CN102985537A - 生产粘康酸和粘康酸盐的异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生产粘康酸盐的顺反-和反反-异构体的方法,所述方法通过提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐;在基本所有顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐的反应条件下将顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐;分离顺反-粘康酸盐;和结晶所述顺反-粘康酸盐。顺反-异构体还可异构化为反反-异构体。在一个示例中,所述方法包括在含所述可再生碳源的培养基中和在所述可再生碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为3-脱氢莽草酸且所述3-脱氢莽草酸被生物催化转变为顺顺-粘康酸盐的条件下培养表达3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的重组细胞。
Description
相关申请
本申请要求2010年1月8日提交的美国临时专利申请第61/335,638号的权益和优先权,其公开通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明一般涉及从可再生原料中生物生产粘康酸盐。本发明更具体涉及从可再生的生物质衍生碳源生产粘康酸盐异构体以及其前体和衍生物。
技术背景
2012年世界范围内对苯二甲酸二甲酯(DMT)消耗预计平均值为397万公吨。DMT是对苯二甲酸和甲醇的酯并用于包括聚对苯二甲酸乙二酯和聚对苯二甲酸丙二酯在内的聚酯生产。DMT还是用于生产工业塑料、汽车部件、膜、鱼线和食品包装材料的主要成分。
通常,DMT生产利用通过对二甲苯催化均质氧化产生的对苯二甲酸和甲醇的酯化反应。例如,液体对二甲苯可在钴盐催化剂存在时被空气氧化,形成含对甲苯酸和对苯二甲酸一甲酯的氧化物,并可在甲醇存在时进行酯化反应产生DMT。
偏苯三酸(TMA)是另一种市售的重要产物,用作化学工业的中间物,包括粉末涂料树脂、墨水、导线釉、低挥发性的高性能增塑剂和用于高温应用的工程改造的聚合物。TMA还可脱水产生偏苯三酸酐,其为另一种市售重要起始材料,用于生产聚合物和化学中间物。
通常,TMA通过偏三甲苯(1,2,4-三甲基苯)的氧化生产。对苯二甲酸和间苯二甲酸可在存在乙酸作为溶剂并存在包括钴、锰和溴的催化系统时通过液相氧化对二甲苯或间二甲苯而商业生产。
这些过程与生产许多其他市售重要化学前体、中间物和产物的方法一样不理想,这是由于过于依赖环境敏感且不可再生的原料(如石油原料)和其产生不需要副产物(如温室气体、重金属、卤素、致癌烃)的倾向。因此,需要利用可再生原料生产DMT、TMA以及其他化学产物的改良方法和系统。
如Frost等的美国公开号2010/0314243和Frost等的国际公开号2010/148049所述(二者的公开通过引用全文纳入本文),DMT和TMA可从粘康酸生产。此外,粘康酸盐也称为2,4-已二烯二酸,由于其双键和二酸功能性而可进行广泛的反应。已知许多粘康酸衍生物,包括内酯、砜、聚酰胺、聚脂、硫酯、加成聚物和其他化合物。该化合物具有广泛的应用,包括用作表面活性剂、阻燃剂、UV光稳定剂、热固性塑料、热塑性塑料和包被。因此,非常需要从可再生原料中生物生产粘康酸或粘康酸盐的方法以用于生产DMT、TMA和其他化学品。
发明内容
本发明的描述使用术语“粘康酸盐”和“粘康酸”。术语“粘康酸”指羧酸官能团被质子化且分子形式上是无电荷化学种(neutral species)的化学物质。粘康酸的化学式为HOOC-CH=CH-CH=CH—COOH。术语“粘康酸盐”指对应的去质子化化学种类,其中一种或两种羧酸官能团被去质子化,以产生阴离子或双阴离子形式,其在生理pH值下为主要化学种类。然而,术语“粘康酸”和“粘康酸盐”指同一分子的质子化或去质子化形式,所述术语同义使用,其中分子的质子化和去质子化(如非电离和电离)形式之间的差异并非有效区分。
本发明提供用于从生物质衍生碳源中生产所述粘康酸盐三种异构体,即顺顺、顺反和反反异构体以及其前体和衍生物的方法。所述异构体通过环绕两个双键的几何形状而在结构上不同。此外,所述异构体可具有不同的物理特性(如熔点)和化学反应性。所述方法可包括来自易获得碳源的微生物生物合成产物,所述碳源能在具有芳族氨基酸生物合成共同途径的微生物中通过生物催化转变为赤藓糖4-磷酸盐(E4P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。
一种优选的碳源是D葡萄糖。能用于本发明的D葡萄糖和其他碳源优选无毒。此外,该碳源可再生,其衍生自淀粉、纤维素,和玉米、甘蔗、甜菜、木浆和其他生物质资源中发现的糖。
适于促进本发明各步骤的宿主微生物有机体可选自具有芳族氨基酸生物合成共同内源途径的属。优选的宿主生物体包括遗传工程改造以表达所选肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)和乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)的内源基因的大肠杆菌(Escherichia coli)突变株。用于本发明的一种优选大肠杆菌(E.coli)突变体是大肠杆菌AB2834,这是一种营养缺陷型突变体,其由于编码莽草酸脱氢酶的aroE基因座中的突变而不能催化芳族氨基酸生物合成共同途径的中间产物3-脱氢莽草酸(DHS)转变为莽草酸。
芳族氨基酸生物合成共同途径在细菌和植物中产生芳族氨基酸苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。所述共同途径以分子分支酸(chorismate)结束,其后续由3种单独终末途径转化为苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
增加芳族氨基酸生物合成共同途径的生产效率的方法包括1992年12月1日授权的美国专利号5,168,056、1997年4月1日授权的美国专利号5,616,496和1992年12月21日提交且已放弃的U.S.S.N.07/994194中所述的那些方法,所有这些公开通过引用全文纳入本文。
在使用遗传工程改造的宿主生物体中,指向芳族氨基酸生物合成的碳流可沿着共同途径进行,使DHS的胞内水平升高,这是由于芳族氨基酸生物合成共同途径中阻止DHS转变为分支酸的突变。DHS作为3-脱氢莽草酸脱水酶(aroZ)的底物,该酶在DHS上的作用产生原儿茶酸盐。然后原儿茶酸盐通过另一已知为原儿茶酸盐脱羧酶(aroY)的酶转变为邻苯二酚。因此形成的邻苯二酚继而通过邻苯二酚1,2-双加氧酶(catA)的作用转变为顺顺-粘康酸。
从DHS催化顺顺-粘康酸盐生物合成的3种酶aroZ、aroY和catA可用重组DNA在宿主细胞中表达,所述DNA包括合适启动子控制下的编码这3种酶的基因。因此碳流可被迫离开芳族氨基酸生物合成途径并进入分歧途径产生顺顺-粘康酸盐。因此形成的顺顺-粘康酸可在胞外培养基中聚集,其可通过离心、过滤或其他本领域已知方法分离。然后分离的顺顺-粘康酸可化学氢化产生己二酸。
本发明的各种实施方式中,顺顺-粘康酸盐产生后可被异构化为顺反-粘康酸盐或反反-粘康酸盐,二者具有不同的物理特性和化学反应性,可产生与顺顺-粘康酸盐不同或以外的用途。例如,顺反-异构体可比顺顺-粘康酸盐具有更高的水和/或有机介质溶解度,具有回收和加工优势。另一示例中,作为狄尔斯-阿尔德反应的反应物,反反-异构体相比顺顺-异构体具有独体的用途。
在一个方面,本发明涉及生产顺反-粘康酸盐的方法。所述方法包括提供从可再生碳源经生物催化转变(如利用aroZ、aroY和catA酶)产生的顺顺-粘康酸盐;在基本所有顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐的反应条件下将顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐;分离顺反-粘康酸盐;和结晶分离的顺反-粘康酸盐(如作为质子化的顺反-粘康酸盐)。
在另一个方面,本发明涉及生产顺反-粘康酸盐的方法。该方法包括:提供含从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐的发酵肉汤;在基本所有顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐的反应条件下将顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐;从所述发酵肉汤中分离顺反-粘康酸盐;和结晶所述顺反-粘康酸盐。
在另一方面,本发明涉及由本发明所述方法生产的顺反-粘康酸盐。顺反-粘康酸盐可回收为盐,例如无机盐如纳粘康酸盐、钙粘康酸盐或铵粘康酸盐。
在另一方面,本发明涉及用于生产反反-粘康酸盐的方法,所述方法包括将从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐在基本所有顺顺-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐的反应条件下异构化为反反-粘康酸盐。例如,所述异构化反应可由贵金属加氢催化剂、海绵金属加氢催化剂或骨架加氢催化剂催化。
在另一方面,本发明涉及用于生产反反-粘康酸盐的方法,所述方法包括将从可再生碳源经生物催化转变产生的顺反-粘康酸盐在基本所有顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐的反应条件下异构化为顺反-粘康酸盐。例如,所述异构化反应可由贵金属加氢催化剂、海绵金属加氢催化剂或骨架加氢催化剂催化。
在另一方面,本发明涉及本发明所述方法生产的反反-粘康酸盐(如可再生的反反-粘康酸盐)。
在另一示例中,本文所述物质的任一上述方面、或任一方法、设备或组合物可包括一种或多种下述特征。
在各种实施方式中,所述方法包括在含所述可再生碳源的培养基中和在所述可再生碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为DHS且得到的DHS被生物催化转变为顺顺-粘康酸盐的条件下培养表达3-脱氢莽草酸脱水酶(如aroZ)、原儿茶酸盐脱羧酶(如aroY)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(如catA)的重组细胞。
