WO2007141900A1

WO2007141900A1 - 分離方法

Info

Publication number: WO2007141900A1
Application number: PCT/JP2007/000326
Authority: WO
Inventors: Takehumi Kawabe
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2007-12-13
Also published as: JP2009198177A

Abstract

　キノロン系合成抗菌薬についてその夾雑物、対掌体関係やジアステレオ異性体関係の異性体をも含む夾雑物、を簡便かつ正確に同定・分析し、さらには分離・精製でき、過塩素酸ナトリウムといった爆発性を有し、使用が制限される惧れのある試剤を使用しない方法を取得する。高速液体クロマトグラフィー法において、銅イオン、アミノ酸、酢酸アンモニウムおよび有機溶媒を水に含有させた移動相を使用する。オクタデシル化シリカゲルを充填したカラム分析が可能であり有用である。

Description

明細書

本願発明は医薬活性成分、とりわけキノロン系合成抗菌化合物、についての分離分析法および分離精製（分取）法に関する。

背景技術

[0002] レポフロキサシン [ (―) ― (S) _9_フルォロ _2， 3—ジヒドロ一 3_メチル一 1 0— (4—メチルビペラジニル） _7_ォキソ一7 H—ピリド [1， 2， 3 - d e] [1， 4] ベンゾォキサジン一 6_カルボン酸■ 1 2水和物（J AN) ] は下記の構造（無水物を示す。）を有するキノロン系合成抗菌薬である。その構造上の特徴は、他のキノロン化合物とは異なり三環性の母核構造を有すること、さらにキノ口ン母核の 3位にメチル基が置換していて 1個の不斉炭素があり、 3_ (S) —メチル構造を有する光学活性化合物であることである。

[0003] レボフロキサシンは、それ以前のキノロン系合成抗菌薬よりも優れた抗菌薬としての特性一高い抗菌活性や良好な体内動態等の優れた特性を有し、かつ、高い安全性をも兼ね備える等一を有し（特許文献 1および 2) 、尿路感染症だけでなく呼吸器感染症を含めた全身の感染症の治療に有効な優れた抗菌薬として認識されており、日本だけでなく全世界において汎用されている

[0004] [化 1]

レボフロキサシンは対掌体的異性体の一方であるが、その工業的製造は中間体段階において不斉ュニットを導入する不斉合成によって行われている（特許文献 1、 2、 3および 4 ) 。

[0006] レポフロキサシンは対掌体化合物であるため、他方の対掌体化合物 [ 3—

( R ) —メチル異性体] が医薬原末に含まれる夾雑成分のひとつとなる。この他に、製造時の化学反応の副生成物や原料化合物由来の生成物、さらには分解生成物等の類縁物質と称される夾雑物がある（非特許文献 1 ) 。また、ラセミ体の化合物であるオフロキサシンで知られているものと同様の夾雑物があると考えられる（非特許文献 2 ) 。

化合物が医薬品として供給されるためには当然に厳格な品質規格が定められ、この規格に合致する製品のみが供給されなくてはならない。この品質規格をチェックするためには例えばレボフロキサシンの場合、上記の夾雑物が感度よく、しかも簡便に検出されることが必要である。

[0007] レボフロキサシンに係る分離分析方法として高速液体クロマトグラフィー法が好適に使用されるが、例えば対掌体の分離分析については光学活性充填材を充填したいわゆる光学活性カラムの使用（特許文献 2 ) や、銅イオンおよびアミノ酸を添加させた移動相を用いて分析する方法（特許文献 5 ) がある。この他、過塩素酸ナトリウム、酢酸アンモニゥ厶およびリン酸を含有させた移動相を使用する方法（非特許文献 3 ) が知られている。これらの方法のうち、光学活性カラムは高価であり汎用性に乏しく、また、特許文献 5の方法であれば光学活性カラムを使用することなく対掌体関係の異性体の分離は可能であるが、いずれの方法も類縁物質等の夾雑物の同定■分離が可能であるかについては明らかでなかった。さらに、非特許文献 2の方法は、対掌体関係の異性体の分析、あるいはこれ以外の夾雑物の全てについての同定■ 分析が可能であるかについては明らかでなかった。また、非特許文献 1に記載の方法であれば夾雑物の一斉分離が可能であるものの、グラジェント法であり簡便な方法とはいえなかった。

[0008] —方、過塩素酸ナトリウムは日本の消防法による危険物第一類として分類され、条件次第では爆発する性質を有している。このため、近年の世界規模でのテロ事件の発生等、国際情勢の緊迫化のためにこのような爆発性試剤の使用が行政当局によって規制され、単なる分析目的（非特許文献 3) であつてもその入手が困難となる事態の招来も予想される。

特許文献 1 ：特開平 4 _ 364 1 85号公報

特許文献 2：特開昭 62— 252790号公報

特許文献 3：特開平 2— 732号公報

特許文献 4：国際公開 WO 0 1 1 8005号パンフレット

特許文献 5：特開平 1 一 1 3455号公報

非特許文献 I ： Y o s h i d a e t a I , A r z e i m. — F o r s c h . D r u g R e s. 43 ( 1 ) ， N に 5 ( 1 993)

