CN102697790A - 化合物和释放前列环素类似物的方法 - Google Patents

化合物和释放前列环素类似物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明广泛涉及前列环素类似物及其用于促进血管舒张、抑制血小板聚集和血栓形成、刺激血栓溶解、抑制细胞增殖(包括血管重建)、提供细胞保护作用、预防动脉粥样硬化形成及诱导血管生成的方法。一般而言，经口给药时，本发明化合物和方法提高了曲前列环素(treprostinil)的口服生物利用度和循环浓度。本发明化合物具有式(I)。
Figure DSA00000721150100011

Description

化合物和释放前列环素类似物的方法
本申请是申请号为200910178738.6(申请日为2004年5月24日)、发明名称为“化合物和释放前列环素类似物的方法”的中国申请的分案申请，其中该申请号为200910178738.6的中国申请是申请号为200480020569.9(国际申请日为2004年5月24日)、发明名称为“化合物和释放前列环素类似物的方法”的进入国家阶段的PCT申请的分案申请。
技术领域
本发明普遍涉及前列环素类似物及其用于促进血管舒张、抑制血小板聚集和血栓形成、刺激血栓溶解、抑制细胞增殖(包括血管重建)、提供细胞保护作用、预防动脉粥样硬化形成及诱导血管生成的方法。通过这些模拟前列环素的机制，本发明化合物可用于治疗：肺动脉高血压、缺血性疾病(例如外周血管疾病、雷诺现象、硬皮病、心肌缺血、缺血性中风、肾机能不全)、心力衰竭(包括充血性心力衰竭)、需要抗凝作用的病症(例如MI后、心脏手术后)、血栓性微血管病，体外循环、视网膜中央静脉阻塞，动脉粥样硬化、炎性疾病(例如COPD、银屑病)、高血压(例如先兆子痫)、生殖和分娩，癌症或其他不调节细胞生长、细胞/组织保护和前列环素治疗似乎具有有益作用的其他新兴治疗领域的病症。这些化合物也可显示附加或与其他心血管药(例如钙通道阻断剂、磷酸二酯酶抑制剂、内皮拮抗剂、抗血小板药)联合的协同作用。
背景技术
许多有价值的药理活性化合物由于各种原因不能有效地口服，而一般通过静脉内或肌内途径给药。这些给药途径一般需要医生或其他卫生保健专业人员的干预，并可使患者遭受相当的不便以及潜在的局部创伤。
该化合物的一个实例为曲前列环素(treprostinil)，为前列环素的一种化学稳定类似物。虽然曲前列环素钠被食品和药品管理局(FDA)批准用于皮下给药，而作为游离酸的曲前列环素具有小于10％的绝对口服生物利用度。因此，有经口提供曲前列环素的临床需要。
因此，对通过给予曲前列环素或曲前列环素类似物增加全身利用度的安全并有效的方法存在需求。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了具有结构I的化合物、其对映异构体、其药学上可接受的盐以及多晶型物：
Figure BSA00000721150400021
其中，
R1独立选自H、取代和未取代苄基和其中OR1为取代或未取代氨甲酰基甲酯(glycolamide)的基团；
R2和R3可相同或不同，且独立选自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白质酯的基团，条件是R1、R2和R3不全部为H。
在某些实施方案中，R1为取代或未取代苄基，例如CH2C6H5。在其他实施方案中，OR1为取代或未取代氨甲酰基甲酯，R1为-CH2CONR4R5，R4和R5可相同或不同，且独立选自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，条件是m为0、1、2、3或4，n为0、1、2、3或4。在某些实施方案中，R4和R5之一或两者独立选自H、-OH、-CH3或-CH2CH2OH。在任一前述实施方案中，R2和R3之一或两者可为H。在该化合物的某些对映异构体中，R1＝R2＝R3＝H，或R2＝R3＝H及R1＝缬氨酰胺。
在本发明化合物的还再一些实施方案中，R2和R3独立选自磷酸酯基和其中OR2和OR3为氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基团。在某些化合物中，R2或R3中只有一个为磷酸酯基。在其他化合物中，R2和R3独立选自其中OR2和OR3为氨基酸酯例如甘氨酸酯或丙氨酸酯的基团。在任一上述实施方案中，R2和R3之一为H。在某些本发明化合物中，化合物的口服生物利用度大于曲前列环素的口服生物利用度，例如至少比曲前列环素口服生物利用度大50％或100％。上述化合物还可包含p-糖蛋白转运抑制剂。这些化合物的任一种也可进一步包含药学上可接受的赋形剂。
本发明也提供使用上述化合物的治疗方法，该方法用于治疗：肺动脉高血压、缺血性疾病、心力衰竭、需要抗凝作用的病症、血栓性微血管病，体外循环、视网膜中央静脉阻塞，动脉粥样硬化、炎性疾病、高血压、生殖和分娩，癌症或其他不调节细胞生长、细胞/组织保护和其他前列环素治疗似乎具有有益作用的其他新兴治疗领域的病症。一个优选的实施方案为治疗患者的肺动脉高血压和/或外周血管疾病的方法，该方法包括经口给予药学有效量的结构II化合物及其对映异构体、药学上可接受的盐或多晶型物：
Figure BSA00000721150400031
其中，
R1独立选自H、取代和未取代烷基、芳烷基和其中OR1形成取代或未取代氨甲酰基甲酯的基团；
R2和R3可相同或不同，且独立选自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白质酯的基团，条件是R1、R2和R3不全部为H。
在某些方法中，当OR1形成取代或未取代氨甲酰基甲酯时，R1为-CH2CONR4R5，其中R4和R5可相同或不同，且独立选自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，条件是m为0、1、2、3或4，n为0、1、2、3或4。在其他方法中，R1为C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基或丁基。在这些公开的方法中，R1也可为取代或未取代苄基。在其他方法中，R1可为-CH3或-CH2C6H5。在还一些其他方法中，R4和R5可相同或不同，且独立选自H、OH、-CH3和-CH2CH2OH。在又一些其他方法中，R2和R3之一或两者为H。或者，R2和R3之一或两者不为H，R2和R3独立选自磷酸酯基和其中OR2和OR3为氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基团。在某些方法中，R2或R3中只有一个为磷酸酯基。在另外一些方法中，R2和R3独立选自其中OR2和OR3为氨基酸酯例如甘氨酸酯或丙氨酸酯的基团。在再一些方法中，R1和R2之一为H。在某些方法中，使用化合物的对映异构体，其中R1＝R2＝R3＝H，或R2＝R3＝H及R1＝缬氨酰胺。
在各种方法中，化合物的口服生物利用度比曲前列环素口服生物利用度大，例如至少比曲前列环素口服生物利用度大50％或100％。本发明的方法也可包括同时、序贯给予药学有效量的p-糖蛋白抑制剂与结构II化合物，或在给予结构II化合物之前给予药学有效量的p-糖蛋白抑制剂。在某些实施方案中，p-糖蛋白抑制剂经口或静脉内给药。这些公开的方法可用于治疗肺动脉高血压。
本发明也提供提高曲前列环素或其药学上可接受的盐的口服生物利用度的方法，该方法包括给予患者药学有效量的p-糖蛋白抑制剂及口服给予药学有效量的曲前列环素。在某些实施方案中，p-糖蛋白抑制剂在给予曲前列环素之前给予或与曲前列环素同时给予。p-糖蛋白抑制剂的给药途径可不同，例如可口服或静脉内给药。本发明也提供包含曲前列环素或其药学上可接受的盐及p-糖蛋白抑制剂的组合物。
本发明化合物也可局部给药或经皮给药。
本发明提供了药用制剂，该制剂包括任一上述化合物与药学上可接受载体的组合。
上述化合物也可用于治疗癌症。
通过下列详细的描述，本发明进一步的目的、特征及优势将是显而易见的。
附图简述
图1A和1B分别表示如实施例1所描述的静脉内和门静脉内给予大鼠曲前列环素二乙醇胺盐的血浆浓度对时间曲线；
图2A、2B和2C分别表示如实施例1所描述的经十二指肠内、结肠内和经口给予大鼠曲前列环素二乙醇胺盐的血浆浓度对时间曲线；
