CN103076423A - 贝西沙星对映异构体的分离检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种实用方便、稳定可靠的手性衍生化高效液相色谱法来分离和检测贝西沙星及其对映异构体，属于分析化学领域。本发明使用2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)和贝西沙星在一定条件下进行衍生化反应，制备得到衍生化产品，衍生化反应可保证贝西沙星及其异构体均得到完全的衍生化，衍生化后的贝西沙星及其异构体可使用常规的反相高效液相色谱法得到分离和检测。本发明可用于贝西沙星原料药及其药物制剂产品中对映异构体的分离检测和质量控制。

Description

贝西沙星对映异构体的分离检测方法

技术领域

本发明涉及手性药物对映异构体的分离检测方法，具体涉及贝西沙星对映异构体的分离检测方法，属于分析化学领域。

背景技术

贝西沙星(besifloxacin)是一种新的用于治疗结膜炎的第四代喹诺酮类抗菌剂，其化学名为(+)-7-[(3R)-3-aminohexahydro-1H-azepin-1-yl]-8-chloro-1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-1，4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid，其结构式如下所示：

临床上使用的是贝西沙星的盐酸盐。盐酸贝西沙星通过作用于G⁺和G^-细菌的DNA回旋酶和拓扑异构酶IV，干扰细菌DNA的合成，对于易引发结膜炎的G⁺和G^-菌、厌氧菌具有良好的抗菌效果。同时，盐酸贝西沙星能够显著抑制眼部致炎因子的表达，发挥局部免疫调节的作用。

在贝西沙星的结构中，7位上连接了一个带有一个手性中心的七元环侧链，手性中心的构型为R型，因此贝西沙星存在一个构型为S型的对映异构体，其结构式如下所示：

通常在手性药物及其制剂产品的制备和生产过程中，需要对其对映异构体的含量进行研究和控制。现代色谱分离分析技术在对映体的分离与测定方面显示出巨大的优越性。常用的手性药物测定技术有手性高效液相色谱法、手性毛细管电泳法和手性气相色谱法等，其中以手性高效液相色谱法最为常用。手性高效液相色谱法又包括手性固定相法、手性流动相添加剂法和手性衍生化法。

在使用手性高效液相色谱法分离盐酸贝西沙星对映异构体的时候，我们尝试了多种手性固定相法和手性流动相添加剂法，但是均未能得到有效的分离结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实用方便、稳定可靠的手性衍生化高效液相色谱法来分离和检测贝西沙星及其对映异构体，可用于贝西沙星原料药及其药物制剂产品中对映异构体的分离检测和质量控制。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

在有机溶剂中，在一定的温度下，使用2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)和贝西沙星进行衍生化反应，制备得到衍生化产品。衍生化反应可保证贝西沙星及其异构体均得到完全的衍生化。衍生化后的贝西沙星及其异构体可使用常规的反相高效液相色谱法得到分离和检测。

本发明所述的衍生化反应的有机溶剂可选择二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、四氢呋喃，优选氯仿。

本发明所述的衍生化反应温度可选择从-15℃到所使用溶剂的常压沸点温度，优选室温。

本发明所述的衍生化反应使用的贝西沙星可以是贝西沙星游离碱，也可以是由贝西沙星的无机酸盐或有机酸盐，通过无机碱或有机碱游离后得到的贝西沙星。

本发明所述的衍生化反应中，贝西沙星与衍生化试剂GITC用量的摩尔比为1∶1～1∶10，优选1∶2～1∶5。

本发明所述的贝西沙星的衍生化反应，可按照以下步骤实现：

室温下，在反应器中加入一定量稀氨水和一定量的贝西沙星无机酸盐或有机酸盐的水溶液(氨与贝西沙星盐的摩尔比为5∶1～7∶1)，搅拌或放置到振荡器上振荡数分钟。混匀后，加入一定量的氯仿(控制贝西沙星在氯仿中的浓度约0.1～0.2mg/mL)，再放置到振荡器上振荡数分钟，静置。吸取氯仿层，放入衍生化反应器中，加入一定量的GITC溶液(浓度为2mg/mL)，再搅拌或放置振荡器上振荡，反应完全后，室温下挥发除去溶剂，即得到贝西沙星的衍生化产品。

本发明所述的贝西沙星的衍生化反应，也可按照以下步骤实现：

室温下，在衍生化反应器中加入氯仿和贝西沙星游离碱，搅拌或放置到振荡器上振荡使之完全溶解后得到贝西沙星溶液，浓度约0.1～0.2mg/mL。控制反应体系在一定的温度或室温下，加入一定量的GITC溶液(浓度为2mg/mL)，搅拌或放置振荡器上振荡，反应完全后，室温下挥发除去溶剂，即得到贝西沙星的衍生化产品。