非特許文献 2：ヨーロッパ薬局方 5. 0、第 2 1 3 1頁

非特許文献 3：医療用医薬品品質情報集（厚生労働省医薬品局審査管理課、平成 1 8年 3月版）

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本願発明の課題は、医薬化合物、とりわけレボフロキサシンを初めとするキノロン系合成抗菌薬、についてその夾雑物、すなわち対掌体関係やジァス亍レオ異性体関係の異性体である夾雑物や、製造または分解に由来する類縁物質等の夾雑物、を簡便かつ正確に同定■分析し、さらには分離■精製できる方法を得ることを目的とする。より具体的には、レポフロキサシンの他方の対掌体である 3— （R) —メチル化合物や製造時の副生物あるいは分解生成物といった類縁物質等の夾雑物を、感度よく、正確かつ簡便に分析できる方法を得ることを目的とする。

さらに本願発明の別の課題は、過塩素酸ナトリゥ厶のような爆発性を有し、使用が制限される危惧のある試剤を使用せずに、簡便かつ感度よく正確に分析でき、汎用的に使用できる方法を得ることを目的とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本願発明者は上記の課題を解決するべく鋭意研究した結果、高速液体クロマトグラフィ一法において、銅イオン、アミノ酸、酢酸アンモニゥムおよび有機溶媒を含有させた移動相を使用することで、レポフロキサシンに係る各種類縁物質および不要な対掌体等の、ピリドンカルボン酸系合成抗菌薬であるレポフロキサシンに含まれる夾雑物を感度よく、正確かつ簡便に分析できる方法となることを見出して本願発明を完成させた。

すなわち本願発明は、高速液体クロマトグラフィーを使用する医薬活性成分の分離分析方法おょびまたは分離精製方法において、移動相として、銅イオン、アミノ酸、酢酸アンモニゥム、および有機溶媒を含有させた水を使用することを特徴とする方法に関するものである。

さらに本願発明は、以下の各々にも関するものである。

( 1 ) 分離分析方法である上記の方法；

(2) 医薬活性成分がキノロン化合物である上記の方法；

(3) 医薬活性成分が、異性体が存在する構造のキノロン化合物である上記の方法；

(4) 異性体がジァステレオ異性体関係または対掌体関係の異性体である上記の方法；

(5) 医薬活性成分がレポフロキサシンである上記の方法；

(6) アミノ酸が、天然ひ一アミノ酸である上記の方法；

(7) アミノ酸が、イソロイシン、バリン、ァラニン、プロリン、ロイシン、またはフエ二ルァラニンである上記の方法；

(8) アミノ酸が、 L—イソロイシン、 L—バリン、 D—バリン、 L—プロリン、または L—ァラニンである上記の方法；

(9) アミノ酸が、 L—イソロイシンまたは L—パリンである上記の方法；

(1 0) アミノ酸が、 L_パリンである上記の方法；

(1 1 ) 有機溶媒が、水と混和するアルコール類、水と混和するエーテル類

、およびァセトニトリルからなる群の有機溶媒から選ばれる有機溶媒である上記の方法；

(1 2) 有機溶媒がメタノールまたはァセトニトリルである上記の方法；

(1 3) 有機溶媒がメタノールである上記の方法； (1 4) 銅イオンの供給源が無機銅塩化合物である上記の方法；

(1 5) 無機銅塩化合物が硫酸銅である上記の方法；

(1 6) 充填材としてォクタデシル化シリカゲルを充填したカラムを使用する高速液体クロマトグラフィ一法である上記の方法；

(1 7) 硫酸銅、 L—パリン、酢酸アンモニゥム、メタノールおよび水からなる高速液体クロマトグラフィー用移動相；

(1 8) L—バリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥム（7. 7 1 g) および硫酸銅（ 1. 25 g ) を水に溶解して全量を 1 000 m Lとし、この水溶液 1 00 OmLにメタノール 250 m Lを加える組成比の組成物；

(1 9) 高速液体クロマトグラフィーの移動相である上記の組成物；

(20) 上記の組成物の高速液体クロマトグラフィー用移動相としての使用

(21 ) 高速液体クロマトグラフィ一によるレポフロキサシンの分離分析方法において、ォクタデシル化シリカゲルカラムを使用し、移動相として、 L —パリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥ厶（7. 7 1 g) および硫酸銅（ 1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとし、この水溶液 1 000 mLにメタノール 25 OmLを加えた組成を有する組成物を使用し、移動相の流量を毎分 1 m Lとしたときに、レポフロキサシンの保持時間が 21分から 24分である分離分析方法；

(22) 純度試験である上記の分離分析方法；

(23) N—メチルビペラジンを、（S) _9， 1 0—ジフルオロー 2， 3 —ジヒドロ一 3_メチル _7_ォキソ _7 H—ピリド [1， 2， 3-d e]

[1， 4] ベンゾォキサジン _6_カルボン酸またはそのジフルォロホウ素キレート化合物と、所望により塩基存在下に反応させてレボフロキサシンを得、この組成生物を精製した後、高速液体クロマトグラフィー法において、 L—パリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥム（7. 7 1 g) および硫酸銅

(1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとし、この水溶液 1 00 OmLにメタノール 25 OmLを加えて調製される組成物を移動相として純度試験を実施することによって、純度確認することを特徴とするレポフロキサシンの製造方法；

