CN109196107A - α-氢化己二烯二酸的制造方法 - Google Patents

α-氢化己二烯二酸的制造方法 Download PDF

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Abstract

一种α‑氢化己二烯二酸的制造方法，包括培养具有α‑氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物的步骤。

Description

α-氢化己二烯二酸的制造方法
技术领域
本发明涉及一种利用了沙雷氏菌属微生物的α-氢化己二烯二酸制造方法。
背景技术
α-氢化己二烯二酸(IUPAC名：(E)-己-2-烯二酸)为碳原子数为6、分子量为144.13的二羧酸。α-氢化己二烯二酸可以用作与多元醇聚合而形成聚酯的原料，另外也可以用作与多元胺聚合而形成聚酰胺的原料。另外，通过在α-氢化己二烯二酸的末端添加氨而内酰胺化，α-氢化己二烯二酸也可单独地成为聚酰胺的原料。
作为与利用了微生物的α-氢化己二烯二酸制造方法相关的报道，有以下报道：在以琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A为起始原料的利用非天然存在的微生物来制造己二酸的方法的过程中，作为己二酸生物合成途径的中间体，3-羟基己二酸(3-羟基己二酸酯)通过酶反应而脱水(利用3-羟基己二酸脱水酶的脱水反应)，可生成α-氢化己二烯二酸(己-2-烯二酸酯)(专利文献1，图3)。
另外，报道了这样的例子：其中，随着己二酸脱硫分枝菌(Desulfovirga adipica)分解己二酸并增殖，在17天内生成了0.86mg/L的α-氢化己二烯二酸(非专利文献1)。
另外，专利文献2中记载了使用生物催化剂或微生物的己二酸、己二酸酯或己二酸硫代酯的制造方法，其中作为中间化合物，记载了α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)酯或α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)硫代酯。记载了α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)酯或α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)硫代酯通过3-羟基己二酸酯或3-羟基己二酸硫代酯的脱水来进行制备。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/151728号
专利文献2：国际公开第2009/113853号
非专利文献
非专利文献1：Int J Syst Evol Microbiol.2000Mar；50Pt 2:639-44
发明内容
发明要解决的课题
虽然专利文献1中记载了：在为了能够制造己二酸而人工进行了改良的微生物中，作为制造对象即己二酸的中间体，3-羟基己二酸(3-羟基己二酸酯)通过酶反应而脱水，可生成α-氢化己二烯二酸(己-2-烯二酸酯)，但是，从3-羟基己二酸到α-氢化己二烯二酸的利用3-羟基己二酸脱水酶的脱水反应的直接证据完全没有得到确认，实际上是否能够利用微生物的代谢途径来制造α-氢化己二烯二酸尚未得到验证。此外，对于本领域技术人员而言，3-羟基己二酸脱水酶这样的酶并不是公知的，因而并不能依照专利文献1的记载，以琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A为起始原料来制造α-氢化己二烯二酸。
另外，虽然非专利文献1报道了利用自然界存在的微生物从而生成α-氢化己二烯二酸，但是其生产率非常地低，并不能称作是α-氢化己二烯二酸的制造方法。
专利文献2中没有记载从α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)酯或α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)硫代酯得到α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)的方法，也没有记载从作为α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)硫代酯的具体例子的5-羧基-2-戊烯酰-辅酶A(2,3-脱氢己二酰-辅酶A)得到α-氢化己二烯二酸(2,3-脱氢己二酸)的方法。
如此，利用微生物的代谢途径以制造α-氢化己二烯二酸的方法实际上是不存在的。因此，本发明的课题在于提供一种利用微生物的代谢途径以制造α-氢化己二烯二酸的方法。
解决课题的方案
本发明人为解决上述课题进行了深入研究，结果发现，自然界中存在有能够利用代谢途径以制造α-氢化己二烯二酸的沙雷氏菌属微生物，从而实现了以下的本发明。
也就是说，本发明由以下(1)至(7)构成。
(1)一种α-氢化己二烯二酸的制造方法，包括培养具有α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物的步骤。
(2)根据(1)所述的α-氢化己二烯二酸的制造方法，其特征在于：对由所述沙雷氏菌属微生物的琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性得到强化。
(3)根据(1)或(2)所述的α-氢化己二烯二酸的制造方法，其中，所述沙雷氏菌属微生物为葛氏沙雷氏菌、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、普利茅斯沙雷氏菌、嗜虫沙雷氏菌或嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的α-氢化己二烯二酸的制造方法，其中，培养所述沙雷氏菌属微生物的培养基包含选自由糖类、琥珀酸、2-氧代戊二酸及甘油所组成的组中的至少一种或两种以上的碳源。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的α-氢化己二烯二酸的制造方法，其中，在包含选自由阿魏酸、对-香豆酸、苯甲酸、顺,顺-己二烯二酸、原儿茶酸及儿茶酚所组成的组中的至少一种或两种以上的诱导物质的培养基中培养所述沙雷氏菌属微生物。
(6)一种沙雷氏菌属微生物，其为具有α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物，特征在于：对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性得到强化。
(7)根据(6)所述的沙雷氏菌属微生物，其中，所述沙雷氏菌属微生物为葛氏沙雷氏菌、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、普利茅斯沙雷氏菌、嗜虫沙雷氏菌或嗜线虫沙雷氏菌。
[发明的效果]
根据本发明，可以利用沙雷氏菌属微生物的代谢途径以得到α-氢化己二烯二酸。
具体实施方式
本发明的α-氢化己二烯二酸的制造方法的特征在于包括培养具有α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物的步骤。更具体地，本发明的制造方法的特征在于，通过培养具有α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物，从而利用该微生物的代谢途径以制造α-氢化己二烯二酸。
