CN102972208B - 食用菌液化菌种的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食用菌液化菌种的制备方法，包括一级菌种的纯化培养、无菌水的制作、二级菌种的制备和液化三个步骤。首先将一级菌种在PDA加富培养基中培养，得到纯化后的一级菌种，然后将纯化后的一级菌种切分后接入溶水性培养基中，得到二级菌种，最后将二级菌种用菌种高速粉碎机打碎菌丝，再加入到无菌水中进行稀释得到液化菌种。该制备方法，工艺简单，接种简便，发菌快，出菇早，优质高产，效率高，污染风险小，投资和运行成本低，经济效益好。使用该方法制备的食用菌液化菌种接种后，菌种的渗透力强，发菌快。而且，食用菌液化菌种的栽培出菇时间大大缩短、出菇整齐、生长速度快，产量明显提高。

Description

食用菌液化菌种的制备方法

技术领域

本发明涉及食用菌菌种的培养方法，尤其涉及一种食用菌液化菌种的制备方法。

背景技术

在食用菌生产中，成功与失败的关键是菌种生产，生产中投入最大，人们最担心的也是菌种。菌种的纯度、活力、培育时间和抗杂能力，决定着生产的成败、效益的高低和质量的好坏。食用菌菌种的生产是食用菌栽培种的关键环节，要实现食用菌栽培的优质、高效，首先要做到菌种的高质量、高效率和低成本。

现有技术中食用菌菌种的生产，主要有固体菌种和液体菌种两种生产方法，固体菌种的生产存在菌种的生长周期长、菌龄不一致、操作不方便、成本高等缺点，液体菌种存在不易运输、贮存、检测、剔杂及投资成本较高等缺点，成为制约工厂化食用菌发展的主要因素。要想实现高质量、工厂化、标准化、全年候生产，提高栽培效益，就必须解决目前菌种生产的落后方式。菌种的液化栽培是工厂化食用菌发展必然趋势和选择。

发明内容

为了克服现有食用菌菌种生产方法存在的缺陷，本发明的目的是提供一种食用菌液化菌种的制备方法。

本发明所采用的技术方案是，一种食用菌液化菌种的制备方法，其步骤包括：

步骤A：一级菌种的纯化培养 

（1）PDA加富培养基的配制：将土豆去芽、去皮，切成小条放入锅中，加入所述土豆质量4～5倍的水，煮沸至土豆酥而不烂时用纱布过滤，得到PDA培养基；加入土豆质量6.7～13.3%的琼脂融化后，再加入土豆质量6.7～13.3%的葡萄糖、0.16～0.33%的植物性蛋白胨、0.67～1.33%的干酵母片，混合搅拌均匀，补水至所述土豆质量的4～5倍，得到PDA加富培养基；然后杀菌、冷却，待用；

（2）一级菌种的纯化培养：在无菌条件下，用组织分离法取种，接入所述PDA加富培养基中，在18～20℃培养室中培养10～15天，得到纯化后的一级菌种；所述取种量与PDA加富培养基的质量比为1:15～1：30；

步骤B：制作无菌水；

步骤C：二级菌种的制备和液化

（1）由以下质量份的原料配制得到溶水性培养基：白糖150～170份、豆粕17～19份、硫酸镁26～30份、磷酸二氢钾26～30份、消泡剂1～3份、无菌水550～580份，在17～19℃混合搅拌均匀；然后将其杀菌、冷却； 

（2）二级菌种的制备：将所述溶水性培养基用紫外线照射杀菌，将所述纯化后一级菌种分切后接入杀菌后的溶水性培养基中，在20～22℃的摇床中培养8～12天，得到二级菌种；所述纯化后一级菌种与溶水性培养基的质量比为1:30～1:50；

（3）二级菌种的液化：将所述二级菌种用紫外线照射杀菌，然后粉碎；将粉碎后的二级菌种用所述无菌水稀释，稀释后即为液化菌种；粉碎后二级菌种与无菌水的质量比1:100～1:150。

