CN110036829A - 一种平菇固体液化菌种的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固体培养料，其原料组成为：木屑粉1％～20％，玉米芯粉1％～30％，淀粉40～80％，玉米粉10～30％；料水比为1：0.8～1.5。本发明还公开了一种平菇固体液化菌种的制备方法，包括将经匀浆处理的平菇母种加入到固体培养料中进行培养，得固体菌种；然后将固体菌种用无菌水进行匀浆处理，再用无菌水稀释20‑30倍，即得平菇固体液化菌种。本发明固体培养料以易被菌丝分解的淀粉和玉米粉为主，无需过滤，适于制备固体液化菌种；用本发明方法制种时间短；菌液渗透性好且生长均匀；菌丝活性高且生长速度快；菌种污染率低，可长途运输；本发明菌种制备只需三角瓶、玻璃瓶等设备，操作简单且成本低，无需专门培训。

Description

一种平菇固体液化菌种的制备方法

技术领域

本发明属于食用菌栽培领域，具体涉及一种用于制备平菇固体液化菌种的固体培养料；还涉及一种平菇固体液化菌种的制备方法。

背景技术

平菇曾是我国年产量第一的食用菌，但是由于销售价格和耐贮性等不如香菇和黑木耳，故近几年平菇的年产量下滑至第三位。我国消费者要求平菇子实体盖大、柄短，而要满足这一需求，必须在出菇时二氧化碳浓度低，即环境通风好，而工厂化栽培很难满足这一要求，因此，我国的平菇栽培几乎全部是农业式栽培。我国的平菇栽培以固体菌种为主，但是用固体菌种存在生产周期长、菌龄不一致、出菇不整齐、管理不便和生产成本高等缺点，因此，亟待用其他菌种取代固体菌种。

利用发酵罐生产的液体菌种由于具有生产周期短、菌丝生长快、菌龄一致、出菇整齐等优点等受到越来越多的重视，但是液体菌种存在如下缺点：(1)一次性投入大，对设备要求高；(2)操作难度较高，需要专门培训；(3)在液体中透气性差，菌丝易因缺氧而衰老，故液体菌种保存期短；(4)液体培养基营养丰富，易受到杂菌污染，污染率高；(5)液体菌种运输不便，因此只能在当地生产，当时使用；(6)液体菌种质量检测难，需要一定的检测设备；(7)生产规模要大，只适于集约化、工厂化大规模生产；(8)一个发酵罐每次只能培养一个品种，如果同时栽培多品种，则要多投入发酵罐，或者错时生产；(9)生产成本高。上述缺点限制了液体菌种在平菇农业式栽培上的应用。

针对发酵罐制作液体菌种时存在的缺点，日本起源生物技术株式会社等开发出“还原型液体菌种”，即将发酵罐培养的菌丝体浓缩后装入无菌保鲜盒，在无菌条件下打碎纯菌丝体，再用无菌水稀释而成，稀释后即刻使用，不需要进行培养。但是此种方法存在如下缺点：发酵罐培养的菌丝体，分泌的酶通常为胞外酶，存在于培养液中，菌丝体经过浓缩后，胞外酶绝大部分丢失；另外菌丝体菌种被打碎后，菌丝受伤，打碎后直接接种，料面菌丝萌发的时间要比发酵罐菌种慢至少2-3天，这样对培养室环境就有很高的要求；另外，纯菌丝体菌种必需从专业的食用菌公司购买。这些缺点对液体菌种在平菇农业式栽培上的应用仍然构成较大的限制。

专利《食用菌固体液化菌种的制作方法》(CN104718996A)公开了一种制备制备固体液化菌种的方法，但是其存在如下缺点：(1)该发明固体培养料中锯末为60-70％，锯末的质地硬且比例比较高，不能被菌丝彻底分解，粉碎后会产生大量不可溶解的残渣，稀释后只能采取逐个倒入菌包的方法进行接种，这样接种效率会非常低；(2)固体菌种粉碎过程中会产生热量，菌种会因被烧死造成损失；而且固体菌丝含水量超过60％，也不能粉碎太细；(3)粉碎后用100目筛过滤，100目的孔径为0.15mm，这种孔径下菌丝是很难过滤的；(4)由于锯末的吸附效应，大量菌丝会吸附在过滤的残渣上而被丢掉造成损失；(5)食用菌菌丝很难利用培养料中的锯末，导致这种固体液化菌种制作时间长达20-30天，菌龄长的菌种老化厉害，且菌种上下不均匀。

