CN103109746A

CN103109746A - 一种杜鹃花属菌根试管内直接诱导和菌根化种苗快繁方法

Info

Publication number: CN103109746A
Application number: CN2013100744515A
Authority: CN
Inventors: 顾地周; 顾川岳; 姜云天; 朱俊义; 杨丽娟; 郭志欣; 潘雨; 禚玲玲; 张学士; 王秋爽; 付航; 倪伟佳
Original assignee: Tonghua Normal University
Current assignee: Tonghua Normal University
Priority date: 2013-03-10
Filing date: 2013-03-10
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2033-03-10
Also published as: CN103109746B

Abstract

本发明涉及一种植物繁殖技术，即一种杜鹃花属菌根试管内直接诱导和菌根化种苗快繁方法。其步骤如下：（1）外植体材料的处理：8月中旬采杜鹃花靠近根部新萌发的嫩芽，消毒处理后切割成1～2叶1段作为外植体备用；（2）杜鹃花菌根诱导的培养基为：基本培养基+KT0.50mg·L^-1+IAA0.02mg·L^-1+GA₃0.70mg·L^-1，得外植体；（3）将外植体在基本培养基+ZT2.20mg·L^-1上培养出细小嫩腋芽，待嫩腋芽长至1.00～2.00cm时，再将腋芽从叶腋处切下转接到基本培养基+KT0.50mg·L^-1+IAA0.02mg·L^-1+GA₃0.70mg·L^-1中；培养60d统计并计算出菌根化苗的诱导率；（4）菌根化植株的快繁。建立杜鹃花菌根苗快繁体系，为杜鹃花生长发育和提高品质提供基础保障，可直接应用于杜鹃花菌根苗的工厂化生产。

Description

一种杜鹃花属菌根试管内直接诱导和菌根化种苗快繁方法

技术领域　

本发明涉及一种植物繁殖技术，即一种杜鹃花属菌根试管内直接诱导和菌根化种苗快繁方法。

背景技术

在现有技术中，杜鹃花属植物根系没有根毛，吸收能力比具有根毛的根系小得多，但自然条件下几乎所有的杜鹃细根都有EM(Eriocdimyochrriaz，EM)内生菌根真菌的寄生，从而克服了杜鹃由于没有根毛而造成的对水分及营养的吸收困难，改善植株营养状况，调节宿主的代谢活性，增强植株的抗逆性，提高杜鹃的产量，加快移栽苗成活速度，节约农业生产成本，增加经济产量和效益。因而将杜鹃组培技术和菌根化技术相结合，生产生长势旺、抗逆能力强的杜鹃苗木是一项很有经济价值的研究项目。在国外，新西兰已经将接种菌根真菌作为促进杜鹃生长、提高肥料利用率、提高产量的一项有效措施。而在国内EM真菌的分离和研究几乎还是一片空白。要生产菌根化苗木的关键是选用适宜当地生态条件的优良菌种用于接种，培育出优质的菌根化杜鹃种苗，在生产和应用中将产生巨大的经济效益。

目前，杜鹃属植物菌根的研究大多集中在菌根菌的分离和鉴定方面，很少达到与植物的共建并利用于栽培生产。杜鹃花属植物菌根的建立大多采用种苗繁殖后再行菌根真菌侵染等多步骤方式完成，这些方法存在步骤和操作复杂、侵染率等问题。本发明开展的杜鹃花试管内菌根直接诱导和含菌根苗高效快繁的报道国内外迄今未见。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种利用植物组织培养技术，以野生杜鹃花根芽的嫩茎在试管内开展了直接诱导菌根的研究，旨在直接建立杜鹃花菌根苗快繁体系，为杜鹃花生长发育和提高品质提供基础保障的杜鹃花属菌根试管内直接诱导和菌根化种苗快繁方法。

本发明的技术解决方案是：一种杜鹃花属菌根试管内直接诱导和菌根化种苗快繁方法，其步骤如下：

（1）外植体材料的处理： 8月中旬采杜鹃花靠近根部新萌发的嫩芽，消毒处理后切割成1～2叶1段作为外植体备用；

（2）杜鹃花菌根诱导的培养基为：基本培养基+KT0.50 mg·L^-1+IAA 0.02 mg·L^-1+GA₃0.70 mg·L^-1；添加蔗糖15.00 g·L^-1，琼脂粉7.00 g·L^-1，调节pH 值为5.6；在温度24±2℃，光照强度1 400 lx条件下培养，光照周期14 h·d^-1；得外植体；所述的基本培养基成分和含量：63 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，180 mg·L^-1KNO₃，220 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，178 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，302 mg·L^-1KH₂PO₄；9.2 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，12.5 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；10.8 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，6.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，4.1 mg·L^-1H₃BO₃，0.15 mg·L^-1KI，0.05 mg·L^-1Na₂MO₄·2H₂O；