图3表示对数标度(scle)实施例1中所描述给药途径的平均血浆浓度对时间曲线；
图4图示如实施例2中所描述的经口给予大鼠曲前列环素甲酯后，大鼠中曲前列环素的血浆浓度对时间曲线；
图5图示如实施例2中所描述的经口给予大鼠曲前列环素苄酯后，大鼠中曲前列环素的血浆浓度对时间曲线；
图6图示如实施例2中所描述的经口给予大鼠曲前列环素二甘氨酸酯后，大鼠中曲前列环素的血浆浓度对时间曲线；
图7图示如实施例2中所描述的经口给予大鼠曲前列环素苄酯(0.5mg/kg)及曲前列环素二甘氨酸酯(0.5mg/kg)后，与曲前列环素(1mg/kg)相比大鼠中曲前列环素的血浆浓度对时间曲线；
图8图示如实施例3中所描述的经十二指肠内给予大鼠曲前列环素单磷酸酯(环状)后，大鼠中曲前列环素的血浆浓度对时间曲线；
图9图示如实施例3中所描述的经十二指肠内给予大鼠曲前列环素单缬氨酸酯(环状)后，大鼠中曲前列环素的血浆浓度对时间曲线；
图10图示如实施例3中所描述的经十二指肠内给予大鼠曲前列环素单丙氨酸酯(环状)后，大鼠中曲前列环素的血浆浓度对时间曲线；
图11图示如实施例3中所描述的经十二指肠内给予大鼠曲前列环素单丙氨酸酯(链状)后，大鼠中曲前列环素的血浆浓度对时间曲线；及
图12图示仅与实施例1的曲前列环素相比的各前药平均血浆浓度对时间曲线，如实施例3中所描述。曲前列环素以1mg/kg给药，而前药以0.5mg/kg给药。
图13A-13D分别表示剂量，每两小时给药，四个剂量，每个剂量0.05mg(合计＝0.2mg)、每个剂量0.125mg(合计＝0.5mg)、每个剂量0.25mg(合计＝1.0mg)或每个剂量0.5mg(合计＝2.0mg)。
图14表示禁食和进食状态下的UT-15C缓释片和缓释胶囊的药代动力学曲线。
图15表示多晶型物A的X射线粉末衍射图谱。
图16表示多晶型物A的IR光谱。
图17表示多晶型物A的拉曼(Raman)光谱。
图18表示多晶型物A的热数据。
图19表示多晶型物A的吸湿数据。
图20表示多晶型物B的X射线粉末衍射图谱。
图21表示多晶型物B的热数据。
图22表示多晶型物B的吸湿数据。
发明详述
除非另外说明，否则“一个(种)”表示“一个(种)或多个(种)”本发明提供在患者体内诱导前列环素样作用的化合物和方法。本文中提供的化合物可配制成用于本发明方法中的药用制剂和药物。本发明也提供此类化合物在制备药物和药用制剂中的用途，及此类化合物在治疗如在发明领域中所描述的、与前列环素活性不足相关的生物学病症中的用途。本发明也提供治疗癌症和癌症相关疾病的化合物及方法。
在某些实施方案中，本发明化合物为具有下列结构的(+)-曲前列环素的化学衍生物：
曲前列环素为前列环素化学上稳定的类似物，本身是有效的血管舒张剂和血小板聚集抑制剂。曲前列环素钠盐，即(1R，2R，3aS，9aS)-[[2，3，3a，4，9，9a-六氢-2-羟基-1-[(3S)-3-羟辛基]-1H-苯并[f]茚-5-基]氧基]乙酸单钠盐，以
Figure BSA00000721150400072
注射液销售，已经被食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗肺动脉高血压。在某些实施方案中，本发明化合物为(-)-曲前列环素的衍生物、(+)-曲前列环素的对映异构体。本发明一个优选的实施方案为曲前列环素的二乙醇胺盐。本发明还包括上述化合物的多晶型物，有两种晶型，晶型A和晶型B，将在下述实施例中描述。在这两种晶型中，优选晶型B。本发明一个特别优选的实施方案为晶型B曲前列环素二乙醇胺。
在某些实施方案中，本发明化合物一般被归为曲前列环素的前药，它例如通过摄取给予患者后转化为曲前列环素。在某些实施方案中，前药本身具有很少活性或无活性，仅在被转化成曲前列环素后显示活性。在某些实施方案中，本发明化合物通过将曲前列环素用化学方法衍生制成稳定的酯制备，而在某些情况下，化合物从羟基衍生化。本发明化合物也可通过以相似的方式修饰美国专利号4,306,075和5,153,222中的化合物来提供。
在一个实施方案中，本发明提供了结构I化合物及其对映异构体和药学上可接受的盐：
Figure BSA00000721150400081
其中，
R1独立选自H、取代和未取代苄基和其中OR1为取代或未取代氨甲酰基甲酯的基团；
R2和R3可相同或不同，且独立选自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白质酯的基团，条件是R1、R2和R3不全部为H。
在某些实施方案中，其中OR1为取代或未取代氨甲酰基甲酯，R1为-CH2CONR4R5，R4和R5可相同或不同，且独立选自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，条件是m为0、1、2、3或4，n为0、1、2、3或4。
本领域技术人员也将容易地认识到：以普通方式将各成员分组，例如以马库什(Markush)组方式或以上下文中结构I和II的R所描述的组方式，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，也包括单个组的各成员及所有主要组可能的亚组。因此，对于所有目的，本发明不仅包括主要组，也包括缺少一个或多个组成员的主要组。本发明也预期直接排除一个或多个所要求保护发明中的任一组成员。例如，R1可特定地排除H、取代和未取代苄基，或其中OR1为取代或未取代氨甲酰基甲酯的基团。
在某些实施方案中，R1为取代或未取代苄基，例如-CH2C6H5、-CH2C6H4NO2、-CH2C6H4OCH3、-CH2C6H4Cl、-CH2C6H4(NO2)2或-CH2C6H4F。苄基可以是邻位、间位、对位、邻位/对位取代及其组合。芳环上合适的取代基包括卤素(氟、氯、溴、碘)、-NO2基团、其中R16为H或C1-C4烷基的-OR16基团及其组合。
或者，当R1为-CH2CONR4R5，那么R4和R5可相同或不同，且独立选自H、OH、-CH3和-CH2CH2OH。在这些化合物中，其中R1不为H，通常R2和R3之一或两者为H。
在某些实施方案中，R2和R3之一或两者为H，R1为-CH2CONR4R5，R4和R5之一或两者为H、-OH、-CH3、-CH2CH2OH。
在其中R2和R3之一或两者不为H的化合物中，R2和R3可独立选自磷酸酯基和其中OR2和OR3为氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基团。在某些实施方案中，R2或R3中只有一个为磷酸酯基。在其中R2和R3中至少一个不为H的化合物中，通常R1为H。在另外的实施方案中，R2和R3之一为H，因此结构I化合物仅在R2和R3之一上衍生化。在特定的化合物中，R2为H，R3如上所定义。在另外的实施方案中，R1和R3为H，R2为其中OR2为氨基酸酯或二肽酯的基团。在再一些实施方案中，R1和R2为H，R3为其中OR3为氨基酸酯或二肽酯的基团。
当OR2和OR3基团之一或两者形成氨基酸酯或肽酯即二肽酯、三肽酯或四肽酯时，它们通常可表示为-COCHR6NR7R8，其中R6选自氨基酸侧链，R7和R8可相同或不同，且独立选自H和-COCHR9NR10R11。通常，提及氨基酸或肽指天然存在的氨基酸或肽，或氨基酸或肽的L-异构体。然而，本发明化合物和方法不限于此，D-异构体氨基酸残基可取代某些或所有L-氨基酸。类似地，也可使用D-和L-异构体的混合物。在其中氨基酸为脯氨酸的实施方案中，R7与R6一起形成吡咯烷环结构。R6可为任一天然存在的氨基酸侧链，例如-CH3(丙氨酸)、-(CH2)3NHCNH2NH(精氨酸)、-CH2CONH2(天冬酰胺)、-CH2COOH(天冬氨酸)、-CH2SH(半胱氨酸)、-(CH2)2CONH2(谷氨酰胺)、-(CH2)2COOH(谷氨酸)、-H(甘氨酸)、-CHCH3CH2CH3(异亮氨酸)、-CH2CH(CH3)2(亮氨酸)、-(CH2)4NH2(赖氨酸)、-(CH2)2SCH3(蛋氨酸)、-CH2Ph(苯丙氨酸)、-CH2OH(丝氨酸)、-CHOHCH3(苏氨酸)、-CH(CH3)2(缬氨酸)、
Figure BSA00000721150400101
-(CH2)3NHCONH2(瓜氨酸)或-(CH2)3NH2(鸟氨酸)。Ph指定为苯基。
