CN115152532A - 一种量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法 - Google Patents

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CN115152532A CN202210644810.5A CN202210644810A CN115152532A CN 115152532 A CN115152532 A CN 115152532A CN 202210644810 A CN202210644810 A CN 202210644810A CN 115152532 A CN115152532 A CN 115152532A
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Abstract

一种量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，包括以下步骤：（1）将木屑试管母种转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养；（2）培养基满皿后，以整块培养基为单位进行筛选；（3）在筛选出的培养基中取菌种块，转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养；（4）培养基满皿后，以整块培养基为单位进行筛选；（5）在筛选出的培养基中取菌种块，转接到摇瓶液体培养基，培养，得摇瓶种；（6）筛选，获得摇瓶原种。本发明方法能够量化、可视化地获得高质量的杏鲍菇液体摇瓶原种，通过目测就能完成筛选；不同摇瓶之间生物量的一致性大幅度提高，锁状联合数目及清晰度大幅度提高；从而获得更高高质量和高产量的食用菌。

Description

一种量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法
技术领域
本发明涉及一种杏鲍菇液体摇瓶原种的生产方法，具体涉及一种可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种的生产方法。
背景技术
目前杏鲍菇生产用的有三种形式的菌种，一种是固体菌种、一种是液体菌种、一种是固体液化的还原性菌种；经过反复证实在大规模生产上，固体菌种已经满足不了大规模的工业化生产，现在大规模工厂化生产过程中基本都是液体菌种；而液化菌种属于具有潜力的新一代技术，目前还没有获得大规模应用。
虽然目前的液体菌种发展非常快，但其工艺成熟度和操作的简便程度上还存在着严重缺陷，尤其是在摇瓶液体原种阶段，没有固定、高效、简洁、可视化的操作工艺流程，在不同三角瓶之间甚至同一个三角瓶中间都有较大差异，随机性高，造成在制作发酵罐栽培种的过程中，不同罐菌种的菌丝球大小、菌丝球密度、菌丝生物量、锁状联合的清晰度和密度有较大差异，制出来的同一批菌种质量和菌丝生物量的误差较大，严重影响到最后生产出的杏鲍菇摇瓶菌种的质量和生物量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，能明显提高同一批菌种的一致性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，包括以下步骤：
（1）将木屑试管母种转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养；
（2）步骤（1）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第一次筛选；
（3）在步骤（2）筛选出的培养基中取菌种块，转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养；
（4）步骤（3）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第二次筛选；
（5）在步骤（4）筛选出的培养基中取菌种块，转接到摇瓶液体培养基，进行培养，得摇瓶种；
（6）以整个摇瓶液体培养基为单位进行摇瓶种的筛选，获得摇瓶原种；
步骤（3）中，所述转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（2）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取大小相同的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等；取菌种块相应个数的空白PDA加富平板培养基，在每个空白PDA加富平板培养基中心打一个孔洞，将每块菌种块转移到一个空白PDA加富平板培养基的中心孔洞中，将转接后的培养皿封好；
该转接方式获得的菌种块条件一致，可以规避菌丝的旺长和不一致对菌丝生长初始速度不一致的影响，做到培养基表面菌丝和培养基内菌丝生长一致，并预防过多不必要气生菌丝的产生（气生菌丝多的情况下，容易形成单核菌丝，最终影响的菌丝生长一致性和育菇产量）。提供了完全一致的起跑线，有利于筛选出最优秀的菌株。