(24) 高速液体ク口マトグラフィ一法において使用するカラムがォクタデシル化シリ力ゲルカラムである上記のレボフロキサシンの製造方法；

(25) N—メチルビペラジンを、（S) -9, 1 0—ジフルオロー 2， 3 —ジヒドロ一 3_メチル _7_ォキソ _7 H—ピリド [1， 2， 3-d e]

(1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとし、この水溶液 1 00 OmLにメタノール 25 OmLを加えて調製される組成物を移動相として純度試験を実施することによって純度確認されたレポフロキサシンの医薬としての使用；

(26) N—メチルビペラジンを、（S) _9， 1 0—ジフルオロー 2， 3 —ジヒドロ一 3_メチル _7_ォキソ _7 H—ピリド [1， 2， 3 - d e]

[1， 4] ベンゾォキサジン _6_カルボン酸またはそのジフルォロホウ素キレート化合物と、所望により塩基存在下に反応させてレポフロキサシンを得、この組成生物を精製した後、高速液体クロマトグラフィー法において、 L—パリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥ厶（7. 7 1 g) および硫酸銅

(1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとし、この水溶液 1 00 OmLにメタノール 25 OmLを加えて調製される組成物を移動相として純度試験を実施することによって純度確認されたレボフロキサシンの医薬品の製造のための使用；

(27) N—メチルビペラジンを、（S) -9, 1 0—ジフルオロー 2， 3 —ジヒドロ一 3_メチル _7_ォキソ _7 H—ピリド [1， 2， 3-d e]

[1， 4] ベンゾォキサジン _6_カルボン酸またはそのジフルォロホウ素キレート化合物と、所望により塩基存在下に反応させてレボフロキサシンを得、この組成生物を精製した後、高速液体クロマトグラフィー法において、 L—パリン（1 . 7 6 g ) 、酢酸アンモニゥ厶（7 . 7 1 g ) および硫酸銅 ( 1 . 2 5 g ) を水に溶解して全量を 1 0 0 O m Lとし、この水溶液 1 0 0 O m Lにメタノール 2 5 O m Lを加えて調製される組成物を移動相として純度試験を実施することによって純度確認されたレポフロキサシンと薬学的に許容された医薬品原料とからなる組成物；

等である。

発明の効果

[0012] 本願発明によれば、高速液体クロマトグラフィー法において汎用されるォクタデシル化シリカゲル充填カラムを使用した分離方法およびまたは分離性製法が実施でき、過塩素酸ナトリゥ厶を使用することなく実施可能であり、夾雑物の種類によつても条件を変えることなく単回の操作での一斉分離を可能とし、レポフロキサシンを初めとするキノロン系合成抗菌薬について、光学異性体を含めた夾雑物の同定■定量が可能である。本願発明で使用される試剤は特段の制限もなく容易に入手可能であり、また分析に係る成分のピークの位置が十分に隔離されたクロマトグラムが得られ、正確な分析が可能である。

図面の簡単な説明

[0013] [図 1 ]レポフロキサシンおよび夾雑物の計 8化合物を、ォクタデシルシリル化シリカゲルを充填したカラム、銅イオン、アミノ酸、酢酸アンモニゥ厶、および有機溶媒を含有させた水からなる移動相を使用した高速液体クロマトグラフィ一法によって得られたクロマトグラムである。物質名近傍に記載の数値は保持時間である。

発明を実施するための最良の形態

[0014] 本願発明の方法は高速液体クロマトグラムを使用する分離方法、すなわち分離分析方法おょびまたは分離精製方法（分取方法）、に係るものである。本願発明の方法で使用できる高速液体クロマトグラムのカラムは、汎用されるォクタデシル化シリ力ゲル充填カラムであればよい。この他に使用できるカラム用充填材としては、ォクチル化シリカゲル、およびフエニル化シリ力ゲルを挙げることができる。この他、光学活性充填材を充填したカラムを使用することも可能である。

本願発明の方法ではカラム用充填材としては、ォクタデシル化シリカゲルが好ましい。

したがって、本願発明の方法によれば特殊な充填材を使用することなく所望の分析を行うことができる。

使用するカラムのサイズは、この分野で通常使用されるものであれば特に制限なく使用できる。分離分析が目的の場合、例えば粒径 2. 5 jU mから 5 m 内径 2. 1 mmから 6mm、長さ 5 c mから 25 c mの範囲のものであれば好適に使用することができる。このようなカラムのうち好ましくは、粒径 5 jU m、内径 4. 6mm、長さ 1 5 c mのものを挙げることができる。

[0015] 本願発明の方法は分離分析の目的だけではなく、分離精製の目的にも適用することができる。その際に必要なカラムは、特に分離精製に係る対象物の量によっても変わるが、実際に採用するべきカラムは、この分野の通常の知識に基づいて定めることが可能である。

[0016] 次に移動相について述べる。本願発明の特徴はこの移動相について、銅ィオン、アミノ酸、酢酸アンモニゥ厶および有機溶媒を含有させた水からなる組成の混合物を採用することにある。