在上述化合物中，R7和R8可相同或不同，并且选自H和-COCHR9NR10R11，其中R9为氨基酸的侧链，R10和R11可相同或不同，并且选自H和-COCHR12NR13R14，其中R12为氨基酸侧链，R13和R14可相同或不同，并且独立选自H和-COCHR15NH2。本领域技术人员将认识到：肽链可以按下列方案延伸至所需要的长度并包括所需要的氨基酸残基。
在其中OR2和OR3基团之一或两者形成肽酯例如二肽酯、三肽酯、四肽酯等的实施方案中，肽可为均肽(homopeptide)，即重复相同的氨基酸，例如精氨酰-精氨酸，或者可为杂肽(heteropeptide)，即由不同的氨基酸组合组成。杂二肽的实例包括丙氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-谷氨酰胺、赖氨酰-精氨酸等。
熟练的技术人员可理解，当仅一个R7和R8包含连接更多氨基酸的肽键，例如二、三和四肽时，所产生的肽链将是直链。当R7和R8均包含肽键时，那么该肽可以是支链。
在本发明化合物的还一些其他实施方案中，R1为H，R2或R3之一为磷酸酯基或H，而另一个R2或R3为OR2或OR3为氨基酸酯例如甘氨酸酯或丙氨酸酯的基团。
本发明也提供了这些化合物药学上可接受的盐以及这些化合物的药用制剂。
一般而言，与游离酸形式或其盐形式的曲前列环素口服生物利用度相比，本文中所描述的化合物具有更高的口服生物利用度。与曲前列环素的口服生物利用度相比，本文所描述的化合物具有至少25％、50％、100％、200％、400％或更高的口服生物利用度。当口服给药时，这些化合物的绝对口服生物利用度的范围可在10％、15％、20％、25％、30％及40％、45％、50％、55％、60％或更高。相比而言，曲前列环素的绝对口服生物利用度大约为10％，虽然曲前列环素钠经皮下输注给药的绝对生物利用度接近为100％。
本领域技术人员可理解，为了任何和所有目的，特别是在提供书面说明书方面，本文中公开的所有范围，特别是本文中所描述的生物利用度范围也包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。仅作为一个实例，20％-40％的范围可分成20％-32.5％和32.5％-40％、20％-27.5％和27.5％-40％等的范围。任何所列出的范围可容易地认为是充分描述并且能使相同范围分成至少二等分、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限定性实例，本文中所讨论的各范围可容易地分成下端三分之一、中间三分之一和上端三分之一等。本领域技术人员也将理解，所有语言例如“最高达”、“至少”、“大于”、“少于”、“多于”等包括所列举的数字并指可进一步分成如上所讨论的子范围的范围。同样地，本文中公开的所有比率也包括在更宽比率范围内的所有子比率。
这些化合物可以通过化合物将是生物可利用的任何途径以有效量给药，包括口服和肠胃外途径。这些化合物可静脉内给药、局部给药、皮下给药、鼻内给药、直肠给药、肌内给药、透皮给药或通过其他肠胃外途径给药。口服给药时，这些化合物可以任何方便的剂型给药，包括例如胶囊剂、片剂、液体制剂、混悬剂等。
试验表明曲前列环素接触皮肤时可产生刺激。相反，本文中公开的某些化合物，一般为曲前列环素的前药，不刺激皮肤。因此，本发明化合物更适于局部或透皮给药。
当给予患者时，上述化合物、特别是结构I化合物是前列环素样化合物，用于治疗其中前列环素显示有益的血管舒张和/或血小板聚集抑制或其他疾病的病症或疾病，例如用于治疗肺动脉高血压。因此，本发明提供诱导患者产生前列环素样作用的方法，该方法包括给予有该治疗需要的患者药学有效量的一种或多种本文中描述的化合物，例如上述结构I的那些化合物，优选口服给药。作为实例，本发明化合物的血管舒张作用可用于治疗肺动脉高血压，该病由各种形式的结缔组织疾病，例如狼疮、硬皮病或混合结缔组织疾病引起。这些化合物因此用于肺动脉高血压的治疗。
在另一个实施方案中，本发明也提供通过给予药学有效量的结构II化合物及其对映异构体和药学上可接受的盐促进患者产生前列环素样作用的方法：
Figure BSA00000721150400121
其中，
R1独立选自H、取代和未取代烷基、芳烷基和其中OR1形成取代或未取代氨甲酰基甲酯的基团；
R2和R3可相同或不同，且独立选自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白质酯的基团，条件是R1、R2和R3不全部为H。
在其中OR1形成取代或未取代氨甲酰基甲酯的基团中，R1可为-CH2CONR4R5，其中R4和R5可相同或不同，且独立选自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，条件是m为0、1、2、3或4，n为0、1、2、3或4。
在其他诱导血管舒张或治疗高血压的方法中，R1可为C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基或丁基。在其他方法中，R1为取代或未取代苄基，例如-CH2C6H5、-CH2C6H4NO2、-CH2C6H4OCH3、-CH2C6H4Cl、-CH2C6H4(NO2)2或-CH2C6H4F。苄基可以是邻位、间位、对位、邻位/对位取代及其组合。芳环上合适的取代基包括卤素(氟、氯、溴、碘)、-NO2基团、其中R16为H或C1-C4烷基的-OR16基团及其组合。
或者，当R1为-CH2CONR4R5，那么R4和R5可相同或不同，且独立选自H、OH、-CH3和-CH2CH2OH。在这些方法中，其中R1不为H，通常R2和R3之一或两者为H。
在某些实施方案中，R2和R3之一或两者为H，R1为-CH3、-CH2C6H5。在其他方法中，当R2和R3之一或两者为H，那么R1为-CH2CONR4R5，R4和R5之一或两者为H、-OH、-CH3、-CH2CH2OH。
在其中R2和R3之一或两者不为H的方法中，R2和R3可独立选自磷酸酯基和其中OR2和OR3为氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基团。在某些实施方案中，R2或R3中只有一个为磷酸酯基。在其中R2和R3中至少一个不为H的方法中，通常R1为H。在其他方法中，R2或R3之一为H，而另一个R2或R3如本文中别处所定义。在某些方法中，R2为H，而R3不为H。在另外的实施方案中，R1和R3为H，而R2为其中OR2为氨基酸酯或二肽酯的基团。在再一些实施方案中，R1和R2为H，R3为其中OR3为氨基酸酯或二肽酯的基团。
在其中OR2和OR3基团之一或两者形成氨基酸酯或肽酯即二肽酯、三肽酯或四肽酯的方法中，这些肽通常可表示为-COCHR6NR7R8，其中R6选自氨基酸侧链，R7和R8可相同或不同，且独立选自H和-COCHR9NR10R11。在其中氨基酸为脯氨酸的实施方案中，R7与R6一起形成吡咯烷环结构。R6可为任一天然存在的氨基酸侧链，例如-CH3(丙氨酸)、-(CH2)3NHCNH2NH(精氨酸)、-CH2CONH2(天冬酰胺)、-CH2COOH(天冬氨酸)、-CH2SH(半胱氨酸)、-(CH2)2CONH2(谷氨酰胺)、-(CH2)2COOH(谷氨酸)、-H(甘氨酸)、-CHCH3CH2CH3(异亮氨酸)、-CH2CH(CH3)2(亮氨酸)、-(CH2)4NH2(赖氨酸)、-(CH2)2SCH3(蛋氨酸)、-CH2Ph(苯丙氨酸)、-CH2OH(丝氨酸)、-CHOHCH3(苏氨酸)、-CH(CH3)2(缬氨酸)、
Figure BSA00000721150400141
-(CH2)3NHCONH2(瓜氨酸)或-(CH2)3NH2(鸟氨酸)。Ph指定为苯基。
在上述方法中，R7和R8可相同或不同，并且选自H和-COCHR9NR10R11，其中R9为氨基酸的侧链，R10和R11可相同或不同，并且选自H和-COCHR12NR13R14，其中R12为氨基酸侧链，R13和R14可相同或不同，并且独立选自H和-COCHR15NH2。本领域技术人员将认识到：肽链可以按下列方案延伸至所需要的长度并包括所需要的氨基酸残基。
在其中OR2和OR3基团之一或两者形成肽酯例如二肽酯、三肽酯、四肽酯等的实施方案中，肽可为均肽，即重复相同的氨基残极，或者可为杂肽，即由氨基酸的不同组合组成。
熟练的技术人员可理解，当仅R7和R8之一包含连接更多氨基酸的肽键，例如二、三和四肽时，所产生的肽链将是直链。当R7和R8均包含肽键时，那么肽可以是支链。