作为具有α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物的具体例子，可列举出葛氏沙雷氏菌、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、普利茅斯沙雷氏菌、嗜虫沙雷氏菌或嗜线虫沙雷氏菌。虽然沙雷氏菌属微生物利用代谢途径从而可制造α-氢化己二烯二酸的机理尚不明确，但是已知沙雷氏菌属微生物被用于使排出的剩余污泥减少的废水处理方法中(参照日本特开2002-18469号公报)，据推测，沙雷氏菌属微生物具有与通常用于物质生产的微生物不同的复杂的代谢途径，基于该代谢途径从而生成α-氢化己二烯二酸。
上述沙雷氏菌属微生物作为自然界中存在的沙雷氏菌属微生物都是已知的，可以从土壤等自然环境中分离出来。另外，也可以从NBRC等微生物供应机构购买。
为了提高α-氢化己二烯二酸的生产率，沙雷氏菌属微生物可以是根据公知的方法进行了基因重组而得的沙雷氏菌属微生物，或者也可以是通过人工突变手段使基因突变而得的沙雷氏菌属微生物。
在本发明中，在培养沙雷氏菌属微生物时，作为具有α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物，优选使用在48小时以内在培养液上清液中能够产生1.0mg/L以上的α-氢化己二烯二酸的沙雷氏菌属微生物。更优选为在没有进行基因突变处理或基因重组的野生型状态下，在培养液上清液中具有1.0mg/L以上的α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物。
关于沙雷氏菌属微生物是否能够在48小时以内在培养液上清液中产生1.0mg/L以上的α-氢化己二烯二酸，根据以下方法进行判断。
沙雷氏菌属微生物的培养上清液中所含的α-氢化己二烯二酸的产生量根据以下方法进行测定。
将一白金环的作为对象的沙雷氏菌属微生物接种于5mL的已调整为pH7的预培养培养基(培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L)中，并在30℃下进行振荡培养直到充分悬浮。向所得的预培养液中添加10mL的0.9％氯化钠，在离心分离菌体之后将上清液除去，该操作进行3次，从而洗净菌体。将洗净后的菌体悬浮于1mL的0.9％氯化钠中，将0.5mL的悬浮液添加到pH调整为6.5的主培养液(培养基组成：琥珀酸10g/L、葡萄糖10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸钾50mM、硫酸镁0.025g/L、硫酸鉄0.0625mg/L、硫酸锰2.7mg/L、氯化钙0.33mg/L、氯化钠1.25g/L、Bacto胰蛋白胨2.5g/L、酵母提取物1.25g/L)5mL中，并在30℃下培养48小时，在48小时内，每过一段时间分取主培养液。
从主培养液中离心分离出菌体，并通过LC-MS/MS对上清液进行分析。LC-MS/MS分析条件如下所述。HPLC可使用1290Infinity(Agilent Technologies公司制)等，MS/MS可使用Triple-Quad LC/MS(Agilent Technologies公司制)等。另外，柱子可使用Synergihydro-RP(Phenomenex公司制)。
HPLC分析条件：
柱子：长度100mm，内径3mm，粒径2.5μm
流动相：0.1％甲酸水溶液/甲醇＝70/30
流速：0.3mL/分钟
柱温：40℃
LC检测器：DAD(210nm)
MS/MS分析条件：
离子化法：ESI负离子模式。
在本发明中，将沙雷氏菌属微生物在含有常规微生物可代谢的碳源的培养基中培养，优选在液体培养基中培养。在此，本发明中的“代谢”指的是沙雷氏菌属微生物从细胞外获取的、或者在细胞内由其他化学物质生成的某种化学物质经由酶反应而转化为其他化学物质。除了沙雷氏菌属微生物可代谢的碳源之外，所用的培养基也适当地含有氮源、无机盐、以及根据需要的氨基酸或维生素等有机微量营养素。只要含有上述营养源，则可以使用天然培养基和合成培养基中的任意一者。
作为沙雷氏菌属微生物可代谢的碳源，可优选使用糖类。作为糖类的具体例子，可列举出葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖等单糖类，这些单糖类结合而成的二糖类、多糖类，以及含有这些糖类的淀粉糖化液、糖蜜、含纤维素的生物质糖化液等。
另外，除了上述列举的糖类以外，只要是沙雷氏菌属微生物可用于其生长的碳源，都可优选使用。例如，可列举出醋酸、琥珀酸、乳酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸、2-氧代戊二酸、丙酮酸等羧酸，甲醇、乙醇、丙醇等一元醇类，甘油、乙二醇、丙二醇等多元醇类，烃、脂肪酸、油脂等，并且优选为琥珀酸、2-氧代戊二酸、甘油。
上述列举的碳源可以仅使用一种，也可以组合使用。具体而言，通过对这些碳源当中的选自由糖类、琥珀酸、2-氧代戊二酸、甘油所组成的组中的1种或2种以上进行代谢，可以有效地制造α-氢化己二烯二酸。培养基中的碳源的浓度没有特别限定，可根据碳源的种类等适当设定，优选为5g/L至300g/L。
作为用于沙雷氏菌属微生物的培养的氮源，例如可使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其他辅助使用的有机氮源(例如，油渣类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他的氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等)。培养基中的氮源的浓度没有特别限定，优选为0.1g/L至50g/L。
作为用于沙雷氏菌属微生物的培养的无机盐类，可以适当地添加使用(例如)磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐以及锰盐等。
对于用于制造α-氢化己二烯二酸的沙雷氏菌属微生物的培养条件，可以根据所使用的沙雷氏菌属微生物的种类及外部条件等，适当调节或选择设定上述成分组成的培养基、培养温度、搅拌速度、pH、通气量、接种量等。当在液体培养中有发泡时，可以将矿物油、硅油及表面活性剂等消泡剂适当地混合到培养基中。
在上述所示的培养基及培养条件下，通过使用本发明所用的沙雷氏菌属微生物进行培养从而可以制造α-氢化己二烯二酸，但是通过在将用于制造α-氢化己二烯二酸所必须的代谢途径活化了的状态下对上述沙雷氏菌属微生物进行培养，可以更有效地制造α-氢化己二烯二酸。
将上述代谢途径活化的方法没有特别限定，例如可列举出：使用于制造α-氢化己二烯二酸的代谢途径中的酶基因(组)的表达量增大的方法；通过在包含将用于制造α-氢化己二烯二酸的代谢途径活化的物质(以下也称为诱导物质)的培养基中培养上述微生物，从而诱导上述酶基因(组)的表达的方法；以及依照公知方法进行基因重组、或者通过基因突变处理等育种技术以修饰上述酶基因(组)，从而使上述酶基因(组)所编码的酶(组)的活性增大的方法等。这些方法可以单独地进行，也可以组合地进行。
作为使上述酶基因(组)的表达量增大的方法，例如可列举出：通过基因修饰技术，从而使在本发明所用的沙雷氏菌属微生物中的细胞内所存在的上述酶基因(组)的拷贝数增加的方法；通过基因修饰技术从而修饰上述基因(组)的编码区域周边的功能性区域的方法等，优选为使上述基因(组)的拷贝数增加的方法。
