CN103076409A - 奥拉西坦及其杂质的分析检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及奥拉西坦有关物质检查的分析方法。具体而言，本发明涉及一种奥拉西坦质量分析的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对奥拉西坦原料药或者包含奥拉西坦的药物制剂进行质量分析的步骤。本发明方法中使用的色谱柱是C18或C8色谱柱；柱温是30~40℃。本发明用高效液相色谱法，在一定色谱条件下有效分离奥拉西坦及其各杂质，通过该方法能准确的测定奥拉西坦中各个杂质的量。

Description

奥拉西坦及其杂质的分析检测方法

技术领域

本发明属于药物分析化学领域，涉及对促智药奥拉西坦质量进行分析的方法，具体涉及用液相色谱法(HPLC)分离测定奥拉西坦及其多种已知杂质的分析方法。

背景技术

奥拉西坦(Oxiracetam,CAS62613-82-5)，化学名为2-(4-羟基吡咯烷-2-酮-1-基)乙酰胺，是一种促进学习，增强记忆力的新型中枢神经系统药物，该活性成分是一种合成的羟基氨基丁酸(BABOB)环状衍生物，仅作用于中枢神经系统，主要分布在大脑皮层、海马，有激活、保护或促进神经细胞的功能恢复，改善智能障碍患者的记忆和学习功能，而药物本身没有直接的血管活性，也没有中枢兴奋作用，对学习记忆能力的影响是一种持久的促进作用。机理研究结果显示，奥拉西坦可促进磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的合成，促进脑代谢，提高血脑屏障对特异中枢神经道路的刺激作用，提高大脑中ATP/ADP的比值，使大脑中蛋白质和核酸的合成增加。

奥拉西坦于1987年在意大利上市，上市的剂型为片剂，800mg；胶囊，800mg；注射液，1g/5ml。目前国内只有奥拉西坦胶囊和注射液上市，且所用主要活性成分均为外消旋体。研究发现，与外消旋体比较，(S)-4-羟基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺(在本文中亦可称为S-奥拉西坦或者左旋奥拉西坦)，具有更好的疗效和更低的毒副作用。

S-奥拉西坦构型其分子式与分子量分别为：C6H10N2O3，Mr.158.16；其结构式为：

其合成工艺中会引入及产生4-羟基-2氧代-1-醋酸吡咯烷(本发明中简称杂质A)、甘氨酸酐(合成甘氨酰胺盐酸盐的起始原料，本发明中简称杂质B)、2-吡咯啉-2-1-乙酰胺基(产品脱水后的产品，降解产物，本发明中简称杂质C)、2-（4-羟基-2-氧代-1-乙酰胺基吡咯烷）(乙酰胺合成杂质，副产物，本发明中简称杂质D)。因此，实现奥拉西坦及其各杂质间的有效分离对测定奥拉西坦和各杂质的量具有重大的意义。

现有技术中已有针对奥拉西坦的纯度检测，具体如下：色谱柱为C18，以甲醇:水(40:60)为流动相，检测波长为214nm。我们以奥拉西坦进行了方法学验证，结果表明：该方法在样品的降解试验中并不能把降解峰与已知杂质很好的分离，且未能检出所有的降解峰。因此本领域仍然期待有用于控制奥拉西坦质量的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于控制奥拉西坦质量的有效方法。本发明人令人意外地发现，用特定的色谱分析条件例如使用C18色谱柱或C8色谱柱分离测定奥拉西坦及其制剂有关物质的高效液相色谱方法，例如使用甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液作为流动相，可以有效地实现奥拉西坦及其杂质的分离及测定。

为此，本发明第一方面提供了一种奥拉西坦质量分析的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对奥拉西坦原料药或者包含奥拉西坦的药物制剂进行质量分析的步骤。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的填料粒度为3~10μm，优选填料粒度为5μm。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的内径为3~10mm，优选色谱柱的内径为4.6mm。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的柱长为150~300mm，优选色谱柱的柱长为250mm。