在还一些其他方法中，R1为H，R2或R3之一为磷酸酯基或H，而另一个R2或R3为OR2或OR3为氨基酸酯例如甘氨酸酯或丙氨酸酯的基团。
在某些方法中，所给予的化合物可具有至少是曲前列环素口服生物利用度25％、50％、100％、200％、400％的口服生物利用度。通常优选给予具有更高绝对口服生物利用度的化合物，例如当口服给药时，其绝对口服生物利用度为15％、20％、25％、30％及40％、45％、50％、55％、60％或更高。
曲前列环素也被发现可以如2001年12月10日递交的美国专利申请顺序号10/006,197和2002年1月16日递交的顺序号10/047,802中所公开的那样抑制癌细胞的转移，这两个专利申请通过引用结合到本申请中。因此，上述化合物、特别是那些结构I和II的化合物也可用于癌症和癌症相关疾病的治疗，因此本发明提供治疗癌症的药用组合物和方法。使用本发明化合物的合适制剂和方法可通过用本发明化合物，例如结构I和II的化合物、特别是曲前列环素的前药替代2002年1月16日递交的美国专利申请顺序号10/006,197和10/047,802中公开的活性化合物来实现。
下列结构I和II化合物的合成可按下列方法完成：
注：以下光谱数据中；“and”表示“和”；“adjacent to”表示“邻近”；
曲前列环素甲酯(2)和曲前列环素二磷酸酯的合成
Figure BSA00000721150400161
曲前列环素甲酯(2)的合成
曲前列环素甲酯(2)通过用50ml干燥盐酸的饱和甲醇溶液处理1.087g(2.8mmol)的曲前列环素(1)制备。室温反应24小时后，蒸发甲醇至干，并将残渣溶于200ml二氯甲烷。二氯甲烷溶液用10％碳酸钾水溶液洗涤，然后用水冼至中性pH，用硫酸钠干燥，过滤并真空除去溶剂，以98％的产率得到黄色油状曲前列环素甲酯(2)。在随后的反应中未处理直接使用该粗甲酯。
曲前列环素二磷酸酯(4)的合成
采用Steroids，2(6)，567-603(1963)中的方法。将曲前列环素甲酯(2)(60mg，0.15mmol)溶于2ml无水吡啶，于40℃真空浓缩先前制备的1M 2-氰基乙基磷酸吡啶
Figure BSA00000721150400162
的吡啶盐溶液(0.3ml，0.3mmol)(参考Enzymology，1971，18(c)，54-57中的方法)至干。加入无水吡啶，再浓缩该反应混合物；重复该操作两次以完全除去水。最后将残渣溶于2ml无水吡啶，并加入190mg(0.9mmol)二环己基碳二亚胺的2ml无水吡啶溶液。于室温磁力搅拌密闭烧瓶中的反应混合物48小时。加入1ml水，一小时后，真空浓缩该混合物至稠膏状。用3ml含35mg氢氧化钠的1/9水/甲醇溶液，于室温处理该反应混合物过夜。滤去形成的白色固体(二环己基脲)并用水充分洗涤。真空浓缩该水-甲醇溶液几乎至干，加入水，用正丁醇(3×2ml)、然后用二氯甲烷(1×2ml)萃取该溶液。通过用磺酸型离子交换树脂(H+循环-Dowex)处理，调节该溶液的pH至9.0，用Dowex树脂处理更长时间(～12小时)导致TBDMS基团的裂解和游离羧基的恢复。将树脂过滤并浓缩该溶液至干，得到相应的二磷酸酯4(43mg，产率52％)。
曲前列环素3′-单磷酸酯(8)和曲前列环素2-单磷酸酯(10)的合成
Figure BSA00000721150400171
单TBDMS保护曲前列环素甲酯(5和6)的合成
采用Org.Synth.，1998，75，139-145中的方法。将曲前列环素甲酯(2)(305.8mg，0.75mmol)溶于15ml无水二氯甲烷中，将该溶液在冰浴中冷却至0℃。加入咪唑(102mg，1.5mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(226.2mg，1.5mmol)，该混合物维持于0℃搅拌30分钟，然后室温搅拌过夜。加入水(25ml)并分离有机层。然后用二氯甲烷(3×50ml)萃取水层。有机层用Na2SO4干燥，溶液过滤并真空除去溶剂，得到447mg粗反应产物。该粗反应产物经柱层析分离(硅胶，35％乙酸乙酯/己烷)，得到140mg双-TBDMS保护的曲前列环素甲酯、160mg 2-TBDMS保护的曲前列环素甲酯(6)和60mg 3′-TBDMS保护的曲前列环素甲酯(5)。
曲前列环素单磷酸酯8/10的合成
采用Steroids，1963，2(6)，567-603中的方法，(8)和(10)的方法相同，起始原料分别为(6)和(5)。将TBDMS保护的曲前列环素甲酯(6)(46mg，0.09mmol)溶于2ml无水吡啶中，于40℃真空浓缩先前制备的1M2-氰基乙基磷酸吡啶的吡啶盐溶液(0.2ml，0.2mmol)(参考Enzymology，1971，18(c)，54-57中的方法)至干。加入无水吡啶，再浓缩该反应混合物；重复该操作两次以完全除去水。最后将残渣溶于2ml无水吡啶，加入116mg(0.56mmol)二环己基碳二亚胺的2ml无水吡啶溶液。于室温、黑暗、磁力搅拌密闭烧瓶中的反应混合物48小时。加入5ml水，一小时后，真空浓缩该混合物至稠膏状。用10ml含100mg氢氧化钠的1/9水/甲醇溶液，于室温处理该反应混合物过夜。滤去形成的白色固体(二环己基脲)并用水充分洗涤。真空浓缩该水-甲醇溶液几乎至干，加入水，用正丁醇(3×10ml)、然后用二氯甲烷(1×10ml)萃取该溶液。通过用磺酸型离子交换树脂(H+循环-Dowex)处理，调节该溶液的pH至9.0；用Dowex树脂处理更长时间(～12小时)导致TBDMS基团裂解和游离羧基的恢复。将树脂过滤并浓缩溶液至干，得到相应的单磷酸酯8(33mg，产率68％)。
曲前列环素甲酯(2)的合成
将(2)(1g；2.56mmol)加入到预先用氯化氢气体饱和的甲醇(50ml)中，旋转该混合物得到澄清溶液，室温放置过夜。真空除去溶剂，残留物用20％碳酸钾溶液中和，用二氯甲烷萃取。有机层用水洗涤，无水硫酸镁干燥并蒸发，得到粗产物(0.96g)。经制备薄层层析(tlc)纯化(硅胶板；展开剂：7∶3(v/v)己烷-乙酸乙酯)，得到2(0.803；77.5％)，无色油状物。
三曲前列环素(Tritreprostinil)二乙醇胺(UT-15C)的合成
将曲前列环素酸溶于1∶1摩尔比率的乙醇∶水混合物中，加入二乙醇胺并使溶解。加热该溶液，在冷却过程中加入丙酮作为反溶剂。
曲前列环素甲酯二甘氨酸酯(12)的合成
Figure BSA00000721150400201
向磁力搅拌下的(2)甲酯2(0.268g；0.66mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中依次加入N-苄氧羰基甘氨酸对硝基苯基酯(0.766g；2.32mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(250mg；2.05mmol)。于20℃搅拌所得黄色溶液24小时，然后用5％氢氧化钠溶液(20ml)处理，继续搅拌15分钟。加入二氯甲烷(50ml)，分离各层，有机相用5％氢氧化钠溶液(6×20ml)、水(30ml)、10％盐酸(2×40ml)、5％碳酸氢钠溶液(40ml)洗涤，无水硫酸钠干燥。除去溶剂后得到浅黄色粘稠油状粗产物(11)(0.61g)。经闪式硅胶柱层析纯化，9/1-1/2(v/v)己烷-乙醚梯度洗脱，得到0.445g(85.3％)11，白色结晶，
m.p.70-72℃.‘Fl-NMR[CDCl3；δ(ppm)]：3.786(s)(3H，COOCH 3)，3.875(d)(2H)and 3.940(d)(2H)(NH-CH 2-COO)，4.631(s)(2H，OCH 2COOCH3)，4.789(m)(1H，adjacent to OOC-CH2NHcbz)and 4.903(m)(1H，adjacent toOOCCH2NHcbz)，5.09(s)(4H，C6H5CH 2O)，5.378(m)(1H)and 5.392(m)(1H)(NH)，7.295-7.329(m)(10H，C6H5).LR ESI-MS(m/z)：787.1[M+H]+，804.1[M+NH4]+，809.3[M+Na]+，825.2[M+K]+，1590.5[2M+NH4]+，1595.6[2M+Na]+.