所述可再生碳源的发酵生产的顺顺-粘康酸盐可产生含所述重组细胞和胞外顺顺-粘康酸盐的肉汤。所述生产还可包括从所述肉汤中分离所述重组细胞、细胞碎片、不可溶蛋白和其他不需要的固体,产生含发酵形成的基本所有或大多数顺顺-粘康酸盐的澄清发酵肉汤。然后所述顺顺-粘康酸盐可在澄清发酵肉汤中异构化为顺反-粘康酸盐。
在某些实施方式中,含从可再生碳源通过生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐的发酵肉汤可提供用于生产顺反-粘康酸盐或反反-粘康酸盐。所述发酵肉汤可包括表达3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的重组细胞。在一些实施方式中,所述发酵肉汤在容器中提供且所述异构化反应在所述容器中进行。所述容器可为发酵罐容器。在一些示例中,可在含所述可再生碳源的培养基中和在所述可再生碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为3-脱氢莽草酸且所述3-脱氢莽草酸被生物催化转变为顺顺-粘康酸盐的条件下培养表达3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的重组细胞。例如,所述重组细胞可在所述发酵罐容器中培养,从而产生所述发酵肉汤。此外,所述重组细胞可根据需要从所述发酵肉汤中移除。
在一些实施方式中,所述异构化反应由酸催化。所述酸可为无机酸(如矿物酸)或有机酸。酸可以水合或无水形式应用于所述过程。在一种示例中,盐副产物可为硫酸铵,其后续可用作例如肥料。所述异构化反应可在约1.5-约6.5的pH下进行(如1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5)。所述异构化反应优选在约3.5-约4.5的pH下进行。
在一些实施方式中,所述异构化反应在约47°C或更高的温度下进行(如47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或更高)。所述异构化反应优选在约60°C或更高的温度下进行。所述异构化反应可在8、7.75、7.5、7.25、7、6.75、6.5、6.25、6、5.75、5.5、5.25、5、4.75、4.5、4.25、4、3.75、3.5、3.25、3、2.75、2.5、2.25、2、1.75、1.5、1.25、1、0.75、0.5或0.25小时内基本完成。
在各种实施方式中,所述异构化反应基本在顺反-粘康酸盐不从反应混合物中沉淀的条件下进行。在一些实施方式中,所述异构化反应包括监控顺顺-粘康酸盐向顺反-粘康酸盐的异构化。在一些实施方式中,所述异构化反应在高于约大气压的压力下进行。
在各种实施方式中,异构化后,顺反-粘康酸盐还可通过足以引起所述顺反-粘康酸沉淀的酸化反应从所述溶液、培养基、肉汤或发酵肉汤中分离。所述肉汤可酸化成pH低于约3.0(如2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2或更低)。所述肉汤还可酸化成pH低于约2。
在一些实施方式中,所述分离步骤包括将所述溶液冷却到低于约37°C、低于约25°C、低于约-4°C或低于约-20°C的温度。
在某些实施方式中,所述分离步骤包括离心、过滤或其他用于分离所沉淀顺反-粘康酸的物理过程。在各种实施方式中,所述分离步骤包括用有机溶剂从所述发酵肉汤中提取顺反-粘康酸盐。所述有机溶剂可包含甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸、乙腈、丙酮和四氢呋喃、叔丁基甲基醚、甲基四氢呋喃、环己酮或环己醇或其混合物中的一种或多种。在一个实施方式中,所述提取可在约7-4(如约7、6.75、6.5、6.25、6、5.75、5.5、5.25、5、5.75、5.5、5.25、4)的pH下进行,而顺反-粘康酸不会明显沉淀,并且可包括使用自动添加酸以随着提取进行将pH维持在此范围内。在另一实施方式中,提取步骤可在低于约4(如约4、3.75、3.5、3.25、3、2.75、2.5、2.25、2)的pH下进行,存在沉淀的顺反-粘康酸,其可由有机溶剂溶解。在另一实施方式中,可进行所述提取步骤而不用先从发酵肉汤中移除细胞、细胞碎片、蛋白或其他不需要的材料。在另一实施方式中,所述提取步骤可由膜介导。
在某些实施方式中,顺顺-粘康酸盐可先从发酵肉汤中移除,然后进行异构化、分离和纯化步骤。所述移除可通过提取、沉淀、离子交换色谱、选择性膜分离、电渗析或其他本领域已知方法完成。
在一些实施方式中,顺反-粘康酸盐用有机溶剂通过结晶纯化。有机溶剂可包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸、乙腈、丙酮和四氢呋喃中的一种或多种。
在一些实施方式中,从发酵肉汤中回收后可进行结晶而不用干燥沉淀的顺反-粘康酸。在某些实施方式中,结晶包括从分离的顺反-粘康酸中移除不需要的盐。在各种实施方式中,结晶包括收集第一批顺反-粘康酸后浓缩结晶培养基以及从该浓缩培养基中收集第二批顺反-粘康酸。
在某些实施方式中,生产反反-粘康酸盐的方法包括生产顺反-粘康酸盐、将至少约65%的顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐,并分离该反反-粘康酸盐。本方法可包括将至少约65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐。或者,反反-粘康酸盐可由顺顺-粘康酸盐在合适的条件下(如pH、温度、催化剂等)生产或异构化。
在各种实施方式中,所述异构化反应由I2、贵金属加氢催化剂、海绵金属加氢催化剂或骨架加氢催化剂催化。所述贵金属可为任何有加氢催化剂功能的贵金属(如铂、钯等)。海绵金属或骨架催化剂可为镍-铝合金(如WRGC公司(W.R.Grace and Company)的镍催化剂)。金属催化剂可为非均相催化剂(如颗粒)或支持催化剂(如在支持物上如硅、铝、碳等)的形式。
在一些实施方式中,提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐使用转化有来自肺炎杆菌的表达3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶以及来自乙酸钙不动杆菌的表达邻苯二酚1,2-双加氧酶的异源结构基因的细菌细胞,其中所述细菌细胞的培养以88小时内足以转变至少约1.38M葡萄糖为至少约0.42M顺顺-粘康酸的速率将葡萄糖生物催化转变为顺顺-粘康酸。所述细菌细胞转化体可包括表达3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸盐合成酶和3-脱氢奎尼酸合成酶的异源DNA序列。所述细菌细胞转化体可包括表达转酮醇酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸盐合成酶和3-脱氢奎尼酸合成酶的异源DNA序列。所述细菌细胞选自具有芳族氨基酸生物合成共同途径中阻碍3-脱氢莽草酸转变为分支酸的突变的突变细胞系。所述细菌细胞可选自具有芳族氨基酸生物合成共同途径中阻碍3-脱氢莽草酸转变为分支酸的突变的突变细胞系。
在某些实施方式中,提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐包括在含碳源的培养基中培养转化有来自肺炎杆菌的表达3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶的酶种类的结构基因以及来自乙酸钙不动杆菌的表达邻苯二酚1,2-双加氧酶的酶种类的结构基因的细菌细胞,通过3-脱氢莽草酸的生物催化转变以至少约0.95毫摩尔/升/小时的速率生产顺顺-粘康酸,所述碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为3-脱氢莽草酸。在其他实施方式中,以至少约0.97、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0毫摩尔/升/小时或更快的速率生产顺顺-粘康酸。
在各种实施方式中,提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐包括在含碳源的培养基中培养转化的细菌细胞,通过3-脱氢莽草酸的生物催化转变以至少约0.95毫摩尔/升/小时的速率生产顺顺-粘康酸,所述细胞表达编码3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶、转酮醇酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸盐合成酶和3-脱氢奎尼酸合成酶的异源结构基因,碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为3-脱氢莽草酸。在其他实施方式中,以至少约0.97、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0毫摩尔/升/小时或更快的速率生产顺顺-粘康酸。
在一些实施方式中,提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐包括在含碳源的培养基中,在所述碳源以至少约0.95毫摩尔/升/小时的速率生物催化转变为顺顺-粘康酸的条件下培养转化有来自肺炎杆菌的表达3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶的结构基因以及来自乙酸钙不动杆菌的表达邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构基因的细菌细胞。在其他实施方式中,以至少约0.97、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0毫摩尔/升/小时或更快的速率生产顺顺-粘康酸。
由以下对仅以示例方式说明本发明原理的图和描述,本发明的其他方面和优点将是显而易见的。
附图简要说明
本发明上述优势和其他优势可通过参考下述说明结合附图来更好地理解。所述图不必定按比例绘制,而强调一般着重于说明本发明的原理。
图1显示芳族氨基酸生物合成共同途径和从3-脱氢莽草酸合成顺顺-粘康酸的分歧途径。
图2显示质粒p2-47的质粒图并描述如何从质粒p2-47、pSU1-31和pSUaroZY 157-27生成质粒pKD8.243A。
图3显示pKD8.292的质粒图并描述如何从质粒pIB1345和pCL1920生成质粒pKD8.292。
图4A和4B显示不同培养基中顺反-粘康酸的1H NMR光谱的示例。
图5显示pH 7时粘康酸盐异构化反应的1H NMR跟踪的示例。
图6显示pH 4时粘康酸盐异构化反应的1H NMR跟踪的示例。
图7显示pH 7时粘康酸盐异构化反应的HPLC跟踪的示例。
