品；32～37为乙肝e抗体0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL和0NCU/mL6个浓度的校准品；38～43为乙肝c抗体4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL和0NCU/mL6个浓度的校准品；44为浓缩清洗液；45为发光底物液。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

参见图1，本发明所述乙肝5项化学发光定量检测试剂盒实施例由链霉亲和素预包被反应板1；乙肝表面抗体生物素标记物2、乙肝表面抗原生物素标记物3、乙肝e抗体1生物素标记物4、乙肝e抗体2生物素标记物5、乙肝核心抗原生物素标记物6；乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物7、乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物8、乙肝e抗体1碱性磷酸酶标记物9、乙肝e抗体2碱性磷酸酶标记物10、乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物11；中和试剂乙肝e抗原12、试剂外包装盒13；乙肝表面抗原200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL和0ng/mL6个浓度的校准品14～19，乙肝表面抗体1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL和0mIU/mL6个浓度的校准品20～25，乙肝e抗原40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL和0NCU/mL6个浓度的校准品26～31；乙肝e抗体0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL和0NCU/mL6个浓度的校准品32～37；乙肝c抗体4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL和0NCU/mL6个浓度的校准品38～43；浓缩清洗液44；发光底物液45共同组成。

其中所述发光底物液为金刚烷胺衍生物CSPD。

所述乙肝5项化学发光定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1.链霉亲和素预包被反应板制备链霉亲和素预包被反应板制备

链霉亲和素用包被缓冲液稀释。取反应板，将稀释的链霉亲和素加入相应反应板中，每反应板150μL。置37℃恒温放置2h进行预包被。甩去包被液，在干净的吸水纸上拍干，每反应板再加入150μL封板缓冲液，置37℃恒温放置2h。去掉封板液，于37℃干燥室烘干2h，加干燥剂密封。所述包被缓冲液为pH9.6、50mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，所述链霉亲和素稀释浓度为8μg/mL。所述封板缓冲液为0.01mol/L TBS-T+(1%BSA、0.2%明胶)。所述干燥室的相对湿度度小于30%。

2.校准品系列的制备

（1）乙肝表面抗原校准品的配制

将高值乙肝表面抗原用校准品稀释液稀释，用国家标准品（购自中国生物制品检定所）重复标定3次。3次标定值，取均值作为标定的表面抗原乙肝表面抗原浓度。所述校准品稀释液由0.05mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01mmol/L的氯化钠的1%牛血清白蛋白与10%的新生牛血清组成，pH值7.4。

乙肝表面抗原作标准品浓度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，分装成0.5mL/瓶，2～8℃(12个月)或－20℃（4年）存放备用。

（2）乙肝表面抗体校准品的配制

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL。

（3）乙肝e抗原校准品的配制

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、0NCU/mL。

（4）乙肝e抗体校准品的配制

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL。

（5）乙肝核心抗体校准品的配制

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL。

3.生物素标记物的制备

（1）乙肝表面抗原生物素标记物的制备

将1mg乙肝表面抗原溶于0.1mol/L，pH8.8的硼酸盐缓冲液0.5ml配成浓度为2mg/ml乙肝表面抗原溶液中，将生物素用二甲亚砜配制成浓度为1mg/ml生物素溶液，按照30～80μg/mg的比率，将生物素加入到乙肝表面抗原溶液中，避光振荡反应4h，10℃，按照每250μg生物素加20μL的量，加入新鲜配制1mol/L的NH₄Cl溶液，常温避光震荡反应10min。10min后,用PBS避光透析过夜。根据终体积计算抗体的浓度，加入甘油制备乙肝表面抗原生物素标记物。

（2）乙肝表面抗原生物素标记物、乙肝e抗体生物素标记物、乙肝核心抗原生物素标记物的制备方法同步骤（1）乙肝表面抗体生物素标记物的制备。所不同的是乙肝表面抗原的浓度为4mg/ml，乙肝e抗体的浓度为1mg/ml，，乙肝核心抗原的浓度为0.5mg/ml。

4.碱性磷酸酶标记物的制备

（1）乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物的制备

采用改良过碘酸钠-乙二醇法进行乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记，将获得的乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS缓冲液按1∶1000稀释成工作液，保存于－20℃。

（2）乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体1碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体2碱性磷酸酶标记物、乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物的制备方法同步骤（1）乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物的制备。