甲酯二甘氨酸酯(12)
将酯(11)(0.4g；0.51mmol)的甲醇(30ml)溶液置于帕尔(Parr)氢化仪的压力瓶中，加入10％钯碳(0.2g；0.197mmolPd)，关闭仪器，用氢气吹扫三次并以50p.s.i加氢。开始搅拌，氢化反应于室温进行5小时。真空抽去装置中的氢气并用氩气置换。催化剂经硅藻土滤除，滤液真空浓缩，得到0.240g(91％)4，白色固体，m.p.98-100℃。
曲前列环素苄酯(13)的合成
Figure BSA00000721150400211
向搅拌下的(2)(2g；5.12mmol)的无水四氢呋喃(20ml)溶液中，于室温依次加入苄溴(0.95ml；7.98mmol)和新鲜蒸馏的三乙胺(1.6ml；11.48mmol)，所得溶液回流搅拌12小时。逐渐形成白色沉淀。真空蒸馏除去溶剂，用水(30ml)处理残渣。用二氯甲烷萃取时出现乳化现象。只有在用5％盐酸溶液(20ml)处理之后，才能将有机层和水层分离。有机层用水洗涤、无水硫酸钠干燥、蒸发，残留物进一步用五氧化二磷减压干燥，得到黄色粘稠油状物(2.32g)，再经制备薄层层析纯化(硅胶板；展开剂：1∶2，v/v，己烷/乙醚)。产率：81.2％。
曲前列环素二甘氨酸酯(15)的合成
Figure BSA00000721150400221
苄酯二-苄氧羰基甘氨酸酯(14)
向磁力搅拌下的苄酯13(1g；2.08mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入N-苄氧羰基甘氨酸对硝基苯基酯(2.41g；7.28mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(788mg；6.45mmol)。于20℃搅拌所得黄色溶液21小时，然后依次用5％氢氧化钠溶液(6×45ml)、10％盐酸(2×40ml)、5％碳酸氢钠溶液(40ml)洗涤，无水硫酸钠干燥。除去溶剂，接着用五氧化二磷减压干燥，得到浅黄色油状粗产物14(2.61g)。经闪式硅胶柱层析纯化，9∶1-1∶2(v/v)己烷-乙醚梯度洗脱，得到无色、非常粘稠的油状物(14-(1.51g；84.1％)。
二甘氨酸酯(15)
酯(14)(0.4g；0.46mmol)的甲醇(30ml)溶液如酯(12)所描述的那样用10％Pd/C催化氢化。后处理并用五氧化二磷真空干燥，得到0.170g(72.7％)酯15，白色固体，m.p.155-158℃。
曲前列环素3′-甘氨酸酯19的合成
Figure BSA00000721150400231
苄酯单(叔丁基二甲基甲硅烷基)酯(16)
将叔丁基二甲基氯硅烷(0.45g；2.98mmol)的二氯甲烷(8ml)溶液用10分钟、于室温滴加到搅拌下的苄酯13(0.83g；1.73mmol)和咪唑(0.33g；4.85mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中。继续搅拌过夜，然后加入水(20ml)，搅拌该混合物一小时，分离各层，有机层用无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到微黄色油状物(1.15g)。该粗产物是单-TBDMS(16)和二-TBDMS酯的混合物(1H-NMR)。硅胶柱层析，9∶1(v/v)己烷-乙酸乙酯混合物洗脱，很容易地在最初的组分中得到二-酯(0.618g)，并在随后的组分中得到酯16(0.353g；相对于13的产率：34.4％)。酯16的硅胶薄层层析分析显示仅有一个斑点(展开剂：3∶2(v/v)己烷-乙醚)。所以，在上述反应条件下，未观察到其他可能的异构体(侧链羟基上的单-TBDMS酯)。
另一个试验，其中叔丁基二甲基氯硅烷∶酯13的摩尔比率降低到1.49(接着该产物进行闪式硅胶柱层析，9.5/0.5-3/1(v/v)己烷-乙醚梯度洗脱)，导致不需要的二-OTBDMS副产物的含量降低(36.5％，纯的分离产物)。该单-OTBDMS酯组分(45.1％；分离产物)由酯16(98％)和其侧链异构体(2％)组成，它们可以明显分离；后者被证明(tlc，NMR)仅存在于单酯组分的最后组分中。
苄酯单(苄氧羰基-甘氨酸)酯(18)
向磁力搅拌下的酯16(0.340g；0.57mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中依次加入N-苄氧羰基甘氨酸对硝基苯基酯(0.445g；1.35mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(150mg；1.23mmol)。于20℃搅拌该溶液40小时。如酯11和14的描述后处理，得到含90％17和10％18的粗产物(0.63g)(1H-NMR)。为了完全除去TBDMS保护基团，将该混合物溶于乙醇(30ml)，于室温搅拌过夜进行酸水解(5％HCl，7ml)。然后减压除去溶剂，残留物用二氯甲烷(3×50ml)萃取；分离有机层，用水(50ml)洗涤一次，硫酸钠干燥并真空浓缩，得到粗酯18(0.51g)。如酯11和14那样闪式柱层析纯化，得到酯18无色粘稠油状物(0.150g；总产率：39.1％)。
单甘氨酸酯(19)
酯18(0.15g；0.22mmol)的甲醇(30ml)溶液如酯12和15所描述的那样用10％Pd/C催化氢化。后处理并用五氧化二磷真空干燥，得到酯10(0.98g；98.0％)，白色闪亮晶体，m.p.74-76℃。LR ESI-MS(m/z)：448.2[M+H]+，446.4[M-H]-。
曲前列环素3′-L-亮氨酸酯22的合成
苄酯单(叔丁基二甲基甲硅烷基)酯单(苄氧羰基-L-亮氨酸)酯(20)
向搅拌下的酯16(0.38g；0.64mmol)和N-苄氧羰基-L-亮氨酸N-羟基丁二酰亚胺酯(0.37g；1.02mmol)的10ml二氯甲烷溶液中加入4-(二甲氨基)吡啶(0.17g；1.39mmol)，然后于室温继续搅拌2天。真空除去溶剂，粗产物(0.9g)进行闪式硅胶柱层析，9∶1己烷-乙酸乙酯洗脱；最初收集的组分得到油状物(0.51g)，根据其NMR光谱和tlc，证实为酯20和起始原料酯16的2∶1混合物。制备硅胶薄层层析(展开剂：乙酸乙酯-己烷1：4)得到无色油状纯20(基于7的总产率：62.6％)。
苄酯单(苄氧羰基-L-亮氨酸)酯(21)
除了使用1∶5(v/v)氯仿-乙醇混合物代替单独使用乙醇以确保均匀外，按照18所描述的用稀盐酸溶液处理，对单(叔丁基二甲基甲硅烷基)酯20的环戊烯基羟基进行脱保护。后处理得到20，无色油状物，产率87.6％。
单L-亮氨酸酯(22)
按照18进行21上的苄基和N-苄氧羰基的氢解。后处理得到22(95.3％)，白色固体，m.p.118-120℃。
曲前列环素2-L-亮氨酸酯25的合成
Figure BSA00000721150400261
苄酯单(苄氧羰基-L-亮氨酸)酯(21，23)和二(苄氧羰基-L-亮氨酸)酯(24)
向搅拌下的酯13(0.53g：1.10mmol)和N-苄氧羰基-L-亮氨酸N-羟基丁二酰亚胺酯(0.76g；2.05mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中加入4-(二甲氨基)吡啶(0.29g；2.37mmol)，然后于室温继续搅拌1天。该溶液用二氯甲烷(40mnl)稀释，依次用5％氢氧化钠溶液(4×25ml)、10％盐酸(2×30ml)、5％碳酸氢钠溶液(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粘稠黄色油状粗产物(0.85g)。薄层层析显示为复杂的混合物，其中通过相应的rF值可以鉴别出酯13和21以及苄氧羰基-L-亮氨酸仅为次要产物。该粗产物经闪式硅胶柱层析，己烷-乙醚梯度洗脱。在以7∶3(v/v)己烷-乙醚洗脱时，最初的组分得到二(苄氧羰基-L-亮氨酸)酯24(进行层析产物的6％)，随后的两个组分得到单(苄氧羰基-L-亮氨酸)酯23(粗产物的54％，分离得到的纯23；相对于2的产率为57.6％)。这两个化合物的纯度经分析tlc和NMR检验。另一个异构体，单(苄氧羰基-L-亮氨酸)酯21仅占粗产物的约5％，后者经制备薄层层析分离仅得到3∶1的23/21混合物。
Figure BSA00000721150400271
单L-亮氨酸酯(25)
按照化合物12的描述进行23氢解为酯25的反应，只是以35p.s.i.反应过夜。后处理并用五氧化二磷真空干燥，定量得到25，白色固体，m.p.153-155℃。
曲前列环素3′-L-丙氨酸酯30的合成
Figure BSA00000721150400272
N-苄氧羰基-L-丙氨酸对硝基苯基酯(27)
