CN111171809B

CN111171809B - 一种羟基茚酮类衍生物荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111171809B
Application number: CN202010008066.0A
Authority: CN
Inventors: 陈鲲; 杜俊熹; 李茂榕; 雪燕; 蔡健鑫; 杨雨顺; 朱海亮
Original assignee: Guangzhou University
Current assignee: Guangzhou University
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2040-01-02
Also published as: CN111171809A

Abstract

本发明公开了一种羟基茚酮类衍生物荧光探针及其制备方法和应用，其具有如下结构式：其中，R选自：

本发明荧光探针生物性能稳定，合成简单，用于生物样品中的钙离子浓度检测具有高灵敏度、高选择性的优点，检测过程不受其他阳离子的影响，并且可通过改变该荧光探针的R基团的脂肪链长度和羟基接枝的基团，实现对脂水分配和荧光性能进行调节，对钙离子相关的疾病如高钙血症与多发性骨髓瘤等的诊断，具有十分重要的现实意义。

Description

一种羟基茚酮类衍生物荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种羟基茚酮类衍生物荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

茚酮类化合物是一类非常重要的有机合成原料和中间体，目前报道的多种天然产物和药物分子中，均含有茚酮的结构单元，其中最具代表性的包括从蕨类植物中分离得到的Pterosin类、从海洋植物中得到的甲酰基茚酮化合物等。在FDA批准的药物中，用于治疗老年痴呆症的Donepezil和用于抗风湿的Indanocine也都含有茚酮结构单元，近期也有研究报道可使用茚酮类化合物开发抗肿瘤先导化合物、过氧化物酶增殖体激动受体拮抗剂和多巴胺转运蛋白底物类似物等，均表现出较好的生物相容性和较低的毒性。因此，其具有开发小分子荧光探针的潜质。

钙离子是一类构成人体骨骼的重要元素，钙离子的缺乏和过多都会导致失调和疾病，因此，开发高选择性、高灵敏度的钙离子探针对相关疾病的检测和疾病的环境因素探索具有重要的科学意义。其中最为迫切的是对高钙血症和多发性性骨髓瘤的诊断。高钙血症是指血清离子钙浓度的异常升高，由于通常所测定的是总钙而非离子钙，因此检测钙离子浓度对高钙血症的诊断实际上更为重要。多发性骨髓瘤通常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害，目前临床上的诊断标准主要以细胞数和蛋白检测为主，近期则主要开发基于抗体抗原反应和核酸分子的诊断试剂盒，而开发基于离子检测的诊断方法，对于前述方法是一种重要补充，综合考虑开发新型诊断试剂盒，能够提高准确率，对于临床诊断意义重大。

发明内容

基于此，针对上述技术问题，本发明旨在提供一种羟基茚酮类衍生物荧光探针及其制备方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种羟基茚酮类衍生物荧光探针，其具有如下结构式：

其中，R选自：

进一步地，所述R选自

所述荧光探针为二乙基2,2'-((4-((5-羟基-1-氧-1,3-二氢茚-2-亚乙基)甲基)苯基)脲二基)(反式)-二乙酸酯。

进一步地，所述R选自

所述荧光探针为二乙基2,2'-((4-((5-羟基-1-氧-1,3-二氢茚-2-亚乙基)甲基)苯基)脲二基)(反式)-二甲酸酯。

进一步地，所述R选自

所述荧光探针为二乙基2,2'-((4-((5-羟基-1-氧-1,3-二氢茚-2-亚乙基)甲基)苯基)脲二基)(反式)-二甲酸。

本发明另一发明目的在于提供一种制备上述羟基茚酮类衍生物荧光探针的方法，包括以下步骤：

(1)将对甲酰基苯胺溶于无水乙醇中，加入氯乙酸或氯乙酸乙酯或氯乙酸甲酯，冰浴条件下搅拌10～30分钟，加入碳酸铯，室温下搅拌2～12小时，反应物经分离纯化，得到第一产物；

(2)将5-羟基-1-茚酮溶于无水乙醇中，加入上述第一产物和哌啶，常温反应1～6小时，反应物经分离纯化，结晶，得到目标化合物。

进一步地，所述对甲酰基苯胺、氯乙酸或氯乙酸乙酯或氯乙酸甲酯、碳酸铯的摩尔比为1：1～4：1～4。

更进一步地，所述对甲酰基苯胺、氯乙酸或氯乙酸乙酯或氯乙酸甲酯、碳酸铯的摩尔比为1：2：2。

进一步地，所述5-羟基-1-茚酮、第一步产物和哌啶的摩尔比为1：0.5～2：0.5～2。

更进一步地，所述5-羟基-1-茚酮、第一步产物和哌啶的摩尔比为1：1：1。

进一步地，所述步骤(1)中反应物分离纯化步骤具体为：反应结束后，使用饱和氯化钠溶液洗涤，减压蒸馏除去有机溶剂，经硅胶柱层析柱分离，洗脱，即得第一产物；所述洗脱过程中采用的洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯按体积比为10:1～5组成的混合溶液。