作为在含有诱导物质的培养基中，培养本发明所用的沙雷氏菌属微生物，从而在诱导上述酶基因(组)的表达的方法中所使用的诱导物质，只要其为将制造α-氢化己二烯二酸所必须的代谢途径活化的物质即可，没有特别限定，例如可以使用以3-氧代己二酰辅酶A作为中间体从而被代谢为碳原子数更少的化合物的芳香族化合物、碳原子数为6以上的脂肪族化合物、以及结构与它们相类似的化合物。关于这种化合物的例子，可以使用(例如)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等数据库而获知，具体而言，可列举出苯甲酸、顺,顺-己二烯二酸、对苯二甲酸、原儿茶酸、儿茶酚、香草醛、香豆酸、阿魏酸等，优选为阿魏酸、对-香豆酸、苯甲酸。
根据用于α-氢化己二烯二酸制造的沙雷氏菌属微生物，上述诱导物质可以单独地使用，也可以2种以上组合地使用。另外，上述诱导物质可以包含在作为α-氢化己二烯二酸制造的预备阶段的用于使沙雷氏菌属微生物增殖而进行的培养(预培养)时所使用的培养基中，也可以包含在用于α-氢化己二烯二酸制造的培养基中。在1种或2种以上的诱导物质包含在培养基中的情况下，诱导物质的浓度(当包含有多种诱导物质时，则为它们的总浓度)没有特别限定，但优选为1mg/L至10g/L，更优选为5mg/L至1g/L。
作为依照公知方法进行基因重组、或者通过基因突变处理等育种技术以修饰上述酶基因(组)从而使上述酶基因(组)编码的酶(组)的活性增大的方法，优选为使用基因重组的方法以将上述酶基因(组)导入到本发明所用的沙雷氏菌属微生物中的方法。
作为对应于上述酶基因(组)的基因的具体例子，可列举出对这样的酶进行编码的基因，该酶具有对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的活性。在本发明中，通过对以下的酶的活性进行强化，该酶具有对由具有3-羟基己二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物的琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的活性，从而能够更有效率地制造α-氢化己二烯二酸。
只要是具有上述活性的酶，则没有特别的限定，具体而言，可优选使用乙酰-辅酶A乙酰转移酶、β-酮脂肪酰-辅酶A酰基转移酶、3-氧代乙二酰-辅酶A酰基转移酶、β-酮乙二酰-辅酶A酰基转移酶、乙酰-辅酶A C-乙酰转移酶、乙酰乙酰-辅酶A硫解酶、β-乙酰乙酰辅酶A硫解酶、2-甲基乙酰乙酰-辅酶A硫解酶、3-氧代硫解酶、乙酰辅酶A硫解酶、乙酰-辅酶A乙酰转移酶、乙酰-辅酶A:N-乙酰转移酶、乙酰-辅酶A C-酰基转移酶、β-酮硫解酶、3-酮脂肪酰-辅酶A硫解酶、β-酮脂肪酰辅酶A硫解酶、β-酮脂肪酰-辅酶A硫解酶、β-酮乙二酰辅酶A硫解酶、β-酮乙二酰-辅酶A硫解酶、3-酮脂肪酰辅酶A硫解酶、3-酮脂肪酰硫解酶、3-酮硫解酶、3-氧代酰基-辅酶A硫解酶、3-氧代酰基-辅酶A硫解酶、6-氧代酰基-辅酶A硫解酶、乙酰乙酰-辅酶Aβ-酮硫解酶、乙酰-辅酶A酰基转移酶、酮脂肪酰-辅酶A酰基转移酶、酮脂肪酰-辅酶A硫解酶、长链3-氧代酰基-辅酶A硫解酶、氧代酰基-辅酶A硫解酶、原-3-酮脂肪酰-辅酶A硫解酶、3-氧代乙二酰-辅酶A硫解酶、3-氧代-5,6-二脱氢环庚基-辅酶A硫解酶等。另外，在根据EC编号的分类方面没有特别的限定，但优选为被分类为EC2.3.1的酰基转移酶，作为具体例子，可列举出被分类为EC2.3.1.174、EC2.3.1.9、EC2.3.1.16、EC2.3.1.223的酶。
另外，关于由功能未知的基因序列编码的蛋白质是否相当于上述的酶，可以在NCBI(National Center for Biotechnology Information，国家生物技术信息中心)等网站进行BLAST搜索，并推断是否相当于该酶。
利用基因重组技术，将编码以下的酶的基因导入至沙雷氏菌属微生物中，该酶具有对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的活性，从而对以下的酶的活性进行强化，该酶对由本发明所用的沙雷氏菌属微生物的琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化，在上述情况下，对于成为编码该酶的基因的基因源的生物没有特别的限定，可以使用在本发明的沙雷氏菌属微生物中易于将从天然存在的微生物取得的基因、人工合成的基因、从微生物取得的基因表达的、使密码子的使用频率最优化的基因等。
对于成为编码由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的基因的基因源的微生物没有特别的限定，可列举出(例如)贝氏不动杆菌、抗辐射不动杆菌等不动杆菌(Acinetobacter)属微生物；阴沟气杆菌等气杆菌属微生物；粪产碱菌等产碱菌属微生物；栗褐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)、玫瑰色芽孢杆菌(Bacillus roseus)等芽孢杆菌属微生物；碘短杆菌等短杆菌属微生物；嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌等棒杆菌属微生物；耐金属贪铜菌、钩虫贪铜菌、Cupriavidus numazuensis、草酸盐贪铜菌等贪铜菌属微生物；食酸戴尔福特菌等戴尔福特菌属微生物；大肠埃希氏菌、弗氏埃希氏菌等埃希氏菌属微生物；峰房哈夫尼菌等哈夫尼菌属微生物；嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)等微杆菌属微生物；白色类诺卡氏菌等类诺卡氏菌属微生物；海床游动微菌等游动微菌属微生物；产氮假单胞菌、绿针假单胞菌、荧光假单胞菌、莓实假单胞菌、恶臭假单胞菌、食爬虫假单胞菌(Pseudomonasreptilivora)、腐臭假单胞菌等假单胞菌属微生物；放射杆状根瘤菌等根瘤菌属微生物；圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)等红冬孢酵母属微生物；酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌属微生物；嗜虫沙雷氏菌、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、葛氏沙雷氏菌、嗜线虫沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、普利茅斯沙雷氏菌等沙雷氏菌属微生物；Shimwellia blattae等Shimwellia属微生物；酒红链霉菌、卡纳塔链霉菌(Streptomyces karnatakensis)、橄榄链霉菌、酒红链霉菌等链霉菌属微生物；解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)等耶氏酵母菌属微生物；鲁氏耶尔森氏菌等耶尔森氏菌属微生物，优选为沙雷氏菌属微生物或棒杆菌属微生物，更优选为普利茅斯沙雷氏菌或谷氨酸棒杆菌。
在本发明中，所谓的“将对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性强化了的沙雷氏菌属微生物”，指的是与没有对该酶的活性进行强化的对照样相比，对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的比活性(单位/mg)增大了的沙雷氏菌属微生物。关于对照样，使用处于以下状态的沙雷氏菌属微生物：对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的表达系统没有发生基因性改变。