[0017] 先ず銅イオンであるが、本願の場合銅イオンでなくとも他の 2価の陽ィォン、例えばコバルトイオンまたは亜鉛イオンを採用することもできるが、銅イオンを採用するのが最も好ましい。銅イオンの供給源としては無機銅塩化合物を使用すればよい。このような銅塩化合物としては、硫酸銅、塩化銅、および酢酸銅を挙げることができる。これらの中では硫酸銅を使用するのが最も好ましい。硫酸銅としては無水でも結晶水含有のものであってもいずれのものも採用することができる。

銅イオンの濃度は、およそ 0. 00 1から 0. O l mo l ZLの範囲であればよく、好ましくは 0. 004mo l Lから0. 006mo l ZLの範囲である。好ましくは 0. 005mo l ZLである。

[0018] 次にアミノ酸であるが、本願発明の方法に使用できるアミノ酸としては不斉構造を有するアミノ酸であればよく、天然型であっても非天然型であってもいずれでも使用できる（天然型のアミノ酸とは、人工的な製造方法によつてのみ得られるアミノ酸以外のァミノ酸であり、動植物が通常に生産するァミノ酸と解釈すればよい。）。また、一アミノ酸の他に8_アミノ酸等であってもよいが、通常は一アミノ酸を使用するのがよい。アミノ酸としては入手の点から天然型の一アミノ酸を使用するのが簡便であり好ましい。天然型一アミノ酸は、 L—型でも、 D—型でもいずれでもよいが、同様に入手の点から L_型のものが好ましい。

本願発明の方法で使用できる天然型一アミノ酸としては、イソロイシン、バリン、ァラニン、プロリン、ロイシン、およびフエ二ルァラニンを挙げることができる。これらは L—型、 D—型いずれでもよいが、より好ましくは L—型であるが、バリンおよびフエ二ルァラニンについては D—形でもよい。

これらのアミノ酸のうち好ましくはイソロイシン、バリン、プロリン、およびァラニンであり、より好ましくは L—イソロイシン、 L—パ'リン、 D— パ'リン、 L—プロリン、および L—ァラニンであり、さらに好ましくは L— イソロイシンおよび L—バリンであり、最も好ましくは L—バリンである。ァミノ酸の添加量は、銅ィォン等の陽ィォン濃度の 2ないし 3倍の濃度を目安として定めればよい。具体的にはおよそ 0. O02mo 1 1_から0. 03 mo I ZLの範囲であればよく、より好ましくは 0. 01 mo I ZLから 0. 01 5mo I ZLの範囲であり、さらに好ましくは 0. 1 5mo l Z Lである。

[0019] 酢酸アンモニゥムは、市販のものを使用すればよい。酢酸アンモニゥムの添加量は、およそ 0. 05 ₀ 1 1_から0. 1 5mo I ZLの範囲であればよく、より好ましくは 0. 09 ₀ 1 1_から0. 1 1 mo l ZLの範囲である。 [0020] 有機溶媒は、水と混和するものであればよく、メタノールおよびエタノール等のアルコール類、テトラヒドロフランおよびジォキサン等のエーテル類、そしてァセトニトリルを挙げることができる。これらのうちでは、アルコール類がよく、好ましくはメタノールである。メタノールの他にはァセトニトリルも好適に使用することができる。

本願発明の方法の特徴である移動相は水が主成分であるが、添加する有機溶媒の量はおよそ 1 0%から 50%の範囲であればよく、より好ましくは 1 5%から 25%の範囲であり、さらに好ましくはおよそ 20%程度である。本願発明の方法で使用する移動相として最も好ましいものとして、 L—バリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥム（7. 7 1 g) および硫酸銅（1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 Om Lとし、この水溶液 1 000m L にメタノール 25 OmLを加えた組成を有するものを挙げることができる。なお、この組成の移動相の調製については、例えば上記の配合割合の場合、 1 00 OmLのメスフラスコにおいて調製された水溶液自体にメタノール 25 OmLを加えて調製しても本発明の目的を達成できる移動相が得られる。さらに、 L—バリン、酢酸アンモニゥ厶および硫酸銅を 1 00 OmLの水に溶解させて水溶液を調製しても本発明の目的を達成できる移動相を得ることができる。すなわち、本願発明の方法に使用する移動相の各成分の濃度はこのような調製方法であっても本願発明の目的を達成できる許容限度内にある。

[0021] この移動相を高速液体クロマトグラフィーに使用する際の流速は、 0. 5 mLZ分から 2. OmLZ分の範囲であればよいが、より好ましくは 1. 0 m LZ分であり、この流速の場合、レボフロキサシンの保持時間は 21分から 24分の間となる。

[0022] 本願発明の方法で使用する検出装置としては、紫外（UV) ■可視光吸光光度計、フォトダイオードアレイ（PDA) 検出器、蛍光（F L) 光度計、示唆屈折計（R I ) および質量計（MS) などを使用することができる。これらのうちでは紫外吸光光度計がよい。 [0023] 本願発明の方法を実行する際の温度は、 2 0 °Cから 8 0 °Cの範囲であればよく、より好ましくは 2 5 °Cから 6 0 °Cの範囲であり、さらに好ましくは 4 0 °Cから 5 0 °Cの温度範囲で実行するのがよい。