步骤（5）中，所述转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（4）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取大小相同的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等，每个培养基取的菌种块个数相同；取培养基相应个数的装有摇瓶液体培养基的摇瓶，从一个培养基中取得的菌种块全部转接到同一个摇瓶中，不同培养基中取得的菌种块转接到不同摇瓶中，封摇瓶口。每个摇瓶对应的菌种块个数、菌种块大小完全一致，确保摇瓶开始的接种量一致。
这样筛选的出来的菌种，菌丝锁状联合的比率可增加20%以上，产量可增加百分之十左右；锁状联合是杏鲍菇等担子菌特有的特征，锁状联合多少直接关系到菌丝质量，与后面育菇的均匀一致性及产量都有直接关系。杏鲍菇菌种是生物，不可能像工业品一样，每一个出来都完全一致，只有优中选优才能够保证遗传稳定性和性状表现的一致性，预防菌种老化、退化及变异，不大量精准的对比筛选很难保障所用于生产上的菌种是最优的，最终影响到生产是否稳定；这个看似很普通的环节被大部分食用菌工厂化液体种企业所忽视，主要没有深刻认清菌种细胞核的异质性，及培养方式和环境对菌种退化变异影响的理论基础，所以很难在这个环节投入过多的关注和优化创新，最终影响到食用菌液体种生产技术成熟，及薄弱环节技术突破；发明人经过大量的定向、定量试验，终于实现了这些关键步的精准化操作。
优选地，所述PDA加富平板培养基使用的培养皿直径为70-100mm，每个培养皿倒灭菌的PDA加富培养基20-30ml。
优选地，倒完PDA加富培养基后，将每4-6个培养皿叠放成一摞，在洁净环境中让培养皿内部的水珠和水汽挥发掉。在倒培养皿时，温差难以避免，皿盖产生的水汽容易滴落到培养皿培养基表面，如果这些培养皿培养基表面或皿盖上的水分没有彻底挥发掉，接种后可能增加杂菌污染几率，同时菌丝生长出现弱菌丝现象，在观察的时候皿盖也容易影响对菌丝的观察。为了避免水汽对培养皿内部湿度环境的影响，在倒培养皿时，尽量较少温差，减少冷凝水的产生；使培养皿培养基表面光滑、无水汽、不开裂、透明度高；避免因为培养皿中的含水汽量不一致，而影响到后续菌丝生长的一致性、健壮程度、感染率，以及对菌丝观察和对比筛选。可以采用超净工作台提供洁净环境，超净工作台的净化风也可用于促进水汽和水珠快速挥发。
优选地，摇瓶液体培养基的配方为：土豆280-340g；葡萄糖20-30 g；蛋白胨3.8-4.4 g；磷酸二氢钾2.0-3.0 g；硫酸镁1.0-1.5 g；水：1000 ml。
优选地，摇瓶液体培养基的制作方法为：土豆按制作常规PDA培养基的方法在水中煮熟，取滤液；补加水到配方量，加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解均匀后分装到摇瓶中，摇瓶装液量为40~70%，把摇瓶口封好；放入高温、高压灭菌锅中，灭菌温度为123-126℃，灭菌时间为30-40min。
优选地，步骤（1）中，所述转接的过程为：在清洁无菌的环境中，从木屑试管母种中勾取绿豆粒大小的菌种块，放置到空白的PDA加富平板培养基的中心位置，将转接后的培养皿封好。
优选地，步骤（1），所述培养的方式为：把每8-11个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在22.5-24.0℃恒温培养9-12天。
优选地，步骤（3）中，所述菌种块的底面直径为5.5~6.5mm。
优选地，步骤（3）中，空白PDA加富平板培养基中心所打的孔洞直径比菌种块的底面直径大1-2mm
优选地，步骤（3）中，在培养基上取菌种块的位置符合以下条件：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为3.5-4.5cm。
优选地，步骤（3）中，每个培养基取17-18个菌种块。
优选地，步骤（3）中，所述培养的方式为：把每8-11个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在22.5-24.0℃恒温培养9-12天。
优选地，步骤（5）中，所述菌种块的底面直径为4.0-5.0mm的菌种块。
优选地，步骤（5）中，在培养基上取菌种块的位置符合以下条件：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为3.5-4.5cm。
优选地，步骤（5）中，每个培养基取8-11个菌种块。
优选地，步骤（5）中，所述培养的周期为7天，培养的温度为23.5℃-24.0℃，在黑暗条件下培养；第1天静置培养，第2~4天使用摇床，转速为120-140 r/min；第5~7天使用磁力搅拌器，转速为800-1000 r/min。
优选地，步骤（2）中，筛选的淘汰率为90-95%。
优选地，步骤（4）中，筛选的淘汰率为80-85%。
优选地，步骤（6）中，筛选的淘汰率为18-22%。
优选地，步骤（6）中，筛选的时机为结束步骤（5）的培养，静置2-4小时后。
本发明的筛选过程淘汰率总体较高，并遵循生物筛选规律淘汰率由高到低依次递减，有助于快速挑选出优良菌株。
优选地，步骤（2）和步骤（4）中，筛选标准是，以满皿速度快且在合理范围内，菌丝洁白、粗壮、浓密、有光泽、舒展度好，菌落圆整，菌落边缘整齐、无缺刻，培养皿无杂菌污染，有浓郁杏仁香味，培养基完整度好、表面光滑、无开裂的为好。
优选地，步骤（6）中，筛选标准是，以菌丝球小、液体种颜色深、菌丝球颜色深（说明菌丝球密度大）、菌丝球沉降高度一致的为好。选用菌丝量生物量一致的摇瓶做为转接发酵罐用摇瓶，经过一段时间的培养，通过菌丝球外观和菌丝球沉降情况实现筛选的可视化，在结束步骤（5）的培养后再静置2-4小时进行筛选，更容易观察到菌丝球的沉降情况。