更进一步地，石油醚与乙酸乙酯的体积比为10:1。

进一步地，所述步骤(2)中反应物分离纯化步骤具体为：反应结束后，使用饱和氯化钠溶液洗涤，减压蒸馏除去有机溶剂，经硅胶柱层析柱分离，洗脱；其中，所述洗脱过程中采用的洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯按体积比为5:1～5组成的混合溶液。

更进一步地，石油醚与乙酸乙酯的体积比为5:1。

本发明另一发明目的在于提供上述的羟基茚酮类衍生物荧光探针在检测钙离子中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明可视钙离子检测荧光探针，是以羟基茚酮类作为荧光团，通过特异性螯合钙离子改变其光学性能，从而实现钙离子的检测。

2)本发明提供的羟基茚酮类荧光探针生物性能稳定，合成简单，该荧光探针对钙离子相比于其他阳离子，表现出高度的选择性和灵敏度。

3)本发明提供的羟基茚酮类荧光探针可通过对R基团的脂肪链长度和羟基接枝的基团进行变化，实现对脂水分配和荧光性能的调节，对钙离子相关的疾病如高钙血症与多发性骨髓瘤等的诊断，具有十分重要的现实意义。

附图说明

图1为本发明实施例一所述荧光分子探针在PBS溶液中对各种阳离子的选择性实验图；

图2为本发明实施例二所述荧光分子探针在PBS溶液中对各种阳离子的选择性实验图；

图3为本发明实施例三所述荧光分子探针在PBS溶液中对各种阳离子的选择性实验图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一、二乙基2,2'-((4-((5-羟基-1-氧-1,3-二氢茚-2-亚乙基)甲基)苯基)脲二基)(反式)-二乙酸酯的制备

步骤(1)：将5mmol，0.60g对甲酰基苯胺加入到30mL无水乙醇中，使其充分溶解，加入10mmol，1.22g氯乙酸乙酯，冰浴条件下搅拌30分钟，加入10mmol，3.26g碳酸铯，移至室温下搅拌5小时，薄层层析跟踪反应，反应结束后，使用饱和氯化钠溶液洗涤，减压蒸馏除去有机溶剂，用硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯体积比为10:1的混合溶液，得到淡黄色油状液体第一产物；

步骤(2)：将5mmol，0.74g 5-羟基-2,3-二氢-茚-1-酮加入到30mL无水乙醇中，使其充分溶解，加入上述淡黄色油状液体，加入5mmol，0.05g哌啶，常温反应4小时，薄层层析跟踪反应，反应结束后，使用饱和氯化钠溶液洗涤，减压蒸馏除去有机溶剂，用硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯体积比为5:1的混合溶液，结晶得到为淡黄色粉末的目标化合物1.59g，产率75％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.80(s,1H),7.77(d,J＝8.6Hz,2H),7.45(s,1H),7.20-7.25(m,1H),7.10(s,1H),7.00(d,J＝6.0Hz,1H),6.68(d,J＝8.2Hz,2H),4.24-4.28(m,2H),4.22(s,4H),3.18-3.23(m,4H),1.47(t,J＝7.3Hz,6H).HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+H]⁺Calcd for C₂₄H₂₆NO₆ 424.1760,Found 424.1758。

实施例二、二乙基2,2'-((4-((5-羟基-1-氧-1,3-二氢茚-2-亚乙基)甲基)苯基)脲二基)(反式)-二甲酸酯的制备

本发明实施例二制备方法与实施例一区别在于：采用原料氯乙酸甲酯替换氯乙酸乙酯，其余参数与实施例一相同，该制备方法制备得到为黄色粉末的目标化合物，产率:70％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ9.78(s,1H),7.74(d,J＝8.7Hz,2H),7.40(s,1H),7.18-7.22(m,1H),7.09(s,1H),6.98(d,J＝6.3Hz,1H),6.65(d,J＝8.1Hz,2H),4.23-4.26(m,2H),4.20(s,4H),3.61(s,6H).HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+H]⁺Calcd for C₂₂H₂₂NO₆ 396.1447,Found 396.1446。