根据本发明第一方面的方法，高效液相色谱法使用的色谱柱的填料粒径5μm，色谱柱的内径为4.6mm，色谱柱的柱长为250mm。以上型号参数可以简写为5μm，4.6×250mm，或简写为4.6mm×25cm×5μm，或其它类似简写方式。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是AQ色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是AQ-C18色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是品牌为月旭AQ-C18的色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是品牌为月旭C8的色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法分离分析时色谱柱的柱箱温度是30~40℃，例如33~37℃，例如约35℃。本发明已经发现，在柱箱温度为33~37℃的范围内具有相当好的分离效果。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法是使用A、B、C三种流动相。流动相A为甲醇，流动相B为乙腈，流动相C为磷酸盐缓冲液。按体积份数计，流动相的比例为甲醇:乙腈:磷酸盐缓冲液=(0-20):((0-20):(100-80)，优选流动相的比例为甲醇:乙腈:磷酸盐缓冲液=(0.5-5):(0-5):(100-95)，优选流动相的比例为甲醇:乙腈:磷酸盐缓冲液=1:0:99。优选流动相的比例为甲醇:磷酸盐缓冲液=1:99~4:96。

在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲液pH值为2.0～8.0，例如pH值为2.3～6.0，例如pH值为2.5～4.0，例如pH值为3.0±0.05。本发明已经发现，在pH值为2.5~4.0的范围内具有相当好的分离效果。所述磷酸盐缓冲液中用于pH调节的酸或碱包括磷酸、枸橼酸、酒石酸、甲酸、草酸、磷酸氢二盐、磷酸二氢盐，优选磷酸。

在一个实施方案中，所述磷酸缓冲液是通过以下步骤获得的：称取磷酸二氢钾，去离子水溶解，再用酸或碱磷酸调节pH值。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法中流动相的流速为：0.2～0.8ml/min，流动相的流速优选为0.35～0.65ml/min，流动相的流速优选为0.4～0.6ml/min。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器。在一个实施方案中，所述紫外检测器所用的检测波长是200nm～230nm，优选的检测波长为210nm。

根据本发明第一方面的方法，奥拉西坦的测定浓度为0.1-3mg/Ml，优选奥拉西坦的测定浓度为0.5-1.5mg/mL，优选奥拉西坦的测定浓度为1.0mg/mL。

根据本发明第一方面的方法，奥拉西坦峰的保留时间为3-20min，优选奥拉西坦峰的保留时间为5-15min，优选奥拉西坦峰的保留时间为7-13min。

根据本发明第一方面的方法，其中用于进行高效液相色谱法测试的样品供试溶液是如下方式配制的：将奥拉西坦原料药或者包含奥拉西坦的药物制剂用流动相溶解样品，并稀释成每1ml含奥拉西坦0.1～3.0mg/ml的样品溶液，特别是配制成0.5～1.5mg/ml的样品溶液，特别是配制成1.0mg/ml的样品溶液。在一个实施方案中，用于配制样品供试溶液的溶剂是流动相A:流动相B:流动相C=1:0:99的混合液。

根据本发明第一方面的方法，其中进行高效液相色谱法测试时，测试溶液注入液相色谱仪的量为10～100μl，例如10～50μl，例如10～20μl。

根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤：

(1)、取奥拉西坦或含奥拉西坦的药物制剂样品适量，用流动相溶解样品，并配制成每1ml含奥拉西坦0.1～3.0mg/ml的样品溶液；

(2)、设置流动相的流速为0.2～0.8ml/min；使用紫外检测器，检测波长为：200nm～230nm；使用AQ色谱柱；色谱柱的柱箱温度测定为：30℃～40℃；流动相的比例为：A:B:C=0:0:100～A:B:C=20:20:100，流动相C：磷酸缓冲液的pH值2.0～8.0；

(3)、取步骤(1)的溶液10～100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的至少3倍，获得高效液相色谱分析图，从中读取和/或计算杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类、杂质相对量、各色谱峰之间的分离度。

根据本发明的方法，其任一实施方案可以与其它方案任意进行组合，只要这种组合不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步详细描述。

在本发明中，提及AQ，是指一类液相色谱柱，其填料使用具有中等强度的疏水性和氢键键合相色谱填料，这类色谱柱可以用于分析亲水极性强的样品。与一般C18色谱柱相比，在纯水相条件下长时间使用而不会引起相塌陷。

有文献报道在对奥拉西坦进行分析时使用色谱柱为C18，此款色谱柱的选择性较强，但不耐纯水相。本发明人经大量反复试验，使用AQ-C18柱，不仅可以很好的分离各杂质与降解峰，还可以比之前的方法检出更多的降解杂质。从而更准确的控制了奥拉西坦的质量。本发明可以简单、准确的测定奥拉西坦的有关物质。