所述食用菌包括金针菇、杏鲍菇、蟹味菇和茶树菇。

步骤C中所述二级菌种粉碎至细度为80～100目。

步骤B中所述无菌水的制作，采取高压蒸汽杀菌的方法或直接用烧开水的方法制备无菌水。

一般情况下，液体菌种的培养液主要成分是白砂糖、豆粕粉和水，是通过形成多而密小的菌丝球后接种到菌瓶中，其菌丝球大部分附着在菌瓶表面，渗透的较缓慢。在接种的过程中，有时喷洒到菌瓶的表面，粘稠的菌液容易受到污染。

采用本发明提供的食用菌液化菌种的制备方法，利用菌种高速粉碎机将二级菌种粉碎成菌丝粉末，通过液化水进行稀释后再接种，菌液较清，渗透力强，菌丝粉末能到达菌瓶的底部，萌发速度较快。由于菌液清澈且含糖量低，喷散到外面也不容易遭到污染。

本发明提供的食用菌液化菌种的制备方法，工艺简单，接种简便，发菌快，出菇早，优质高产，效率高，污染风险小，投资和运行成本低，经济效益好。使用本方法制备的食用菌液化菌种，食用菌液化菌种的菌液较原先深层发酵液体菌种的菌液更为细小，且菌液不含糖分等营养粘稠物质，不以菌球存在，食用菌液化菌种接种后，菌种的渗透力强，发菌快。而且，食用菌液化菌种的栽培出菇时间大大缩短、出菇整齐、生长速度快，产量明显提高。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例一：

金针菇液化菌种的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：一级菌种的纯化培养

（1）PDA加富培养基的配制：将300g土豆去芽、去皮，切成小条放入锅中，加入1500ml水，煮沸至土豆酥而不烂时用6层纱布过滤，得到PDA培养基；加入30g琼脂融化，再加入30g葡萄糖、1.0g植物性蛋白胨、3.0g干酵母片，混合搅拌均匀，补水至1500ml得到PDA加富培养基，趁热分装于20mm×200mm的试管中；将试管塞上棉塞，7只一把用牛皮纸包扎，橡皮筋固定备用。

（2）PDA加富培养基的杀菌、冷却：将包扎好的试管放入高压蒸汽杀菌锅中，压力为1.5kg/m³，温度为121℃，加热35min进行杀菌；杀菌完成后，趁热取出试管摆斜面，自然冷却至17℃，待用。

（3）一级菌种的纯化培养：接种室内采用百级净化，超净工作台及其各种工具用75％酒精浸泡擦洗，接种前，打开紫外线灯杀菌15min。在无菌条件下，用组织分离法进行取种。用接种针从金针菇新12号的菇帽与菇柄之间的组织挑取一小块组织接入试管的PDA加富培养基上，取种量与PDA加富培养基的质量比为1:20。瓶口靠近酒精灯火焰处，速度要快，接种完成以后将试管塞上棉花，放到20℃培养室中培养。从48h起开始观察菌丝萌发、生长情况。观察菌丝长势，包括菌丝萌发力，菌丝色泽和浓度、菌落形态等，每隔2d进行一次观察记录，待全部菌丝长满时就结束观察，并对观察结果和测定数据进行对比分析。10天后待全部菌丝长满试管瓶时，挑选出菌丝生长旺盛、无污染、活力强的作为纯化后的一级菌种。

步骤2：无菌水的制作

检查500升液化罐的气密性，检查完毕后给液化罐内注入自来水至500l刻度线为止，盖紧液化罐的罐盖，推入杀菌室进行杀菌。给液化罐连接好进气管道，设置压力1.3kg/m³，温度123℃，用高压蒸汽杀菌100min。液化罐杀菌结束后，将液化罐移入水淋冷却室，连接好自来水管道和进气管，对液化罐的罐体进行不间断水淋冷却3.5小时，用手触摸罐底冰凉为止，使液化罐内温度降至17℃。为了防止个别大颗粒未融化菌块堵塞自动接种机的接种喷头，在液化罐的接种口加装80目的菌丝过滤网袋。

步骤3：二级菌种的制备和液化

（1）溶水性培养基的配制：在18℃下用白糖168g、豆粕18.9g、硫酸镁28g、磷酸二氢钾28g，消泡剂3.0g，无菌水550g，制作成800ml溶水性培养基三角瓶，瓶口用棉球塞紧。