衍生化后的贝西沙星产品含有衍生化的贝西沙星和衍生化的贝西沙星对映异构体，其分离检测方法为高效液相色谱法或高效液相色谱与质谱法联合使用，高效液相色谱的色谱条件为以反相色谱柱为分离柱，以有机改性剂-缓冲液(pH为2～5)组成反相流动相系统，流速为1.0mL/min，检测波长为293nm。

本发明所述的反相色谱柱可选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱、辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱或者苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，优选十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

本发明所述的反相流动相系统中有机改性剂可选择乙腈、甲醇、乙醇，优选甲醇。

本发明所述的反相流动相系统中缓冲盐可选择磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、醋酸钠、醋酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾，优选磷酸二氢钠或磷酸二氢钾。

本发明所述的反相流动相系统中缓冲盐的浓度为10～50mM，优选20～30mM。

本发明所述的反相流动相系统中缓冲盐溶液的pH值为2～5，优选2.5～3.5，最优选3.0。

本发明所述的反相流动相系统中有机改性剂所占混合流动相溶液的体积百分比为55％～85％，优选65％～75％。

本发明所述的分离检测方法，可按照以下步骤实现：

(1)取贝西沙星衍生化产品适量，用流动相溶解，配制成每1mL含贝西沙星0.1～0.2mg的样品溶液；

(2)设置流动相流速为1.0mL/min，检测波长为293nm，色谱柱柱温为30℃；

(3)取(1)的样品溶液100μL注入色谱仪，记录色谱图。

采用本发明的方法，可有效分离贝西沙星及其对映异构体，使两者的分离度达到《中国药典》的有关要求。本发明的方法简便有效、稳定可靠，有利于准确、快速地检测贝西沙星原料药及其药物制剂产品中的贝西沙星异构体的含量。

附图说明

图1、盐酸贝西沙星纯度检测的高效液相色谱图；

图2、消旋盐酸贝西沙星衍生化产品分离检测的高效液相色谱图；

图3、盐酸贝西沙星原料药衍生化产品分离检测的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下典型实施例用来举例说明本发明，在本领域内的技术人员对本发明所做的简单替换或改进等均属于本发明所保护的技术方案之内。

实施例1：

贝西沙星衍生化产品的制备1

室温下，在1.5mL的EP管中加入600μL的氯仿和约0.1mg的贝西沙星游离碱，放置到振荡器上振荡使之完全溶解后，再加入200μL的GITC溶液(浓度为2mg/mL)，放置振荡器上振荡30min，室温下挥发除去溶剂，即得到贝西沙星衍生化产品。

实施例2：

贝西沙星衍生化产品的制备2

室温下，在1.5mL的EP管中加入10μL稀氨水(由浓氨水稀释100倍制得)，然后加入100μL贝西沙星水溶液(浓度为1mg/mL)，放置到振荡器上振荡5min。混匀后，加入600μL的氯仿，再放置到振荡器上振荡10min，静置10min。吸取氯仿层，放入新的EP管中，加入200μL的GITC溶液(浓度为2mg/mL)，放置振荡器上振荡30min，室温下挥发除去溶剂，即得到贝西沙星衍生化产品。

实施例3：

盐酸贝西沙星的纯度检测

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津，LC-10ATvp，SPD-10Avp，HW-2000色谱工作站；

色谱柱：Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：甲醇：20mM KH₂PO₄＝50∶50；

流速：1.0mL/min；

检测波长：296nm；

柱温：30℃；

进样体积：20μL。

实验步骤

取盐酸贝西沙星适量，精密称定，用流动相溶解并制成浓度为40μg/mL的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见图1，保留时间8.543min为盐酸贝西沙星。

实施例4：

消旋盐酸贝西沙星衍生化产品的分离检测

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津，LC-10ATvp，SPD-10Avp，HW-2000色谱工作站；

色谱柱：Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：甲醇：20mM KH₂PO₄(pH3.0)＝72∶28；

流速：1.0mL/min；

检测波长：293nm；

柱温：30℃；

进样体积：100μL。

实验步骤

取按实施例2制得的消旋的贝西沙星及其异构体衍生化产品适量，用流动相溶解，配制成每1mL含贝西沙星衍生化产品(以贝西沙星计)0.18mg的样品溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图2，保留时间16.138min的为衍生化的贝西沙星对映异构体，保留时间17.912min的为衍生化的贝西沙星。