发明内容

针对用液体菌种栽培平菇时存在的资金投入高、操作复杂、易污染等问题，本发明目的在于提供一种用于制备平菇固体液化菌种的固体培养料。

本发明另一目的在于提供上述固体培养料的制备方法。

本发明第三目的在于提供一种平菇固体液化菌种的制备方法。

为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：

本发明一种用于制备平菇固体液化菌种的固体培养料，其原料组成成分及其重量百分比为：木屑粉1％～20％，玉米芯粉1％～30％，淀粉40～80％，玉米粉10～30％；料水比为1：0.8～1.5。

上述固体培养料，其原料组成成分及其重量百分比优选为：木屑粉1％～5％，玉米芯粉1％～5％，淀粉60％～80％，玉米粉20％～30％；料水比为1：0.8～0，9。

上述固体培养料，其原料组成成分及其重量百分比优选为：木屑粉1％，玉米芯粉1％，淀粉78％，玉米粉20％；料水比为1：0.8。

上述固体培养料的制备方法，包括按照比例将木屑粉、玉米芯粉、淀粉和玉米粉混合均匀，然后按照料水比加水，并混合均匀；再在126℃下灭菌30min，即得固体培养料。

本发明还提供了一种平菇固体液化菌种的制备方法，包括如下步骤：

(1)固体培养料的制备：按照如下重量百分比比例称取木屑粉1％～20％，玉米芯粉1％～30％，淀粉40～80％，玉米粉10～30％，然后将它们混合均匀；再按照料水比为1：0.8～1.5的比例加入水，混合均匀，得固体培养料；取固体培养料200～300g，装入规格为1L的三角瓶中，用硅胶塞封口；将三角瓶在126℃下灭菌30min，然后在洁净处趁热摇散，冷却至室温；

(2)在无菌条件下，取一个直径为9cm的平菇母种平板，将平板上的全部菌丝和琼脂块转入规格为250ml的三角瓶中，加入无菌水90～110g，匀浆处理，得匀浆液；

(3)在无菌条件下，按照每千克培养料加入匀浆液100～150ml的比例将步骤(2)中所得匀浆液加入步骤(1)的三角瓶中，摇匀；然后在23～28℃、黑暗条件下培养8～10天，得固体菌种；

(4)在无菌条件下，向步骤(3)的装有固体菌种的三角瓶中加入无菌水，加入无菌水的量为高出固体菌种表面2～3cm；将固体菌种进行匀浆，得菌种浆液；

(5)对所得菌种浆液进行细菌污染检测，检测结果呈现菌液澄清透明的，即为没有被细菌污染的合格的菌种浆液；

(6)无菌条件下，将细菌检测合格的步骤(4)的菌种浆液加入到装有无菌水的容器中，用无菌水稀释20～50倍，并在容器中加入1-2个磁力搅拌子，然后在121℃下灭菌30min，冷却；同时用磁力搅拌器搅拌菌液，以使菌液均匀，即得平菇固体液化菌种。

上述制备方法，其步骤(1)中所述固体培养料的原料组成成分及其重量百分比优选为：木屑粉1％～5％，玉米芯粉1％～5％，淀粉60％～80％，玉米粉20％～30％；料水比为1：0.8～0，9。

上述制备方法，其步骤(1)中所述固体培养料的原料组成成分及其重量百分比优选为：木屑粉1％，玉米芯粉1％，淀粉78％，玉米粉20％；料水比为1：0.8。

上述制备方法步骤(5)中所述的细菌污染检测，按照如下方法进行：取菌种浆液1～2ml接种至100ml细菌检测培养基中，在37℃下培养24h；检测结果呈现菌液澄清透明的，即为没有被细菌污染的合格的菌种浆液。

所述的细菌检测培养基的组成成分及其比例为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000ml。所述的细菌检测培养基按照常规方法制备。