本发明通过以上简洁、精准、定量、可视化操作的高质量制作摇瓶种的方法，规避了现有工厂化液体种摇瓶生产模式中，方法不够精准和精确，淘汰率不高，很难稳定生产出高品质、均一性、一致性好的杏鲍菇摇瓶原种的情况，而摇瓶原种质量的好坏，以及不同摇瓶之间生物量的一致性，直接决定了下一步发酵罐制栽培种质量的好坏，最终决定栽培瓶菌丝生长的一致性，以及最后杏鲍菇出菇的一致性和产量状况。发明人通过反复实践检验，得到本发明的这种规范、精准的创新工艺，能够持续，简洁，高效，可视化，可量化的生产出高质量、性状均一、生物量一致的杏鲍菇液体摇瓶原种。
本发明有益效果：
（1）本发明方法能够量化、可视化地获得高质量的杏鲍菇液体摇瓶原种，方法简单，通过目测就能完成筛选；
（2）本发明使不同摇瓶之间生物量的一致性大幅度提高，锁状联合数目及清晰度有大幅度提高；
（3）本发明方法能筛选出性状稳定的菌种，从而获得更高高质量和高产量的食用菌。
附图说明
图1是本发明实施例1所得摇瓶原种育菇得到的菇蕾生长情况图。
图2是采用常规杏鲍菇液体摇瓶种制作工艺所得摇瓶原种育菇得到的菇蕾生长情况图。
图3是按照CN104557209A的方法所得摇瓶原种育菇得到的菇蕾生长情况图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的原料，均通过常规商业途径获得。
实施例1
本实施例中所用PDA加富平板培养基使用的培养皿直径为90mm，每个培养皿倒灭菌的PDA加富培养基25ml。倒完PDA加富培养基后，将每5个培养皿叠放成一摞，在洁净环境中让培养皿内部的水珠和水汽挥发掉。
本实施例中所用摇瓶液体培养基的配方为：土豆333.3g；葡萄糖25.0g；蛋白胨4.2g；磷酸二氢钾2.5g；硫酸镁1.25g；水：1000 ml。
本实施例中摇瓶液体培养基的制作方法为：土豆按制作常规PDA培养基的方法在水中煮熟，取滤液；补加水到配方量，加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解均匀后分装到摇瓶中，摇瓶装液量为70%，把摇瓶口封好；放入高温、高压灭菌锅中，灭菌温度为126℃，灭菌时间为35min。
本实施例量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，包括以下步骤：
（1）将木屑试管母种转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养：把每10个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在23.5℃恒温培养11天；
步骤（1）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，从木屑试管母种中勾取绿豆粒大小的菌种块，放置到空白的PDA加富平板培养基的中心位置，将转接后的培养皿封好；
（2）步骤（1）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第一次筛选（淘汰率为93.3%；筛选标准：以满皿速度快且在合理范围内，菌丝洁白、粗壮、浓密、有光泽、舒展度好，菌落圆整，菌落边缘整齐、无缺刻，培养皿无杂菌污染，有浓郁杏仁香味，培养基完整度好、表面光滑、无开裂的为好）；
（3）在步骤（2）筛选出的培养基中取菌种块，转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养：把每10个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在23.5℃恒温培养11天；
步骤（3）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（2）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取17个大小相同的直径为6mm的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为4cm；取菌种块相应个数的空白PDA加富平板培养基，在每个空白PDA加富平板培养基中心打一个孔洞（直径7mm），将每块菌种块转移到一个空白PDA加富平板培养基的中心孔洞中，将转接后的培养皿封好；
（4）步骤（3）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第二次筛选（淘汰率为82.9%；筛选标准：以满皿速度快且在合理范围内，菌丝洁白、粗壮、浓密、有光泽、舒展度好，菌落圆整，菌落边缘整齐、无缺刻，培养皿无杂菌污染，有浓郁杏仁香味，培养基完整度好、表面光滑、无开裂的为好）；
（5）在步骤（4）筛选出的培养基中取菌种块，转接到摇瓶液体培养基，进行培养；培养的周期为7天，培养的温度为23.5℃，在黑暗条件下培养；第1天静置培养，第2~4天使用摇床，转速为135 r/min；第5~7天使用磁力搅拌器，转速为1000 r/min；得摇瓶种；
步骤（5）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（4）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取10个大小相同的直径为4.5mm的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为4cm，每个培养基取的菌种块个数相同；取培养基相应个数的装有摇瓶液体培养基的摇瓶，从一个培养基中取得的菌种块全部转接到同一个摇瓶中，不同培养基中取得的菌种块转接到不同摇瓶中，封摇瓶口；