图8显示pH 4时粘康酸盐异构化反应的HPLC跟踪的示例。
图9显示pH 7时粘康酸盐异构化反应的时程的示例。
图10显示pH 4时粘康酸盐异构化反应的时程的示例。
图11显示粘康酸的批次培养生产。
发明详述
本发明包括从能被宿主细胞利用的可发酵碳源生产顺反-粘康酸和反反-粘康酸的方法,所述细胞具有芳族氨基酸生物合成共同途径,例如能通过中间物DHS发挥作用,以及表达酶aroZ、aroY和catA的能力。在一个优选实施方式中,所述方法包括步骤:存在可发酵碳源时培养所述宿主细胞生产顺顺-粘康酸、将所述顺顺-粘康酸异构化产生顺反-粘康酸或反反-粘康酸。
可发酵碳源可主要包括能被生物催化转变为芳族氨基酸生物合成共同途径的两种前体化合物D-赤藓糖4-磷酸盐(E4P)和磷酸烯丙醇丙酮酸(PEP)的任何碳源。合适的碳源包括但不限于,生物质衍生的或可再生的来源如淀粉、纤维素和糖部分如葡萄糖、戊糖和果糖,以及能支持微生物代谢的其他碳源如一氧化碳。在一个实施方式中,D-葡萄糖可用作生物质衍生的碳源。
适用于本发明的宿主细胞包括能用于生物合成生产所需芳族化合物的属成员。在一些实施方式中,该宿主细胞适于工业规模生物合成生产所需芳族化合物。具体地,合适的宿主细胞可具有芳族氨基酸生物合成共同内源途径,其至少具有生产DHS的功能。共同芳族途径在各种微生物中均为内源,且可用于生产各种芳族化合物。例如,美国专利号5,168,056和5,616,496(二者的公开都通过引用全文纳入本文)中所述的微生物芳族氨基酸生物合成途径可用于本发明。
图1显示芳族氨基酸生物合成共同途径和通过共同芳族途径从3-脱氢莽草酸合成顺顺-粘康酸的分歧途径,所述共同芳族途径用该途径中许多中间物引导从E4P和PEP到分支酸。E4P的有效性可通过tkt基因编码的磷酸戊糖途径酶即转酮醇酶增强。该途径中的中间物包括3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸盐(DAHP)、3-脱氢奎尼酸(DHQ)、3-脱氢莽草酸(DHS)、莽草酸、莽草酸3-磷酸盐(S3P)和5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸盐(EPSP)。该共同途径中的酶包括DAHP合成酶(aroF)、DHQ合成酶(aroB)、DHQ脱水酶(aroD)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL,aroK)、EPSP合成酶(aroA)和分支酸合成酶(aroC)。
包含该类型共同途径的宿主细胞包括属于下列属的原核生物:埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯菌(Klebsiella)、棒状杆菌棒状杆菌(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、节核细菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、链丝菌(Streptomyce)、葡萄球菌(Staphylococcus)和沙雷氏菌属(Serratia)。也可利用真核宿主细胞,例如用酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的酵母。
更具体地,原核宿主细胞可衍生自包括下述的种,大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)、双歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、马铃薯杆菌(Bacillus mesentericus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、烟草角斑病假单胞菌(Pseudomonas angulata)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、烟草假单胞菌(Pseudomonas tabaci)、金素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、阿弗链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、春日链霉菌(Streptomyces kasugensis)、淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)、利波曼链霉菌(Streptomyces lipmanii)、变青链霉菌(Streptomyceslividans)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。原核宿主细胞的示例包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。
宿主细胞可包括具有阻断DHS转变为分支点分子即分支酸的突变营养缺陷型突变细胞系。该突变体由于编码莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶、EPSP合成酶和分支酸合成酶的一种或多种基因中的突变而不能催化3-脱氢莽草酸(DHS)转变为分支酸,因此会聚集更高胞内水平的DHS。该突变细胞系的示例包括大肠杆菌株系AB2834、AB2829和AB2849。
大肠杆菌(E.coli)AB2834由于编码莽草酸脱氢酶的aroE基因座的突变而不能催化3-脱氢莽草酸(DHS)转变为莽草酸。使用大肠杆菌AB2834能确保导向芳族氨基酸生物合成的碳流不会处理超出DHS。相似地,大肠杆菌AB2829(由于编码EPSP合成酶的aroA基因座的突变而不能催化莽草酸3-磷酸盐(S3P)转变为5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸盐(EPSP))且大肠杆菌AB2849(由于编码分支酸合成酶的aroC基因座的突变而不能催化EPSP转变为分支酸)也使DHS胞内水平提高。
宿主细胞可被转化,从而胞外DHS可用作生物催化转变成邻苯二酚的底物,然后可被转化为粘康酸。例如,宿主细胞可用重组DNA转化,迫使碳流在产生DHS后远离芳族氨基酸生物合成共同途径并进入生产粘康酸的途径。
如图1所示,分歧途径中的中间物是原儿茶酸盐、邻苯二酚和顺顺-粘康酸。负责将DHS生物催化转变为原儿茶酸盐的酶是3-脱氢莽草酸脱水酶,图1中标记为“aroZ”。负责原儿茶酸盐脱羧作用形成邻苯二酚的酶是原儿茶酸盐脱羧酶,图1中标记为“aroY”。最后,催化邻苯二酚氧化产生顺顺-粘康酸的酶是邻苯二酚1,2-双加氧酶,图1中标记为“aroA”。按照标准注释,表达这些酶的基因用斜体字分别表示为aroZ、aroY和catA。然后顺顺-粘康酸可被异构化(未显示)。在本发明的一个实施方式中,宿主细胞可组成型表达基因aroZ、aroY和catA。在另一实施方式中,宿主细胞可组成型表达基因aroZ、aroY和catA中任何一种或多种;或其二者的任意组合。在另一实施方式中,宿主细胞可均不组成型表达aroZ、aroY和catA。
3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶从邻位切割途径募集,其能使微生物如脉孢菌(Neurospora)、黑麴菌属(Aspergillus)、不动杆菌(Acinetobacter)、克雷伯菌(Klebsiella)和假单胞菌(Pseudomonas)使用芳族(苯甲酸和对羟基苯甲酸盐)以及氢化芳族(莽草酸和奎尼酸)作为碳源用于生长。DHS脱水酶在奎宁酸和莽草酸的微生物分解代谢中有重要作用。在产气克氏杆菌(Klebsiella aerogenes)的对羟基苯甲酸盐分解代谢期间,原儿茶酸盐脱羧酶用Patel制备用以催化原儿茶酸盐转变为邻苯二酚。Patel株系(现在称为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))的复查[(a)Grant,D.J.W.;Patel,J.C.Antonie van Leewenhoek 1969,35,325.(b)Grant,D.J.W.Antonievan Leewenhoek 1970,36,161]近期引导Ornston总结出原儿茶酸盐脱羧酶在对羟基苯甲酸盐的分解代谢中并非为代谢上重要[Doten,R.C.;Ornston,N.J.Bacteriol.1987,169,5827]。
转化宿主细胞使碳流导向分歧途径的机制可涉及插入遗传元件,包括编码3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的可表达序列。无论所用的确切机制,预期这些酶活性的表达会受到遗传元件转移到所述宿主细胞的影响或介导。本文定义的遗传元件包括可表达编码序列的核酸(通常DNA和RNA),用于产物例如蛋白、脱辅基蛋白或反义RNA,其可进行或控制途径酶功能。表达的产物可用作酶、抑制或去抑制酶活性、或控制酶的表达。编码这些可表达序列的核酸可为染色体的(如插入或整合到宿主染色体中)或染色体外(如由质粒、粘粒携带等)。
本发明的遗传元件可通过质粒、粘粒、噬菌体、酵母人工染色体或介导所述遗传元件转入宿主细胞的其他载体来引入宿主细胞。这些载体可包含沿着顺式作用对照元件的复制起点,其控制所述载体和该载体所携带遗传元件的复制。选择标记可存在于载体上以用于帮助鉴定已引入所述遗传元件的宿主细胞。例如,选择标记可为赋予对具体抗生素如四环素、氯霉素、卡那霉素或新霉素的抗性的基因。
将遗传元件引入宿主细胞可利用已插入遗传元件的染色体外多拷贝质粒载体。由质粒承担的将所述遗传元件引入宿主细胞包括先用限制性酶切割质粒,然后连接质粒和本发明所述的遗传元件。连接的重组质粒重新环化后,用转导或其他质粒转移机制(如电穿孔、微注射等)将所述质粒转入所述宿主细胞。适于将遗传元件插入所述宿主细胞的质粒包括但不限于pBR322和其衍生物如pAT153、pXf3、pBR325、pBr327、pUC载体,pACYC和其衍生物,pSC101和其衍生物和ColE1。此外,粘粒载体如pLAFR3也适于将遗传元件插入宿主细胞。质粒构建体的示例包括但不限于p2-47、pKD8.243A、pKD8.243B和pSUaroZY157-27,其带有分离自肺炎杆菌的aroZ和aroY基因座,分别编码3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶。质粒构建体的其他示例包括pKD8.292,其载有乙酸钙不动杆菌catA的内源遗传片段,编码邻苯二酚1,2-双加氧酶。