（2）溶水性培养基的杀菌：将溶水性培养基三角瓶放入高压蒸汽杀菌锅中，压力为1.3kg/m³，温度为121℃，加热60min进行杀菌；杀菌完成后自然冷却至16℃待接种。

（3）二级菌种的制备：将冷却后的溶水性培养基三角瓶放入无菌超净台，紫外线照射10min，用酒精棉擦拭表面后，准备接种；选菌丝生长旺盛、菌丝活力强、无污染的一级菌种试管数支，做好人员消毒（尤其是手部消毒），在无菌超净台下，将纯化后一级菌种试管的母种分切后的颗粒菌种接入溶水性培养基三角瓶中，纯化后一级菌种与溶水性培养基的质量比为1:40。用硫酸纸包紧瓶口，在硫酸纸外再包一层报纸，用橡皮绳扎紧。接种完毕的二级菌种三角瓶放入摇床培养8天，温度22℃,得到三角瓶二级菌种。

（4）粉碎二级菌种：将菌种高速粉碎机、镊子放入无菌超净台，用紫外线照射10min，用酒精棉擦拭表面后备用；挑选菌丝生长旺盛、菌丝活力强、无污染的三角瓶二级菌种5瓶，做好人员消毒（尤其是手部消毒），在无菌超净台下打开三角瓶，把高速搅拌棒放入三角瓶正中位置，启动菌种高速粉碎机，由低速到高速逐步增加，直到三角瓶二级菌种的菌丝球完全打碎，大约3分钟，取出搅拌棒，然后用无菌纸封好三角瓶口。二级菌种粉碎后的细度为80目。菌丝通过粉碎装置粉碎打断，粉碎后的菌丝水溶化效果良好，溶入无菌水中其接种后渗透力强，接种后生长旺盛，菌丝萌发点多，发菌快、发菌整齐。

（5）二级菌种的液化：将冷却后的无菌水罐推入高效过滤器下，连接好进气管道，在接种口周围布满95%的酒精纱布，左手持粉碎好的二级种，右手点燃酒精纱布，在火焰圈的保护下，将粉碎后二级菌种倒入无菌水罐的无菌水中进行稀释，稀释后即成液化菌种。关闭接种口，熄灭火焰。粉碎后二级菌种与无菌水的比例为1:150。

步骤4：液化菌种的接种

在16℃下，连接好生产瓶的进气管道和接种机，进行接种，每半小时抽检一次。生产瓶的体积为1100ml，生产瓶中有840 g 的固体培养基，固体培养基按照质量百分比计，为：玉米芯30%，米糠30%，棉籽壳15%，麸皮15%，甜菜渣5%，黄蛋皮4%，碳酸钙1%。，每个生产瓶的接种量为27g。将接种后的生产瓶移入养菌室培养，养菌室的温度为15℃，湿度为65%，黑暗培养。每隔7天或不定期拿手电筒进行照射检查，若发现生长异常及污染，应及时将生产瓶撤离出养菌室，以免影响其他菌种的生长。养菌周期为23天，养菌完成后，搔菌，入育菇房培养，出菇，催菇生长，采收。

采用本发明提供的金针菇液化菌种的制备方法，工艺简单，接种简便，发菌快，出菇早，优质高产，效率高，污染风险小，投资和运行成本低，经济效益好。金针菇的菌丝生长速度快，出菇时间大大缩短、出菇整齐、生长速度快，产量明显提高。达到了零污染，商品菇一等率可以达到99%。

实施例二

杏鲍菇液化菌种的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：一级菌种的纯化培养

（1）PDA加富培养基的配制：将300g土豆去芽、去皮，切成小条放入锅中，加入1500ml水，煮沸至土豆酥而不烂时用6层纱布过滤，得到PDA培养基；加入20g琼脂融化，再加入40g葡萄糖、1.2g蛋白胨、2.5g酵母片，混合搅拌均匀，补水至1500ml得到PDA加富培养基，趁热分装于20mm×200mm的试管中；将试管塞上棉塞，7只一把用牛皮纸包扎，橡皮筋固定备用。