（6）步骤（5）的培养结束再静置2小时后，以整个摇瓶液体培养基为单位进行摇瓶种的筛选（淘汰率为20%；筛选标准：以菌丝球小、液体种颜色深、菌丝球颜色深（说明菌丝球密度大）、菌丝球沉降高度一致的为好），获得摇瓶原种。
实施例2
本实施例中所用PDA加富平板培养基使用的培养皿直径为70mm，每个培养皿倒灭菌的PDA加富培养基25ml。倒完PDA加富培养基后，将每6个培养皿叠放成一摞，在洁净环境中让培养皿内部的水珠和水汽挥发掉。
本实施例中所用摇瓶液体培养基的配方为：土豆280g；葡萄糖30g；蛋白胨3.8 g；磷酸二氢钾2.0 g；硫酸镁1.5 g；水：1000 ml。
本实施例中摇瓶液体培养基的制作方法为：土豆按制作常规PDA培养基的方法在水中煮熟，取滤液；补加水到配方量，加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解均匀后分装到摇瓶中，摇瓶装液量为40%，把摇瓶口封好；放入高温、高压灭菌锅中，灭菌温度为123℃，灭菌时间为30min。
本实施例量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，包括以下步骤：
（1）将木屑试管母种转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养：把每8个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在22.5℃恒温培养10天；
步骤（1）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，从木屑试管母种中勾取绿豆粒大小的菌种块，放置到空白的PDA加富平板培养基的中心位置，将转接后的培养皿封好；
（2）步骤（1）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第一次筛选（淘汰率为95%；筛选标准：以满皿速度快且在合理范围内，菌丝洁白、粗壮、浓密、有光泽、舒展度好，菌落圆整，菌落边缘整齐、无缺刻，培养皿无杂菌污染，有浓郁杏仁香味，培养基完整度好、表面光滑、无开裂的为好）；
（3）在步骤（2）筛选出的培养基中取菌种块，转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养：把每9个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在22.5℃恒温培养10天；
步骤（3）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（2）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取15个大小相同的直径为5.5mm的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为3.5cm；取菌种块相应个数的空白PDA加富平板培养基，在每个空白PDA加富平板培养基中心打一个孔洞（直径6.5mm），将每块菌种块转移到一个空白PDA加富平板培养基的中心孔洞中，将转接后的培养皿封好；
（4）步骤（3）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第二次筛选（淘汰率为80%；筛选标准：以满皿速度快且在合理范围内，菌丝洁白、粗壮、浓密、有光泽、舒展度好，菌落圆整，菌落边缘整齐、无缺刻，培养皿无杂菌污染，有浓郁杏仁香味，培养基完整度好、表面光滑、无开裂的为好）；
（5）在步骤（4）筛选出的培养基中取菌种块，转接到摇瓶液体培养基，进行培养；培养的周期为7天，培养的温度为22.5℃，在黑暗条件下培养；第1天静置培养，第2~4天使用摇床，转速为140 r/min；第5~7天使用磁力搅拌器，转速为900 r/min；得摇瓶种；
步骤（5）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（4）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取11个大小相同的直径为4mm的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为4.3cm，每个培养基取的菌种块个数相同；取培养基相应个数的装有摇瓶液体培养基的摇瓶，从一个培养基中取得的菌种块全部转接到同一个摇瓶中，不同培养基中取得的菌种块转接到不同摇瓶中，封摇瓶口；
（6）步骤（5）的培养结束再静置2小时后，以整个摇瓶液体培养基为单位进行摇瓶种的筛选（淘汰率为18%；筛选标准：以菌丝球小、液体种颜色深、菌丝球颜色深（说明菌丝球密度大）、菌丝球沉降高度一致的为好），获得摇瓶原种。
实施例3
本实施例中所用PDA加富平板培养基使用的培养皿直径为100mm，每个培养皿倒灭菌的PDA加富培养基25ml。倒完PDA加富培养基后，将每4个培养皿叠放成一摞，在洁净环境中让培养皿内部的水珠和水汽挥发掉。
本实施例中所用摇瓶液体培养基的配方为：土豆340g；葡萄糖20 g；蛋白胨4.4 g；磷酸二氢钾3.0 g；硫酸镁1.0 g；水：1000 ml。