对沙雷氏菌属微生物进行培养，制备无细胞提取液(CFE)，使用CFE作为酶溶液，从而测定沙雷氏菌属微生物的对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的比活性。酶溶液的制备方法如下所述。
将一白金环的成为活性测定对象的沙雷氏菌属微生物接种于5mL的调整为pH7的预培养培养基(培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L)中，并在30℃下进行振荡培养直到充分悬浮。向所得的预培养液中添加10mL的0.9％氯化钠，在离心分离菌体之后将上清液除去，该操作进行3次，从而洗净菌体。将洗净后的菌体悬浮于1mL的0.9％氯化钠中，将0.5mL的悬浮液添加到pH调整为6.5的主培养液(培养基组成：琥珀酸10g/L、葡萄糖10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸钾50mM、硫酸镁0.025g/L、硫酸鉄0.0625mg/L、硫酸锰2.7mg/L、氯化钙0.33mg/L、氯化钠1.25g/L、Bacto胰蛋白胨2.5g/L、酵母提取物1.25g/L)中，并在30℃下振荡培养3小时。
在通过离心从5mL所得的主培养液中收集菌体后，将其混悬于1mL的由100mMTris-HCl(pH8.0)、1mM二硫苏糖醇构成的Tris-HCl缓冲液中，将玻璃珠(φ0.1mm)添加到所得的混悬液中，并在4℃下使用超声波破碎机将菌体破碎。对所得的菌体破碎液进行离心，并将作为上清液而回收的无细胞提取液(CFE)设为酶液。
使用通过上述方法制备而得的酶液，当在反应体系内过量地存在NADH依赖型3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(该脱氢酶对于通过琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A的缩合反应而生成的3-氧代己二酰辅酶A具有基质特异性)时，测定随着3-氧代己二酰辅酶A的还原而来的NADH的消耗速度，并依照式1计算出比活性。在式1中，酶液浓度(mg/ml)是酶液中的蛋白质浓度。
[数1]
具体的计算方法如下所述。将50μL的酶液混合至25μL的酶反应溶液A(组成：200mM的Tris-HCl(pH 8.0)、40mM的MgCl2、0.8mM的NADH、2mM的DTT、4.4μg的来自大肠埃希氏菌的3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(PaaH))中，并在30℃下培育2分钟。随后，将上述酶反应溶液A和酶液的混合液全部添加至石英池中，该石英池在放入有25μL的酶反应溶液B(组成：2mM的乙酰辅酶A、0.4mM的琥珀酰辅酶A)的状态下预先在30℃下进行了预培育，快速地进行混合，制成反应液。采用分光光度计测定所制备的反应液在30℃下的340nm处的吸光度的减少量，并依照式(1)对所得的Δ340的值进行计算，从而计算出比活性(单位/mg)。可以使用QuickStart Bradford蛋白质测定(“BIO-RAD社”制)等来测定酶液中的蛋白质浓度。分光光度计可以使用Ultrospec 3300Pro(“GEヘルスケア社”制)。
除了上述方法以外，为了更有效率地制造α-氢化己二烯二酸，也可以使用以下方法：在本发明所用的沙雷氏菌属微生物的代谢途径当中，对α-氢化己二烯二酸的副产物的生物合成途径中的酶基因功能进行破坏等。
在沙雷氏菌属微生物的培养物中，当所生产的α-氢化己二烯二酸达到可回收的量之后，可以回收所生产的α-氢化己二烯二酸。在累积量适度变高的时间点停止培养，并可以根据通常的收集发酵产物的方法从该培养物中进行所生产的α-氢化己二烯二酸的回收(例如分离)。具体而言，在通过离心分离、过滤等分离菌体之后，可以通过柱层析、离子交换层析、活性炭处理、结晶、膜分离、蒸馏等，从培养物中分离出α-氢化己二烯二酸。更具体而言，作为优选的回收方法，可列举出：在通过使用反渗透膜或蒸发器等对培养物进行浓缩操作以除去水并提高α-氢化己二烯二酸的浓度之后，通过冷却结晶或绝热结晶使α-氢化己二烯二酸及/或α-氢化己二烯二酸的盐的晶体析出，然后通过离心分离或过滤等得到α-氢化己二烯二酸及/或α-氢化己二烯二酸的盐的晶体的方法；在向培养物中添加醇而成为α-氢化己二烯二酸酯之后，通过蒸馏操作回收α-氢化己二烯二酸酯，然后通过水解得到α-氢化己二烯二酸的方法等，但是并不限于上述方法。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行具体说明。
(参考例1)α-氢化己二烯二酸的制备
用于后述实施例的分析的α-氢化己二烯二酸通过化学合成来制备。首先，将1.5L的超脱水四氢呋喃(和光純薬株式会社制)添加到13.2g(0.1mol)的琥珀酸单甲酯(和光純薬株式会社制)中，一边搅拌一边添加16.2g(0.1mol)的羰基二咪唑(和光純薬株式会社制)，在氮气气氛、室温下搅拌1小时。向该悬浮液中添加15.6g(0.1mol)的丙二酸单甲酯钾盐以及9.5g(0.1mol)的氯化镁，并在氮气气氛、室温下搅拌1小时，然后在40℃下搅拌12小时。反应结束后，添加0.05L的1mol/L盐酸，通过乙酸乙酯进行萃取，并通过硅胶柱色谱法(己烷：乙酸乙酯＝1:5)进行分离纯化，从而得到了13.1g的纯3-氧代己烷二羧酸二甲酯。产率为70％。
将0.1L的甲醇(国産化学株式会社制)添加到10g(0.05mol)所得到的3-氧代己烷二羧酸二甲酯中，一边搅拌一边添加2.0g(0.05mol)的硼氢化钠(和光純薬株式会社制)，并在室温下搅拌1小时。接着，添加0.02L的5mol/L氢氧化钠水溶液，并在室温下搅拌2小时。反应结束后，用5mol/L的盐酸将pH调整为1，并通过旋转蒸发仪进行浓缩，然后用水进行重结晶，从而得到了7.2g的纯α-氢化己二烯二酸。产率为95％。
α-氢化己二烯二酸的1H-NMR谱：
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ2.48(m,4H)、δ5.84(d,1H)、δ6.96(m,1H)。
(实施例1)α-氢化己二烯二酸生产试验
研究表1所示的沙雷氏菌属微生物(均从微生物供应机构购入。供应商记载在菌株名中。)的α-氢化己二烯二酸的生产能力。将一白金环的各个沙雷氏菌属微生物接种于5mL的调整为pH7的培养基中，该培养基含有10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的氯化钠，并在30℃下进行振荡培养(预培养)直到充分悬浮。向该培养液中添加10mL的0.9％氯化钠，在离心分离菌体之后将上清液完全除去以洗净菌体，将该操作进行3次，然后将菌体悬浮于1mL的0.9％氯化钠中。将0.5mL的悬浮液添加到5mL的具有以下所示组成的培养基中，并在30℃下进行48小时的振荡培养。
琥珀酸 10g/L
葡萄糖 10g/L
硫酸铵 1g/L
磷酸钾 50mM
硫酸镁 0.025g/L
硫酸铁 0.0625mg/L
硫酸锰 2.7mg/L
氯化钙 0.33mg/L
氯化钠 1.25g/L
Bacto胰蛋白胨 2.5g/L
酵母提取物 1.25g/L
pH 6.5。
(α-氢化己二烯二酸的定量分析)
从主培养液中离心分离出菌体，上清液通过LC-MS/MS进行分析。利用LC-MS/MS的α-氢化己二烯二酸的定量分析在以下条件下进行。