（2）PDA加富培养基的杀菌、冷却：将包扎好的试管放入高压蒸汽杀菌锅中，压力为1.4kg/m³，温度为122℃，加热30min进行杀菌；杀菌完成后，趁热取出试管摆斜面，自然冷却至16℃，待用。

（3）一级菌种的纯化培养：接种室内采用百级净化，超净工作台及其各种工具用75％酒精浸泡擦洗，接种前，打开紫外线灯杀菌15min。在无菌条件下，用组织分离法进行取种。用接种针从杏鲍菇的菇帽与菇柄之间的组织挑取一小块组织接入试管的加富培养基上，取种量与PDA加富培养基的质量比为1:15。瓶口靠近酒精灯火焰处，速度要快，接种完成以后将试管塞上棉花，放到19℃培养室中培养。从48h起开始观察菌丝萌发、生长情况。观察菌丝长势，包括菌丝萌发力，菌丝色泽和浓度、菌落形态等，每隔2d进行一次观察记录，待全部菌丝长满时就结束观察，并对观察结果和测定数据进行对比分析。12天后待全部菌丝长满试管瓶时，挑选出菌丝生长旺盛、无污染、活力强的作为纯化后的一级菌种。

步骤2：无菌水的制作

检查500升液化罐的气密性，检查完毕后给液化罐内注入自来水至500l刻度线为止，盖紧液化罐的罐盖，推入杀菌室进行杀菌。给液化罐连接好进气管道，设置压力1.4kg/m³，温度122℃，用高压蒸汽杀菌105min。液化罐杀菌结束后，将液化罐移入水淋冷却室，连接好自来水管道和进气管，对液化罐的罐体进行不间断水淋冷却4.0小时，用手触摸罐底冰凉为止，使液化罐内温度降至18℃。为了防止个别大颗粒未融化菌块堵塞自动接种机的接种喷头，在液化罐的接种口加装90目的菌丝过滤网袋。

步骤3：二级菌种的制备和液化

（1）溶水性培养基的配制：在18℃下用白糖150g、豆粕19g、硫酸镁26g、磷酸二氢钾30g，消泡剂2.0g，无菌水573g，制作成800ml溶水性培养基三角瓶，瓶口用棉球塞紧。

（2）溶水性培养基的杀菌：将溶水性培养基三角瓶放入高压蒸汽杀菌锅中，压力为1.4kg/m³，温度为123℃，加热55min进行杀菌；杀菌完成后自然冷却至17℃待接种。

（3）二级菌种的制备：将冷却后的溶水性培养基三角瓶放入无菌超净台，紫外线照射12min，用酒精棉擦拭表面后，准备接种；选菌丝生长旺盛、菌丝活力强、无污染的一级菌种试管数支，做好人员消毒（尤其是手部消毒），在无菌超净台下，将纯化后一级菌种试管的母种分切后的颗粒菌种接入溶水性培养基三角瓶中，纯化后一级菌种与溶水性培养基的质量比为1:30。用硫酸纸包紧瓶口，在硫酸纸外再包一层报纸，用橡皮绳扎紧。接种完毕的二级菌种三角瓶放入摇床培养10天，温度21℃,得到三角瓶二级菌种。

（4）粉碎二级菌种：将菌种高速粉碎机、镊子放入无菌超净台，用紫外线照射12min，用酒精棉擦拭表面后备用；挑选菌丝生长旺盛、菌丝活力强、无污染的三角瓶二级菌种5瓶，做好人员消毒（尤其是手部消毒），在无菌超净台下打开三角瓶，把高速搅拌棒放入三角瓶正中位置，启动菌种高速粉碎机，由低速到高速逐步增加，直到三角瓶二级菌种的菌丝球完全打碎，大约3分钟，取出搅拌棒，然后用无菌纸封好三角瓶口。二级菌种粉碎后的细度为90目。菌丝通过粉碎装置粉碎打断，粉碎后的菌丝水溶化效果良好，溶入无菌水中其接种后渗透力强，接种后生长旺盛，菌丝萌发点多，发菌快、发菌整齐。