本实施例中摇瓶液体培养基的制作方法为：土豆按制作常规PDA培养基的方法在水中煮熟，取滤液；补加水到配方量，加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解均匀后分装到摇瓶中，摇瓶装液量为60%，把摇瓶口封好；放入高温、高压灭菌锅中，灭菌温度为125℃，灭菌时间为40min。
本实施例量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，包括以下步骤：
（1）将木屑试管母种转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养：把每11个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在24℃恒温培养12天；
步骤（1）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，从木屑试管母种中勾取绿豆粒大小的菌种块，放置到空白的PDA加富平板培养基的中心位置，将转接后的培养皿封好；
（2）步骤（1）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第一次筛选（淘汰率为90%；筛选标准：以满皿速度快且在合理范围内，菌丝洁白、粗壮、浓密、有光泽、舒展度好，菌落圆整，菌落边缘整齐、无缺刻，培养皿无杂菌污染，有浓郁杏仁香味，培养基完整度好、表面光滑、无开裂的为好）；
（3）在步骤（2）筛选出的培养基中取菌种块，转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养：把每8个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在24℃恒温培养12天；
步骤（3）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（2）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取18个大小相同的直径为6.5mm的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为4.5cm；取菌种块相应个数的空白PDA加富平板培养基，在每个空白PDA加富平板培养基中心打一个孔洞（直径8mm），将每块菌种块转移到一个空白PDA加富平板培养基的中心孔洞中，将转接后的培养皿封好；
（4）步骤（3）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第二次筛选（淘汰率为85%；筛选标准：以满皿速度快且在合理范围内，菌丝洁白、粗壮、浓密、有光泽、舒展度好，菌落圆整，菌落边缘整齐、无缺刻，培养皿无杂菌污染，有浓郁杏仁香味，培养基完整度好、表面光滑、无开裂的为好）；
（5）在步骤（4）筛选出的培养基中取菌种块，转接到摇瓶液体培养基，进行培养；培养的周期为7天，培养的温度为24℃，在黑暗条件下培养；第1天静置培养，第2~4天使用摇床，转速为120 r/min；第5~7天使用磁力搅拌器，转速为800 r/min；得摇瓶种；
步骤（5）转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（4）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取9个大小相同的直径为5mm的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为3.8cm，每个培养基取的菌种块个数相同；取培养基相应个数的装有摇瓶液体培养基的摇瓶，从一个培养基中取得的菌种块全部转接到同一个摇瓶中，不同培养基中取得的菌种块转接到不同摇瓶中，封摇瓶口；
（6）步骤（5）的培养结束再静置2小时后，以整个摇瓶液体培养基为单位进行摇瓶种的筛选（淘汰率为22%；筛选标准：以菌丝球小、液体种颜色深、菌丝球颜色深（说明菌丝球密度大）、菌丝球沉降高度一致的为好），获得摇瓶原种。
采用目前常规的杏鲍菇摇瓶原种的制作方法和CN104557209A（杏鲍菇液化专用菌种培养基及相应的培养法）中涉及的杏鲍菇摇瓶原种的制作方法与本发明实施例1所得摇瓶原种进行对比。方法为：分别制成液体菌种或量相当的液化菌种，每种方法制摇瓶原种六个，统一都接常规25ml的量，接种9筐144瓶，连续做三次重复，每次重复的时候都使用完全一致的栽培瓶和培养育菇条件，最后取其平均值进行效果分析，结果见表1。三种方法得到的菇蕾生长情况如图1~3所示，本发明方法所得摇瓶原种得到的菇体明显更为粗壮，不同栽培瓶之间生长情况一致。
Figure 609509DEST_PATH_IMAGE002
由表1和图1~3可知本发明方法菌丝生物量大、满瓶速度快、菇蕾生长的一致性好、产量高、菇型美观，明显优于现有的常规的杏鲍菇摇瓶原种的制作方法和液体菌种的制作方法。

Claims (10)

1.一种量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将木屑试管母种转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养；
（2）步骤（1）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第一次筛选；
（3）在步骤（2）筛选出的培养基中取菌种块，转接到空白的PDA加富平板培养基中心，进行培养；