HPLC：1290Infinity(Agilent Technologies公司制)
柱子：Synergi hydro-RP(Phenomenex公司制)，长度100mm，内径3mm，粒径2.5μm
流动相：0.1％甲酸水溶液/甲醇＝70/30
流速：0.3mL/分钟
柱温：40℃
LC检测器：DAD(210nm)
MS/MS：Triple-Quad LC/MS(Agilent Technologies公司制)
离子化法：ESI负离子模式。
对在培养上清液中蓄积的α-氢化己二烯二酸进行定量分析的结果分别示出于表1中。由这些结果可以确认，各个沙雷氏菌属微生物都具有α-氢化己二烯二酸的生产能力。
[表1]
(实施例2)使用了诱导物质的α-氢化己二烯二酸生产试验
以表2所示的沙雷氏菌属微生物为对象，在与实施例1相同的条件下进行预培养及主培养，并且对培养上清液中的α-氢化己二烯二酸进行定量分析，不同之处在于：以成为2.5mM的方式分别向预培养培养基中添加作为诱导物质的阿魏酸、对-香豆酸、苯甲酸、顺,顺-己二烯二酸、原儿茶酸及儿茶酚。结果分别示出于表2中。从这些结果可知，通过向预培养培养基中添加诱导物质，提高了α-氢化己二烯二酸的生产量。
[表2]
(实施例3)使用了2种碳源的α-氢化己二烯二酸生产试验
以表3所示的沙雷氏菌属微生物为对象，使用与实施例2相同的培养基进行了预培养，随后在分别含有10g/L的表3所示的化合物作为碳源的培养基中在与实施例2相同的条件下进行培养，并且对培养上清液中的α-氢化己二烯二酸进行定量分析。结果分别示出于表3中。从这些结果可知，即使将除了葡萄糖和琥珀酸以外的物质作为碳源进行培养，也能够有效地生产α-氢化己二烯二酸。
[表3]
(实施例4)使用了多种浓度的2种碳源的α-氢化己二烯二酸生产试验
以表4所示的沙雷氏菌属微生物为对象，使用与实施例2相同的培养基进行了预培养，随后在分别含有表4所示浓度的化合物作为碳源的培养基中在与实施例2相同的条件下培养48至120小时，对培养上清液中的α-氢化己二烯二酸进行定量分析。结果分别示出于表4中。从这些结果可知，即使改变碳源的添加比例，也能够生产α-氢化己二烯二酸。
[表4]
(实施例5)使用了单一碳源的α-氢化己二烯二酸生产试验
以表5所示的沙雷氏菌属微生物为对象，使用与实施例1相同的培养基进行预培养，随后在含有10g/L的琥珀酸、葡萄糖和甘油中任意一者作为碳源的培养基中在与实施例1相同的条件下进行培养，对培养上清液中的α-氢化己二烯二酸进行定量分析。结果分别示出于表5中。此外，仅将预培养培养基改变为实施例2中的，进行相同的实验，当在预培养培养基中添加有诱导物质时的α-氢化己二烯二酸的生产量示于表6中。从这些结果可知，即使在使用了单一碳源的情况下，也能够生产α-氢化己二烯二酸，另外，即使在使用了单一碳源的情况下，通过向预培养培养基中添加诱导物质，从而提高了α-氢化己二烯二酸的生产量。
[表5]
[表6]
(实施例6)使用了多种浓度的阿魏酸作为诱导物质的α-氢化己二烯二酸生产试验
以表7所示的沙雷氏菌属微生物为对象，以成为表7所示的浓度的方式，向实施例1的预培养培养基中添加实施例2至5中作为诱导物质而被添加至预培养培养基中的物质中的阿魏酸，进行预培养。除此之外，在与实施例1相同的条件下进行预培养及主培养，并且对培养上清液中的α-氢化己二烯二酸进行定量分析。结果分别示出于表7中。从这些结果可知，即使在仅将阿魏酸作为诱导物质添加到预培养培养基中的情况下，也提高了α-氢化己二烯二酸的生产量。
[表7]
(实施例7)使用了多种浓度的对-香豆酸作为诱导物质的α-氢化己二烯二酸生产试验
以表8所示的沙雷氏菌属微生物为对象，以成为表7所示的浓度的方式，向实施例1的预培养培养基中添加实施例2至5中作为诱导物质而被添加至预培养培养基中的物质中的对-香豆酸，进行预培养。除此之外，在与实施例1相同的条件下进行预培养及主培养，并且对培养上清液中的α-氢化己二烯二酸进行定量分析。结果分别示出于表8中。从这些结果可知，即使在仅将对-香豆酸作为诱导物质添加到预培养培养基中的情况下，也提高了α-氢化己二烯二酸的生产量。
[表8]
(实施例8)使用了苯甲酸作为诱导物质的α-氢化己二烯二酸生产试验
以表9所示的沙雷氏菌属微生物为对象，以成为2.5mM的方式，向实施例1的预培养培养基中添加实施例2至5中作为诱导物质而被添加至预培养培养基中的物质中的苯甲酸，进行预培养。除此之外，在与实施例1相同的条件下进行预培养及主培养，并且对培养上清液中的α-氢化己二烯二酸进行定量分析。结果分别示出于表9中。从这些结果可知，即使在仅将苯甲酸作为诱导物质添加到预培养培养基中的情况下，也提高了α-氢化己二烯二酸的生产量。
[表9]
(实施例9)α-氢化己二烯二酸的制造例
将一白金环的在实施例1中能够确认为具有α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物的葛氏沙雷氏菌NBRC 13537接种于5mL的LB培养基中，并在30℃下进行振荡培养直到充分悬浮。将2mL的该培养液添加到100mL的培养基中，该培养基含有10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的氯化钠、0.5mM的阿魏酸，并在30℃下进行振荡培养(预培养)直到充分悬浮。与实施例1同样地采用200mL的0.9％氯化钠将预培养液洗净3次，然后将菌体悬浮于10mL的0.9％氯化钠中。将10mL的悬浮液添加到以100g/L的葡萄糖及20g/L的琥珀酸作为碳源的实施例1所述的培养基100mL中，在30℃下进行120小时的振荡培养。从该培养液离心分离出菌体，上清液与实施例1一样地通过LC-MS/MS进行分析，分析结果为：在培养上清液中蓄积的α-氢化己二烯二酸的浓度为46mg/L。
接着，将培养上清液减压浓缩，得到了α-氢化己二烯二酸浓度为420mg/L的浓缩液11mL。将该浓缩液注入至连接有流分收集器的HPLC中，并收集与α-氢化己二烯二酸标准品的洗脱时间一致的流分。重复该操作10次，得到了培养液中的杂质被除去了的α-氢化己二烯二酸水溶液。需要说明的是，用于收集α-氢化己二烯二酸的流分收集型HPLC在以下条件下进行。
HPLC：SHIMADZU 20A(株式会社島津製作所制)
柱子：Synergi hydro-RP(Phenomenex公司制)，长度250mm，内径10mm，粒径4μm
流动相：5mM甲酸水溶液/乙腈＝98/2
流速：4mL/分钟
注入量：1mL
柱温：45℃
检测器：UV-VIS(210nm)
流分收集器：FC 204(Gilson公司制)。
随后，将α-氢化己二烯二酸水溶液减压浓缩，得到了3.8mg晶体。通过1H-NMR分析晶体，结果可以确认所得的晶体为α-氢化己二烯二酸。
(参考例2)未添加碳源的培养
除了使用了表2所示的沙雷氏菌属微生物并且使用了未添加葡萄糖及琥珀酸的组成的培养基之外，在与实施例1相同的条件下进行培养，并进行α-氢化己二烯二酸的定量分析，结果是在培养上清液中没有检测到α-氢化己二烯二酸。由这些结果可知，在实施例1至8中沙雷氏菌属微生物所生产的α-氢化己二烯二酸是通过以葡萄糖、琥珀酸、阿拉伯糖、2-氧代戊二酸、木糖或甘油作为碳源的代谢而得到的。
(参考例3)不具有α-氢化己二烯二酸生产能力的微生物
为了确认表10所示的微生物的α-氢化己二烯二酸生产能力，在与实施例1相同的条件下进行培养，并进行α-氢化己二烯二酸的定量分析，结果均在检测极限以下，在培养上清液中没有检测到α-氢化己二烯二酸。需要说明的是，检测极限为0.1mg/L。
[表10]