上述制备方法步骤(6)中所述的容器是指小口带盖的不锈钢桶或玻璃瓶。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明固体培养料以淀粉和玉米粉为主，它们能够短时间内被菌丝彻底分解而无残留，适合用于制备固体液化菌种；而现有的固体培养料多以锯末和玉米芯粉等木质纤维素多的材料为主，不易被菌丝分解，会产生大量残渣，不适于用于制备固体液化菌种。另外，本发明固体培养料中有少量木屑粉和玉米芯粉，它们能诱导菌丝分泌分解木质纤维素所需要的酶类(如漆酶)，木屑粉和玉米芯粉量少而且细，所得菌种浆液不需要过滤，直接用无菌水稀释即可。(2)采用固体培养时透气性好，菌丝活性比用发酵罐液体培养时高。(3)本发明液化菌种直接由固体菌种液化而来，固体培养基中的酶活性保持较好，匀浆处理后渗透性好，萌发点多，故接种后菌种发菌速度快，菌丝生长旺盛，比发酵罐液体菌种接种菌包时长满菌包的时间快3天左右。(4)本发明固体液化菌种的污染率低。本发明固体液化菌种制备过程中经过细菌检测这一步骤，可以有效排除菌种污染带来的高污染；用本发明固体液化菌种接种的菌包，污染率接近于0。(5)本发明液化菌种制作简单，成本低，只接种1个品种时，制作成本只有使用发酵罐时的1/3。(6)本发明适于在投入很低的情况下同时栽培多个品种。本发明中，栽培多个菌株，只需要多培养些三角瓶固体菌种，多配套几个稀释用的无菌水瓶，就可以做到多个品种同时栽培，成本很低。若使用发酵罐，则需要多购置发酵罐，成本会大增。接种多个品种时，本发明固体液化菌种的制作成本只有使用发酵罐时制作液体菌种成本的1/10左右。

(7)本发明方法操作简单。本发明操作人员，只需要掌握基本的微生物无菌操作知识，实际观看一次就能掌握操作过程，无需专门的技术培训。(8)本发明制作的固体菌种适合远距离运输。本发明的固体菌种装在三角瓶中，在三角瓶塞不打开的状态下，可在28℃以下、1周内在全国范围内运输，在栽培场所匀浆稀释后用于接种。而用发酵罐制作的液体菌种不适于运输，只能现场使用；日本发明的还原型液体菌种因为菌丝中无营养、而且作为包装的无菌保鲜盒不透气，要求低温(5℃)下运输，难以长时间保存。

附图说明：

图1为平菇在不同比例组分组成的固体培养料上生长7天的菌落对比照片；其中1～8为不同比例组分组成的固体培养料。

图2为接种后生长8天长满三角瓶的平菇固体菌种照片；其中1-3为在相同本发明固体培养料下、相同条件下培养的三个重复。

图3为本发明平菇固体菌种匀浆成液体菌种的照片；其中1为固体菌种；2为匀浆后的菌种浆液。

图4本发明固体液化菌种与发酵罐液体菌种接种菌包后12天的菌包对比照片；其中1为使用本发明固体液化菌种；2为使用发酵罐液体菌种。

具体实施方式

以下通过实例对本发明作进一步说明，但是对本发明不构成任何限制。

实施例1适于制备平菇固体液化菌种的固体培养料筛选试验

按照如下方法进行：

(1)按照表1所示比例称取木屑粉、玉米芯粉、淀粉和玉米粉，然后混合均匀；取混合均匀的培养料100g放入规格为250ml的三角瓶中，再按照表1中所示的料水比加入水，混合均匀，在121℃下灭菌30min，即得固体培养料。