（4）步骤（3）的PDA加富平板培养基满皿后，以整块培养基为单位进行第二次筛选；
（5）在步骤（4）筛选出的培养基中取菌种块，转接到摇瓶液体培养基，进行培养，得摇瓶种；
（6）以整个摇瓶液体培养基为单位进行摇瓶种的筛选，获得摇瓶原种；
步骤（3）中，所述转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（2）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取大小相同的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等；取菌种块相应个数的空白PDA加富平板培养基，在每个空白PDA加富平板培养基中心打一个孔洞，将每块菌种块转移到一个空白PDA加富平板培养基的中心孔洞中，将转接后的培养皿封好；
步骤（5）中，所述转接的过程为：在清洁无菌的环境中，取步骤（4）筛选出的培养基，刮除培养基表面的气生菌丝，用打孔器在每个培养基上打孔取大小相同的圆柱形菌种块，每个取菌种块的位置到接种点的距离都相等，每个培养基取的菌种块个数相同；取培养基相应个数的装有摇瓶液体培养基的摇瓶，从一个培养基中取得的菌种块全部转接到同一个摇瓶中，不同培养基中取得的菌种块转接到不同摇瓶中，封摇瓶口。
2. 根据权利要求1所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，所述PDA加富平板培养基使用的培养皿直径为70-100mm，每个培养皿倒灭菌的PDA加富培养基20-30ml；倒完PDA加富培养基后，将每4-6个培养皿叠放成一摞，在洁净环境中让培养皿内部的水珠和水汽挥发掉；摇瓶液体培养基的配方为：土豆280-340g；葡萄糖20-30 g；蛋白胨3.8-4.4 g；磷酸二氢钾2.0-3.0 g；硫酸镁1.0-1.5 g；水：1000 ml。
3.根据权利要求2所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，摇瓶液体培养基的制作方法为：土豆按制作常规PDA培养基的方法在水中煮熟，取滤液；补加水到配方量，加入葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁，溶解均匀后分装到摇瓶中，摇瓶装液量为40~70%，把摇瓶口封好；放入高温、高压灭菌锅中，灭菌温度为123-126℃，灭菌时间为30-40min。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，步骤（1）中，所述转接的过程为：在清洁无菌的环境中，从木屑试管母种中勾取绿豆粒大小的菌种块，放置到空白的PDA加富平板培养基的中心位置，将转接后的培养皿封好。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，步骤（3）中，所述菌种块的底面直径为5.5~6.5mm；空白PDA加富平板培养基中心所打的孔洞直径比菌种块的底面直径大1-2mm；在培养基上取菌种块的位置符合以下条件：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为3.5-4.5cm；每个培养基取17-18个菌种块。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，步骤（5）中，所述菌种块的底面直径为4.0-5.0mm的菌种块；在培养基上取菌种块的位置符合以下条件：菌种块所在圆柱的上底面圆到接种点的最远距离为3.5-4.5cm；每个培养基取8-11个菌种块。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（3）中，所述培养的方式为：把每8-11个培养皿叠放成一摞，放到一个干净塑料袋中，在22.5-24.0℃恒温培养9-12天。
8. 根据权利要求1~7中任一项所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，步骤（5）中，所述培养的周期为7天，培养的温度为23.5℃-24.0℃，在黑暗条件下培养；第1天静置培养，第2~4天使用摇床，转速为120-140 r/min；第5~7天使用磁力搅拌器，转速为800-1000 r/min。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，步骤（2）中，筛选的淘汰率为90-95%；步骤（4）中，筛选的淘汰率为80-85%；步骤（6）中，筛选的淘汰率为18-22%；步骤（6）中，筛选的时机为结束步骤（5）的培养，静置2-4小时后。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的量化、可视化的杏鲍菇液体摇瓶原种生产方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（4）中，筛选标准是，以满皿速度快且在合理范围内，菌丝洁白、粗壮、浓密、有光泽、舒展度好，菌落圆整，菌落边缘整齐、无缺刻，培养皿无杂菌污染，有浓郁杏仁香味，培养基完整度好、表面光滑、无开裂的为好；步骤（6）中，筛选标准是，以菌丝球小、液体种颜色深、菌丝球颜色深、菌丝球沉降高度一致的为好。
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