转化宿主细胞的方法还可包括插入编码增加碳进入芳族氨基酸生物合成共同途径的酶的基因。基因的表达主要由其自身启动子指导,尽管包括任选表达控制序列如抑制子和增强子的其他遗传元件也可包括在内以控制表达或去抑制蛋白、脱辅基蛋白或反义RNA的编码序列。此外,可生成重组DNA构建体,其中所述基因的天然启动子用替代的启动子取代以增加基因产物表达。启动自可为组成型或诱导型。组成型启动子在细胞周期中以恒定速率控制基因转录,而诱导型启动子的活性波动由存在(或缺失)特异诱导剂所确定。例如,控制序列可插入野生型宿主细胞以促进宿主细胞基因组已编码的所选酶的过表达,或这可用于控制染色体外编码酶的合成。
可使用促进DHS过表达的控制序列。如前所述,DHS在共同途径中通过3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸盐(DAHP)合成酶(aroF编码)的酪氨酸敏感的同工酶和3-脱氢奎尼酸(DHQ)合成酶(aroB编码)以及磷酸戊糖途径酶转酮醇酶(tkt编码)顺序催化活性合成。这些生物合成酶的表达可扩增以增加D-葡萄糖转变为DHS。共同途径的第一个酶即DAHP合成酶的体内催化剂活性增加使等价D-葡萄糖流导入芳族生物合成。然而,达到DAHP合成酶催化活性的水平,除此之外负责芳族合成的D-葡萄糖百分比上没有实现进一步改良。在该限制水平的芳族氨基酸生物合成下,磷酸戊糖途径酶转酮醇酶的催化水平扩大可实现流入该途径的D-葡萄糖百分比大量增加。
扩大的转酮醇酶活性可增加D-赤藓糖4-磷酸盐的浓度。作为DAHP合成的两种底物之一,受限的D-赤藓糖4-磷酸盐有用性会限制DAHP合成酶的催化活性。因此,扩大DAHP合成酶、DHQ合成酶和DHQ脱水酶的催化活性的一种方法是通过用编码这些酶的重组DNA序列转化微生物催化剂来过表达酶种类。
扩增DAHP合成酶和转酮醇酶的表达可产生流入芳族氨基酸生物合成共同途径的大量碳流,超出进入该途径的正常碳流。若芳族氨基酸共同途径中个体酶催化的底物转变成产物的个体速率低于DAHP合成速率,这些速率限制酶的底物可在胞内聚集。
微生物如大肠杆菌通常通过将底物运出到外部环境如大量发酵培养基来处理聚集的底物。这会导致通过所述共同途径的碳流损失,因为运出的底物通常不再属于微生物代谢。DHQ合成酶是速率限制的共同途径酶的示例。DHQ合成酶的扩增表达消除该酶的速率限制特征,并阻止DAHP和其非磷酸化类似物DAH的聚集。DHQ脱水酶非速率限制型。因此,aroF-编码的DAHP合成酶、tkt-编码的转酮醇酶和aroB-编码的DHQ合成酶的扩增表达增加DHS的生产,其在DHS脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶存在时转变为邻苯二酚,然后生物催化转变为顺顺-粘康酸,然后其可被异构化。
能促进碳流沿着碳源和DHS之间共同途径的效率的一种质粒是质粒pKD136,其编码aroF、tkt和aroB基因。由于DAHP合成酶(aroF编码)和转酮醇酶(tkt编码)的扩增表达,质粒pKD136将大量碳流导向芳族生物合成。然后由于DHQ合成酶(aroB编码)的扩增表达,所述大量碳流通过pKD136完整导入DHS合成。
因此,作为本发明的优选实施方式,构建表达编码DHS脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶、和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因的大肠杆菌异源株系,使D-葡萄糖生物催化转变为顺顺-粘康酸。D-葡萄糖有效转变为DHS在pKD136转化宿主细胞后实现。然后用质粒pKD8.243A和pKD8.292转化株系大肠杆菌株系AB2834/pKD136。得到表达3-脱氢莽草酸脱水酶(aroZ)、原儿茶酸盐脱羧酶(aroY)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(catA)的大肠杆菌AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292。该细菌细胞系于1995年8月1日保藏在马里兰州罗克维尔帕克曼12301(12301Parklawn Drive,Rockville,MD)的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),登录号69875。
在另一实施方式中,大肠杆菌AB2834/pKD136用质粒p2-47和pKD8.292转化,生成大肠杆菌AB2834/pKD136/p2-47/pKD8.292。在另一实施方式中,大肠杆菌AB2834/pKD136用质粒pKD8.243B和pKD8.292转化,生成大肠杆菌AB2834/pKD136/p2-47/pKD8.292。这些异源宿主细胞系各催化D-葡萄糖转变为顺顺-粘康酸。合成的顺顺-粘康酸在胞外聚集且可从细胞中分离。然后,顺顺-粘康酸可异构化为顺反-粘康酸以及进一步成为所需的反反-粘康酸。
因此本发明涉及具有芳族氨基酸生物合成共同内源途径的宿主细胞转化体。所述转化体的特征为组成型表达编码3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的异源基因。在一个实施方式中,所述细胞转化体还用编码转酮醇酶、DAHP合成酶和DHQ合成酶的可表达重组DNA序列转化。在另一实施方式中,所述宿主细胞选自突变细胞系组,所述突变细胞系组包括具有芳族氨基酸生物合成共同途径中具有阻碍3-脱氢莽草酸转变为分支酸的突变。在另一实施方式中,编码3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶的基因为肺炎杆菌内源。在另一实施方式中,编码邻苯二酚1,2-双加氧酶的异源基因为乙酸钙不动杆菌内源。
可再生粘康酸盐
产自可再生、生物衍生碳源的粘康酸由来自可被植物纳入的空气二氧化碳的碳组成(如来自诸如葡萄糖、蔗糖、甘油或植物油等碳源)。因此,该粘康酸的分子结构中包括可再生碳而不是基于化石燃料或基于石油的碳。因此,作为本专利主题的生物合成粘康酸盐和相关的衍生产物,比传统方法生产的粘康酸盐和相关产物具有更小的碳足迹,因为其不消耗化石燃料或石油储存且因为其不增加碳循环中的碳量(如生命周期分析显示对全球碳平衡没有净碳增加)。
生物合成的粘康酸盐和相关产物可与化石燃料或石油化学碳源生产的粘康酸盐和相关产物相区分,通过本领域已知方法如双碳-同位素指印。本方法可区分化学上相同的材料,并用14C和13C同位素比例根据来源区分材料中的碳原子,即生物对比非生物。碳原子同位素14C不稳定,半衰期为5730年。测量不稳定14C同位素相对于稳定同位素13C的相对丰度能区分化石(长期死亡)和生物圈(活的因此可再生)原料之间的样本碳(参见Currie,L.A.“SourceApportionment of Atmospheric Particles,”Characterization of EnvironmentalParticles,(“大气颗粒的来源解析,”环境颗粒鉴定)J.Buffle和H.P.vanLeeuwen编,IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series(《IUPAC环境分析化学系列》)第I卷第1部分(路易斯出版社公司(Lewis Publishers,Inc))(1992)3-74)。放射性碳数据中的基本假设是14C浓度在大气中的恒定导致14C在活生物体中恒定。
处理分离样品时,样品年龄可通过关系式t=(-5730/0.693)ln(A/Ao)近似推测,其中t=年龄,5730年是不稳定14C同位素的半衰期,且A和Ao分别是样品和现代标准的特异14C活性(Hsieh,Y.,Soil ScL Soc.Am J.,56,460,(1992))。然而,由于1950年开始的大气核测试和1850年开始燃烧化石燃料,14C获得第二地理化学时间特征。其在大气CO2中的浓度以及因此在或生物圈中的浓度在20世纪60年代中期核测试顶峰时近似翻倍。然后其逐渐恢复到稳定状态宇宙发生(大气)的基线同位素率(14C/12C)-约1.2x 10-12,近似松弛半衰期为7-10年。(后一种半衰期需与同位素半衰期区分,即必须使用详细的大气核输入/衰退函数来示踪核时代发生以来大气和生物圈14C的变化。)正是这后一种生物圈14C时间特征使近期生物圈碳能保持每年测定。14C可通过加速器质谱(AMS)来测量,结果以现代碳部分的单位给出。fM由国家标准和技术研究院(National Institute of Standards and Technology(NIST))标准参考材料(Standard Reference Materials(SRM))4990B和4990C定义,分别称为草酸标准HOxI和HOxII。基础定义涉及0.95倍的14C/12C同位素比HOxI(参考AD1950)。对于当前活生物圈(植物材料),fM≈1.1。
稳定碳同位素13C和12C的比例提供了来源区分和分配的补充途径。给定生物来源材料中的13C/12C是二氧化碳被固定时大气二氧化碳中13C/12C比例的结果,并且还反映了精确的代谢途径。还发生地区变化。石油、C3植物(阔叶植物)、植物(禾本科)和海洋碳酸盐都显示出在13C/12C和相应的δ13C值方面的显著不同。此外,代谢途径的结果是,C3和C4植物的脂类物质与衍生自相同植物糖组分的材料进行不同的分解。测量精度内,由于同位素分馏效应,13C显示较大的变化,其对本发明最重要的是光合作用机制。植物中碳同位素比例差异的主要原因是与植物光合作用碳代谢途径的差异相关,尤其是主要羧化反应期间发生的反应(如空气CO2的初始固定)。两大类植物是将C3(或卡尔文-本森(Calvin-Benson))光合循环纳入的那些和将C4(或哈奇-斯莱克(Hatch-Slack))光合循环纳入的那些。C3植物如阔叶树和针叶树主要在温带气候带。C3植物中,主要CO2固定或羧化反应涉及核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶,第一个稳定产物是3碳化合物。另一方面,C4植物包括诸如热带针叶树、玉米和甘蔗等植物。C4植物中,涉及另一酶即磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的其他羧化反应是主要的羧化反应。第一稳定碳化合物是4碳酸,然后其被去羧化。因此释放的CO2被C3循环再固定。
C4和C3植物都显示13C/12C同位素比例范围,但通常值为每密耳约-10~-14(C4)和每密耳-21~-26(C3)(Weber等J.Agric.Food Chem.,45,2942(1997))。煤和石油通常落入后者的范围。13C测量尺度原始定义为由国际标准物质pee dee belemnite(PDB)石灰石设定的零,其中数值以此材料的千分率偏差给出。δ13C值为千分之几(每密耳),缩写为%o,按如下计算:δ13C≡(13C/12C)样品-(13C/12C)标准/(13C/12C)标准x 1000%o
