CN104557210B - 金针菇液化专用菌种培养基及相应的培养法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金针菇液化专用菌种培养基，其由以下重量份的成分组成：玉米淀粉50‑60份、葡萄糖1‑2份、小麦纤维素5‑10份、细麸皮25‑30份、酵母浸膏1‑1.5份、牛肉蛋白胨1‑1.5份、磷酸二氢钾2‑3份、硫酸镁1‑1.5份、水100份。本发明还同时提供了利用上述培养基进行的金针菇液化菌种培养法，依次进行以下步骤：将金针菇液化专用菌种培养基进行灭菌，于无菌条件下在灭菌后培养基中接入金针菇母种，17～19℃黑暗培养19～21天，得液化专用固体菌种；将液化专用固体菌种液化处理，得金针菇液化菌种。
Description
技术领域
本发明涉及一种金针菇液化专用菌种配方和培养法。
背景技术
食用菌是中国最具现代农业发展特征的优势产业之一。这不仅因为中国是世界最大的食用菌生产和消费国，食用菌生产量大面广，而且更重要的是食用菌产业在生物技术产业化和农业可持续发展中的良好载体和突出地位。目前我国的食用菌产业体系，有很多不适应全球市场经济的要素，其中最主要的是产业经营的集约化、专业化程度低，生产要素落后，生产工艺不尽完善，缺乏关键技术的支撑，其中最具代表性的是菌种的集约化高效繁育技术，成了产业面临的主要瓶颈。目前普遍采用的传统三级固体菌种繁育工艺，生产效率低，培养周期长，菌种染菌率高，无法突破手工化、作坊式低效生产模式，使规模企业与散户制种处在同一竞争平台，这是造成目前食用菌生产安全、质量事故频发的主要根源，也是食用菌企业效益欠佳的主要原因。国外如日本、韩国食用菌工厂化生产中目前已普遍采用液体菌种技术，而我国在此领域缺乏规模化生产成功的经验与技术，所以加强菌种在规模化生产中应用的研发，利用现代生物科技和生物工程技术，实现菌种(菌袋)的高效繁育已迫在眉睫。
传统三级固体菌种繁育工艺有3步(试管母种-瓶装原种-瓶装栽培种)：第1级为试管母种，配方为PDA为主(去皮鲜马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20、水1000ml)，培养时间7-15天(根据菇种而异，金针菇一般为7-9天)，1支母种转接5瓶原种。第2级为瓶装原种(750ml)，配方以木屑、麸皮培养基为主(如香菇原种配方细木屑78％、麸皮20％、白糖1％、石膏1％，含水量60％)，培养时间45-60天(根据菇种而异)，1瓶原种可转接50瓶栽培种。第3级为瓶装栽培种(750ml)，配方以木屑、麸皮培养基为主(同原种配方，培养时间35-45天(根据菇种而异)，1瓶栽培种(湿重600克培养料)可转接20个出菇袋，每袋出菇袋需要固体菌种30克。上述3级种工艺全程培养周期87-120天。该方法所得的菌种按照常规的接种出菇袋法培育鲜菇时染菌率一般为5-10％。备注说明：上述固体菌种在原种(第2级)、栽培种(第3级)阶段由于培养时间长，培养环境差，加上封口不规范，会在发满菌丝的成品菌种表面隐形染菌，这种隐性感染的菌种被接种后，会变成显性的污染(此时杂菌比食用菌菌丝生长快)。所以现有固体菌种风险很大，且很难避免。
目前现有的食用菌液体发酵菌种(也称深层发酵)工艺流程为3步(试管母种-三角瓶摇床发酵液体原种-发酵罐深层发酵液体栽培种)：第1级为母种，(制作法同前)培养时间7-15天(根据菇种而异，金针菇一般为7-9天)，1支母种转接2-3瓶三角瓶摇床发酵液体原种(200ml)。第2级为三角瓶摇床发酵液体原种(500ml三角瓶中放入200ml培养液)，配方以去皮鲜马铃薯、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨等为主，摇床培养时间7-10天(根据菇种而异)，1瓶液体原种可转接2000ml的3级发酵罐培养液(10％接种量)。第3级为发酵罐深层发酵液体栽培种，配方同三角瓶摇床液体原种培养基，发酵需专用深层发酵罐或发酵系统，培养时间3-5天(根据菇种而异)，1升液体菌种可转接100个出菇袋。上述液体菌种繁育工艺全程培养周期17-30天。该方法所得的菌种按照常规的接种出菇袋法培育鲜菇时染菌率一般为2-5％。