在一个实施方案中，本发明所说的用液相色谱法分离测定奥拉西坦及其制剂的有关物质的方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以甲醇为流动相A，以乙腈为流动相B，以磷酸盐缓冲液(pH值为2.3～6.0)为流动相C，进行洗脱。

在一个实施方案中，上述所用色谱柱选自品牌为月旭AQ-C₁₈的色谱柱。

在一个实施方案中，本发明所述的分离测定方法，可按以下方法实现：

1)取奥拉西坦或含奥拉西坦的制剂样品适量，用流动相溶解样品，并配制成每1ml含奥拉西坦0.1～3.0mg/ml的样品溶液，优选是配制成0.5～1.5mg/ml的样品溶液，优选是配制成1.0mg/ml的样品溶液；

2)设置流动相的流速为0.2～0.8ml/min，流动相的流速优选为0.35～0.65ml/min，流动相的流速优选为0.4～0.6ml/min；检测波长为：200nm～230nm，优选波长为210nm；色谱柱的柱箱温度为：30℃～40℃，柱箱温度优选为33~37℃，柱箱温度优选为35℃；流动相的比例为：A:B:C=0:0:100～A:B:C=20:20:100，流动相的比例优选为：A:B:C=1:0:99；流动相C：磷酸缓冲液的pH值2.5～8.0，其优选为4.6±0.05。

3)取步骤1)的溶液10～100μl，注入液相色谱仪，完成奥拉西坦有关物质的测定。

在一个实施方案中，高效液相色谱仪可以是使用岛津LC-10ATvp/LC-10AD/SIL-10AD/SPD-M10A/SCL-10A/DGU-14A高效液相色谱仪，或者也可以采用其它色谱系统。

在一个实施方案中，使用的色谱柱为：AQ-C18，填料粒度可以是5μm，柱内径可以是4.6mm，柱长可以是10~40cm，例如柱长可以是15~30cm，例如25cm。

在一个实施方案中，使用的色谱柱柱温：35℃。

在一个实施方案中，使用的流动相：以甲醇为流动相A，以乙腈为流动相B，以磷酸盐缓冲液为流动相C，磷酸盐缓冲液的pH值为2.0～8.0，优选pH值为2.3～6.0，优选pH值为2.5～4.0，优选pH值为3.0±0.05。

在一个实施方案中，流动相的流速为0.5ml/min。

在一个实施方案中，使用的检测器的检测波长：210nm。

在一个实施方案中，液相分析进样体积为：20μl。

本发明采用AQ-C₁₈色谱柱，能够有效的分离奥拉西坦及其杂质；选用流动性相溶解样品，确保了溶液的稳定性；本发明解决了分离测定奥拉西坦已知杂质和未知杂质测定的问题，从而保证了奥拉西坦及其制剂的质量可控。

附图说明

图1、流动相为甲醇-磷酸缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调pH值至3.0）=1:99，色谱柱为C18柱，流速为0.5ml/min时的HPLC图。

图2、流动相为甲醇-磷酸缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调pH值至3.0）=1:99，色谱柱为C8柱，流速为0.5ml/min时的HPLC图。

图3、流动相为磷酸缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调pH值至3.0），色谱柱为C18柱，流速为0.5ml/min时的HPLC图。

图4、流动相为磷酸缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调pH值至3.0），色谱柱为C8柱，流速为0.5ml/min时的HPLC图。

图5、流动相为磷酸缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾），色谱柱为C18柱，流速为0.5ml/min时的HPLC图。

图6、流动相为磷酸缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾），色谱柱为C8柱，流速为0.5ml/min时的HPLC图。

图7、流动相为磷酸缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾），色谱柱为C18柱，流速为0.4ml/min时的HPLC图。

图8、流动相为磷酸缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾），色谱柱为C18柱,流速为0.6ml/min时的HPLC图。

具体实施方式

通过以下实例对本发明做进一步具体说明，但应该理解，以下实例不限于本发明的范围。

以下各实施例和对照例使用的试剂可从市场上容易地购得。

实施例1

仪器及条件：

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪及岛津的工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AQ-C18，4.6mm×25cm×5μm，月旭)；以甲醇为流动相A，以磷酸缓冲液(配制0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至3.0)为流动相C，流动相为流动相A甲醇与流动相C磷酸缓冲液按照体积份1:99的比例配制；检测波长为210nm；柱温为35℃。流动相流速：0.5ml/min，液相分析进样体积为：20μl。

试验步骤：

称取奥拉西坦原料10mg，置于10ml量瓶中，加流动相，溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，得到待分析溶液。