（3）将外植体在基本培养基+玉米素ZT2.20 mg·L^-1上培养出细小嫩腋芽，待嫩腋芽长至1.00～2.00 cm时，再将腋芽从叶腋处切下转接到基本培养基+KT0.50 mg·L^-1+IAA 0.02 mg·L^-1+GA₃0.70 mg·L^-1中；培养60 d统计并计算出菌根化苗的诱导率；

（4）菌根化植株的快繁：待含有菌根的苗生长至2.50 cm以上时，将含有菌根的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的菌根诱导培养基：基本培养基+ KT0.50 mg·L^-1+IAA 0.02 mg·L^-1+GA₃0.70 mg·L^-1中进行同时腋芽萌发、生长及菌根再生培养；35 d为1个继代增殖周期，每瓶增殖倍数平均达65以上。

本发明的优点是：1、本发明利用植物组织培养技术，以野生杜鹃花根芽的嫩茎在试管内开展了直接诱导菌根的研究，旨在建立杜鹃花菌根苗快繁体系，为杜鹃花生长发育和提高品质提供基础保障。2、应用均匀设计对杜鹃花菌根诱导培养基进行筛选，以期缩短培养基的摸索周期，并避免了以往方法中的步骤复杂、可操作性差、侵染率低等难点。3、杜鹃花菌根诱导率最低达97.3%以上。通过炼苗移栽结果可知，移栽成活率均达95%以上。4、本发明可行、适用，可直接应用于杜鹃花菌根苗的工厂化生产。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

具体实施方式

一种杜鹃花属菌根试管内直接诱导和菌根化种苗快繁方法：

1 材料与方法

1.1 外植体材料的处理

8月中旬采矮壮且分枝多的杜鹃花靠近根部新萌发的嫩芽在超净工作台上用70%酒精涮洗10 s，用含3%次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水冲洗8次。用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切割成1～2叶1段作为外植体备用。

1.2 菌根直接诱导培养基的筛选

基本培养基成分和含量：63 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，180 mg·L^-1KNO₃，220 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，178 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，302 mg·L^-1KH₂PO₄；9.2 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，12.5 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；10.8 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，6.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，4.1 mg·L^-1H₃BO₃，0.15 mg·L^-1KI，0.05 mg·L^-1Na₂MO₄·2H₂O。基本培养基中附加不同质量浓度的激动素KT、吲哚乙酸IAA（由预试验可知，KT和IAA质量浓度分别控制在0.50～1.50 mg·L^-1和0.10～0.50 mg·L^-1之间）和赤霉素GA₃（由预试验可知，质量浓度控制在1.00～1.50 mg·L^-1之间），添加蔗糖15.00 g·L^-1，琼脂粉7.00 g·L^-1，调节pH 值为5.6。在温度(24±2)℃，光照强度1 400 lx条件下培养，光照周期14 h·d^-1。将外植体在基本培养基+ZT2.20 mg·L^-1上培养出细小嫩腋芽（图1a），待嫩腋芽长至1.00～2.00 cm时，再将腋芽从叶腋处切下转接到附加不同质量浓度的激动素KT、吲哚乙酸IAA和赤霉素GA₃的基本培养基中，培养60 d统计并计算出菌根化苗的诱导率（菌根化以图1d中的根形态为准），同时筛选确定最适宜的杜鹃花菌根诱导的培养基。

1.3 菌根化植株快繁体系的建立

利用已菌根化的再生植株的茎节为材料在试管内利用茎节增殖的方法进行快繁，即将菌根化的植株于根上部向下留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的菌根诱导培养基中进行同时腋芽萌发、生长及菌根再生培养。统计并计算出增殖周期和增殖倍数。