(2)在超净工作台中趁热将(1)中各不同配方的固体培养料转入直径为9cm的无菌培养皿中，尽量压平，冷却备用，每个配方3个重复。

(3)取一个直径9cm平菇母种培养皿，用打孔器沿菌落边缘打直径5mm菌块，将菌块转接到(2)的无菌培养皿中央，用封口膜封口。

(4)将培养皿置于培养箱中，在25℃、黑暗条件下培养7天，观察菌落大小、长势。

表1平菇固体培养料的组成成分及其比例

结果(见图1)接种平菇母种后，各组分不同比例组成的固体培养料中都有菌丝生长，但是生长速度差异很大，其中编号为8的固体培养料的培养皿中的菌丝生长效果最佳，菌丝长满了培养皿；其次是编号为7和6的固体培养料，菌丝接近长满培养皿。而编号为2和3的固体培养料的培养皿中的菌丝生长速度较慢，主要是因为木屑和玉米芯粉中木质纤维素含量较高，平菇不容易利用。上述结果说明在组成成分为木屑粉为1-5％、玉米芯粉1-5％、淀粉为60-78％、玉米粉为20-30％时的固体培养料上平菇菌丝生长速度较快，尤其在编号为8的组成成分为木屑粉1％、玉米芯粉1％、淀粉78％、玉米粉20％，料水比1：0.8的固体培养料上菌丝生长速度最快、生长效果最好。

实施例2利用本发明固体培养料制作平菇固体菌种试验

按照如下方法进行:

(1)固体培养料的制备：按照重量百分比比例称取木屑粉1％，玉米芯粉1％，淀粉78％，玉米粉20％，混匀，再按照料水比为1：0.8的比例加入水，混匀，装入1L的三角瓶中，装入量为600g/瓶，用硅胶塞封口。将三角瓶在126℃下灭菌30min；灭菌后在超净工作台趁热摇散，冷却至室温，待用。

(3)在超净工作台中，取一个直径为9cm的平菇母种培养皿中的菌种，用解剖刀全部转入装有100g无菌水的规格为250ml的三角瓶中，匀浆处理，得匀浆液。

(4)在超净工作台中，将匀浆液加入(2)中的三角瓶中，每瓶固体培养料加入匀浆液80g，摇匀；将三角瓶在25℃、黑暗条件下培养8天，菌丝长满三角瓶，即为平菇固体菌种。

结果(见图2)利用本发明固体培养料仅用8天即长满菌丝，远快于GB19172-2003平菇菌种中规定的平菇原种25-30天长满容器，栽培种20-25天的标准，即标准的平菇固体菌种准备时间需要50天以上。而用发酵罐培养的菌种制种时间也要十多天，均比本发明固体菌种制种时间长。本发明固体菌种制种时间短，主要是采用了容易被利用的淀粉类为主料，另外，经过匀浆处理后的平菇母种渗透性极佳，菌液接入固体培养料后几乎全部都是萌发点，因而8天就能长满，上述结果说明利用本发明固体培养料以及对母液进行匀浆处理，使菌丝生长速度快，制种时间大大缩短。

实施例3本发明平菇固体液化菌种的制备试验

(1)超净工作台中，将无菌水加入装有实施例2的固体菌种的三角瓶(见图3-1)中，无菌水没过培养料表面2-3cm，匀浆处理，将固体菌种打成浆，以底部看不到大颗粒为止，得菌种浆液(见图3-2)。

(2)在超净工作台中，取菌种浆液1ml，转入装有100ml细菌检测培养基(其组成成分及其比例为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000ml，121℃30min灭菌)中。在三角瓶口盖上硅胶塞，置于冷库(1-4℃)中冷藏；将接入菌种浆液的细菌检测培养基在37℃振荡或静置培养24h，观测检测结果。结果菌种检测中呈现清澈透明的，即为没有受到细菌污染的，是合格的菌种浆液。

(3)在无菌条件下，用无菌水将细菌检测合格的菌种浆液稀释30倍，即得平菇固体液化菌种。

(4)取步骤(3)所得的液化菌种25ml，接种到灭菌后的的菌包中，菌包中培养料重量为1.1kg；同时用发酵罐发酵培养的液体菌种接种菌包作为对照，接种后将菌包在洁净环境下，在23℃、黑暗条件下培养12天。