[0024] 本願発明の方法、すなわち本願発明の組成物からなる移動相を使用した高速液体クロマトグラフィ一による分離分析方法は、医薬品製剤において活性成分として使用する医薬化合物の成分の分離分析に使用することができる。医薬活性成分に含有される夾雑物を簡便かつ正確に分析することができるので純度試験に好適に使用することができ、製造された医薬活性成分においてその定められた規格の純度であるか否かを簡便かつ正確に検定することがでさる。

本願発明の方法は、多くの医薬活性成分に適用することができる。本願発明の方法が適用できる医薬活性成分としてキノロン系合成抗菌薬を挙げることができる。キノロン系合成抗菌薬としては、キノリン骨格のものだけでなく、ピリドベンゾォキサジン骨格やナフチリジン骨格のキノロン化合物も含まれる。すなわち、キノロン骨格を構成するピリドンカルボン酸骨格および縮合ピリドンカルボン酸骨格を有する化合物について好適に適用することができる。

さらには本願発明の方法は，ケト基（c = o ) とカルボキシル基（C O O H ) を有する化合物、より好ましくは C ( = 0 ) _ C _ C O O Hとなる位置に有する化合物、に対して適用できる。

[0025] また、本願発明の方法が適用できる化合物として、上記の構造部分を有する光学活性化合物を挙げることができる。このような光学活性化合物としては不斉炭素を含有することで光学活性となった構造の化合物を挙げることができ、対掌体構造、あるいはジァステレオ異性体構造の異性体を分離分析することができる。

[0026] 本願発明の方法が適用できる医薬活性成分として代表的な適用例は、対掌体関係となる異性体の存在するキノロン化合物であるレボフロキサシンを挙げることができる。レボフロキサシンの純度に関わる夾雑物としては、他方の対掌体や、反応原料や副反応に由来する副生物、そして反応中の分解生成物等を挙げることができる。またレポフロキサシンは固体状態では安定であり、溶液状態でも酸性条件下での加熱下では分解生成物が生ずるが、中性あるいはアルカリ条件では加熱下でも安定である。一方、溶液状態では光に対して不安定であり、種々の分解産物が確認されている（非特許文献 1 ) 。ヨーロッパ薬局方（非特許文献 2) にはオフロキサシンの不純物に関する記載があるが、レボフロキサシンに含有される可能性のある夾雑物の構造としてはとしてはここに記載のあるものの他、光分解産物の中で生成量の多いもの（非特許文献 2) を含めた次の 6種のものが想定される。すなわち、脱炭酸化合物、 9位脱フッ素化合物（9一 H化合物）、ピぺラジン一 N—脱メチル化合物、 9位ピペラジン置換化合物（1 0—「化合物）、ピぺラジン一 N—ォキシド化合物、ジァミン化合物である。これらの標品を調製して、レポフロキサシンおよびその対掌体関係の異性体を含めた 8種の化合物の混合物について本願発明の移動相を使用した高速液体ク口マトグラフィ一によつて分析した結果、 8成分が独立したピークとして観察され一斉分離によって分離できることが明らかとなった（図 1参照）。さらにこの他、 S— (-) _9， 1 0—ジフルオロー 3_メチル _7_ォキソ _2， 3—ジヒドロ _7 H—ピリド [1， 2， 3 - d e] [1， 4] ベンゾォキサジン _6—カルボン酸ゃ 2 _メチル化合物等も分析できることが判明している。

本願発明の方法や移動相組成物はオフロキサシンにも好適に適用できる。レポフロキサシンの製造は、 S— (-) _9， 1 0—ジフルオロー 3—メチル一 7_ォキソ _2， 3—ジヒドロ _7 H—ピリド [1， 2， 3 - d e]

[1 , 4] ベンゾォキサジン _ 6 _カルボン酸を原料として簡便に製造することができる。すなわち、この化合物に対して、好ましくは塩基の存在下で、 4—メチルビペラジン（N—メチルビペラジン）を反応させることでレポフロキサシンが得られる。

この塩基は無機塩基でも有機塩機でもよく、無機塩基としては、アルカリ金属、もしくはアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素塩等を挙げることができる。有機塩機としてはトリアルキルァミンゃ含窒素複素環化合物を挙げることができる。具体的には、トリェチルァミン、トリプチルァミン、ェチルジイソプロピルアミン等、また、 4 _メチルモルホリン、ジメチルアミノビリジン等、さらには 4 _メチルピペラジンを過剰量使用して塩基と兼用させてもよい。

この反応は溶媒を使用するのがよく、ジメチルスルホキシドを使用することができる。

4—メチルビペラジンとの反応では、三環性のカルボン酸化合物ではなくこのカルボン酸のジハロゲノホウ素キレート化合物との反応を行うのがより効果的である。このジハロゲノホウ素キレート化合物は、三環性のカルボン酸化合物とトリハロゲノホウ素化合物を反応させればよいが、トリハロゲノホウ素化合物とエーテル化合物との錯体を使用するのが簡便である。例えば、ジェチルエーテル錯体ゃテトラヒドロフラン錯体等である。一方、トリハロゲノホウ素のハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましい。このエーテル錯体とカルボン酸とを各種エーテル溶媒中で攪拌することで、カルボン酸のジハロゲノホウ素キレート化合物が得られる。