由于PDB参考材料(RM)已经耗尽,IAEA、USGS、NIST和其他选定国际同位素实验室已联合开发一系列替代的RM。PDB的每密耳偏差注释为δ13C。通过高精度稳定比值质谱(IRMS)在分子离子质量44、45和46下对CO2进行测量。
因此,生物合成的粘康酸盐和包括生物合成粘康酸盐的组合物可与其基于14C (fM)和双碳-同位素指纹的化石燃料和石油衍生的相对物相区分,表明其为新的物质组合物(如美国专利号7,169,588、7,531,593和6,428,767)。区别这些产物的能力有益于在商业上跟踪这些材料。例如,含新和旧碳同位素分布的产品可与仅用旧材料制作的产品区分。因此,生物合成粘康酸盐和衍生材料可在商业上基于其独特的分布而跟踪。
实施例
实施例1-克隆aroZ基因
编码DHS脱水酶的基因称为aroZ,从肺炎杆菌DNA基因组库中分离。基因组DNA从肺炎杆菌株系A170-40中纯化且部分用BamHI消化产生15kb-30kb的片段。得到的DNA片段连接到粘粒pLAFR3中,其先用BamHI消化然后用小牛肠碱性磷酸酶处理。pLAFR3是具有RK2复制子的四环素抗性粘粒。连接的DNA用Packagene包装系统(普洛麦格(Promega))包装,且得到的噬菌体颗粒用于感染大肠杆菌DH5α/pKD136。质粒pKD136是含编码转酮醇酶(tkt)、DAHP合成酶(aroF)和DHQ合成酶(aroB)的基因以及氨苄青霉素抗性基因的基于pBR325的载体(pMB1复制起点)。然后将对四环素和氨苄青霉素都有抗性的菌落置于显色极限培养基(M9)平板上,所述培养基板含D-葡萄糖(4g L)、莽草酸(0.04g L)、柠檬酸铁(0.07g L)、对甲苯胺(1.9g L)、氨苄青霉素(0.05g L)和四环素(0.013g L)。37°C孵育48小时后,菌落5-87周围的生长培养基显示为棕色,与原儿茶酸点在板上时培养基发生暗化类似。从菌落5-87的培养物中纯化DNA,由pKD136和四环素抗性粘粒组成,称为p5-87。粘粒p5-87含有14kb BamH I片段,其用BamH I消化完全时产生四种可检测DNA片段。
实施例2–确认aroZ基因的克隆
确认粘粒p5-87含有aroZ基因依赖于通常将D-葡萄糖转变为DHS的大肠杆菌株系的转化,其可进一步将DHS转变为原儿茶酸。由于编码莽草酸脱氢酶的aroE基因的突变,大肠杆菌AB2834在培养物上清中聚集DHS。D-葡萄糖转变为DHS在AB2834转化有pKD136时达到最大化。AB2834用pKD136和p5-87共转化产生对氨苄青霉素和四环素有抗性的菌落。1升LB培养基(4L锥形瓶)用AB2834/pKD136/p5-87的过夜培养物(5mL)接种。所述培养物37°C振荡(250rpm)生长8小时。然后收获细胞并在1升(4L锥形瓶)基本M9培养基中重悬,所述培养基含有葡萄糖(10g L)、莽草酸(0.04g L)、氨苄青霉素(0.05g L)和四环素(0.013g L)。培养物返回37°C孵育。24小时和64小时后移出等分培养物,离心移除细胞。从各样品中收集5毫升分离上清并真空移除水。样品再溶于D2O中并真空浓缩。重复该过程,使残余水与D2O交换,产生适于1H NMR分析的样品。用3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-2,2,3,3-d4酸的钠盐作为内标,确定约9mM原儿茶酸聚集在培养物上清中。δ6.94(d,7Hz,1H)和δ7.48(d,7Hz,2H)的诊断共振指示原儿茶酸。DHS未在所述培养物上清中检测到。从本实验推断出编码DHS脱水酶(aroZ)的基因定位在质粒p5-87上。
实施例3–亚克隆aroZ基因
为了使编码aroZ的插入物尺寸最小化,用BamH I消化质粒p5-87,得到的片段连接到前面用BamH I消化并用磷酸酶处理的载体pSU19上。质粒pSU19含p15A复制子和影响赋予氯霉素抗性的基因。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α/pKD136中后,得到的氨苄青霉素和氯霉素抗性菌落如实施例1所述就将含柠檬酸铁和对甲苯胺的显色极限培养基琼脂糖平板变为棕色的能力筛选。使用该技术,分离到质粒pSU1-31,其由pSU19所含的3.5kb BamHI插入物组成。AB2834/pKD136/pSU1-31生长在与实施例1所述条件相似的1L规模中,培养物上清的1H NMR分析表明11mM原儿茶酸在胞外聚集。
实施例4–克隆aroY基因
分离含aroY基因的DNA片段是基于正常合成原儿茶酸盐的株系会在催化活性的原儿茶酸盐脱羧酶存在时转而合成邻苯二酚。制备含位于pLAFR3中3.5kb BamH I aroZ片段的粘粒p4-20。在粘粒p4-20中制备用EcoR I消化的肺炎杆菌DNA库,类似先前在pLAFR3中的构建。包装在λ噬菌体头中的DNA用于感染大肠杆菌DH5α/pKD136,产生对氨苄青霉素和四环素有抗性的菌落。在含柠檬酸铁和对甲苯胺的显色极限培养基琼脂糖平板中筛选菌落。由于添加邻苯二酚到显色极限培养基中比添加等量原儿茶酸产生更强的周围琼脂糖暗化,所以预期合成邻苯二酚的那些菌落可从合成原儿茶酸盐的菌落背景中筛选出来。37°C孵育约24小时后,菌落2-47产生所有其他菌落都没有的棕色局部区域。
从菌落2-47中分离DNA产生质粒pKD136和质粒p2-47,然后其共转化到感受态细胞中产生大肠杆菌AB2834/pKD136/p2-47。AB2834/pKD136/p2-47的培养物上清如实施例2所述通过1H NMR分析。极限培养基中48小时后,56mM D-葡萄糖溶液被AB2834/pKD136/p2-47转变为20mM邻苯二酚溶液。
实施例5-亚克隆aroY基因
与分离编码原儿茶酸盐脱羧酶的DNA原始策略类似,将aroYEcoR I片段以其最小尺寸亚克隆也依赖于存在DHS脱水酶时aroE宿主菌株的邻苯二酚合成。p2-47用EcoR I消化完全表明aroY插入物由两个约8kb和11.9kb的EcoR I片段组成。11.9kb EcoR I片段定位在pSU1-31中会产生质粒pSUaroZY157-27。在实施例2所述的相似条件下于1L规模中培养时,大肠杆菌AB2834/pKD136/pSUaroZY157-27在补充有56mM D-葡萄糖的培养物上清中聚集16mM邻苯二酚。11.9kb EcoR I片段结合其他亚克隆的作图表明aroY基因可能定位在11.9kb片段中部附近。用Hind III消化pSUaroZY157-27产生2.3kb Hind III片段,将其插入pSU1-31中产生质粒pKD8.243A(图2)。还分离质粒pKD8.243B,其中2.3kb Hind III片段位于相对所述载体的反向。这些质粒各共转化到含质粒pKD136的AB2834中。在实施例2所述的相似条件下于1L规模中培养时,AB2834/pKD136/pKD8.243A在48小时内从56mMD-葡萄糖合成16mM邻苯二酚,而AB2834/pKD136/pKD8.243B合成10mM邻苯二酚。还在一些培养物上清中检测到原儿茶酸(<4mM),尽管并非一致的基础且不是总在微生物合成的末端。表达酶种类3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶的细菌细胞系AB2834/pKD136/pKD8.243A于1996年3月19日保藏于马里兰州罗克维尔帕克曼12301(12301Parklawn Drive,Rockville,MD)的美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection),登录号98014。
实施例6–DHS脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的酶活性
邻苯二酚1,2-双加氧酶在生物体中的表达能催化D-葡萄糖转变为邻苯二酚,预期引起微生物合成顺顺-粘康酸。获得含宿主载体pUC19所提供lac启动子表达的乙酸钙不动杆菌catA基因的质粒pIB 1345。设计三种质粒系统用于从D-葡萄糖微生物合成顺顺-粘康酸盐。发现质粒pKD136(pMB1起点,氨苄青霉素抗性)和pKD8.243A(p15A起点,氯霉素抗性)在所用生长条件下稳定维持。选择第三种质粒pCL1920用于表达邻苯二酚1,2-双加氧酶。质粒pCL1920是含有pSC101复制起点和赋予壮观霉素抗性的基因的低拷贝载体。用Sal I和Kpn I消化pIB1345产生1.5kb片段,然后其被定位到pCL1920中产生pKD8.292(图3),其中邻苯二酚1,2-双加氧酶从编码lac启动子的载体中表达。用pKD8.243A和pKD8.292转化AB2834/pKD136产生对氨苄青霉素、氯霉素和壮观霉素有抗性的菌落。
测定酶活性以确认大肠杆菌AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292表达将DHS转变为顺顺-粘康酸盐必需的来自邻位切割途径的各基因。AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292的培养物在含IPTG(0.2mM)、氨苄青霉素(0.05g)、氯霉素(0.02g)和壮观霉素(0.05g)的LB中(1L)250rpm,37°C培养10小时。收获细胞并在100mM Tris HCl、pH 7.5、2.5mM MgCl2中重悬。经过两次弗氏(French)压细胞压碎器(16,000psi)后,裂解物通过离心澄清(40000g,30分钟,4°C)。为了测定DHS脱水酶活性,各实验包含(终体积1mL)100mM Tris HCl,pH 7.5,25mM MgCl2,mM DHS和细胞裂解物。添加DHS后,原儿茶酸盐(ε=3890M1cm1)的形成在290nm处监控数分钟。测量的3种AB2834/pKD 136/pKD8.243A/pKD8-292样品的DHS脱水酶活性测定为0.078单位毫克±0.009,其中一个单位是在1分钟内将1μmol DHS转变为原儿茶酸所需的酶量。
邻苯二酚1,2-双加氧酶特异活性用上述生产的相同细胞裂解物样品测定。各试验含有100mM磷酸钾、pH 7.5,0.2mM邻苯二酚和细胞裂解物。通过跟踪260nm处吸光度的增加来监控顺顺-粘康酸盐的形成。假定试验条件下顺顺-粘康酸盐和邻苯二酚之间的摩尔消光系数差异为16,000M1cm1,测定AB2834/pKD136/pKD8.243A/PKD8-292中的邻苯二酚1,2-双加氧酶活性为0.25单位毫克±0.0,其中一个单位对应于每分钟的1μmol顺顺-粘康酸盐形成。