备注说明：液体发酵菌种工艺理论上菌种纯度高，大规模发酵生产的染菌率在1％-5％之间(3级发酵罐中)，加上染菌(细菌性为主)往往在发酵后期，常规在线检验很难发现，导致用液体发酵菌种接种产生大批量出菇袋污染的生产事故，教训惨痛。另外，液体菌种由于培养需用高浓度的有机氮和糖源等营养成分，这些成分残留在菌液中被接入出菇袋，由于操作时不可避免有杂菌带入，所以残留的营养就成为了杂菌的温床，增加了出菇袋接种后的污染风险。这是液体发酵菌种不能大规模应用于食用菌生产的主要问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种培养周期短、菌种质量高的金针菇液化专用菌种培养基及所相应的培养法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种金针菇液化专用菌种培养基，其由以下重量份的成分组成：
作为本发明的金针菇液化专用菌种培养基的改进，其由以下重量份的成分组成：
本发明还同时提供了上述培养基的制备法，包括如下步骤：
将玉米淀粉、细麸皮(小麦麸皮)、小麦纤维素混合均匀，得配料Ⅰ；
将葡萄糖、酵母浸膏、牛肉蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁加入水中，充分搅拌(使葡萄糖、酵母浸膏、牛肉蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解于水中)，得配料Ⅱ；
将配料Ⅰ和配料Ⅱ充分混合后，得金针菇液化专用菌种培养基。
本发明还同时提供了利用上述培养基进行的金针菇液化菌种培养法，将金针菇母种依次进行以下步骤：
1)、菌种制作：
将金针菇液化专用菌种培养基装入培养瓶中，盖好微孔膜透气盖，高温高压灭菌(即在121℃、0.11Mpa下进行高温高压灭菌90分钟)；得灭菌后培养基；
备注说明：可选用上海颂拓实业有限公司ZP14-200透气培养瓶，其自带微孔膜透气盖。
按照每200g的金针菇液化专用菌种培养基对应4.8～5.2g(较佳为5g)金针菇母种的接种量，于无菌条件下在灭菌后培养基中接入金针菇母种，17～19℃(较佳为18℃)黑暗培养19～21天(较佳20天)，得液化专用固体菌种；此时菌丝发满全瓶；
备注说明：
1、金针菇母种按照常规技术即可获得；
2、为了证明本发明所得液化专用固体菌种的纯度和种性，可对步骤1)所得的液化专用固体菌种进行以下检验：
①、纯度检验，包括霉菌检验、细菌检验，采用显微镜检验和常规细菌检验标准；
霉菌的检测种类为：木霉、青霉；
细菌的检测种类为：枯草芽孢杆菌。
②、活力检验，采用ttc法；
③、感官检验：包括无原基形成(即，没有幼小的菇蕾形成)、培养瓶盖完整密封、标签正确等。
2)、液化菌种制备：
将液化专用固体菌种在无菌条件下先经高速均质(于8000～10000转/分的转速下均质1～1.5分钟)，然后按照1:100的稀释度(即，在1重量份的液化专用固体菌种中加入99重量份的无菌水；备注说明：属于二级稀释)稀释，稀释后的所得物(pH自然为6.5-7.0)在稀释罐内于温度为20-23℃、通气比为1：0.4(v/v/min)的条件下液化4～6分钟(较佳为5分钟)；得金针菇液化菌种。
本发明所得的金针菇液化菌种，液化菌种菌丝碎片多，分散度好(经400倍显微镜检测，每个视野有菌丝细胞120个)，活力强(TTC-脱氢酶还原法检测：0.2g待测样品+2ml0.5％TTC-PBS(PH＝8.0)，40℃恒温水浴染色2h，再加入5ml无水乙醇室温萃取1h，萃取液吸光值OD485值，备注：0.40-0.50为合格)，在接种量30ml/瓶时，可获得满意的发菌效果。备注说明：接种量30ml/瓶是指向每个待接种的金针菇出菇袋中接入30ml的液化菌液(即，本发明所得的金针菇液化菌种)，培育后所得的是金针菇鲜菇产品。
本发明的金针菇液化菌种培养法与传统三级固体菌种繁育工艺相比，具有如下技术优势：
本发明的工艺为2大步(试管母种-瓶装液化专用种)，第1步为母种(制作法同上述现有技术)；第2步为液化专用菌种(200ml)，培养时间20天左右，然后只需进行稀释液化5分钟左右即可。因此，工艺全程培养周期27-29天。每瓶液化专用固体菌种(200克)经液化，成20升菌液，可转接600多个出菇袋(每袋接30ml菌液)，每袋出菇袋需要固体菌种0.3克。接种效率是传统固体菌种的100倍。