2 结果与分析

2.1 培养基中不同质量浓度KT、IAA和GA₃的交叉配比对杜鹃花菌根诱导的影响。　

表 1 杜鹃花属植物菌根诱导影响因素的U₁₁(11³)均匀设计实验安排及结果。

试验数据(表1)经均匀设计软件处理后得回归方程Y=126-8.58X ₁--68.5X ₂-23.6X ₃，样本容量Ｎ＝11，显著性水平α＝0.05，复相关系数Ｒ＝0.9812，检验值Ｆ _t＝60.34，临界值Ｆ _(0.05,3,7)＝4.347 Ｆ _t＞Ｆ _(0.05,3,7)，回归方程显著。说明激动素、吲哚乙酸和赤霉素均对杜鹃花菌根诱导影响显著。根据回归方程求出Y的最优组合为：X ₁=0.50，X ₂=0.10，X ₃=1.00，在此组合基础上求得最优解：y=91.2，此解为回归方程的解析解，需按公式Y=y±u _α ·s(其中y为最优组合基础上求得的最优解，u _α为正态分布的双侧分位数，s为剩余标准差)计算出优化值区间估计为Y=91.2±7.13，即84.07%～98.33%。通过计算各方程项对回归的贡献率(U ₁/U＝4.34%，U ₂/U＝64.4%，U ₃/U＝8.61%)可知，IAA对杜鹃花试管苗菌根诱导率Y的贡献远远大于KT和GA₃，又因KT、IAA和GA₃的质量浓度与菌根诱导率呈负相关，猜测KT、IAA和GA₃质量浓度分别在0.50 mg·L^-1、0.10 mg·L^-1和1.00 mg·L^-1以下有较高的菌根诱导率峰值，因此，又以KT质量浓度为0.50、0.40、0.30、0.20和0.10，IAA质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg·L^-1以及GA₃质量浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90和1.00 mg·L^-1做了10个处理的补充试验，重复3次，发现KT质量浓度为0.80 mg·L^-1、IAA质量浓度为0.04 mg·L^-1和GA₃质量浓度为0.15 mg·L^-1时杜鹃花菌根诱导率最高且诱导速度最快。即待杜鹃花嫩茎腋芽萌发生长至1～2 cm时(图1a)，将腋芽从叶腋处切下转接到附加KT0.50 mg·L^-1、IAA0.02 mg·L^-1和GA₃0.70 mg·L^-1的基本培养基中再次进行验证试验(图1b)，每个处理数接种腋芽数为30，重复3次，腋芽培养至13 d时发现腋芽切口处形成大量锥形颗粒，20 d后颗粒由锥形状逐渐伸长形成白色的不定根；培养至35 d时，不定根上逐渐出现菌化(图1c)，继续培养至60 d后不定根上的菌根趋于明显化并形成木质化根(图1d)，有的苗由发根处苗的基部又发出3～5根苗形成丛生状(图1e)，较未产生菌根的植株(图1f)矮壮、生长势旺且根和苗的形态、发育均接近于野生植株，杜鹃花菌根诱导率最低达97.3%以上。在估计区间内，比表1所列11个处理的诱导率均高。可见，杜鹃花菌根诱导的最佳培养基为：基本培养基+KT0.50 mg·L^-1+IAA 0.02 mg·L^-1+GA₃0.70 mg·L^-1。

2.2 菌根化植株的快繁

采取1.3方法进行快繁，待含有菌根的苗生长至2.50 cm以上时，在超净工作台上打开培养瓶将含有菌根的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的菌根诱导培养基（基本培养基+ KT0.50 mg·L^-1+IAA 0.02 mg·L^-1+GA₃0.70 mg·L^-1）中进行同时腋芽萌发、生长及菌根再生培养。35 d为1个继代增殖周期，每瓶增殖倍数平均达65以上。通过炼苗移栽结果可知，移栽成活率均达95%以上。

平均按每瓶接种12个茎段，平均35天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可平均切割成6段计算，每年有n个周期（杜鹃花每年均为10个周期）进行扩繁，年生产杜鹃花菌根化苗数为：∑年产菌根苗=12×6¹⁰×97.3%×95.0%株，可见本发明可以直接应用于杜鹃花菌根化苗的工厂化生产。

Claims

1.一种杜鹃花属菌根试管内直接诱导和菌根化种苗快繁方法，其步骤如下：

（4）菌根化植株的快繁：待含有菌根的苗生长至2.50 cm以上时，将含有菌根的试管苗于根上部留1～2叶切下，并将切下的小枝条再切割成一叶一段转接到优化后的菌根诱导培养基：基本培养基+ KT0.50 mg·L^-1+IAA 0.02 mg·L^-1+GA₃0.70 mg·L^-1中进行同时腋芽萌发、生长及菌根再生培养；35 d为1个继代增殖周期。