为了测定原儿茶酸盐脱羧酶的活性,如前实施例6所述培养AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292。收获细胞并在75mM pH 7.1磷酸缓冲液中重悬。经过弗氏(French)细胞压碎器(16000psi)破碎后,裂解物通过离心澄清(40000g,30分钟,4°C)。通过跟踪原儿茶酸的消耗来测定原儿茶酸脱羧酶活性。各试验(终体积1mL)含75mM磷酸钠、pH 6.0、0.3mM原儿茶酸和细胞裂解物。监控290nm吸光度随着时间的损失。AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292中原儿茶酸脱羧酶活性测定为0.028单位毫克±0.009,其中一个单位对应于每分钟的1μmol原儿茶酸氧化。
实施例7–D-葡萄糖转变为顺顺-粘康酸盐
用大肠杆菌AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292从D-葡萄糖微生物合成顺顺-粘康酸盐如下进行。含IPTG(0.2mM)、氨苄青霉素(0.05g)、氯霉素(0.02g)和壮观霉素(0.05g)1升LB培养基(4L锥形烧瓶中)用10mLAB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292过夜培养物接种。细胞在250rpm 37°C培养10小时。收获细胞,在含56mM D-葡萄糖、莽草酸(0.04g)、IPTG(0.2mM)、氨苄青霉素(0.05g)、氯霉素(0.02g)和壮观霉素(0.05g)的1L M9基本培养基中重悬。培养物返回37°C孵育。在基本培养基中重悬后,密切监控培养物的pH,尤其是初始12小时。培养物pH达到6.5时,加入5N NaOH将pH调回约6.8。48小时聚集期间,培养物pH不能低于6.3。基本培养基中24小时后,用实施例2所述的方法在培养物上清中检测到12mM顺顺-粘康酸盐和1mM原儿茶酸以及23mM D-葡萄糖。基本培养基中48小时后,AB2834/pKD136/pKD8.243A/pKD8.292用17mM顺顺-粘康酸盐替代了56mM D-葡萄糖。
实施例7A–20L规模下葡萄糖转变为顺顺-粘康酸盐
图7A显示20L批次培养WN1/pWN2.248生产顺反-粘康酸的结果。培养物在OD600=33时每6小时用IPTG诱导(100mM,10mL)。约88小时后,粘康酸滴度为59g/L(30%产量)且合成的粘康酸总量为1475g。这对应于约88小时中约1.38M葡萄糖转变为0.42M顺反-粘康酸。表1显示整个培养期间各时间的顺反-粘康酸产率。(应注意该表显示诱导后产率随着时间的变化。若排除异常数据点(接种后48小时和接种后58小时),平均速率为1.1g/L/h。)还发现IPTG重结晶(如在乙酸乙酯中)能增加粘康酸滴度。例如,数个实验显示20L规模下约55-60g/L的粘康酸滴度,其比没有IPTG重结晶时观察到的约50g/L产量提高约17%(如约30%对比24%的产量)
表1发酵中顺顺-粘康酸盐产率
诱导后(小时) | 顺顺-粘康酸盐(g/L) | 比率(g/L/h) | 比率(mmol/L/h) |
0 | 0.52 | ||
6 | 7.46 | 1.16 | 8.14 |
12 | 16.14 | 1.45 | 10.18 |
18 | 22.37 | 1.04 | 7.31 |
24 | 28.26 | 0.98 | 6.91 |
30 | 35.14 | 1.15 | 8.07 |
36 | 39.57 | 0.74 | 5.20 |
42 | 46.72 | 1.19 | 8.39 |
48 | 47.53 | 0.14 | 0.95 |
53 | 52.19 | 0.93 | 6.56 |
58 | 51.55 | -0.13 | -0.90 |
66.5 | 59.22 | 0.90 | 6.35 |
从葡萄糖或其他可发酵碳源中生产顺顺-粘康酸盐后,生产顺反-粘康酸盐的方法包括(i)提供从可再生碳源通过生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐(ii)在基本所有顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐的反应条件下将顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐;和(iii)分离顺反-粘康酸盐并结晶顺反-粘康酸盐。
异构化反应可由酸如无机酸催化。所述异构化反应可在pH低于7的溶液中进行,优选pH低于约4或更低。在一些示例中,异构化的pH可高于一种或多种顺顺-粘康酸盐、顺反-粘康酸盐和反反-粘康酸盐从溶液沉淀的值。
异构化反应可在高于室温或高于发酵温度的温度下进行。例如,异构化反应可在约30°C或更高的温度下进行,优选高于60°C或更高。
分离步骤可包括通过酸化溶液从溶液中沉淀所述顺反-粘康酸盐。优选地,所述溶液可酸化成pH低于约3。分离步骤可包括冷却所述溶液。所述溶液可冷却至低于约30°C,优选低于0°C的温度。
重结晶可使用有机溶剂。所述有机溶解可包括一种或多种极性非质子溶剂(如乙酸、丁醇、异丙醇、丙醇、乙醇、甲醇、甲酸、水)、极性质子溶剂(如二噁烷、四氢呋喃、二氯甲烷、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲亚砜)、和非极性溶剂(如己烷、苯、甲苯、二乙醚、氯仿、乙酸乙酯)。
在某些实施方式中,所述方法包括从分离的顺反-粘康酸中移除盐。所述盐可包括无机盐。
在某些实施方式中,所述方法包括将至少约50%的顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐,优选多于95%。
图11显示OD600=33时每6小时用IPTG诱导(100mM,10mL)的20L批次培养WN1/pWN2.248生产顺反-粘康酸的结果。约88小时后,粘康酸滴度为59g/L(30%产量)且合成的粘康酸总量为1475g,这对应于约88小时中约1.38M葡萄糖转变为0.42M顺反-粘康酸。
实施例8–顺顺-粘康酸盐在发酵罐中原位异构化为顺反-粘康酸盐
提供从可再生碳源通过生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐(如按照实施例7和7A的方法),含顺顺-粘康酸盐的发酵培养物加热到60°C。加热的发酵培养物通过添加2N硫酸0.5小时调节至pH4。酸化的培养基可反应3.5小时。
通过配有Prevail有机酸柱(150mm x 4.6mm)的1H NMR和HPLC监控反应,以测定反应终点。这些数据与中性pH的对照实验一起示于图7-10。通常,可监控该异构化反应以测定合适的反应参数(如时间、温度、pH等)。
图5显示pH 7时粗发酵肉汤中顺顺-粘康酸盐向顺反-粘康酸盐异构化的1H NMR踪迹。0-1.25和3.25小时的时间踪迹表明中性pH(如实际发酵期间的近似pH水平)下基本没有顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸。因此,实际发酵期间没有发生顺顺-粘康酸盐的异构化或可以忽略不计。
图6显示pH 4时粗发酵肉汤中粘康酸盐异构化反应的1H NMR踪迹。0-1.25和3.25小时的时间踪迹表明酸性pH下快速进行顺顺-粘康酸向顺反-粘康酸的异构化,且所述异构化在约1.25小时后基本完成。
图7显示pH 7时粘康酸盐异构化反应的HPLC踪迹。图9显示pH 7时粘康酸盐异构化反应的时程。与1H NMR踪迹一样,这些HPLC踪迹和时程表明中性pH下基本没有顺顺-粘康酸异构化为顺反-粘康酸。
图8显示pH 4时粘康酸盐异构化反应的HPLC踪迹。图10显示pH 4时粘康酸盐异构化反应的时程。与1H NMR踪迹一样,这些HPLC踪迹和时程表明酸性pH下快速进行顺顺粘康酸-向顺反-粘康酸的异构化,且所述异构化在约1.25小时后基本完成。
实施例9–通过酸化、沉淀和过滤从发酵肉汤中分离顺反-粘康酸
异构化后(如实施例8),含顺反-粘康酸的肉汤冷却到约环境温度并通过离心将所述细胞、细胞碎片和沉淀固体从培养物肉汤中移除。或者,该固体可过滤移除(例如通过100kD膜包(Slice cassette))。然后无细胞肉汤过滤澄清(如通过10kD膜包),以移除蛋白。
过滤后,澄清肉汤的pH通过添加浓硫酸调节为pH 1.5。各种pH值下顺反-粘康酸盐的沉淀量示于表2。
表2.不同pH值下的顺反-粘康酸盐沉淀
pH | 沉淀中的ctMA | 过滤物的ctMA% | ctMA/总MA |
(重量%) | (重量%) | (HPLC%) | |
4.7 | 0 | 100 | 98 |
4.0 | 22 | 75 | 94 |
3.5 | 58 | 26 | 86 |
3.0 | 61 | 22 | 83 |
2.5 | 64 | 18 | 87 |
2.0 | 18 | 86 |
酸化的肉汤静置冷却至4°C持续1.5小时,期间粗顺反-粘康酸沉淀为淡黄色固体。该材料通过过滤回收且澄清肉汤中包括约60%的顺反-粘康酸。可使沉淀持续较长时间(如过夜)和/或处于低温(如-20°C)以增加产物回收并同时减轻盐污染。
过滤物含额外的顺反-粘康酸。为了回收所述额外的顺反-粘康酸,低压下蒸发过滤物,将体积降低约50%。浓缩的过滤物过夜冷却至-20°C,期间第二批粗顺反-粘康酸沉淀。再过滤回收沉淀物。
合并粗顺反-粘康酸固体并用乙腈重结晶,产生纯化的顺反-粘康酸盐白色固体。用甲醇重结晶提供相似的产量。甲醇还减少纯化产物中的盐污染。
图4A显示结晶的顺反-粘康酸的1H NMR谱。图4B显示在缺少葡萄糖的极限盐培养基中重悬的结晶顺反-粘康酸的1H NMR谱。图4B的谱近似于发酵肉汤中其他组分引起的顺反-粘康酸的NMR谱移动,且因此可进行监控发酵肉汤中顺顺向顺反的异构化反应的比较。
实施例10–用有机溶剂从发酵肉汤提取顺反-粘康酸
有利地,顺反-粘康酸令人惊奇并意外地比顺顺-或反反-异构体在有机溶剂中溶解性更高。因此,分离步骤(如实施例8的分离步骤)可包括用有机溶剂从溶液(如发酵肉汤)中提取顺反-粘康酸盐。
从中提取顺反-粘康酸盐的溶液可为完整培养发酵肉汤或无细胞、无蛋白的发酵肉汤。细胞可例如通过过滤(如所述肉汤通过0.1μM中空纤维过滤单元)从肉汤中移除。蛋白可例如通过过滤(如穿过例如获自的10kD切向流过滤系统)从肉汤中移除。
用于提取的有机溶剂(如不能与水相混溶的溶剂)可包括例如以下一种或多种:甲基异丁基酮(MIBK)、乙酸乙酯、乙酸异丙酯(乙酸丙酯)、庚烷(混合物)、甲基叔丁基醚、二甲苯、二氯甲烷、环己醇、萘烷、萘满、四氢萘酮、环己烷、醋酸丁酯、甲基四氢呋喃(THF)、环己酮/环己醇(市售混合物)、1-辛醇、异戊醇和2-乙基己醇.