（5）二级菌种的液化：将冷却后的无菌水罐推入高效过滤器下，连接好进气管道，在接种口周围布满95%的酒精纱布，左手持粉碎好的二级种，右手点燃酒精纱布，在火焰圈的保护下，将粉碎后二级菌种倒入无菌水罐的无菌水中进行稀释，稀释后即成液化菌种。关闭接种口，熄灭火焰。粉碎后二级菌种与无菌水的比例为1:140。

步骤4：液化菌种的接种

在16℃下，连接好生产瓶的进气管道和接种机，进行接种，每半小时抽检一次。生产瓶的体积为1100ml，生产瓶中有845 g 的固体培养基，固体培养基按照质量百分比计，为：玉米芯30%，米糠30%，棉籽壳15%，麸皮15%，甜菜渣5%，黄蛋皮4%，碳酸钙1%。，每个生产瓶的接种量为27g。每个生产瓶的接种量为25g。将接种后的生产瓶移入养菌室培养，养菌室的温度为16℃，湿度为70%，黑暗培养。每隔7天或不定期拿手电筒进行照射检查，若发现生长异常及污染，应及时将生产瓶撤离出养菌室，以免影响其他菌种的生长。养菌周期为30天，养菌完成后，搔菌，入育菇房培养，出菇，催菇生长，采收。

采用本发明提供的杏鲍菇液化菌种的制备方法，工艺简单，接种简便，发菌快，出菇早，优质高产，效率高，污染风险小，投资和运行成本低，经济效益好。杏鲍菇的菌丝生长速度快，出菇时间大大缩短、出菇整齐、生长速度快，产量明显提高。达到了零污染，商品菇一等率可以达到99%。

实施例三

蟹味菇液化菌种的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：一级菌种的纯化培养

（1）PDA加富培养基的配制：将300g土豆去芽、去皮，切成小条放入锅中，加入1200ml水，煮沸至土豆酥而不烂时用5层纱布过滤，得到PDA培养基；加入25g琼脂融化，再加入20g葡萄糖、1.5g蛋白胨、2.0g酵母片，混合搅拌均匀，补水至1200ml得到PDA加富培养基，趁热分装于20mm×200mm的试管中；将试管塞上棉塞，7只一把用牛皮纸包扎，橡皮筋固定备用。

（2）PDA加富培养基的杀菌、冷却：将包扎好的试管放入高压蒸汽杀菌锅中，压力为1.4kg/m³，温度为123℃，加热35min进行杀菌；杀菌完成后，趁热取出试管摆斜面，自然冷却至18℃，待用。

（3）一级菌种的纯化培养：接种室内采用百级净化，超净工作台及其各种工具用75％酒精浸泡擦洗，接种前，打开紫外线灯杀菌15min。在无菌条件下，用组织分离法进行取种。用接种针从蟹味菇的菇帽与菇柄之间的组织挑取一小块组织接入试管的加富培养基上，取种量与PDA加富培养基的质量比为1:22。瓶口靠近酒精灯火焰处，速度要快，接种完成以后将试管塞上棉花，放到18℃培养室中培养。从48h起开始观察菌丝萌发、生长情况。观察菌丝长势，包括菌丝萌发力，菌丝色泽和浓度、菌落形态等，每隔2d进行一次观察记录，待全部菌丝长满时就结束观察，并对观察结果和测定数据进行对比分析。15天后待全部菌丝长满试管瓶时，挑选出菌丝生长旺盛、无污染、活力强的作为纯化后的一级菌种。

步骤2：无菌水的制作

检查500升液化罐的气密性，检查完毕后给液化罐内注入自来水至500l刻度线为止，盖紧液化罐的罐盖，推入杀菌室进行杀菌。给液化罐连接好进气管道，设置压力1.4kg/m³，温度122℃，用高压蒸汽杀菌110min。液化罐杀菌结束后，将液化罐移入水淋冷却室，连接好自来水管道和进气管，对液化罐的罐体进行不间断水淋冷却4.0小时，用手触摸罐底冰凉为止，使液化罐内温度降至18℃。为了防止个别大颗粒未融化菌块堵塞自动接种机的接种喷头，在液化罐的接种口加装95目的菌丝过滤网袋。