精密吸取待分析溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图1。

由图1可知，峰1-3均为杂质峰，峰4为奥拉西坦峰。峰1-3与主峰分离度均大于2.5。奥拉西坦选用的测定波长处于末端吸收，易受流动相的影响。采用本实施例中水相pH值3.0，基线更趋于稳定，且流动相系统简单易配制，测定过程不易受外界环境的干扰；且两主峰出峰时间适宜，与杂质分离度良好。

实施例2

仪器及条件：

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪及岛津的工作站；色谱柱(C8，4.6mm×25cm×5μm，月旭)；以甲醇为流动相A，以磷酸缓冲液(配制0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至3.0)为流动相C，流动相为流动相A甲醇与流动相C磷酸缓冲液按照体积份1:99的比例配制；检测波长为210nm；柱温为35℃。流动相流速：0.5ml/min，液相分析进样体积为：20μl。

试验步骤：

称取奥拉西坦原料10mg，置于10ml量瓶中，加流动相，溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，得到待分析溶液。

精密吸取待分析溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图2。

由图2可知，样品中主峰和各杂质峰分离良好。峰1-3均为杂质峰，峰4为奥拉西坦峰。峰1-3与主峰分离度均大于2.5。

实施例3

仪器及条件：

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪及岛津的工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AQ-C18，4.6mm×25cm×5μm，月旭)；流动相为磷酸缓冲液(配制0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至3.0)；检测波长为210nm；柱温为35℃。流动相流速：0.5ml/min，液相分析进样体积为：20μl。

试验步骤：

称取奥拉西坦原料10mg，置于10ml量瓶中，加流动相，溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，得到待分析溶液。

精密吸取待分析溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图3。

由图3可知，样品中主峰和各杂质峰分离良好。峰1-3均为杂质峰，峰4为奥拉西坦峰。峰1-3与主峰分离度均大于2.5。

实施例4

仪器及条件：

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪及岛津的工作站；色谱柱(C8，4.6mm×25cm×5μm，月旭)；流动相为磷酸缓冲液(配制0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至3.0)；检测波长为210nm；柱温为35℃。流动相流速：0.5ml/min，液相分析进样体积为：20μl。

试验步骤：

称取奥拉西坦原料10mg，置于10ml量瓶中，加流动相，溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，得到待分析溶液。

精密吸取待分析溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图4。

由图4可知，样品中主峰和各杂质峰分离良好。峰1-3均为杂质峰，峰4为奥拉西坦峰。峰1-3与主峰分离度均大于2.5。

实施例5

仪器及条件：

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪及岛津的工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AQ-C18，4.6mm×25cm×5μm，月旭)；流动相为磷酸缓冲液(配制0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液)；检测波长为210nm；柱温为35℃。流动相流速：0.5ml/min，液相分析进样体积为：20μl。

试验步骤：

称取奥拉西坦原料10mg，置于10ml量瓶中，加流动相，溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，得到待分析溶液。

精密吸取待分析溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图5。

由图5可知，样品中主峰和各杂质峰分离良好。峰1-3均为杂质峰，峰4为奥拉西坦峰。峰1-3与主峰分离度均大于2.5。

实施例6

仪器及条件：

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪及岛津的工作站；色谱柱(C8，4.6mm×25cm×5μm，月旭)；流动相为磷酸缓冲液(配制0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液)；检测波长为210nm；柱温为35℃。流动相流速：0.5ml/min，液相分析进样体积为：20μl。

试验步骤：

称取奥拉西坦原料10mg，置于10ml量瓶中，加流动相，溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，得到待分析溶液。

精密吸取待分析溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图6。

由图6可知，样品中主峰和各杂质峰分离良好。峰1-3均为杂质峰，峰4为奥拉西坦峰。峰1-3与主峰分离度均大于2.5。

实施例7

仪器及条件：

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪及岛津的工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AQ-C18，4.6mm×25cm×5μm，月旭)；流动相为磷酸缓冲液(配制0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液)；检测波长为210nm；柱温为35℃。流动相流速：0.4ml/min，液相分析进样体积为：20μl。

试验步骤：

称取奥拉西坦原料10mg，置于10ml量瓶中，加流动相，溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，得到待分析溶液。