向搅拌下的含N-苄氧羰基-L-丙氨酸(1g；4.48mmol)和对硝基苯酚(1g；7.19mmol)的无水四氢呋喃(7ml)溶液中用30分钟加入1，3-二环己基碳二亚胺(1.11g；5.38mmol)的四氢呋喃(5ml)悬浮液。于室温继续搅拌18小时，加入冰醋酸(0.3ml)，滤去1，3-二环己基脲并于40℃真空除去溶剂，得到粘稠黄红色油状物(2.5g)。1H-NMR光谱显示为N-苄氧羰基-L-丙氨酸对硝基苯基酯(27)、未反应的对硝基苯酚和少量DCU的混合物，该混合物不经处理直接用于下步反应。
Figure BSA00000721150400281
苄酯单(苄氧羰基-L-丙氨酸)酯(29)
将4-(二甲氨基)吡啶(0.30g；2.49mmol)的二氯甲烷(3ml)溶液迅速滴加(在5分钟内)到磁力搅拌下的酯16(0.37g；0.62mmol)和粗N-苄氧羰基-L-丙氨酸对硝基苯基酯(0.98g)的二氯甲烷(12ml)溶液中。该混合物于室温搅拌过夜，然后用二氯甲烷(50ml)稀释，并用5％氢氧化钠溶液(7×35ml)、10％盐酸(3×35ml)、5％碳酸氢钠溶液(50ml)彻底洗涤，无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗酯28(1.1g)。将后者溶于乙醇(30ml)，加入5％盐酸(8ml)和氯仿(5ml)并搅拌该溶液过夜。真空除去溶剂，残留物溶于二氯甲烷，用5％碳酸氢钠溶液洗至pH 7，无水硫酸钠干燥并蒸发溶剂，得到粗29(1.04g)。硅胶柱层析纯化，己烷-乙醚梯度洗脱，分离得到纯29组分(己烷∶乙醚＝1∶1v/v)，无色非常粘稠油状物(0.11g；基于16的总产率为25.8％)。
单L-丙氨酸酯(30)
按照12的描述进行催化氢化反应，除去29的苄基和N-苄氧羰基。得到浅黄色、部分结晶的油状酯30(产率：97.2％)。
曲前列环素苄酯的3′-L-缬氨酸酯33的合成
Figure BSA00000721150400291
曲前列环素苄酯13的合成
苄酯11采用J.C.Lee等在Organic Prep.and Proc.Intl.，1996，28(4)，480-483中描述的方法合成。向1(620mg，1.6mmol)和碳酸铯(782.4mg，2.4mmol)的乙腈(30ml)溶液中加入苄溴(0.48ml，4mmol)，该混合物回流搅拌1小时。室温冷却后，滤去沉淀并真空浓缩滤液。将残留物溶于氯仿(150ml)，用2％NaHCO3水溶液(3×30ml)洗涤。有机层用盐水洗涤，Na2SO4干燥，过滤并真空除去溶剂，得到750mg黄色粘稠油状粗苄酯13(产率98％)。粗苄酯13可经柱层析纯化(100-0％二氯甲烷(甲醇)，也可在随后的反应中使用粗产物。
TBDMS保护的曲前列环素苄酯16的合成
采用Organic Synth.，1998，75，139-145中的方法合成TBDMS保护的苄酯。将苄酯13(679mg，1.4mmol)溶于无水二氯甲烷(20ml)，并将该溶液在冰浴中冷却至0℃。加入咪唑(192mg，2.8mmol)和氯化叔丁基-二甲基硅烷(TBDMSCl)(420mg，2.8mmol)，该混合物维持在冰浴中再搅拌半小时，然后使其室温过夜。向反应混合物中加入40ml水并分离有机层。水层用3×50ml二氯甲烷萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空除去溶剂。得到795mg产物，证实为所需单TBDMS保护的5苄酯及双-TBDMS保护苄酯的混合物。硅胶柱层析得到纯16(249mg)(洗脱剂35％乙酸乙酯/己烷)。
TBDMS保护的曲前列环素苄酯的N-苄氧羰基-L-缬氨酸酯31的合成
采用Tetrahedron Lett.，1978，46，4475-4478中的方法。于室温搅拌N-苄氧羰基-L-缬氨酸(127mg，0.5mmol)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)(111mg，0.5mmol)、化合物16(249mg，0.4mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)(6mg，0.05mmol)的无水二氯甲烷(15ml)溶液，直到完全酯化。过滤该溶液，滤去所形成的N，N-二环己基脲。滤液用二氯甲烷(80ml)稀释并用水(3×30ml)、5％乙酸水溶液(2×30ml)洗涤，然后再用水(3×30ml)洗涤。有机层用Na2SO4干燥并真空蒸发溶剂，得到369mg粗31。层析(硅胶，35％乙酸乙酯/己烷)得到纯31。
曲前列环素苄酯的3′-N-苄氧羰基-L-缬氨酸酯32的合成
采用Org.Letters，2000，2(26)，4177-4180中描述的方法进行化合物31的TBDMS基团的裂解。将TBDMS保护的苄酯的N-苄氧羰基-L-缬氨酸酯31(33mg，0.04mmol)溶于甲醇(5ml)，加入四丁基三溴化铵(TBATB)(2mg，0.004mmol)。于室温搅拌该反应混合物24小时，直到TBDMS完全脱保护。蒸发甲醇并将残留物溶于二氯甲烷。该二氯甲烷溶液用盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥。滤去干燥剂后，将溶剂蒸发至干，得到30.2mg粗化合物32。
曲前列环素的3′-L-缬氨酸酯33的合成
苄基和苄基羧基通过在大气压下、在10％wt钯碳的存在下催化氢化除去。将苄酯的3′-N-苄氧羰基-L-缬氨酸酯32(30.2mg，0.04mmol)溶于甲醇(10ml)并加入催化量的Pd/C。在磁力搅拌下除去烧瓶中的空气，然后通入氢气。该反应混合物维持在氢气下并室温搅拌24小时，然后真空除去氢气。将反应混合物通过硅藻土层过滤并真空除去溶剂，得到纯的曲前列环素的3′-L-缬氨酸酯33(15mg，0.03mmol)。
曲前列环素的2-L-缬氨酸酯36/曲前列环素的二-L-缬氨酸酯37的合成
曲前列环素的2-L-丙氨酸酯36′/曲前列环素的二-L-丙氨酸酯37′的合成
Figure BSA00000721150400321
曲前列环素苄酯的2-N-苄氧羰基-L-缬氨酸酯34和曲前列环素苄酯的二N-苄氧羰基-L-缬氨酸酯35的合成
采用Tetrahedron Lett.，1978，46，4475-4478中的方法。于室温搅拌N-苄氧羰基-L-缬氨酸(186mg，0.7mmol)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)(167mg，0.8mmol)、化合物13(367mg，0.8mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)(12mg，0.09mmol)的无水二氯甲烷(15ml)溶液，直到完全酯化。过滤该溶液，滤去所形成的N，N-二环己基脲。滤液用二氯甲烷(100ml)稀释并用水(3×50ml)、5％乙酸水溶液(2×50ml)洗涤，然后再用水(3×50ml)洗涤。有机层用Na2SO4干燥并真空蒸发溶剂，得到556mg粗产物。层析(硅胶，35％乙酸乙酯/己烷)分离该产物，得到369.4mg 2-缬氨酸酯34和98mg二-缬氨酸酯35。
曲前列环素苄酯的2-N-苄氧羰基-L-丙氨酸酯34′和曲前列环素苄酯的二-N-苄氧羰基-L-丙氨酸酯35′的合成
采用Tetrahedron Lett.，1978，46，4475-4478中的方法。于室温搅拌N-苄氧羰基-L-丙氨酸(187mg，0.84mmol)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)(175mg，0.85mmol)、化合物13(401mg，0.84mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(UMAP)(11.8mg，0.1mmol)的无水二氯甲烷(15ml)溶液，直到完全酯化。过滤该溶液，滤去所形成的N，N-二环己基脲。滤液用二氯甲烷(100ml)稀释并用水(3×50ml)、5％乙酸水溶液(2×50ml)洗涤，然后再用水(3×50ml)洗涤。有机层用Na2SO4干燥并真空蒸发溶剂，得到516mg粗产物。层析(硅胶，35％乙酸乙酯/己烷)分离该产物，得到93.4mg 2-丙氨酸酯34′和227mg二-丙氨酸酯35′。
曲前列环素的2-L-缬氨酸酯36/曲前列环素的二-L-缬氨酸酯37的合成
苄基和苄基羧基通过在大气压下、在10％wt钯碳的存在下催化氢化除去。将曲前列环素苄酯的2-N-苄氧羰基-L-缬氨酸酯34(58.2mg，0.08mmol)/曲前列环素苄酯的二-N-苄氧羰基-L-缬氨酸酯35(55.1mg，0.06mmol)溶于甲醇(10ml)，加入催化量的Pd/C。在磁力搅拌下除去烧瓶中的空气，然后通入氢气。该反应混合物维持在氢气下并室温搅拌20小时，然后真空除去氢气。将反应混合物通过硅藻土层过滤并真空除去溶剂，得到纯的曲前列环素的2-L-缬氨酸酯36(40mg，0.078mmol)/曲前列环素的二-L-缬氨酸酯37(23mg，0.04mmol)。