步骤3：二级菌种的制备和液化

（1）溶水性培养基的配制：在17℃下用白糖160g、豆粕18g、硫酸镁27g、磷酸二氢钾27g，消泡剂2.5g，无菌水580g，制作成800ml溶水性培养基三角瓶，瓶口用棉球塞紧。

（2）溶水性培养基的杀菌：将溶水性培养基三角瓶放入高压蒸汽杀菌锅中，压力为1.4kg/m³，温度为122℃，加热50min进行杀菌；杀菌完成后自然冷却至17℃待接种。

（3）二级菌种的制备：将冷却后的溶水性培养基三角瓶放入无菌超净台，紫外线照射13min，用酒精棉擦拭表面后，准备接种；选菌丝生长旺盛、菌丝活力强、无污染的一级菌种试管数支，做好人员消毒（尤其是手部消毒），在无菌超净台下，将纯化后一级菌种试管的母种分切后的颗粒菌种接入溶水性培养基三角瓶中，纯化后一级菌种与溶水性培养基的质量比为1:35。用硫酸纸包紧瓶口，在硫酸纸外再包一层报纸，用橡皮绳扎紧。接种完毕的二级菌种三角瓶放入摇床培养11天，温度21℃,得到三角瓶二级菌种。

（4）粉碎二级菌种：将菌种高速粉碎机、镊子放入无菌超净台，用紫外线照射13min，用酒精棉擦拭表面后备用；挑选菌丝生长旺盛、菌丝活力强、无污染的三角瓶二级菌种4瓶，做好人员消毒（尤其是手部消毒），在无菌超净台下打开三角瓶，把高速搅拌棒放入三角瓶正中位置，启动菌种高速粉碎机，由低速到高速逐步增加，直到三角瓶二级菌种的菌丝球完全打碎，大约3分钟，取出搅拌棒，然后用无菌纸封好三角瓶口。二级菌种粉碎后的细度为95目。菌丝通过粉碎装置粉碎打断，粉碎后的菌丝水溶化效果良好，溶入无菌水中其接种后渗透力强，接种后生长旺盛，菌丝萌发点多，发菌快、发菌整齐。

（5）二级菌种的液化：将冷却后的无菌水罐推入高效过滤器下，连接好进气管道，在接种口周围布满95%的酒精纱布，左手持粉碎好的二级种，右手点燃酒精纱布，在火焰圈的保护下，将粉碎后二级菌种倒入无菌水罐的无菌水中进行稀释，稀释后即成液化菌种。关闭接种口，熄灭火焰。粉碎后二级菌种与无菌水的比例为1:130。

步骤4：液化菌种的接种

在16℃下，连接好生产瓶的进气管道和接种机，进行接种，每半小时抽检一次。生产瓶的体积为1100ml，生产瓶中有845 g 的固体培养基，固体培养基按照质量百分比计，为：玉米芯30%，米糠30%，棉籽壳15%，麸皮15%，甜菜渣5%，黄蛋皮4%，碳酸钙1%。，每个生产瓶的接种量为27g。每个生产瓶的接种量为28g。将接种后的生产瓶移入养菌室培养，养菌室的温度为16℃，湿度为70%，黑暗培养。每隔7天或不定期拿手电筒进行照射检查，若发现生长异常及污染，应及时将生产瓶撤离出养菌室，以免影响其他菌种的生长。养菌周期为85天，养菌完成后，搔菌，入育菇房培养，出菇，催菇生长，采收。

采用本发明提供的蟹味菇液化菌种的制备方法，工艺简单，接种简便，发菌快，出菇早，优质高产，效率高，污染风险小，投资和运行成本低，经济效益好。蟹味菇的菌丝生长速度快，出菇时间大大缩短、出菇整齐、生长速度快，产量明显提高。达到了零污染，商品菇一等率可以达到99%。