本发明的金针菇液化菌种培养法与现有的液体发酵的最大区别是：采用2步种源培养法，周期短、工艺简单；同时由于用种量是固体菌种的1/100，所以菌种使用前可对每瓶种源进行纯度、活力和种性的检验，从而标准菌种源的质量(液体菌种使用前做不到在线检验，风险极大)；第三是本发明的液化菌种出菇袋时无需培养(液体菌种需要3-5天发酵培养)，使用简单、设备投资省，更关键的是菌液只含纯菌丝，没有培养基(只有无菌水)，所有杜绝了接种后菌液带丰富营养而导致的次生性污染，提高接种成品率和出菇袋的纯度(这在固体三级菌种和液体发酵菌种中是做不到的)。
本发明所得的液化专用固体菌种在5℃环境(清洁干燥的冰箱即可)下可保存30天，而上述液体发酵菌种不能保存，发酵完成后要立即使用。
本发明的有益效果如下：
本发明的金针菇液化专用菌种和液化接种技术，由于分散性好，菌丝活力强，可更快发满栽培袋，液化菌种满袋时间(即，步骤1)的黑暗培养时间)比固体菌种缩短1/3左右；且污染率低，满袋后菌袋失重率低，菌丝活力强。产量与品质比使用固体菌种接种的优势明显。既解决了种源的培育，简化了工艺，减少了接种用量，更为重要的是，它有效地解决了菌丝在液化培养基中大小不均匀的问题，提高了菌液的质量和活力，并符合了快速接种的要求，总体减少接种环节成本50％以上。
综上所述，发明人对金针菇菌种品质形成关键技术、菌瓶(袋)规模化高效繁育进行了新技术研究，发明了一种金针菇液化专用菌种培养基和相应的培养技术，用该发明生产的液化专用固体菌种周期短，菌丝生长旺盛，活力强，生产成本低，经液化后用于栽培瓶或栽培袋，接种后多点发菌，菌丝生长迅速，成品率高，接种效率是传统固体菌种的50倍-100倍，是一种高效、稳定、可靠的菌种模式，特别适宜金针菇工厂化集约生产方式模式。
具体实施方式
实施例1、一种金针菇液化专用菌种培养基，其由以下重量份的成分组成：
上述培养基的制备法为依次进行如下步骤：
在不锈钢容器中，将玉米淀粉、细麸皮(小麦麸皮)、小麦纤维素在干燥条件下混合均匀，得配料Ⅰ；
将葡萄糖、酵母浸膏、牛肉蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁加入水中，充分搅拌(使葡萄糖、酵母浸膏、牛肉蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解于水中)，得配料Ⅱ；
将配料Ⅰ和配料Ⅱ充分混合后，得金针菇液化专用菌种培养基。
备注说明：该金针菇液化专用菌种培养基现配现用。
实施例2、利用实施例1所得的培养基进行的金针菇液化菌种培养法，将金针菇母种依次进行以下步骤：
1)、菌种制作：
将现配好的金针菇液化专用菌种培养基200g立即分装到200ml的专用培养瓶中，盖好微孔膜透气盖(选用上海颂拓实业有限公司ZP14-200透气培养瓶)，在121℃、0.11Mpa下进行高温高压灭菌90分钟；得灭菌后培养基；
于无菌条件下在上述灭菌后培养基中接入金针菇母种(固体母种)5克，18℃黑暗培养20天，得液化专用固体菌种；此时菌丝发满全瓶。
经检验，纯度为100％；
经检测，木霉、青霉等霉菌没有被测到；
经检测，枯草芽孢杆菌等细菌没有被测到；
采用ttc法检测所得的活力数据为OD485值0.45；
感官检验结果为：无原基形成，培养瓶盖完整密封，标签正确。
2)、液化菌种制备：
将液化专用固体菌种在无菌条件下先经高速均质(于1万转/分的转速下均质液化1分钟)，然后按照1:100的稀释度(属于二级稀释)稀释，稀释后的所得物(pH6.5，菌丝体)在稀释罐内于温度为20℃、通气比为1：0.4(v/v/min)的条件下液化5分钟；得金针菇液化菌种。
实验1、将本发明的金针菇液化菌种和现有的固体菌种、液体发酵菌种按照常规的接种出菇袋法培育金针菇鲜菇，所得结果对比如下表1：
表1、金针菇液化菌种与固体菌种、液体发酵菌种接种出菇袋效果比较
从上述表1的数据对比，可知，本发明的金针菇液化菌种远远优于现有技术所得的固体菌种和液体发酵菌种。
对比例1-1、
将实施例1中的金针菇液化专用菌种培养基的配方作如下更改：