5.制备中和试剂 

将乙肝e抗原配制成1mg/ml浓度作为中和试剂乙肝e抗原。

6.制备发光底物液

取底物稀释缓冲液（0.05mol/L Tris-HCl(pH9.5)）450mL，增强剂(10×)50mL，1mol/L MgCl₂500μL,加发光底物金刚烷胺衍生物CSPD8000μL于灭活容器中，振荡混匀，避光，密封2～8℃保存。得底物工作液508.5mL。

7.制备浓缩清洗液

配制0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）1000mL，加吐温20mL作为浓缩清洗液。

8.制备乙肝5项（或乙肝两对半）化学发光定量检测试剂盒

包被微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、中和试剂、校准品、发光底物液、浓缩清洗液共同组成乙肝5项（或乙肝两对半）化学发光定量检测试剂盒。

以下给出采用乙肝5项（或乙肝两对半）化学发光定量检测试剂盒检测患者的临床标本中的乙肝表面抗原：

1.标本处理：血清：静脉血5mL，置37℃水浴30min，3000g离心10min，上清为检测样品备用。

2.标本检测：将样品、生物素标记的乙肝表面抗体和碱性磷酸酶标记的乙肝表面抗体加到固相有链霉亲和素的微孔板中，反应60min后，乙肝表面抗原分子与生物素标记的乙肝表面抗体和碱性磷酸酶标记分别特异性结合，洗掉游离成分。加入发光底物工作液，碱性磷酸酶底物脱磷酸基，并发出463nm的可见光。于第15min测定各样品孔的发光值RLU。样品的RLU与其中的乙肝表面抗原浓度呈正相相关。样品结果根据其RLU值可进行定量计算。

以下给出乙肝5项化学发光定量检测试剂盒的性能检定：

1、精密度试验：对同一样本每天进行1批次检测，每批重复检测2次，共进行20天。收集20天的有效数据，进行重复性评价。

2、分析灵敏度：以乙肝表面抗原100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL4个浓度样品 每天重复8次检测，连续做3次，95%检出阳性的最低浓度值为乙肝表面抗原分析灵敏度；乙肝表面抗体的分析灵敏度同乙肝表面抗原，所不同的其检测的样品浓度为500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL；乙肝e抗原的分析灵敏度同乙肝表面抗原，所不同的其检测的样品浓度为10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL；乙肝e抗体的分析灵敏度同乙肝表面抗原，所不同的其检测的样品浓度为0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL；乙肝c抗体的分析灵敏度同乙肝表面抗原，所不同的其检测的样品浓度为4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL；

3、特异性：临床常见肝炎患者标本150例，其中丙肝患者标本50例、戊肝患者标本50例、甲肝患者标本50例，评价方法的特异性。

4、线性范围：根据较准曲线的线性，维持相关系数在0.97以上，判断方法的线性范围。

5、试剂稳定性：用两个浓度水平临床样本，每个浓度水平样本重复测定至少6次，计算平均值。新配制及稳定期末工作液应在同次运行中测定，将仪器带来的不精密度减到最小。测定新配制的试剂工作液和稳定期末试剂工作液两组平均值之间的一致性。

以下给出具体实施例。

实施例1

1.链霉亲和素预包被反应板制备

链霉亲和素用包被缓冲液稀释。取反应板，将稀释的链霉亲和素加入相应反应板中，每反应板150μL。置37℃恒温放置2h进行预包被。甩去包被液，在干净的吸水纸上拍干，每反应板再加入150μL封板缓冲液，置37℃恒温放置2h。去掉封板液，于37℃干燥室烘干2h，加干燥剂密封。所述包被缓冲液为pH9.6、50mmol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液，所述链霉亲和素稀释浓度为8μg/mL。所述封板缓冲液为0.01mol/L TBS-T+(1%BSA、0.2%明胶)。所述干燥室的相对湿度度小于30%。

2.校准品系列的制备

（1）乙肝表面抗原校准品的配制

将高值乙肝表面抗原用校准品稀释液稀释，用国家标准品（购自中国生物制品检定所）重复标定3次。3次标定值，取均值作为标定的表面抗原乙肝表面抗原浓度。所述校准品稀释液由0.05mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01mmol/L的氯化钠的1%牛血清白蛋白和10%牛血清组成，pH值7.4。

乙肝表面抗原作标准品浓度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，分装成0.5mL/瓶，2～8℃(12个月)或－20℃（4年）存放备用。