实施例5：

盐酸贝西沙星原料药衍生化产品的分离检测

仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津，LC-10ATvp，SPD-10Avp，HW-2000色谱工作站；

色谱柱：Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：甲醇：20mM KH₂PO₄(pH3.0)＝72∶28；

流速：1.0mL/min；

检测波长：293nm；

柱温：30℃；

进样体积：100μl。

实验步骤

取按实施例3制得的贝西沙星及其异构体衍生化产品适量，用流动相溶解，配制成每1mL含贝西沙星衍生化产品(以贝西沙星计)0.18mg的样品溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图3，保留时间16.205min的为衍生化的贝西沙星对映异构体，保留时间18.522min的为衍生化的贝西沙星。

Claims (15)

1.一种分离检测贝西沙星对映异构体的方法，其特征在于：在有机溶剂中，在一定的温度下，使用2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)和贝西沙星进行衍生化反应，制备得到衍生化产品，衍生化反应可保证贝西沙星及其异构体均得到完全的衍生化，衍生化后的贝西沙星及其异构体可使用常规的反相高效液相色谱法得到分离和检测。

2.根据权利要求1所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述衍生化反应的有机溶剂可选择二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、四氢呋喃，优选氯仿。

3.根据权利要求1所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述衍生化反应温度可选择从-15℃到所使用溶剂的常压沸点温度，优选室温。

4.根据权利要求1所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述衍生化反应使用的贝西沙星可以是贝西沙星游离碱，也可以是由贝西沙星的无机酸盐或有机酸盐，通过无机碱或有机碱游离后得到的贝西沙星。

5.根据权利要求1所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述衍生化反应中，贝西沙星与衍生化试剂GITC用量的摩尔比为1∶1～1∶10，优选1∶2～1∶5。

6.根据权利要求1所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述衍生化反应可按照以下步骤实现：

(1)室温下，在反应器中加入一定量稀氨水和一定量的贝西沙星无机酸盐或有机酸盐的水溶液(氨与贝西沙星盐的摩尔比为5∶1～7∶1)，搅拌或放置到振荡器上振荡数分钟；

(2)混匀后，加入一定量的氯仿(控制贝西沙星在氯仿中的浓度约0.1～0.2mg/mL)，再放置到振荡器上振荡数分钟，静置；

(3)吸取氯仿层，放入衍生化反应器中，加入一定量的GITC溶液(浓度为2mg/mL)，再搅拌或放置振荡器上振荡，反应完全后，室温下挥发除去溶剂，即得到贝西沙星的衍生化产品。

7.根据权利要求1所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述衍生化反应也可按照以下步骤实现：

(1)室温下，在衍生化反应器中加入氯仿和贝西沙星游离碱，搅拌或放置到振荡器上振荡使之完全溶解后得到贝西沙星溶液，浓度约0.1～0.2mg/mL，

(2)控制反应体系在一定的温度或室温下，加入一定量的GITC溶液(浓度为2mg/mL)，搅拌或放置振荡器上振荡，反应完全后，室温下挥发除去溶剂，即得到贝西沙星的衍生化产品。

8.根据权利要求1所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述分离检测方法为高效液相色谱法或高效液相色谱与质谱法联合使用，高效液相色谱的色谱条件为以反相色谱柱为分离柱，以有机改性剂-缓冲液(pH为2～5)组成反相流动相系统，流速为1.0mL/min，检测波长为293nm。

9.根据权利要求1和8所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述反相色谱柱可选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱、辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱或者苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，优选十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

10.根据权利要求1和8所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述反相流动相系统中有机改性剂可选择乙腈、甲醇、乙醇，优选甲醇。

11.根据权利要求1和8所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述反相流动相系统中缓冲盐可选择磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、醋酸钠、醋酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾，优选磷酸二氢钠或磷酸二氢钾。

12.根据权利要求1和8所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述反相流动相系统中缓冲盐的浓度为10～50mM，优选20～30mM。

13.根据权利要求1和8所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述反相流动相系统中缓冲盐溶液的pH值为2～5，优选2.5～3.5，最优选3.0。

14.根据权利要求1和8所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述反相流动相系统中有机改性剂所占混合流动相溶液的体积百分比为55％～85％，优选65％～75％。

15.根据权利要求1和8所述的分离检测贝西沙星对映异构体的方法，所述分离检测方法，可按照以下步骤实现：

(1)取贝西沙星衍生化产品适量，用流动相溶解，配制成每1mL含贝西沙星0.1～0.2mg的样品溶液；

(2)设置流动相流速为1.0mL/min，检测波长为293nm，色谱柱柱温为30℃；

(3)取(1)的样品溶液100μL注入色谱仪，记录色谱图。

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