(实施例10)来自普利茅斯沙雷氏菌的对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶基因表达质粒的构建
根据BLAST检索的结果，推定普利茅斯沙雷氏菌NBRC102599所具有的序列编号4的基因序列对3-氧代乙二酰辅酶A硫解酶(PcaF)进行编码，该PcaF是对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶。为了上述基因的表达，构建了质粒pBBR1MCS-2::SppcaF。通过XhoI将在沙雷氏菌属中能够自主复制的载体pBBR1MCS-2(ME Kovach,(1995),Gene166:175-176)切断，从而得到了pBBR1MCS-2/XhoI。将大肠埃希氏菌K-12MG1655的基因组作为模板，设计了用于将gapA基因的ORF上游区域200b(序列编号1)进行PCR扩增的引物(序列编号2、3)，并依照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HDCloning Kit(“Clontech社”制)将所得的片段及pBBR1MCS-2/XhoI连结在一起，并将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pBBR1MCS-2::PgapA。接下来，用ScaI将pBBR1MCS-2::PgapA切断，从而得到了pBBR1MCS-2::PgapA/ScaI。将普利茅斯沙雷氏菌NBRC102599的基因组作为模板，设计了用于将酶基因的ORF(序列编号4)进行PCR扩增的引物(序列编号5、6)，该酶对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化，然后依照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit将所得的片段及pBBR1MCS-2::PgapA/ScaI连结在一起，并将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pBBR1MCS-2::SppcaF。
(实施例11)来自谷氨酸棒杆菌的对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶基因表达质粒的构建
为了表达谷氨酸棒杆菌ATCC13032的对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶，将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组作为模板，设计了用于将乙酰-辅酶A乙酰转移酶基因(pcaF)的ORF(GenBank注册编号NC_003450，GI编号19553591)进行PCR扩增的引物(序列编号7、8)，并依照常规方法进行了PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit将所得的片段及pBBR1MCS-2::PgapA/ScaI连结在一起，并将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pBBR1MCS-2::CgpcaF。
(实施例12)向沙雷氏菌属微生物导入质粒
通过电穿孔(NM Calvin,PC Hanawalt.J.Bacteriol,170(1988),第2796-2801页)将实施例10及11中所构建的质粒pBBR1MCS-2::SppcaF、pBBR1MCS-2::CgpcaF及作为对照的载体pBBR1MCS-2导入至表11所示的沙雷氏菌属微生物中。将转化后的沙雷氏菌属微生物在含有25μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上在30℃下保温，并将其培育1至2天。
(实施例13)对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性测定
使用实施例12中得到的沙雷氏菌属微生物的转化体，比较了对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的比活性。
(a)来自大肠埃希氏菌的PaaH的过表达及纯化
进行PaaH的过表达及纯化，该PaaH用于对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性测定。首先，用BamHI将pCDF-1b切断，从而得到了pCDF-1b/BamHI。将大肠埃希氏菌K-12MG1655的基因组作为模板，设计了用于将paaH基因(GenBank注册编号NC_000913，GI编号945940)进行PCR扩增的引物(序列编号9、10)，并依照常规方法进行PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit将所得的片段及pCDF-1b/BamHI连结在一起，并将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pCDF-1b:EcpaaH。将pCDF-1b:EcpaaH导入至大肠杆菌BL21(DE3)中，在含有50μg/mL链霉素的LB中，对所得的转化体进行需氧培养(37℃)，当OD600为0.3左右时，以最终浓度成为1mM的方式添加异丙基硫代半乳糖苷，从而诱导paaH的表达(需氧、37℃、一晚)。采用20mM的Tris-HCl(pH 8.0)将离心分离后的菌体悬浮，并在进行冰冷的同时，通过超声波均化器使细胞破碎，随后将离心分离而得的上清液回收并作为无细胞提取液。使用His Bind Resin(Merck公司制)来纯化所得的无细胞提取液，并用Amicon Ultra 3K(Merck公司制)进行离心，所得的浓缩液用20mM的Tris-HCl(pH 8.0)进行稀释，成为PaaH酶溶液(0.31mg/mL)。酶浓度通过使用QuickStart Bradford蛋白质测定(“BIO-RAD社”制)来确定。
(2)酶液的制备
将一白金环的导入有pBBR1MCS-2的、表11中所记载的沙雷氏菌属微生物作为对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性没有被强化的沙雷氏菌属微生物，以及导入有pBBR1MCS-2::CgpcaF的、表11中所记载的沙雷氏菌属微生物作为对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性被强化了的沙雷氏菌属微生物，接种于5mL的具有下述组成的预培养培养基中，并在30℃下振荡培养直到充分悬浮。向该培养液中添加10mL的0.9％氯化钠，在离心分离菌体之后将上清液完全除去，从而洗净菌体，该操作进行3次，然后将菌体悬浮于1mL的0.9％氯化钠中。将0.5mL的悬浮液添加至5mL的具有下述组成的主培养培养基中，并在30℃下振荡培养3小时。
在通过离心从5mL的上述培养液中收集菌体后，将其悬浮于1mL的下述Tris-HCl缓冲液中。将玻璃珠(φ0.1mm)添加到上述菌体悬浮液中，并在4℃下使用Micro Smash(“TOMY社”制)将菌体破碎。在如上所述地将菌体破碎之后，将离心得到的上清液的无细胞提取液(CFE)作为酶液用于以下实验。
(c)对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性测定