（2）乙肝表面抗体校准品的配制

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL。

（3）乙肝e抗原校准品的配制

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、0NCU/mL。

（4）乙肝e抗体校准品的配制

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL。

（5）乙肝核心抗体校准品的配制

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL。

3.生物素标记物的制备

（1）乙肝表面抗原生物素标记物的制备

将1mg乙肝表面抗原溶于0.1mol/L，pH8.8的硼酸盐缓冲液0.5ml配成浓度为2mg/ml乙肝表面抗原溶液中，将生物素用二甲亚砜配制成浓度为1mg/ml生物素溶液，按照30～80μg/mg的比率，将生物素加入到乙肝表面抗原溶液中，避光振荡反应4h，10℃，按照每250μg生物素加20μL的量，加入新鲜配制1mol/L的NH₄Cl溶液，常温避光震荡反应10min。10min后,用PBS避光透析过夜。根据终体积计算抗体的浓度，加入甘油制备乙肝表面抗原生物素标记物。

（2）乙肝表面抗原生物素标记物、乙肝e抗体生物素标记物、乙肝核心抗原生物素标记物的制备方法同步骤（1）乙肝表面抗体生物素标记物的制备。所不同的是乙肝表面抗原的浓度为4mg/ml，乙肝e抗体的浓度为1mg/ml，，乙肝核心抗原的浓度为0.5mg/ml。

4.碱性磷酸酶标记物的制备

（1）乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物的制备

采用改良过碘酸钠-乙二醇法进行乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记，将获得的乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L(pH7.5)TBS缓冲液按1∶1000稀释成工作液，保存于－20℃。

（2）乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体1碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体2碱性磷酸酶标记物、乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物的制备方法同步骤（1）乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物的制备。

5.中和试剂制备 

将乙肝e抗原配制成1mg/ml浓度作为中和试剂乙肝e抗。

6.发光底物液制备

取底物稀释缓冲液（0.05mol/L Tris-HCl(pH9.5)）450mL，增强剂(10×)50mL，1mol/L MgCl₂500μL,加发光底物金刚烷胺衍生物CSPD8000μL于灭活容器中。振荡混匀，避光，密封2～8℃保存。得底物工作液508.5mL。

7.浓缩清洗液制备

配制0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）1000mL，加20mL吐温-20作为浓缩清洗液。

8.制备乙肝5项（或乙肝两对半）化学发光定量检测试剂盒

包被微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、中和试剂、校准品、发光底物液、浓缩清洗液共同组成乙肝5项（或乙肝两对半）化学发光定量检测试剂盒。

9.标本处理：血清：静脉血5mL，置37℃水浴30min，3000g离心10min，上清为检测样品备用。

10.标本检测： 

将样品、生物素标记的乙肝表面抗体和碱性磷酸酶标记的乙肝表面抗体加到固相有链霉亲和素的微孔板中，反应60min后，乙肝表面抗原分子与生物素标记的乙肝表面抗体和碱性磷酸酶标记乙肝表面抗体分别特异性结合，洗掉游离成分。加入发光底物工作液，碱性磷酸酶底物脱磷酸基，并发出463nm的可见光。于第15min测定各样品孔的发光值RLU。样品的RLU与其中的乙肝表面抗原浓度呈正相相关。样品结果根据其RLU值可进行定量计算。

实施例2

与实施例1相似，其区别在于待检标本中的乙肝表面抗体，将样品、生物素标记的乙肝表面抗原和碱性磷酸酶标记的乙肝表面抗原加到固相有链霉亲和素的微孔板中，反应60min后，乙肝表面抗体分子与生物素标记的乙肝表面抗原和碱性磷酸酶标记的乙肝表面抗原分别特异性结合，洗掉游离成分。加入发光底物工作液，碱性磷酸酶底物脱磷酸基，并发出463nm的可见光。于第15min测定各样品孔的发光值RLU。样品的RLU与其中的乙肝表面抗体浓度呈正相相关。样品结果根据其RLU值可进行定量计算。

实施例3

与实施例1相似，其区别在于待检标本中的乙肝e抗原，将样品、生物素标记的乙肝e抗体1和碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体1加到固相有链霉亲和素的微孔板中，反应60min后，乙肝e抗原分子与生物素标记的乙肝e抗体1和碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体1分别特异性结合， 洗掉游离成分。加入发光底物工作液，碱性磷酸酶底物脱磷酸基，并发出463nm的可见光。于第15min测定各样品孔的发光值RLU。样品的RLU与其中的乙肝e抗原浓度呈正相相关。样品结果根据其RLU值可进行定量计算。