结果(见图4)接种本发明固体液化菌种后长满菌包的时间为12天，而接种用发酵罐培养的液体菌种在12天时还没有长满，到第15天才长满，说明本发明固体液化菌种菌丝活性高、接种后菌丝生长速度快；其次，本发明经匀浆处理后的液化菌种渗透性好、萌发点多，菌丝在菌包中生长均匀；相对地，用发酵罐培养的液体菌种不仅生长速度慢，而且渗透性差，在菌包中菌丝生长不均匀，在菌包中上下生长不一致。另外，由于本发明每瓶菌种浆液不多，所以经过检测合格的菌种浆液样品，可以保证被检测的菌种浆液以及稀释后所得的固体液化菌种污染率为0；而由于发酵罐中菌液量大，即使少量取样检测合格，也不敢保证菌液没有受到细菌污染。还有制备本发明固体液化菌种时所需设备仅是三角瓶和玻璃瓶等，操作简单且成本很低，还不需培训，简单看一下就会操作，机动灵活；而用发酵罐培养则成本高，操作比较麻烦，需要专门培训。

Claims (10)

1.一种用于制备平菇固体液化菌种的固体培养料，其特征在于其原料组成成分及其重量百分比为：木屑粉1％～20％，玉米芯粉1％～30％，淀粉40～80％，玉米粉10～30％；料水比为1：0.8～1.5。

2.根据权利要求1所述的固体培养料，其特征在于其原料组成成分及其重量百分比为：木屑粉1％～5％，玉米芯粉1％～5％，淀粉60％～80％，玉米粉20％～30％；料水比为1：0.8～0，9。

3.根据权利要求1所述的固体培养料，其特征在于其原料组成成分及其重量百分比为：木屑粉1％，玉米芯粉1％，淀粉78％，玉米粉20％；料水比为1：0.8。

4.权利要求1-3所述的固体培养料的制备方法，其特征在于包括按照比例将木屑粉、玉米芯粉、淀粉和玉米粉混合均匀，然后按照料水比加水，并混合均匀；再在126℃下灭菌30min，即得固体培养料。

5.一种平菇固体液化菌种的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)固体培养料的制备：按照如下重量百分比比例称取木屑粉1％～20％，玉米芯粉1％～30％，淀粉40～80％，玉米粉10～30％，然后将它们混合均匀；再按照料水比为1：0.8～1.5的比例加入水，混合均匀，得固体培养料；取固体培养料200～300g，装入规格为1L的三角瓶中，用硅胶塞封口；将三角瓶在126℃下灭菌30min，然后在洁净处趁热摇散，冷却至室温；

(2)在无菌条件下，取一个直径为9cm的平菇母种平板，将平板上的全部菌丝和琼脂块转入规格为250ml的三角瓶中，加入无菌水90～110g，匀浆处理，得匀浆液；

(3)在无菌条件下，按照每千克培养料加入匀浆液100～150ml的比例将步骤(2)中所得匀浆液加入步骤(1)的三角瓶中，摇匀；然后在23～28℃、黑暗条件下培养8～10天，得固体菌种；

(4)在无菌条件下，向步骤(3)的装有固体菌种的三角瓶中加入无菌水，加入无菌水的量为高出固体菌种表面2～3cm；将固体菌种进行匀浆，得菌种浆液；

(5)对所得菌种浆液进行细菌污染检测，检测结果呈现菌液澄清透明的，即为没有被细菌污染的合格的菌种浆液；

(6)无菌条件下，将细菌检测合格的步骤(4)的菌种浆液加入到有无菌水的容器中，用无菌水稀释20～50倍，并在容器中加入1-2个磁力搅拌子，然后在121℃下灭菌30min，冷却；同时用磁力搅拌器搅拌菌液，以使菌液均匀，得平菇固体液化菌种。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述固体培养料的原料组成成分及其重量百分比为：木屑粉1％～5％，玉米芯粉1％～5％，淀粉60％～80％，玉米粉20％～30％；料水比为1：0.8～0，9。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述固体培养料的原料组成成分及其重量百分比为：木屑粉1％，玉米芯粉1％，淀粉78％，玉米粉20％；料水比为1：0.8。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的细菌污染检测，按照如下方法进行：取菌种浆液1～2ml接种至100ml细菌检测培养基中，在37℃下培养24h；检测结果呈现菌液澄清透明的，即为没有被细菌污染的合格的菌种浆液。

9.根据权利要求5或8所述的制备方法，其特征在于所述的细菌检测培养基的组成成分及其比例为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000ml。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(6)中所述的容器是指小口带盖的不锈钢桶或玻璃瓶。