实施例三、二乙基2,2'-((4-((5-羟基-1-氧-1,3-二氢茚-2-亚乙基)甲基)苯基)脲二基)(反式)-二甲酸的制备

本发明实施例三制备方法与实施例一区别在于：采用原料氯乙酸替换氯乙酸乙酯，其余参数与实施例一相同，该制备方法得到为黄色粉末的目标化合物，产率:68％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.06(s,2H),9.79(s,1H),7.77(d,J＝8.4Hz,2H),7.42(s,1H),7.19-7.24(m,1H),7.11(s,1H),6.99(d,J＝6.6Hz,1H),6.68(d,J＝8.4Hz,2H),4.24-4.28(m,2H),4.22(s,4H).HRMS(ESI-TOF)m/z:[M+H]⁺Calcd for C₂₀H₁₈NO₆ 368.1134,Found 368.1132。

试验例一、钙离子选择性试验

为了测试本发明实施例一～三所示的荧光分子探针对钙离子的选择性，对实施例一～三所示的荧光分子探针与不同的重金属离子反应后的荧光强度进行了试验研究，结果如图1～3所示。

试验方法：将10μM实施例一～三制备的荧光分子探针分别溶解在PBS(pH7.4,10mM,5％DMSO)溶液中，37℃孵育1h，分别加入不同的金属离子，定容摇匀，在日立F-7000仪器上进行检测，狭缝宽度为5nm，光电倍增管电压为600V。

其中，Ca²⁺组中Ca²⁺的浓度为100μM，Al³⁺组、Co²⁺组、Mn²⁺组、Na⁺组、K⁺组、Cr³⁺组、Zn²⁺组、Ba²⁺组、Pb²⁺组、Ag⁺组、Li⁺组、Cu²⁺组、Ni²⁺组、Cd²⁺组、Fe²⁺和Fe³⁺组中对应离子的浓度均为1mM，Probe组加入10μM相应的荧光分子探针。

从图1可看出，本发明实施例一中所述荧光分子探针，激发波长为368nm，观测发射波长为582nm位置的荧光强度显示，该荧光分子探针能够特异性的对Ca²⁺响应，而其他离子组之间荧光强度没有显著区别，说明该荧光分子探针对Ca²⁺具有很好的选择性，可作为检测Ca²⁺的探针。

从图2可看出，本发明实施例二中所述荧光分子探针，激发波长为355nm，观测发射波长为557nm位置的荧光强度显示，该荧光分子探针能够特异性的对Ca²⁺响应，而其他离子组之间荧光强度没有显著区别。说明该荧光分子探针对Ca²⁺具有很好的选择性，可作为Ca²⁺的探针。

从图3可看出，本发明实施例三中所述荧光分子探针激发波长为345nm，观测发射波长为535nm位置的荧光强度，可看出该荧光分子探针能够特异性的对Ca²⁺响应，而其他离子组之间荧光强度没有显著区别。说明该荧光分子探针对Ca²⁺具有很好的选择性，可作为Ca²⁺的探针。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所述技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种羟基茚酮类衍生物荧光探针，其特征在于，其具有如下结构式：

其中，R选自：

或

或

。

2.如权利要求1所述的羟基茚酮类衍生物荧光探针，其特征在于，所述R选自

。

3.如权利要求1所述的羟基茚酮类衍生物荧光探针，其特征在于，所述R选自

。

4.如权利要求1所述的羟基茚酮类衍生物荧光探针，其特征在于，所述R选自

。

5.一种制备如权利要求1~4任一所述的羟基茚酮类衍生物荧光探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将对甲酰基苯胺溶于无水乙醇中，加入氯乙酸或氯乙酸乙酯或氯乙酸甲酯，冰浴条件下搅拌10~30分钟，加入碳酸铯，室温下搅拌2~12小时，反应物经分离纯化，得到第一产物；

（2）将5-羟基-1-茚酮溶于无水乙醇中，加入上述第一产物和哌啶，常温反应1~6小时，反应物经分离纯化，结晶，得到目标化合物。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述对甲酰基苯胺、氯乙酸或氯乙酸乙酯或氯乙酸甲酯、碳酸铯的摩尔比为1：1~4：1~4。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述5-羟基-1-茚酮、第一步产物和哌啶的摩尔比为1：0.5~2：0.5~2。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中反应物分离纯化步骤具体为：反应结束后，使用饱和氯化钠溶液洗涤，减压蒸馏除去有机溶剂，经硅胶柱层析柱分离，洗脱，即得第一产物；所述洗脱过程中采用的洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯按体积比为10:1~5组成的混合溶液。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中反应物分离纯化步骤具体为：反应结束后，使用饱和氯化钠溶液洗涤，减压蒸馏除去有机溶剂，经硅胶柱层析柱分离，洗脱；其中，所述洗脱过程中采用的洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯按体积比为5:1~5组成的混合溶液。

10.如权利要求1~4任一所述的羟基茚酮类衍生物荧光探针在制备检测钙离子试剂中的应用。