可加入水相且有助于提取以及同时或随后酯化顺反-粘康酸盐的其他有机溶剂可包括例如以下一种或多种:甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙酸、乙腈、和丙酮,以及丁醇如1-丁醇和异丁醇,和与水不能完全混溶的其他醇。
溶剂提取可在低于约4的pH下进行,如顺反-粘康酸足以被质子化的pH,所述顺反-粘康酸会分配进入用于提取的有机溶剂。即使在低到足以会引发沉淀的pH水平,质子化顺反-粘康酸的部分可保持在溶液中。例如,如上述实施例9的表2所示,pH3时最初在溶液中约60%的顺反-粘康酸沉淀且可通过过滤分离。然而,仍在溶液中的约40%顺反-粘康酸不能过滤分离但可通过提取回收。因此,相对于不包括用有机溶剂从溶液中提取顺反-粘康酸的方法,溶剂提取可提高顺反-粘康酸盐的分离产量。实施例9的表2中的数据还清楚显示提取顺反-粘康酸盐可在部分顺反-粘康酸盐已沉淀且不在水溶液中时进行。
溶剂提取还可包括从无机盐(如硫酸铵、硫酸钙)中分离顺反-粘康酸盐。此外,溶剂提取可比沉淀生产更纯的顺反-粘康酸盐,后者还会引起无机盐的沉淀以及因此造成的污染。
一系列样品测量可有助于选择溶剂和/或pH参数。对于各种可能溶剂,可在所有三种粘康酸异构体(顺顺-、顺反-和反反异构体)上进行提取(如测量分配系数)。各异构体还可针对pH值范围用约pH 1-低于pH7的增量(如0.5)来测试。
实施例11–通过溶剂提取从发酵肉汤中分离顺反-粘康酸
获得已被异构化为顺反-粘康酸的发酵肉汤,并酸化成约pH 3。固体顺反-粘康酸通过过滤移除以使酸化的发酵肉汤含约5-10克/升的顺反-粘康酸。
在各含15mL过滤肉汤的单独50mL锥形离心管中加入15mL下表所列的各溶剂。各管振荡2分钟并使有机相和水相分离。用移液管将水层与有机层分离,并置于新的50mL锥形管中。各提取的水相和溶剂相用HPLC分析粘康酸。在各分离的水层上用新鲜溶剂进行二次提取。再次振荡样品、静置、水相和有机相分离并分析。
结果见下表3、4和5。含不同量顺反-粘康酸的不同肉汤样品用于生成各表中的结果。
表3.含9.82g/L顺反-粘康酸的肉汤。
溶剂 | 提取编号 | 有机相中的粘康酸 | 水相中的粘康酸 | 分配系数 |
无 | 9.82 | |||
tBME | 1 | 6.53 | 2.05 | 3.19 |
tBME | 2 | 1.23 | 0.72 | 1.71 |
辛醇 | 1 | 5.40 | 2.19 | 2.47 |
辛醇 | 2 | 0.53 | 1.52 | 0.35 |
1-丁醇 | 1 | 6.26 | 1.10 | 5.69 |
1-丁醇 | 2 | 0.51 | 0.27 | 1.89 |
表4.含10.69g/L顺反-粘康酸的肉汤。
溶剂 | 提取编号 | 有机相中的粘康酸 | 水相中的粘康酸 | 分配系数 |
无 | 10.69 | |||
1-戊醇 | 1 | 8.29 | 1.29 | 6.43 |
1-戊醇 | 2 | 1.06 | 0.30 | 3.53 |
环己烷 | 1 | 0.00 | 10.47 | 0.00 |
环己烷 | 2 | 0.00 | 10.20 | 0.00 |
乙酸正丁酯 | 1 | 6.78 | 3.96 | 1.71 |
乙酸正丁酯 | 2 | 3.55 | 2.02 | 1.76 |
MEK | 1 | 9.65 | 2.63 | 3.67 |
MEK | 2 | 1.99 | 0.84 | 2.37 |
MeTHF | 1 | 7.40 | 0.65 | 11.38 |
MeTHF | 2 | 0.51 | 0.00 | large |
环己醇 | 1 | 8.62 | 0.98 | 8.80 |
环己醇 | 2 | 1.05 | 0.28 | 3.75 |
萘烷 | 1 | 0.00 | 10.25 | 0.00 |
萘烷 | 2 | 0.00 | 12.99 | 0.00 |
表5.含4.86g/L顺反-粘康酸的肉汤。
溶剂 | 提取编号 | 有机相中的粘康酸 | 水相中的粘康酸 | 分配系数 |
无 | 4.86 | |||
环己酮 | 6.11 | 0.21 | 29.10 | |
环己酮 | 0.00 | 0.23 | 大 | |
二甲苯 | 0.00 | 5.15 | 0.00 | |
二甲苯 | 0.00 | 4.82 | 0.00 | |
异醇 | 4.87 | 0.63 | 7.73 | |
异醇 | 0.49 | 0.04 | 12.25 | |
乙基己醇 | 3.83 | 0.89 | 4.30 | |
乙基己醇 | 0.79 | 0.20 | 3.95 |
为了检测在酸化到显著量顺反-粘康酸沉淀的足够低水平后溶剂提取回收顺反-粘康酸的能力,M9盐溶液中的顺反-粘康酸溶液用于模拟发酵肉汤。15克顺反-粘康酸加入250mL M9盐中,产生约60g/L的滴度。这是通过用氢氧化钠将pH升至7.0来实现。然后用硫酸将所述肉汤酸化至pH 3.0,引起顺反-粘康酸沉淀。固体沉淀留在酸化混合物中,且如上所述将完整浆液用溶剂提取两次。结果示于表6。
表6.含63.34g/L顺反-粘康酸(包括沉淀的粘康酸)的肉汤。
溶剂 | 提取编号 | 有机相中的粘康酸 | 水相中的粘康酸 | 分配系数 |
无 | 63.34 | |||
环己酮 | 1 | 51.05 | 2.92 | 17.48 |
环己酮 | 2 | 2.10 | 0.20 | 10.50 |
MeTHF | 1 | 47.10 | 2.03 | 23.20 |
MeTHF | 2 | 1.64 | 0.11 | 14.91 |
环己醇 | 1 | 51.37 | 10.53 | 4.88 |
环己醇 | 2 | 3.75 | 2.71 | 1.38 |
tBME | 1 | 0.00 | 54.00 | 0.00 |
tBME | 2 | 0.00 | 59.88 | 0.00 |
实施例12-碘催化顺反-粘康酸异构化为反反-粘康酸
含顺反-粘康酸(1.00g)、催化量的I2(53mg)和MeCN(35ml)的混合物加热回流11小时。冷却至室温后,滤出沉淀固体并用冷MeCN清洗。真空干燥后,0.80g(80%产量)的纯化反反-粘康酸显示为棕褐色粉末。该过程获得的材料用1H和13C NMR光谱学确认为反反-粘康酸。非极性溶剂(如THF)中进行的异构化反应优于许多其他测试溶剂。
实施例13–加氢催化剂催化顺反-粘康酸异构化为反反-粘康酸
含顺反-粘康酸(1.00g)和催化量的碳载钯(Pd/C,5%)的混合物在50mL甲醇中制备。甲醇反应混合物回流1小时、冷却至室温,然后用过滤移除负载靶催化剂。剩余的反应溶液蒸发至原始体积的约一半,然后用1体积的MeCN稀释。减压下持续蒸发,直到移除甲醇且反反-粘康酸开始从溶液析出。滤出得到的固体并用冷MeCN清洗。真空干燥后,约0.80g(80%产量)的纯化反反-粘康酸可显示为棕褐色粉末。该过程获得的材料用1H和13C NMR光谱学可确认为反反-粘康酸。
实施例14–加氢催化剂催化顺顺-粘康酸异构化为反反-粘康酸
含顺顺-粘康酸(1.00g)和催化量的碳载钯(Pd/C,5%)的混合物在50mL甲醇中制备。甲醇反应混合物回流1小时、冷却至室温,然后用过滤移除负载靶催化剂。剩余的反应溶液蒸发至原始体积的约一半,然后用1体积的MeCN稀释。减压下持续蒸发,直到移除甲醇且反反-粘康酸开始从溶液析出。滤出得到的固体并用冷MeCN清洗。真空干燥后,约0.80g(80%产量)的纯化反反-粘康酸可显示为棕褐色粉末。该过程获得的材料用1H和13C NMR光谱学可确认为反反-粘康酸。
虽然参照具体实施方式对本发明进行了具体展示和描述,但本领域技术人员应理解,可在不背离所附权利要求定义的本发明精神和范围的情况下对形式和细节作出各种改变。
Claims (41)
1.一种产生顺反-粘康酸盐的方法,所述方法包括:
提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐;
在基本所有顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐的反应条件下将顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐;
分离所述顺反-粘康酸盐;和
结晶所述顺反-粘康酸盐。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
在含所述可再生碳源的培养基中和在所述可再生碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为3-脱氢莽草酸且所述3-脱氢莽草酸被生物催化转变为顺顺-粘康酸盐的条件下培养表达3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的重组细胞。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述异构化反应用酸催化,其中所述酸可为无机酸或有机酸。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述异构化反应在pH为约3.0-约6.5或约3.5-约4.5的溶液中进行。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述异构化反应在47°C或更高的温度下或在约60°C或更高的温度下进行。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述异构化反应基本在8、7.75、7.5、7.25、7、6.75、6.5、6.25、6、5.75、5.5、5.25、5、4.75、4.5、4.25、4、3.75、3.5、3.25、3、2.75、2.5、2.25、2、1.75、1.5、1.25、1、0.75、0.5或0.25小时内完成。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述异构化反应在基本没有顺反-粘康酸盐沉淀的情况下进行。