实施例4

与实施例1相似，其区别在于待检标本中的乙肝e抗体，将样品、生物素标记的乙肝e抗体2、碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体2和中和抗原乙肝e抗原加到固相有链霉亲和素的微孔板中，反应60min后，生物素标记的乙肝e抗体2与固相的亲和素结合后与中和抗原乙肝e抗原结合，标本中的乙肝e抗体分子与碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体2竞争与结合了生物素标记的乙肝e抗体2的中和抗原乙肝e抗原结合，洗掉游离成分。加入发光底物工作液，碱性磷酸酶底物脱磷酸基，并发出463nm的可见光。于第15min测定各样品孔的发光值RLU。样品的RLU与其中的乙肝e抗体的浓度呈负相相关。样品结果根据其RLU值可进行定量计算。

实施例5

与实施例1相似，其区别在于待检标本中的乙肝核心抗体，将样品、生物素标记的乙肝核心抗体、碱性磷酸酶标记的乙肝核心抗体和中和抗原乙肝核心抗原加到固相有链霉亲和素的微孔板中，反应60min后，生物素标记的乙肝核心抗原与固相的亲和素结合的乙肝核心抗原结合，标本中的乙肝核心抗体分子与碱性磷酸酶标记的乙肝核心抗体竞争与结合了生物素标记的乙肝核心抗体的中和抗原乙肝核心抗原结合，洗掉游离成分。加入发光底物工作液，碱性磷酸酶底物脱磷酸基，并发出463nm的可见光。于第15min测定各样品孔的发光值RLU。样品的RLU与其中的乙肝核心抗体的浓度呈负相相关。样品结果根据其RLU值可进行定量计算。

Claims (10)

1.乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述乙肝5项化学发光检测试剂盒包括包被的微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、中和试剂、校准品、发光底物液和浓缩清洗液；

所述生物素标记物共有5种生物素标记物，分别为生物素标记的乙肝表面抗体、生物素标记的乙肝表面抗原、生物素标记的乙肝e抗体1、生物素标记的乙肝e抗体2和生物素标记的乙肝核心抗原，所述生物素标记的乙肝e抗体1和生物素标记的乙肝e抗体2的分子成份相同，工作浓度不同，所述生物素标记的乙肝e抗体1用于乙肝e抗原检测，生物素标记的乙肝e抗体2用于乙肝e抗体检测；

所述碱性磷酸酶标记物共有5种碱性磷酸酶标记物，分别为乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物、乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物，乙肝e抗体碱性磷酸酶标记物1，乙肝e抗体碱性磷酸酶标记物2和乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物，所述碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体1和碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体2的分子成份相同，工作浓度不同，所述碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体1用乙肝e抗原检测，碱性磷酸酶标记的乙肝e抗体2用于乙肝e抗体检测；

所述中和试剂为中和试剂乙肝e抗原；

所述校准品包括乙肝病毒表面抗原校准品、乙肝病毒表面抗体校准品、乙肝病毒e抗原校准品、乙肝病毒e抗体校准品和乙肝病毒核心抗体校准品共5种校准品，其中乙肝病毒表面抗原校准品的浓度包括200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL共6个浓度，乙肝病毒表面抗体校准品的浓度包括1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL共6个浓度，乙肝病毒e抗原校准品的浓度包括40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、0NCU/mL共6个浓度，乙肝病毒e抗体校准品的浓度包括0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL共6个浓度，乙肝病毒核心抗体校准品的浓度包括4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL共6个浓度；

所述制备方法，包括以下步骤：

1)制备链霉亲和素预包被反应板

链霉亲和素用包被缓冲液稀释，取反应板，将稀释的链霉亲和素加入反应板中，预包被后，甩去包被缓冲液，再加入封板缓冲液，置37℃恒温放置2h，去掉封板缓冲液，烘干后，加干燥剂密封，得链霉亲和素预包被反应板；