曲前列环素的2-L-丙氨酸酯36′/曲前列环素的二-L-丙氨酸酯37′的合成
苄基和苄基羧基通过在大气压下、在10％wt钯碳的存在下催化氢化除去。将曲前列环素苄酯的2-N-苄氧羰基-L-丙氨酸酯34′(87.4mg，0.13mmol)/曲前列环素苄酯的二-N-苄氧羰基-L-丙氨酸酯35′(135mg，0.15mmol)溶于甲醇(15ml)，加入催化量的Pd/C。在磁力搅拌下除去烧瓶中的空气，然后通入氢气。该反应混合物维持在氢气下并室温搅拌20小时，然后真空除去氢气。将反应混合物通过硅藻土层过滤并真空除去溶剂，得到纯的曲前列环素的2-L-丙氨酸酯36′(57mg，0.12mmol)/曲前列环素的二-L-丙氨酸酯37′(82mg，0.15mmol)。
曲前列环素苄酯38a-e的合成
Figure BSA00000721150400341
a  4-NO2C6H4CH2；b  4-(CH3O)C6H4CH2；c  2-ClC6H4CH2；d2，4-(NO2)2C6H3CH2；e  4-FC6H4CH2
使用苄酯13的方法进行曲前列环素苄酯38a-e的合成。
这些化合物的对映异构体，如下所示，可用上述试剂的对映体手性试剂和合成子合成。
Figure BSA00000721150400351
(-)-曲前列环素可按如下方法合成：
Figure BSA00000721150400352
(a)(S)-2-甲基-CBS-氧杂氮杂硼烷(oxazaborolidine)，BH3·SMe2，THF，-30℃，85％。(b)TBDMSCl，咪唑，CH2Cl2，95％。(c)Co2(CO)8，CH2Cl2，2hr.r.t.，然后CH3CN，2hr.回流，98％。(d)K2CO3，Pd/C(10％)，EtOH，50psi/24hr.78％。(e)NaOH，EtOH，NaBH4，95％。(f)BnBr，NaH，THF，98％。(g)CH3OH，TsOH，96％。(h)i.对硝基苯甲酸，DEAD，TPP，苯。(i)CH3OH，KOH，94％。(j)Pd/C(10％)，EtOH，50psi/2hr，定量。(k)Ph2PLi，THF。(l)i.ClCH2CN，K2CO3，ii.KOH，CH3OH，回流，83％(2步)。
简而言之，商品药物(+)-曲前列环素的对映异构体使用立体选择性分子内Pauson Khand反应作为关键步骤及侧链羟基的Mitsunobu转化合成。(-)-曲前列环素的绝对构型通过L-缬氨酸酰胺衍生物的X-射线结构确定。
使用下列方法制备(-)-曲前列环素-甲基-L-缬氨酰胺：在Ar下向搅拌下的(-)-曲前列环素(391mg，1mmol)和L-缬氨酸甲酯盐酸盐(184mg，1.1mmol)的DMF(10ml)溶液中依次加入pyBOP试剂(1.04g，2mmol)、二异丙基乙胺(0.52ml，3mmol)。反应混合物室温搅拌过夜(15小时)。真空除去溶剂并经层析纯化，得到白色固体12(481mg，86％)，重结晶(10％乙酸乙酯/己烷)得到合适的结晶用于X-射线分析。
这些能够生成本文中所讨论另外化合物的合成流程的各种修改，对本领域技术人员而言将是显而易见的。
在循环系统中释放曲前列环素有两个主要障碍。障碍之一是曲前列环素的首过效应很大。在最初循环经过肝脏时，血浆中约60％的曲前列环素被代谢，仅剩下所吸收剂量的约40％。其次，口服释放曲前列环素的主要障碍是该化合物在胃肠道易于流失。曲前列环素的渗透性已通过Caco-2单层细胞测定。测定的基础转运率的峰值为1.39×106cm/sec，它表示化合物的渗透性强。然而，峰值转运率的基值为12.3×106cm/sec，提示曲前列环素能有效地从浆膜流到上皮细胞管腔侧。这些数据提示曲前列环素对膜结合的多药转运蛋白p-糖蛋白敏感。认为p-糖蛋白流出泵能防止某些药用化合物穿过小肠粘膜细胞，因此，能防止被吸收入全身循环。
相应地，本发明提供包含曲前列环素、结构I化合物或结构II化合物或其药学上可接受的盐及其组合，与一种或多种p-糖蛋白抑制剂组合的药用组合物。美国专利号6,451,815、6,469,022和6,171,786中公开了许多显示抑制p-糖蛋白的、已知的非细胞毒药物。
p-糖蛋白抑制剂包括水溶形式的维生素E、聚乙二醇、泊洛沙姆包括泊洛沙姆F-68、聚环氧乙烷、聚氧乙烯蓖麻油衍生物包括Cremophor EL和Cremophor RH 40、柯因、(+)-黄杉素、柚苷配基、香叶木苷、槲皮素、环孢菌素A(也称为环孢菌素)、维拉帕米、他莫昔芬、奎尼丁、吩噻嗪及9，10-二氢-5-甲氧基-9-氧代-N-[4-[2-(1，2，3，4-四氢-6，7-二甲氧基-2-异喹啉基)乙基]苯基]-4-吖啶甲酰胺或其盐。
聚乙二醇(PEGs)为通式H(OCH2CH2)nOH的液体和固体聚合物，其中n大于或等于4，平均分子量范围在约200-约20,000。PEGs也称为α-氢-ω-羟基聚-(氧基-1，2-乙二基)聚乙二醇。例如，PEG 200为其中n的平均值为4及平均分子量为约190-约210的聚乙二醇。PEG 400为其中n的平均值介于8.2和9.1之间及平均分子量为约380-约420的聚乙二醇。同样地，PEG 600、PEG 1500和PEG 4000的n的平均值分别为12.5-13.9、29-36和68-84，平均分子量分别为570-630、1300-1600和3000-3700，PEG 1000、PEG 6000和PEG 8000的平均分子量分别为950-1050、5400-6600和7000-9000。平均分子量在200-20000之间变化的聚乙二醇在药物科学领域中熟知并且易于得到。
优选用于本发明的聚乙二醇为具有平均分子量为约200-约20,000的聚乙二醇。更优选的聚乙二醇具有平均分子量为约200-约8000。更具体地说，用于本发明的更优选的聚乙二醇为PEG 200、PEG400、PEG 600、PEG 1000、PEG 1450、PEG 1500、PEG 4000、PEG 4600和PEG 8000。用于本发明的最优选的聚乙二醇为PEG 400、PEG 1000、PEG 1450、PEG 4600和PEG 8000。
聚山梨酯80为山梨醇及其酸酐与约20摩尔环氧乙烷/摩尔山梨醇和山梨醇酸酐共聚的油酸酯。聚山梨酯80由脱水山梨醇单-9-十八烷酸酯聚(氧基-1，2-乙二基)衍生物组成。聚山梨酯80，也称为吐温80，在药学领域中熟知并且易于得到。
水溶性维生素E，也称为d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯[TPGS]，为天然来源维生素E的水溶性衍生物。TPGS可通过结晶的d-α-生育酚酸琥珀酸酯的酸基与聚乙二醇1000酯化制备。该产品在药学领域中熟知并且易于得到。例如，水溶性维生素E产品由EastmanCorporation以维生素E TPGS销售。
柚苷配基为生物黄酮类化合物2，3-二氢-5，7-二羟基-2-(4-羟基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮，也称为4′，5，7-三羟基黄烷酮。柚苷配基是柚苷(naringen)的苷元，它是在葡萄柚的果实和壳中发现的天然产物。公众易于从商业渠道获得柚苷配基。
槲皮素为生物黄酮类化合物2-(3，4-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，也称为3，3′，4′，5，7-五羟基黄酮。槲皮素是槲皮甙、芦丁和其他糖苷的苷元。公众易于从商业渠道获得槲皮素。
香叶木苷是天然存在的黄酮糖苷化合物7-[[6-O-6-脱氧-α-L-吡喃甘露糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]-5-羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮。香叶木苷可从各种植物资源包括柑橘果实中分离。公众易于从商业渠道获得香叶木苷。
柯因是天然存在的化合物5，7-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，可从各种植物资源中分离。公众易于从商业渠道获得柯因。