精密吸取待分析溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图7。

由图7可知，样品中主峰和各杂质峰分离良好。峰1-3均为杂质峰，峰4为奥拉西坦峰。峰1-3与主峰分离度均大于2.5。

实施例8

仪器及条件：

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪及岛津的工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(AQ-C18，4.6mm×25cm×5μm，月旭)；流动相为磷酸缓冲液(配制0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液)；检测波长为210nm；柱温为35℃。流动相流速：0.6ml/min，液相分析进样体积为：20μl。

试验步骤：

称取奥拉西坦原料10mg，置于10ml量瓶中，加流动相，溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，得到待分析溶液。

精密吸取待分析溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图(记录时间为主峰保留时间的3倍以上)，结果分别见图8。

由图8可知，样品中主峰和各杂质峰分离良好。峰1-3均为杂质峰，峰4为奥拉西坦峰。峰1-3与主峰分离度均大于2.5。

实施例9

基本上与实施例1相同的方法，不同的是在配制流动相C时，配制成不同的pH值，然后照实施例1的方法对高温降解溶液进行检测，以检出可分离开的杂质个数以及全部色谱峰中任意相邻两色谱峰之间的分离度的最小值为指标，考察不同pH值的流动相C在梯度洗脱中的分离效果，进样体积为20ul。结果如下：

流动相C的pH值	可分离开的杂质个数	最小分离度
			1.0	1	0.26
1.3	1	0.52
			1.6	1	0.69
2.0	2	1.03
			2.2	2	1.35
2.5	3	2.63
			2.8	3	2.85
3.1	3	3.17

3.4	3	3.22
			3.7	3	3.19
4.0	3	2.35
			4.3	2	1.45
4.7	1	1.25
			5.5	1	1.13

对于药物的高效液相色谱分析方法而言，本领域技术人员清楚，通常而言可接受的分离度一般需要在1.0以上，通常分离度大于1.5时认为可以满足质量控制方法要求的标准。本发明人出人意料地发现，在使用梯度洗脱过程中，当流动相C的pH值在2.5~4.0的范围内时，不但分离度良好，而且可以检测到最多的杂质；在低于或高于此pH值范围时，有一些杂质检测不到，并且它们之间的分离度也较差甚至不能满足一般的分析要求，这对于化学药品严格的质量分析方法是不可取的。因此在本发明一个特别优选的实施方案中，使用的流动相C的pH值在2.5~4.0范围内。

实施例10

基本上与实施例1相同的方法，不同的是在进行分离时测定不同的色谱柱温度，照实施例1的方法对高温降解溶液进行检测，以检出的可分离开的杂质个数以及全部色谱峰中任意相邻两色谱峰之间的分离度的最小值为指标，考察不同柱温在梯度洗脱中的分离效果，结果如下：

柱温(℃)	可分离开的杂质个数	最小分离度
			25	1	0.69
27	1	0.86
			29	2	1.25
31	2	1.40
			33	3	2.08
35	3	2.13
			37	3	2.10
39	3	1.70

41	2	1.34
			43	1	1.21
45	1	0.99

本发明人出人意料地发现，在使用梯度洗脱过程中，当色谱柱的柱温在33~37℃的范围内时，不但分离度良好，而且可以检测到最多的杂质；在低于或高于此温度范围时，有一些杂质检测不到，并且它们之间的分离度也较差甚至不能满足一般的分析要求，这对于化学药品严格的质量分析方法是不可取的。因此在本发明一个特别优选的实施方案中，使用的柱温为33~37℃。

实施例11

基本上与实施例1相同的方法，不同的是使用200nm、220nm、220nm三种波长进行检测，对降解试验样品进行测定。结果与实施例1的结果基本相同，色谱图中可以读取到主峰以及3个杂质峰，各峰间的分离良好(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上，任意相邻两峰之间的分离度，最小值为2.17)。表明检测波长在200nm~230nm范围内均可满足测定要求。

实施例12

基本上与实施例1相同的方法，不同的是配制降解试验样品样品时，浓度分别为0.5、1.0、或2.5mg/ml的溶液，对这些降解试验样品进行测定。结果与实施例1的结果基本相同，色谱图中可以读取到主峰以及3个杂质峰，各峰间的分离良好(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上，任意相邻两峰之间的分离度，最小值为2.31)。表明样品浓度在0.5~2.5mg/ml范围内均可满足测定要求。