このキレート化合物と 4—メチルビペラジンとの反応はカルボン酸化合物自体の反応と同様にして塩基存在下、溶媒中で実施すればよい。 4 _メチルピぺラジンとの反応後、キレートを除去（加水分解）することが必要である力これは、塩基存在下でプロトン性溶媒中加熱することで除去、切断することができる。例えば、アルコール溶媒中、トリアルキルアミン存在下に加熱する条件を例示することができるが、具体的にはエタノール中、トリェチルァミンの存在下に加熱攪拌すればよい。

得られたレボフロキサシンの精製は、通常の再結晶によって実施できる他、溶媒中において結晶が懸濁状態であるスラリー状態で攪拌しても精製することができる。再結晶やスラリー精製法において使用できる溶媒は多くのものが採用でき、薬学的に許容されるものであれば特に限定はない。このような溶媒としてはアルコール類がよく、ェタノ一ル等を好適に使用することができる。またエタノールは含水溶媒としてもよい。

実施例

[0029] 以下に具体例を挙げて本願発明を詳細に説明するが、これらはいかなる意味においても本願発明を限定的に解釈させるものではない。

[0030] [類縁物質および対掌体の同定■分析]

本操作は光を避けて行う。分析対象物（50mg) をメタノール一水混液 (1 : 1， v/v ； 1 OmL) に溶解して試料溶液とする。この溶液（1 m L) を正確に量り、移動相（下記）を加えて正確に 1 OmLとする。さらにこの溶液から 1 mLを正確に量り、移動相を加えて正確に 1 OmLとし、標準溶液とする。

[0031] [試験条件]

検出器：紫外吸光光度計（測定波長： 340 n m)

カラム：内径 4. 6mm、長さ 1 5 cmのステンレス管に 5 mの液体クロマトグラフ用ォクタデシルシリル化シリカゲルを充てん。

カラム温度： 45 °C付近の一定温度

移動相： L—パリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥム（7. 7 1 g) および硫酸銅（1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとする。この溶液 1 00 Om Lにメタノール 25 Om Lを加えた。

流量： 1 mLZ分（この条件で、レボフロキサシンの保持時間は約 21〜 24分となる。）

[0032] [実施例 1 ]

レボフロキサシンおよびレボフロキサシンのもう一方の対掌体化合物 [3 - (R) —メチル異性体] の他、ヨーロッパ薬局方 5. 0に不純物として記載された化合物で、レボフロキサシンの 3_ (S) —メチルピリドベンゾォキサジン骨格を有する化合物 5種類（脱炭酸化合物、 9位脱フッ素化合物、ピペラジン一 N—脱メチル化合物、 9位ピペラジン置換化合物、ピぺラジン _N_ォキシド化合物およびジァミン化合物、計 6種の夾雑物の標品、計 8 化合物を混合した分析用試料（レポフロキサシンを 1 とし、他を 0. 5の割合で混合して作成した。各標品は出願人の社内で調製されたものである。）を作成して、上記の条件によって分析を実施した。その結果を図に示す。なお、化合物 Dは脱メチル体である。

[0033] [レボフロキサシンの製造]

[0034] 製造例 1 ：

S- (-) -9, 1 0—ジフルオロー 3_メチル _7_ォキソ _2， 3 - ジヒドロ _7 H—ピリド [ 1， 2， 3-d e] [1， 4] ベンゾォキサジン _ 6 _カルボン酸（1 4. 3 g) をジェチルエーテル（600mL) に懸濁し、三フッ化ホウ素ジェチルエーテルコンプレックス（70mL) を加え、室温で 5時間攪拌した。上澄を傾瀉で除去し、残留物にジェチルエーテルを加えて濾取し、ジェチルエーテルで洗浄後乾燥した。このものをジメチルスルホキシド（1 OOmL) に溶解し、トリェチルァミン（1 4. 2mL) および N—メチルビペラジン（7. 3mL) を加え室温で 1 8時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残留物にジェチルエーテルを加え、濾取した黄色粉末を 95%メタノール（4 OOmL) に懸濁し、トリェチルァミン（25mL) を加え、 25時間加熱還流した。溶媒を減圧留去し、残留物を 1 0%塩酸（ 500 m L ) に溶解し、クロ口ホルムで 3回洗浄後 4 N水酸化ナトリゥ厶水溶液で p H 1 1 とし、再び 1 N塩酸で p H 7. 3に調整してクロロホルム（ 200 OmL X 3) で抽出、芒硝乾燥した。クロ口ホルムを留去し、得られた結晶性固体をエタノール一ジェチルエーテルより再結晶し、レポフロキサシン 1 2. 0 gを得た。

融点： 226〜230°C (分解）

[ ] ο = - 76. 9° (c = 0. 655, 0. 05 N N aOH) [0035] 製造例 2 ：

S- (-) -9, 1 0—ジフルオロー 3_メチル _7_ォキソ _2， 3 - ジヒドロ _7 H—ピリド一 [1， 2， 3_d e] [1， 4] ベンゾォキサジン _ 6 _カルボン酸（281 mg) をジェチルエーテル（3 OmL) に懸濁し、室温攪拌下、大過剰の三フッ化ホウ素ジェチルエーテルコンプレックスを加えて、 45分間反応させた。沈殿物を濾取し、ジェチルエーテルで洗浄後減圧乾燥してホウ素キレート体を得た。