实施例四

茶树菇液化菌种的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：一级菌种的纯化培养

（1）PDA加富培养基的配制：将300g土豆去芽、去皮，切成小条放入锅中，加入1200ml水，煮沸至土豆酥而不烂时用5层纱布过滤，得到PDA培养基；加入40g琼脂融化，再加入20g葡萄糖、0.5g蛋白胨、4.0g酵母片，混合搅拌均匀，补水至1200ml得到PDA加富培养基，趁热分装于20mm×200mm的试管中；将试管塞上棉塞，7只一把用牛皮纸包扎，橡皮筋固定备用。

（2）PDA加富培养基的杀菌、冷却：将包扎好的试管放入高压蒸汽杀菌锅中，压力为1.5kg/m³，温度为120℃，加热30min进行杀菌；杀菌完成后，趁热取出试管摆斜面，自然冷却至16℃，待用。

（3）一级菌种的纯化培养：接种室内采用百级净化，超净工作台及其各种工具用75％酒精浸泡擦洗，接种前，打开紫外线灯杀菌15min。在无菌条件下，用组织分离法进行取种。用接种针从茶树菇的菇帽与菇柄之间的组织挑取一小块组织接入试管的加富培养基上，取种量与PDA加富培养基的质量比为1:30。瓶口靠近酒精灯火焰处，速度要快，接种完成以后将试管塞上棉花，放到19℃培养室中培养。从48h起开始观察菌丝萌发、生长情况。观察菌丝长势，包括菌丝萌发力，菌丝色泽和浓度、菌落形态等，每隔2d进行一次观察记录，待全部菌丝长满时就结束观察，并对观察结果和测定数据进行对比分析。14天后待全部菌丝长满试管瓶时，挑选出菌丝生长旺盛、无污染、活力强的作为纯化后的一级菌种。

步骤2：无菌水的制作

检查500升液化罐的气密性，检查完毕后给液化罐内注入自来水至500l刻度线为止，盖紧液化罐的罐盖，推入杀菌室进行杀菌。给液化罐连接好进气管道，设置压力1.2kg/m³，温度123℃，用高压蒸汽杀菌120min。液化罐杀菌结束后，将液化罐移入水淋冷却室，连接好自来水管道和进气管，对液化罐的罐体进行不间断水淋冷却4.5小时，用手触摸罐底冰凉为止，使液化罐内温度降至19℃。为了防止个别大颗粒未融化菌块堵塞自动接种机的接种喷头，在液化罐的接种口加装100目的菌丝过滤网袋。

步骤3：二级菌种的制备和液化

（1）溶水性培养基的配制：在19℃下用白糖170g、豆粕17g、硫酸镁30g、磷酸二氢钾26g，消泡剂1.0g，无菌水556g，制作成800ml溶水性培养基三角瓶，瓶口用棉球塞紧。

（2）溶水性培养基的杀菌：将溶水性培养基三角瓶放入高压蒸汽杀菌锅中，压力为1.2kg/m³，温度为123℃，加热40min进行杀菌；杀菌完成后自然冷却至18℃待接种。

（3）二级菌种的制备：将冷却后的溶水性培养基三角瓶放入无菌超净台，紫外线照射15min，用酒精棉擦拭表面后，准备接种；选菌丝生长旺盛、菌丝活力强、无污染的一级菌种试管数支，做好人员消毒（尤其是手部消毒），在无菌超净台下，将纯化后一级菌种试管的母种分切后的颗粒菌种接入溶水性培养基三角瓶中，纯化后一级菌种与溶水性培养基的质量比为1:50。用硫酸纸包紧瓶口，在硫酸纸外再包一层报纸，用橡皮绳扎紧。接种完毕的二级菌种三角瓶放入摇床培养12天，温度20℃,得到三角瓶二级菌种。

（4）粉碎二级菌种：将菌种高速粉碎机、镊子放入无菌超净台，用紫外线照射15min，用酒精棉擦拭表面后备用；挑选菌丝生长旺盛、菌丝活力强、无污染的三角瓶二级菌种4瓶，做好人员消毒（尤其是手部消毒），在无菌超净台下打开三角瓶，把高速搅拌棒放入三角瓶正中位置，启动菌种高速粉碎机，由低速到高速逐步增加，直到三角瓶二级菌种的菌丝球完全打碎，大约3分钟，取出搅拌棒，然后用无菌纸封好三角瓶口。二级菌种粉碎后的细度为100目。菌丝通过粉碎装置粉碎打断，粉碎后的菌丝水溶化效果良好，溶入无菌水中其接种后渗透力强，接种后生长旺盛，菌丝萌发点多，发菌快、发菌整齐。