通过Quick Start Bradford蛋白质测定(“BIO-RAD社”制)来测定(b)中所得的CFE中的蛋白质浓度。接下来，将25μL的具有以下所示组成的酶反应溶液A及50μL的CFE相混合，并进行培育(30℃、2分钟)。随后，将含有酶反应溶液A和CFE的上述溶液全部添加至在放入有25μL的酶反应溶液B的状态下预先在30℃下进行了预培育的石英池中，快速混合后，开始进行活性测定(30℃)。采用分光光度计(Ultrospec3300Pro，“GEヘルスケア社”制)测定340nm处的吸光度的减少，并将所得的Δ340的值代入式(1)，从而分别计算出比活性。表11中示出了计算结果。
从这些结果可知，对于导入有对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的沙雷氏菌属微生物株而言，其比活性高于未导入菌株的比活性。
预培养培养基：
胰蛋白胨 10g/L
酵母提取物 5g/L
氯化钠 5g/L
pH 7。
主培养培养基：
琥珀酸 10g/L
葡萄糖 10g/L
硫酸铵 1g/L
磷酸钾 50mM
硫酸镁 0.025g/L
硫酸铁 0.0625mg/L
硫酸锰 2.7mg/L
氯化钙 0.33mg/L
氯化钠 1.25g/L
Bacto胰蛋白胨 2.5g/L
酵母提取物 1.25g/L
pH 6.5。
Tris-HCl缓冲液：
Tris-HCl(pH 8.0) 100mM
二硫苏糖醇 1mM。
酶反应溶液A：
Tris-HCl(pH 8.0) 200mM
MgCl2 40mM
NADH 0.8mM
DTT 2mM
PaaH 4.4μg。
酶反应溶液B：
乙酰辅酶A 2mM
琥珀酰辅酶A 0.4mM
[表11]
(实施例14)使用了沙雷氏菌属微生物的α-氢化己二烯二酸生产试验，其中该沙雷氏菌属微生物通过基因重组而使对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶进行表达
研究表12所示的沙雷氏菌属微生物、以及实施例12中所制作的通过基因重组而导入有对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的沙雷氏菌属微生物的α-氢化己二烯二酸生产能力。将一白金环的各个沙雷氏菌属微生物接种于5mL的调整为pH7的培养基中，该培养基含有10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的氯化钠、25μg/mL的卡那霉素，并在30℃下进行振荡培养(预培养)直到充分悬浮。将0.25mL该培养液添加到5mL的具有以下所示组成的培养基中，并在30℃下进行24小时的振荡培养，从而进行了主培养。
琥珀酸 10g/L
葡萄糖 10g/L
硫酸铵 1g/L
磷酸钾 50mM
硫酸镁 0.025g/L
硫酸铁 0.0625mg/L
硫酸锰 2.7mg/L
氯化钙 0.33mg/L
氯化钠 1.25g/L
Bacto胰蛋白胨 2.5g/L
酵母提取物 1.25g/L
卡那霉素 25μg/mL
pH 6.5。
从主培养液中离心分离出菌体，上清液与实施例1同样地通过LC-MS/MS进行分析。对蓄积在培养上清液中的α-氢化己二烯二酸进行定量分析的结果分别示出于表12中。
从这些结果可知，对于导入有对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的菌株而言，其α-氢化己二烯二酸的蓄积浓度高于未导入株。因此，从本实施例和实施例12的结果可知，通过对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性强化，从而能够更有效地制造α-氢化己二烯二酸。
[表12]
(实施例15)
来自普利茅斯沙雷氏菌NBRC102599的PcaF的酶活性的确认
在实施例10中克隆的序列编号4的基因序列所编码的PcaF确认具有对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的活性。
(a)来自普利茅斯沙雷氏菌的PcaF的过表达及纯化
采用SacI将pRSF-1b切断，得到了pRSF-1b/SacI。将普利茅斯沙雷氏菌NBRC102599的基因组作为模板，设计了用于将PcaF基因的ORF(序列编号4)进行PCR扩增的引物(序列编号11、12)，并依照常规方法进行了PCR反应。使用In-Fusion HD Cloning Kit将所得的片段及pRSF-1b/SacI连结在一起，并将通过常规方法确认了碱基序列的质粒设为pRSF-1b:SppcaF。将pRSF-1b:SppcaF导入至大肠杆菌BL21(DE3)中，在含有25μg/mL卡那霉素的LB中，对所得的转化体进行需氧培养(37℃)，当OD600为0.3左右时，以最终浓度成为1mM的方式添加异丙基硫代半乳糖苷，从而诱导pcaH的表达(需氧、37℃、一晚)。采用20mM的Tris-HCl(pH8.0)将离心分离后的菌体悬浮，并在进行冰冷的同时，通过超声波均化器使细胞破碎，随后将离心分离而得的上清液回收并作为无细胞提取液。使用His Bind Resin(Merck公司制)来纯化所得的无细胞提取液，并用Amicon Ultra 3K(Merck公司制)进行离心，所得的浓缩液用20mM的Tris-HCl(pH 8.0)进行稀释，成为PcaF酶溶液(0.52mg/mL)。酶浓度通过使用Quick Start Bradford蛋白质测定(“BIO-RAD社”制)来确定。
(b)对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性测定
将PcaF酶溶液作为酶液，通过与实施例13相同的顺序进行了酶活性测定。作为测定结果，比活性为0.170单位/mg，从而可确认：纯化后的酶具有对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的活性。
工业实用性
根据本发明，可以利用沙雷氏菌属微生物来制造α-氢化己二烯二酸。所得的α-氢化己二烯二酸可用作各种聚合物原料。
序列表
<110> 东丽株式会社
<120> α-氢化己二烯二酸的制造方法
<130> 17081WO01
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<220>
<221> 5'UTR
<222> (1)..(200)
<400> 1
cgtaattgcc ctttaaaatt cggggcgccg accccatgtg gtctcaagcc caaaggaaga 60
gtgaggcgag tcagtcgcgt aatgcttagg cacaggattg atttgtcgca atgattgaca 120
cgattccgct tgacgctgcg taaggttttt gtaattttac aggcaacctt ttattcacta 180
acaaatagct ggtggaatat 200
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(30)
<400> 2
taccgtcgac ctcgacgtaa ttgcccttta 30
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(41)
<400> 3
ggccccccct cgagtcatta agtactatat tccaccagct a 41
<210> 4
<211> 1203
<212> DNA
<213> 普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1203)