8.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述培养步骤产生含有所述重组细胞和胞外顺反-粘康酸盐的肉汤,且还包括从所述肉汤中移除所述重组细胞的步骤。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述分离步骤包括通过酸化从溶液中沉淀所述顺反-粘康酸盐,其中所述溶液优选酸化成pH低于约3.0或低于约2.0。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述分离步骤还包括将所述溶液冷却到低于约37°C、低于约25°C、低于约-4°C或低于约-20°C的温度。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括监控顺顺-粘康酸盐向顺反-粘康酸盐的异构化。
12.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述顺反-粘康酸盐用有机溶剂结晶,其中所述有机溶剂优选包含甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸、乙腈、丙酮和四氢呋喃中的一种或多种。
13.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括从分离的顺反-粘康酸盐中移除盐,其中所述盐优选包含无机盐。
14.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
沉淀第一批顺反-粘康酸盐后浓缩所述溶液;和
从所述浓缩溶液中沉淀第二批顺反-粘康酸盐。
15.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述异构化反应在高于约大气压的压力下进行。
16.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括将至少约65%的顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐、将至少约75%的顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐、将至少约85%的顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐或将至少约95%的顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述顺反-粘康酸盐在I2、贵金属加氢催化剂、海绵金属加氢催化剂或骨架加氢催化剂催化的反应中异构化为反反-粘康酸盐。
18.一种产生顺反-粘康酸盐的方法,所述方法包括:
提供含从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐的发酵肉汤;
在基本所有顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐的反应条件下将顺顺-粘康酸盐异构化为顺反-粘康酸盐;
从所述肉汤中分离顺反-粘康酸盐;和
结晶所述顺反-粘康酸盐。
19.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述发酵肉汤包含表达3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的重组细胞。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述方法还包括从所述发酵肉汤中移除所述重组细胞。
21.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述发酵肉汤在容器中提供,且其中所述异构化反应在所述容器中进行,其中所述容器优选发酵罐容器。
22.如权利要求21所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
在含所述可再生碳源的培养基中和在所述可再生碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为3-脱氢莽草酸且所述3-脱氢莽草酸被生物催化转变为顺顺-粘康酸盐的条件下培养表达3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶的重组细胞,和
其中所述重组细胞在所述发酵罐容器中培养,从而产生所述发酵肉汤。
23.如权利要求1或18所述的方法,其特征在于,所述分离步骤包括用有机溶剂从溶液中提取顺反-粘康酸盐。
24.如权利要求23所述的方法,其特征在于,所述有机溶剂包含甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸、乙腈、丙酮和四氢呋喃中的一种或多种。
25.如权利要求23所述的方法,其特征在于,所述分离步骤在低于约7、6.75、6.5、6.25、6、5.75、5.5、5.25、5、4.75、4.5、4.25、4、3.75、3.5、3.25、或3的pH下进行。
26.如权利要求23所述的方法,其特征在于,所述分离步骤还包括从无机盐中分离所述顺反-粘康酸盐。
27.如权利要求23所述的方法,其特征在于,所述分离步骤相对于不包括用有机溶剂从溶液中提取顺反-粘康酸盐的方法提高顺反-粘康酸盐的分离产量。
28.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述提供含从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐使用转化有来自肺炎杆菌的表达3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶以及来自乙酸钙不动杆菌的表达邻苯二酚1,2-双加氧酶的异源结构基因的细菌细胞,其中所述细菌细胞的培养物在约88小时内将至少约1.38M葡萄糖生物催化转变为至少约0.42M顺顺-粘康酸。
29.如权利要求28所述的细菌细胞转化体,其特征在于,所述转化体还包括表达3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸盐合成酶和3-脱氢奎尼酸合成酶的异源DNA序列。
30.如权利要求29所述的细菌细胞转化体,其特征在于,所述转化体还包括表达转酮醇酶的异源DNA序列。
31.如权利要求30所述的细菌细胞转化体,其特征在于,所述细菌细胞选自具有芳族氨基酸生物合成共同途径中具有阻断3-脱氢莽草酸转变为分支酸的突变的突变细胞系。
32.如权利要求28所述的细菌细胞转化体,其特征在于,所述细菌细胞选自具有芳族氨基酸生物合成共同途径中具有阻断3-脱氢莽草酸转变为分支酸的突变的突变细胞系。
33.如权利要求1所述的方法,其特征自在于,所述提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐包括在含碳源的培养基中培养转化有来自肺炎杆菌的表达酶种类3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶的结构基因以及来自乙酸钙不动杆菌的表达酶种类邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构基因的细菌细胞,通过3-脱氢莽草酸的生物催化转变以至少约0.95毫摩尔/升/小时的速率生产顺顺-粘康酸,所述碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为3-脱氢莽草酸。
34.如权利要求1所述的方法,其特征自在于,所述提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐包括在含碳源的培养基中培养转化的细菌细胞,通过3-脱氢莽草酸的生物催化转变以至少约0.95毫摩尔/升/小时的速率生产顺顺-粘康酸,所述细胞表达编码3-脱氢莽草酸脱水酶、原儿茶酸盐脱羧酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶、转酮醇酶、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸盐合成酶和3-脱氢奎尼酸合成酶的异源结构基因,所述碳源被细胞的芳族氨基酸生物合成共同途径中的酶转变为3-脱氢莽草酸。
35.如权利要求1所述的方法,其特征自在于,所述提供从可再生碳源经生物催化转变产生的顺顺-粘康酸盐包括在含碳源的培养基中,在所述碳源以至少约0.95毫摩尔/升/小时的速率生物催化转变为顺顺-粘康酸的条件下培养转化有来自肺炎杆菌的表达酶种类3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸盐脱羧酶的结构基因以及来自乙酸钙不动杆菌的表达邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构基因的细菌细胞。
36.一种由权利要求1-15和18-35中任一项所述方法生产的可再生顺反-粘康酸盐。
37.一种产生反反-粘康酸盐的方法,所述方法包括:
将从可再生碳源经生物催化转化生成的顺顺-粘康酸盐在基本所有顺顺-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐的反应条件下异构化为反反-粘康酸盐。
38.如权利要求37所述的方法,其特征在于,所述异构化反应由贵金属加氢催化剂、海绵金属加氢催化剂或骨架加氢催化剂催化。
39.一种产生反反-粘康酸盐的方法,所述方法包括:
将从可再生碳源经生物催化转化生成的顺反-粘康酸盐在基本所有顺反-粘康酸盐异构化为反反-粘康酸盐的反应条件下异构化为反反-粘康酸盐。
40.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述异构化反应由贵金属加氢催化剂、海绵金属加氢催化剂或骨架加氢催化剂催化。
41.一种由权利要求16-17和37-40中任一项所述方法生产的可再生反反-粘康酸盐。
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