（5）二级菌种的液化：将冷却后的无菌水罐推入高效过滤器下，连接好进气管道，在接种口周围布满95%的酒精纱布，左手持粉碎好的二级种，右手点燃酒精纱布，在火焰圈的保护下，将粉碎后二级菌种倒入无菌水罐的无菌水中进行稀释，稀释后即成液化菌种。关闭接种口，熄灭火焰。粉碎后二级菌种与无菌水的比例为1:100。

步骤4：液化菌种的接种

在17℃下，连接好生产瓶的进气管道和接种机，进行接种，每半小时抽检一次。生产瓶的体积为1100ml，生产瓶中有850g 的固体培养基，固体培养基按照质量百分比计，为：玉米芯30%，米糠15%，棉籽壳30%，麸皮15%，甜菜渣5%，黄蛋皮4%，碳酸钙1%。，每个生产瓶的接种量为27g。每个生产瓶的接种量为30g。

将接种后的生产瓶移入养菌室培养，养菌室的温度为19℃，湿度为75%，黑暗培养。每隔7天或不定期拿手电筒进行照射检查，若发现生长异常及污染，应及时将生产瓶撤离出养菌室，以免影响其他菌种的生长。养菌周期为25天，养菌完成后，搔菌，入育菇房培养，出菇，催菇生长，采收。

采用本发明提供的茶树菇液化菌种的制备方法，工艺简单，接种简便，发菌快，出菇早，优质高产，效率高，污染风险小，投资和运行成本低，经济效益好。茶树菇的菌丝生长速度快，出菇时间大大缩短、出菇整齐、生长速度快，产量明显提高。达到了零污染，商品菇一等率可以达到99%。

Claims (1)

1.一种食用菌液化菌种的制备方法，其特征在于，所述食用菌包括金针菇、杏鲍菇、蟹味菇和茶树菇，制备方法包括以下步骤：

步骤A：一级菌种的纯化培养 

（1）PDA加富培养基的配制：将土豆去芽、去皮，切成小条放入锅中，加入所述土豆质量4～5倍的水，煮沸至土豆酥而不烂时用纱布过滤，得到PDA培养基；加入土豆质量6.7～13.3%的琼脂融化后，再加入土豆质量6.7～13.3%的葡萄糖、0.16～0.33%的植物性蛋白胨、0.67～1.33%的干酵母片，混合搅拌均匀，补水至所述土豆质量的4～5倍，得到PDA加富培养基；然后杀菌、冷却，待用；

（2）一级菌种的纯化培养：在无菌条件下，用组织分离法取种，接入所述PDA加富培养基中，在18～20℃培养室中培养10～15天，得到纯化后的一级菌种；所述取种量与PDA加富培养基的质量比为1:15～1：30；

步骤B：制作无菌水，所述无菌水的制作，采取高压蒸汽杀菌的方法或直接用烧开水的方法制备无菌水；

步骤C：二级菌种的制备和液化

（1）由以下质量份的原料配制得到溶水性培养基：白糖150～170份、豆粕17～19份、硫酸镁26～30份、磷酸二氢钾26～30份、消泡剂1～3份、无菌水550～580份，在17～19℃混合搅拌均匀；然后将其杀菌、冷却； 

（2）二级菌种的制备：将所述溶水性培养基用紫外线照射杀菌，将所述纯化后一级菌种分切后接入杀菌后的溶水性培养基中，在20～22℃的摇床中培养8～12天，得到二级菌种；所述纯化后一级菌种与溶水性培养基的质量比为1:30～1:50；

（3）二级菌种的液化：将所述二级菌种用紫外线照射杀菌，然后粉碎；所述二级菌种粉碎至细度为80～100目；将粉碎后的二级菌种用所述无菌水稀释，稀释后即为液化菌种；粉碎后二级菌种与无菌水的质量比1:100～1:150。