<400> 4
atgaatccag cctatctgtg tgacgccgtt cgtacgcctt ttggccgtct gaacggcagt 60
ctcgccactg tccgcgccga cgatctggcc gccctgccgc tgaaagcgct acaggcgcgc 120
cacccgcagc ttgactggag cgcggtagac gacgtgttgc tcggctgcgc caaccaggcg 180
ggagaagata accgcaacgt agcacgcatg gcgctgctgc tggccggcct gccggtgcag 240
atccccggtt gcaccctcaa tcgtctgtgc ggctccagcc tggatgctgt ggcgatggcg 300
gcccgcgcca tcaagacagg tgaaagtgag ctgatgattg ccggtggcgt ggaaagcatg 360
tcgcgggcgc cgtttgtgat gggcaaagcg gagagcgcct ttagccgggc gatgaaaata 420
gaagacacca ccatgggctg gcggtttatc aatccgcaaa tgcaggcgca atacggcgtg 480
gactctatgc cgcagaccgc tgaaaacgta gccctgaagt ttggcattag ccgccaggat 540
caggatgctt tcgccctgcg cagccagcaa cgcaccgcag cggcccagga aagcggtttc 600
tttgccgagc aactgatcga agtcagtctg gcgcagaaaa aaggcgaccc actgctgttc 660
cgccaggatg aacatccgcg cgccactacg ctcgaggcac tggcgaagtt gaaaccggta 720
gttaatccgc aaggtaccgt caccgccggt aatgcctccg ggctgaacga cggtgcctgc 780
gcactgttgc tggccggaga gcgcggagta acccgccacg gcttggagcc aatggcgcgc 840
attgtcgcca gcgccgtgac cggcattgaa ccttcgatta tgggctttgc gccgacagag 900
gcggtgcgca aagtgctgaa aatcgccggt ctgacgctcg atcaaatgga cgttatcgaa 960
cttaacgaag cctttgcagc gcaggcgctg gcggtgactc gtgagctggg actgagtgac 1020
gacgccgcac aggtgaaccc aaacggcggc gcgattgcgc tgggccatcc gctgggtgct 1080
tccggtggca ggctggtgat gaacgccgcc tggcaattgc agaaaacacg gggacgctac 1140
gggttatgca ccatgtgcat cggcgttggc caaggtattg cgctgatcat cgagcgggta 1200
tga 1203
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(30)
<400> 5
ctggtggaat atagtatgaa tccagcctat 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(30)
<400> 6
ctcgagtcat taagttcata cccgctcgat 30
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(53)
<400> 7
ctggtggaat atagtactta gctggtggaa tatatgaacc ctcaagatat tgt 53
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(41)
<400> 8
ctcgagtcat taagtgttaa cttagttctc cttttcaaag a 41
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(30)
<400> 9
caagagtccg gatccatgat gataaatgtg 30
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(34)
<400> 10
cgagctccca attgggatca gatctttatg actc 34
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(35)
<400> 11
cggatcccaa ttgggagctc atgaatccag cctat 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer
<222> (1)..(35)
<400> 12
gcgccgtgta cacgagatct tcatacccgc tcgat 35

Claims (7)

1.一种α-氢化己二烯二酸的制造方法，包括培养具有α-氢化己二烯二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物的步骤。
2.根据权利要求1所述的α-氢化己二烯二酸的制造方法，其特征在于：对由所述沙雷氏菌属微生物的琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性得到强化。
3.根据权利要求1或2所述的α-氢化己二烯二酸的制造方法，其中，所述沙雷氏菌属微生物为葛氏沙雷氏菌、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、普利茅斯沙雷氏菌、嗜虫沙雷氏菌或嗜线虫沙雷氏菌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的α-氢化己二烯二酸的制造方法，其中，培养所述沙雷氏菌属微生物的培养基包含选自由糖类、琥珀酸、2-氧代戊二酸及甘油所组成的组中的至少一种或两种以上的碳源。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的α-氢化己二烯二酸的制造方法，其中，在包含选自由阿魏酸、对-香豆酸、苯甲酸、顺,顺-己二烯二酸、原儿茶酸及儿茶酚所组成的组中的至少一种或两种以上的诱导物质的培养基中培养所述沙雷氏菌属微生物。
6.一种沙雷氏菌属微生物，其为具有3-羟基己二酸生产能力的沙雷氏菌属微生物，特征在于：对由琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A生成3-氧代己二酰辅酶A及辅酶A的反应进行催化的酶的活性得到强化。
7.根据权利要求6所述的沙雷氏菌属微生物，其中，所述沙雷氏菌属微生物为葛氏沙雷氏菌、无花果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、普利茅斯沙雷氏菌、嗜虫沙雷氏菌或嗜线虫沙雷氏菌。
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