实施例13

基本上与实施例1相同的方法，不同的是在洗脱过程中，流动相C的比例为96%或98%，对降解试验样品进行测定。结果与实施例1的结果基本相同，色谱图中可以读取到主峰以及3个杂质峰，各峰间的分离良好(相邻两色谱峰之间的分离度均在2.0以上，任意相邻两峰之间的分离度，最小值为2.28)。表明梯度洗脱时流动相A和C的比例适当调整仍然可以满足测定要求。因此在本发明的一个实施方案中，由流动相A/流动相C组成的混合流域动相中，流动相C的比例可以为96~99%，即流动相A:流动相C=1:99~4:96。

本发明人在另外的试验中，照实施例1的方法，使用ODS柱(4.6mm×25cm×5μm，THERMO)，结果在对降解试验样品进行测定时，无法检测到杂质。

实施例14

使用实施例1的方法，测定3批奥拉西坦原料药，以及三批分别此3批原料药制备成的片剂(加入有乳糖、微晶纤维素、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮以便压制成片)。按照药物分析领域对药品进行有关物质检查的一般要求进行测定，结果表明，三批原料药的有关物质总量分别为0.33%、0.46%、0.41%；分别由此3批原料药制备成的片剂的有关物质总量(扣除辅料影响)分别为0.35%、0.45%、0.44%，显示原料与制剂有良好的一致性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种奥拉西坦质量分析的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对奥拉西坦原料药或者包含奥拉西坦的药物制剂进行质量分析的步骤。

2.根据权利要求1的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；例如所述高效液相色谱法使用的色谱柱是AQ-C18色谱柱;例如所述高效液相色谱法使用的色谱柱是C8色谱柱。

3.根据权利要求1的方法，其中所述高效液相色谱法分离分析时色谱柱的柱温是30~40℃，例如33~37℃，例如约35℃。

4.根据权利要求1的方法，其中所述高效液相色谱法使用A、B、C三种流动相；进一步地，流动相A为甲醇，流动相B为乙腈，流动相C为磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求4的方法，所述磷酸缓冲液是通过以下步骤获得的：称取磷酸二氢钾，去离子水溶解，再用酸或碱磷酸调节pH值，例如所述磷酸盐缓冲液中用于pH调节的酸或碱包括磷酸、枸橼酸、酒石酸、甲酸、草酸、磷酸氢二盐、磷酸二氢盐。

6.根据权利要求5的方法，所述磷酸缓冲液其pH值为2.0～8.0，例如pH值为2.3～6.0，例如pH值为2.5～4.0，例如pH值为3.0±0.05。

7.根据权利要求6的方法，其中所述高效液相色谱法中使用的流动相的比例为甲醇:乙腈:磷酸盐缓冲液=(0-20):((0-20):(100-80)，例如流动相的比例为甲醇:乙腈:磷酸盐缓冲液=(0.5-5):(0-5):(100-95)，例如流动相的比例为甲醇:乙腈:磷酸盐缓冲液=1:0:99。

8.根据权利要求1-7的方法，其中所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.2～0.8ml/min，流动相的流速优选为0.35～0.65ml/min，流动相的流速优选为0.4～0.6ml/min；所述紫外检测器所用的检测波长是200nm～230nm，优选的检测波长为210nm。

9.根据权利要求1-7的方法，其中用于进行高效液相色谱法测试的样品供试溶液是如下方式配制的：将奥拉西坦原料药或者包含奥拉西坦的药物制剂用流动相溶解样品，并稀释成每1ml含奥拉西坦0.1～3.0mg/ml的样品溶液，特别是配制成0.5～1.5mg/ml的样品溶液，特别是配制成1.0mg/ml的样品溶液；进行高效液相色谱法测试时，测试溶液注入液相色谱仪的量为10～100μl，例如10～50μl，例如10～20μl。

10.根据权利要求1-9的方法，该方法包括以下步骤：

(1)、取奥拉西坦或含奥拉西坦的药物制剂样品适量，用流动相溶解样品，并配制成每1ml含奥拉西坦0.1～3.0mg/ml的样品溶液；

(2)、设置流动相的流速为0.2～0.8ml/min；使用紫外检测器，检测波长为：200nm～230nm；使用AQ色谱柱；色谱柱的柱箱温度测定为：30℃～40℃；流动相的比例为：A:B:C=0:0:100～A:B:C=20:20:100，流动相C：磷酸缓冲液的pH值2.0～8.0；

(3)、取步骤(1)的溶液10～100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的至少3倍，获得高效液相色谱分析图，从中读取和/或计算杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类、杂质相对量、各色谱峰之间的分离度。

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