2)制备校准品系列

(1)配制乙肝表面抗原校准品

将高值乙肝表面抗原用校准品稀释液稀释，用国家标准品重复标定3次，3次标定值，取均值作为标定的乙肝表面抗原浓度，所述校准品稀释液由0.05mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01mmol/L的氯化钠的1％的牛血清白蛋白及10％新生牛血清组成，pH值7.4，乙肝表面抗原作标准品浓度系列200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL，分装成0.5mL/瓶，2～8℃或－20℃存放备用；

(2)配制乙肝表面抗体校准品

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为1000mIU/mL、500mIU/mL、200mIU/mL、50mIU/mL、10mIU/mL、0mIU/mL；

(3)配制乙肝e抗原校准品

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为40NCU/mL、10NCU/mL、2NCU/mL、0.5NCU/mL、0.1NCU/mL、0NCU/mL；

(4)配制乙肝e抗体校准品

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为0.4NCU/mL、1NCU/mL、2.5NCU/mL、6NCU/mL、12NCU/mL、0NCU/mL；

(5)配制乙肝核心抗体校准品

同乙肝表面抗原的配制，其中校准品系列工作浓度为4.5NCU/mL、9NCU/mL、18NCU/mL、36NCU/mL、96NCU/mL、0NCU/mL；

3)制备生物素标记物

(1)制备乙肝表面抗体生物素标记物

将1mg乙肝表面抗体溶于0.1mol/L，pH8.8的硼酸盐缓冲液0.5ml配成浓度为2mg/ml乙肝表面抗体溶液中，将生物素用二甲亚砜配制成浓度为1mg/ml生物素溶液，按照30～80μg/mg的比率，将生物素加入到乙肝表面抗体溶液中，避光振荡反应4h，10℃，按照每250μg生物素加20μL的量，加入新鲜配制1mol/L的NH₄Cl溶液，避光震荡反应10min后，用PBS避光透析过夜，根据终体积计算抗体的浓度，加入甘油制备乙肝表面抗体生物素标记物；

(2)制备乙肝表面抗原生物素标记物、乙肝e抗体生物素标记物和乙肝核心抗原生物素标记物

方法同步骤(1)乙肝表面抗体生物素标记物的制备，所不同的是乙肝表面抗原的浓度为4mg/ml，乙肝e抗体的浓度为1mg/ml，乙肝核心抗原的浓度为0.5mg/ml；

4)制备碱性磷酸酶标记物

(1)制备乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物

采用改良过碘酸钠-乙二醇法进行乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记，将获得的乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物用含100g/L小牛血清的0.05mol/L TBS缓冲液按1∶1000稀释成工作液，保存于－20℃，小牛血清的pH为7.5；

(2)制备乙肝表面抗体碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体1碱性磷酸酶标记物、乙肝e抗体2碱性磷酸酶标记物和乙肝核心抗体碱性磷酸酶标记物

方法同步骤(1)乙肝表面抗原碱性磷酸酶标记物的制备；

5)制备中和试剂

将乙肝e抗原配制成1mg/ml浓度作为中和试剂乙肝e抗原；

6)制备发光底物液

取底物稀释缓冲液450mL，增强剂为10×50mL，1mol/L MgCl₂500μL，加发光底物金刚烷胺衍生物CSPD 8000μL于灭活容器中，振荡混匀，避光，密封2～8℃保存，得发光底物液508.5mL；

7)制备浓缩清洗液

配制0.01mol/L磷酸盐缓冲液1000mL，加20mL的吐温-20作为浓缩清洗液，磷酸盐缓冲液的pH为7.4；

8)组装乙肝5项化学发光定量检测试剂盒

将包被微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、中和试剂、校准品、发光底物液、浓缩清洗液组装成乙肝5项化学发光定量检测试剂盒。

2.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述微孔反应板的材料为聚苯乙烯。

3.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述包被缓冲液为pH9.6、50mmol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液，所述链霉亲和素稀释浓度为8μg/mL。

4.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述稀释的链霉亲和素的加入量为每反应板150μL。

5.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述预包被的条件是置37℃恒温放置2h进行预包被。

6.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述封板缓冲液的加入量为每反应板加入150μL封板缓冲液。

7.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述烘干的条件是于37℃干燥室烘干2h。

8.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述封板缓冲液为0.01mol/L TBS-T再加上1％BSA、0.2％明胶。

9.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述干燥室的相对湿度小于30％。

10.如权利要求1所述乙肝5项化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述底物稀释缓冲液为0.05mol/L Tris-HCl，pH9.5。