分解点 > 300°C

[ ] ο = - 9. 4° (c = 0. 490， DMSO)

元素分析： C₁₃H₈B F₄N0₄として；

計算値： C, 47. 46 ； H, 2. 46 ； N, 4. 26

分析値： C, 47. 68 ； H, 2. 59 ； N, 4. 32

このキレート体（31 Omg) をジメチルスルホキシド（6mL) に溶解し、トリェチルァミン（0. 32mL) および N—メチルビペラジン（0. 1 3mL) を加え、室温で 1 7時間攪拌した後減圧乾固した。残留物をジェチルエーテルで洗浄した後、トリェチルァミン（0. 5mL) を含む 95% エタノール（20mL) に溶解して 8時間加熱還流した。冷後減圧乾固して得た残留物を、希塩酸（5<½) に溶解してクロ口ホルムと振り分け、水層を 1 N水酸化ナトリゥ厶で p H 1 1 とし、次いで 1 N塩酸で p H 7. 4に調整した。これをクロ口ホルム（50mLX 3) で抽出して芒硝乾燥後クロロホル厶を留去し、得た粉末をエタノール一ジェチルエーテルより再結晶し、透明微針晶の標記の化合物 1 20 m gを得た。

融点： 225 ~ 227 °C (分解）

元素分析： C₁₈H₂。FN₃0₄ ' 1 2 H₂0として；

計算値： C， 58. 37 ； H, 5. 72 ； N, 1 1. 35

分析値： C， 58. 1 7 ； H, 5. 58 ； N, 1 1. 27

製造例 3 ：

S- (-) -9, 1 0—ジフルオロー 3_メチル _7_ォキソ _2， 3 - ジヒドロ _7 H—ピリド一 [1， 2， 3_d e] [1， 4] ベンゾォキサジン _6_カルボン酸（21 mg) および N—メチルビペラジン（3 Omg) を無水ジメチルスルホキシド（3mL) に溶解し， 1 30〜1 40°Cで 1時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、残留物にエタノール（2mL) を加え、析出した固体を濾取して少量のェタノールおよびエーテルで順次洗浄した。得られた粉末 1 4m gを、シリカゲル 5 gのカラムクロマトグラフィ一に付し、クロ口ホルム一メタノール一水（7 : 3 : 1 ) の下層溶液で溶出させて S - (-) _9_フルオロー 3_メチル _ 1 0_ (4—メチル _ 1—ピペラジニル） _7_ォキソ _2， 3—ジヒドロ _7 H—ピリド [1， 2， 3-d e ] [1 , 4] ベンゾォキサジン一 6—カルボン酸を得た。また、上記濾取母液を分取し、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、 20 x 20 cm、 0. 5 mm) に付し、クロ口ホルム一メタノール一水（1 5 : 3 : 1 ) の下層溶液で展開して精製した。両者を合わせ目的物 1 4mgの結晶を得た。融点： 220〜228°C (分解）

元素分析： C₁₈H₂。 F N ₃0₄として；

計算値： C, 59. 82 ； H, 5. 58 ； N, 1 1. 63

分析値： C, 60. 01 ； H, 5. 69 ； N, 1 1. 53

MS (m/e) ; 361 (M+)

¹ H-NMR (C D C I ₃) δ ( p p m) ： 1. 63 (3 H， d， J = 7 , C₃ _CH₃) ， 2. 38 (3 H， s， N_CH₃) ， 2. 54~2. 60 (4 H ， m， 2 X C H₂N) ， 3. 40~3. 44 (4 H, m， 2 X C H₂N) ， 4 . 35~4. 52 (3 H， m， CH&CH₂) ， 7. 76 ( 1 H, d，芳香環 C₈-H) ， 8. 64 ( 1 H， s， C₅-H)

Claims

請求の範囲

[I ] 高速液体クロマトグラフィーを使用する医薬活性成分の分離分析方法およびまたは分離精製方法において移動相として、銅イオン、アミノ酸、酢酸アンモニゥム、および有機溶媒を含有させた水を使用することを特徴とする方法。

[2] 分離分析方法である請求項 1に記載の方法。

[3] 医薬活性成分がキノ口ン化合物である請求項 1または 2に記載の方法。

[4] 医薬活性成分が、異性体が存在する構造のキノ口ン化合物である請求項 3 に記載の方法。

[5] 異性体がジァステレオ異性体関係または対掌体関係の異性体である請求項 4に記載の方法。

[6] 医薬活性成分がレポフロキサシンである請求項 1から 5のいずれか一項に記載の方法。

[7] アミノ酸が、天然ひ一アミノ酸である請求項 1から 6のいずれか一項に記載の方法。

[8] アミノ酸が、イソロイシン、バリン、ァラニン、プロリン、ロイシン、またはフエ二ルァラニンである請求項 7に記載の方法。

[9] アミノ酸が、 L—イソロイシン、 L—バリン、 D—バリン、 L—プロリン

、または L—ァラニンである請求項 7に記載の方法。

[10] ァミノ酸が、 L—イソロイシンまたは L—バリンである請求項 7に記載の方法。

[I I ] アミノ酸が、 L—パリンである請求項 7に記載の方法。

[12] 有機溶媒が、水と混和するアルコール類、水と混和するエーテル類、およびァセトニトリルからなる群の有機溶媒から選ばれる有機溶媒である請求項 1から 1 1のいずれか一項に記載の方法。