取消小麦纤维素10份的使用，并相应的将玉米淀粉由51份增加至61份；其余等同于实施例1。
对比例1-2、
将实施例1中的金针菇液化专用菌种培养基的配方作如下更改：
将“小麦纤维素10份”改成“木质素10份”，其余等同于实施例1。
对比例1-3、
将实施例1中的金针菇液化专用菌种培养基的配方作如下更改：
将“小麦纤维素10份”改成“木屑10份”，其余等同于实施例1。
利用上述对比例1-1～对比例1-3的培养基用于实施例2所述金针菇液化菌种培养法，为了使步骤1)实现菌丝发满全瓶所需的时间，以及所得的金针菇液化菌种按照上述实验1的常规的接种出菇袋法培育金针菇鲜菇，所得结果对比如下述表2所示：
表2
| 项目 | 实施例 | 对比例1-1 | 对比例1-2 | 对比例1-3 |
| 菌种液化率％ | 100 | 100 | 90 | 65 |
| 污染率％ | 0 | 9 | 11 | 8 |
| 菌丝满袋时间d | 20 | 33 | 26 | 35 |
| 失重率％ | 1 | 2 | 2 | 2 |
| 菌丝体特性 | 浓 | 较浓 | 一般 | 一般 |
| 头潮菇形成时间(天) | 42 | 53 | 57 | 55 |
| 单产g/袋 | 282 | 252 | 248 | 225 |
| 生物学效率％ | 94 | 84 | 82 | 75 |
对比例2-1、
将实施例2中的“2)、液化菌种制备：”作如下更改：
将稀释度由“1:100”改成“1:1”；其余等同于实施例2。
结果为：菌种无法进行后续的液化，成黏胶状。液化菌种失败！
对比例2-2、
将实施例2中的“2)液化菌种制备：”作如下更改：
将稀释度由“1:100”改成“1:200”；其余等同于实施例2。
对比例2-3、将实施例2中的“2)液化菌种制备：”作如下更改：
将通气比由“1：0.4”改成“1：0.2”；其余等同于实施例2。
对比例2-4、将实施例2中的“2)液化菌种制备：”作如下更改：
将通气比由“1：0.4”改成“1：0.6”；其余等同于实施例2。
对比例3-1、
将实施例2中的“1)、菌种制作”作如下更改：
将培养温度由“18℃”改成“20℃”；其余等同于实施例2。
对比例3-2、
将实施例2中的“1)、菌种制作”作如下更改：
将培养温度由“18℃”改成“16℃”；其余等同于实施例2。
将上述对比例2-2～对比例3-2所得的金针菇液化菌种按照上述实验1所述的常规的接种出菇袋法培育金针菇鲜菇，所得结果对比如下述表3所示：
表3
备注说明：
将实施例2步骤1)所得的液化专用固体菌种于5℃环境(清洁干燥的冰箱)下保存30天，然后继续进行后续的步骤2)。
所得的金针菇液化菌种按照上述实验1所述的常规的接种出菇袋法培育金针菇鲜菇，所得结果基本同表1中“液化菌种(本发明)”所得的结果(差距不超过5％)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.金针菇液化专用菌种培养基，其特征是由以下重量份的成分组成：
2.如权利要求1所述培养基的制备方法，其特征是包括如下步骤：
将玉米淀粉、细麸皮、小麦纤维素混合均匀，得配料Ⅰ；
将葡萄糖、酵母浸膏、牛肉蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁加入水中，充分搅拌，得配料Ⅱ；
将配料Ⅰ和配料Ⅱ充分混合后，得金针菇液化专用菌种培养基。
3.利用权利要求1所述的培养基进行的金针菇液化菌种培养法，其特征是：将金针菇母种依次进行以下步骤：
1)、菌种制作：
将金针菇液化专用菌种培养基装入培养瓶中，盖好微孔膜透气盖，高温高压灭菌，得灭菌后培养基；
按照每200g的金针菇液化专用菌种培养基对应4.8～5.2g金针菇母种的接种量，于无菌条件下在灭菌后培养基中接入金针菇母种，17～19℃黑暗培养19～21天，得液化专用固体菌种；
2)、液化菌种制备：
将液化专用固体菌种在无菌条件下先经高速均质，然后按照1:100的稀释度稀释，稀释后的所得物在稀释罐内于温度为20-23℃、通气比为1：0.4(v/v/min)的条件下液化4～6分钟；得金针菇液化菌种。
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