[13] 有機溶媒がメタノールまたはァセトニトリルである請求項 1から 1 1のいずれか一項に記載の方法。

[14] 有機溶媒がメタノールである請求項 1から 1 1のいずれか一項に記載の方法。

[15] 銅イオンの供給源が無機銅塩化合物である請求項 1から 1 4のいずれか一項に記載の方法。

[16] 無機銅塩化合物が硫酸銅である請求項 1 5に記載の方法。

[17] 充填材としてォクタデシル化シリカゲルを充填したカラムを使用する高速液体クロマトグラフィ一法である請求項 1から 1 6のいずれか一項に記載の方法。

[18] 硫酸銅、 L—パリン、酢酸アンモニゥム、メタノールおよび水からなる高速液体クロマトグラフィー用移動相。

[19] L—パリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥム（7. 7 1 g) および硫酸銅（1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとし、この水溶液 1 0

0 OmLにメタノール 25 Om Lを加える組成比の組成物。

[20] 高速液体クロマトグラフィ一の移動相である請求項 1 9に記載の組成物。

[21] 請求項 1 9に記載の組成物の高速液体クロマトグラフィー用移動相としての使用。

[22] 高速液体クロマトグラフィ一によるレポフロキサシンの分離分析方法において、ォクタデシル化シリカゲルカラムを使用し、移動相として、 L—バリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥ厶（7. 7 1 g) および硫酸銅（1. 2 5 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとし、この水溶液 1 00 OmLにメタノール 25 OmLを加えた組成を有する組成物を使用し、移動相の流量を毎分 1 mLとした時に、レポフロキサシンの保持時間が 21分から 24分である分離分析方法。

[23] 純度試験である請求項 22に記載の分離分析方法。

[24] N—メチルビペラジンを、（S) _9， 1 0—ジフルオロー 2， 3—ジヒドロ一 3_メチル _7_ォキソ _7 H—ピリド [1， 2， 3 - d e] [1， 4] ベンゾォキサジン _ 6 _力ルポン酸またはそのジフルォ口ホウ素キレート化合物と、所望により塩基存在下に反応させてレボフロキサシンを得、この組成生物を精製した後、高速液体クロマトグラフィー法において、 L—バリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥ厶（7. 7 1 g) および硫酸銅（1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとし、この水溶液 1 0 OOm L にメタノール 25 OmLを加えて調製される組成物を移動相として純度試験を実施することによって純度確認することを特徴とするレボフロキサシンの製造方法。

[25] 高速液体ク口マトグラフィ一法において使用するカラムがォクタデシル化シリ力ゲルカラムである請求項 24に記載のレボフロキサシンの製造方法。

[26] N—メチルビペラジンを、（S) _9， 1 0—ジフルオロー 2， 3—ジヒドロ一 3_メチル _7_ォキソ _7 H—ピリド [1， 2， 3 - d e] [1， 4] ベンゾォキサジン _ 6 _力ルポン酸またはそのジフルォ口ホウ素キレート化合物と、所望により塩基存在下に反応させてレボフロキサシンを得、この組成生物を精製した後、高速液体クロマトグラフィー法において、 L—バリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥ厶（7. 7 1 g) および硫酸銅（1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 OmLとし、この水溶液 1 00 OmL にメタノール 25 OmLを加えて調製される組成物を移動相として純度試験を実施することによって純度確認されたレポフロキサシンの医薬としての使用。

[27] N—メチルビペラジンを、（S) _9， 1 0—ジフルオロー 2， 3—ジヒドロ一 3_メチル _7_ォキソ _7 H—ピリド [1， 2， 3 - d e] [1， 4] ベンゾォキサジン _ 6 _力ルポン酸またはそのジフルォ口ホウ素キレート化合物と、所望により塩基存在下に反応させてレポフロキサシンを得、この組成生物を精製した後、高速液体クロマトグラフィー法において、 L—バリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥム（7. 7 1 g) および硫酸銅（1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 Om Lとし、この水溶液 1 00 OmL にメタノール 25 OmLを加えて調製される組成物を移動相として純度試験を実施することによって純度確認されたレボフロキサシンの医薬品の製造のための使用。

[28] N—メチルビペラジンを、（S) _9， 1 0—ジフルオロー 2， 3—ジヒドロ一 3_メチル _7_ォキソ _7 H—ピリド [1， 2， 3 - d e] [1， 4] ベンゾォキサジン _ 6 _力ルポン酸またはそのジフルォ口ホウ素キレート化合物と、所望により塩基存在下に反応させてレポフロキサシンを得、この組成生物を精製した後、高速液体クロマトグラフィー法において、 L—バリン（1. 76 g) 、酢酸アンモニゥム（7. 7 1 g) および硫酸銅（1. 25 g) を水に溶解して全量を 1 00 Om Lとし、この水溶液 1 00 OmL にメタノール 25 OmLを加えて調製される組成物を移動相として純度試験を実施することによって純度確認されたレボフロキサシンと薬学的に許容された医薬品原料とからなる組成物。