泊洛沙姆为α-氢-ω-羟基聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物。泊洛沙姆是通式为HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH的、环氧乙烷与环氧丙烷的系列紧密相关的嵌段共聚物。例如，泊洛沙姆124是″a″为12、″b″为20、平均分子量为约2090-约2360的液体；泊洛沙姆188是″a″为80、″b″为27、平均分子量为约7680-约9510的固体；泊洛沙姆237是″a″为64、″b″为37、平均分子量为约6840-约8830的固体；泊洛沙姆338是″a″为141、″b″为44、平均分子量为约12700-约17400的固体；泊洛沙姆407是″a″为101、″b″为56、平均分子量为约9840-约14600的固体。泊洛沙姆在药学领域中熟知并且易于得到。例如，泊洛沙姆F-68是BASF公司销售的泊洛沙姆。用于本发明的、优选的泊洛沙姆为如泊洛沙姆188、泊洛沙姆F-68等。
聚氧乙烯蓖麻油衍生物是通过各种量的环氧乙烷与蓖麻油或氢化蓖麻油反应而获得的系列物质。这些聚氧乙烯蓖麻油衍生物在药学领域中熟知并且一些不同类型的物质有市售，包括BASF公司的Cremophors。聚氧乙烯蓖麻油衍生物是各种疏水和亲水组分的复杂混合物。例如，在聚氧乙烯35蓖麻油(也称为Cremophor EL)中，疏水成分占总混合物的约83％，主要组分为聚乙二醇蓖麻油酸甘油酯。其他疏水成分包括聚乙二醇脂肪酸酯及某些未变化的蓖麻油。聚氧乙烯35蓖麻油的亲水部分(17％)由聚乙二醇和甘油基乙氧基化物组成。
在聚氧乙烯40氢化蓖麻油(Cremophor RH 40)中，该混合物中约75％的组分为疏水性。这些组分主要包括甘油聚乙二醇的脂肪酸酯和聚乙二醇的脂肪酸酯。亲水部分由聚乙二醇和甘油乙氧基化物组成。优选的、用于本发明的聚氧乙烯蓖麻油衍生物为聚氧乙烯35蓖麻油，例如Cremophor EL，及聚氧乙烯40氢化蓖麻油，例如Cremophor RH40。Cremophor EL和Cremophor RH 40为BASF公司产品。
聚环氧乙烷是通式为(OCH2CH2)n的环氧乙烷非离子均聚物，其中n代表氧基亚乙基的平均数目。可得到在药学领域中熟知的各种级别的聚环氧乙烷和买到一些不同类型的物质。聚环氧乙烷的优选级别为市售的NF等。
(+)-黄杉素为(2R-反式)-2-(3，4-二羟基苯基)-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。(+)-黄杉素的其他常用名有(+)-二氢槲皮素；3，3′，4′，5，7-五羟基-黄烷酮；diquertin；花旗松素(taxifoliol)；和distylin。(+)-黄杉素在药学领域中熟知并且易于从商业渠道获得。
优选的、用于本发明的p-糖蛋白抑制剂有水溶性维生素E，例如维生素E TPGS，及聚乙二醇。在聚乙二醇中，最优选的p-糖蛋白抑制剂有PEG 400、PEG 1000、PEG 1450、PEG 4600和PEG 8000。
p-糖蛋白抑制剂可通过p-糖蛋白抑制剂为生物可利用的任何途径以有效量给药，包括口服和肠胃外途径。虽然口服给药为优选，p-糖蛋白抑制剂也可静脉内、局部、皮下、鼻内、直肠、肌内或通过其他肠胃外途径给药。口服给药时，p-糖蛋白抑制剂可以任何方便的剂型给药，包括例如胶囊剂、片剂、液体制剂、混悬剂等。
通常，p-糖蛋白抑制剂的有效p-糖蛋白抑制量为有效地提供存在于肠的p-糖蛋白介导活性转运系统的活性抑制的量。有效p-糖蛋白抑制量可在日剂量为约5mg-约1000mg p-糖蛋白抑制剂之间变化，取决于所选的特定p-糖蛋白抑制剂、被治疗的患者种类、剂量方案及其他因素，这些因素全部在医疗领域普通技术人员的评价和估计能力范围内。然而典型的优选量将为约50mg-约500mg，典型的更优选量为约100mg-约500mg。p-糖蛋白抑制剂的上述量可每天给予一次至多次。对典型的口服给药而言，剂量将以每天需要一个剂量、两个剂量或三个剂量的方案给予。
当水溶性维生素E或聚乙二醇被选为p-糖蛋白抑制剂时，典型的优选量将为约5mg-约1000mg，典型的更优选量为约50mg-约500mg，典型的还更优选量将为约100mg-约500mg。水溶性维生素E或聚乙二醇最优选量为约200mg-约500mg。水溶性维生素E或聚乙二醇的上述量可每天给予一次至多次。典型地，剂量将以每天需要一个剂量、两个剂量或三个剂量的方案给予，优选一个剂量和两个剂量。
如本文中所使用的，术语“联合给药”指给予患者具有血管舒张和/或抑制血小板聚集性质的两种化合物，包括美国专利号4,306,075和5,153,222中描述的化合物，它们包括曲前列环素和本文中描述的结构I和II化合物及p-糖蛋白抑制剂，以使p-糖蛋白抑制剂抑制肠中p-糖蛋白介导转运的药理作用，在化合物被肠吸收的时候显现。当然，化合物和p-糖蛋白抑制剂可在不同的时间或同时给予。例如，p-糖蛋白抑制剂可在给予治疗化合物之前给予患者，以使在准备给予血管舒张化合物时预先治疗患者。此外，预先用p-糖蛋白抑制剂治疗对患者而言可能更方便，使得在给予第一剂量治疗化合物之前p-糖蛋白抑制剂达到稳态水平。也可预期：血管舒张和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制剂基本上可以同时以单独剂型或以同一口服剂型给予。
本发明还提供：血管舒张和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制剂可以单独剂型或以同一联合口服剂型给予。化合物和p-糖蛋白抑制剂的联合给药可以方便地通过经口给予含该化合物和p-糖蛋白抑制剂的联合剂型实现。
因此，本发明另外的实施方案为口服给药的联合药物组合物，该组合物包括有效量的本文中描述的血管舒张和/或抑制血小板聚集化合物及有效量的抑制p-糖蛋白的p-糖蛋白抑制剂。该联合口服剂型可提供速释的血管舒张和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制剂，或可提供缓释的血管舒张和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制剂之一或两者。本领域技术人员能容易地决定该联合剂型的适当性质，以使血管舒张和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制剂的联合给药获得理想的效果。
因此，本发明提供通过p-糖蛋白抑制剂的联合给药提高曲前列环素、结构I或II药物及其药学上可接受的盐的生物利用度。通过这些化合物与p-糖蛋白抑制剂的联合给药，相对于在无p-糖蛋白抑制剂情况下在血液循环中的量，可增加化合物的总量。因此，本发明的联合给药可导致与化合物单独给药相比的本发明化合物AUC的增加。
典型地，通过测量给药后各时间点的该药血药浓度评定生物利用度，然后对相对于时间所获得的值积分，得出药物在血中循环的总量。该测量称为曲线下面积(AUC)，是药物生物利用度的直接测量。
在不限制本发明范围的情况下，相信在某些实施方案中，在曲前列环素的R2和R3羟基上衍生化，可通过封闭这些位置帮助克服曲前列环素经口释放的障碍，因此可减慢代谢速度使化合物避免某些首过效应。并且，由于具有暴露的氨基酸，前药可主动地被存在于胃肠道的二肽转运系统吸收。因此，本发明提供如那些在结构I和II中发现的化合物，这些化合物可降低曲前列环素的首过效应和/或降低胃肠道的流出机制。
在某些治疗患者高血压方法的实施方案中，患者为哺乳动物，在某些实施方案中为人。
药物制剂可包括任何上述实施方案中单独或联合的任何化合物，与如本文中所描述的那些药学上可接受的载体的组合。
本发明也提供组合物，该组合物可通过一种或多种本发明化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合制备，用于治疗或改善各种与血管收缩和/或血小板聚集相关的疾病。治疗有效剂量还指能导致改善疾病症状的一种或多种本发明化合物的量。本发明药用组合物可通过本领域众所周知的方法制备，例如其中有常规制粒、混合、溶解、填充胶囊、冷冻干燥、乳化或研磨工序。组合物可为例如颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、混悬剂或溶液剂。本发明组合物可配制成用于各种给药途径，例如经口给药、经粘膜给药、直肠给药、经皮或皮下给药以及鞘内、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、眼内或心室内注射。本发明化合物也可通过上述任何途径给药，例如以局部形式而不是以如缓释注射剂的全身形式给药。下列剂型以实例的方式给出而不应视为对本发明的限制。
对经口、口颊和舌下给药而言，散剂、混悬剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、软胶囊剂和胶囊形片剂为可接受的固体剂型。这些剂型可通过例如将一种或多种本发明化合物或其药学上可接受的盐与至少一种添加剂或赋形剂例如淀粉或其他添加剂混合制备。合适的添加剂或赋形剂有蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、氢化麦芽糖(maltitol)、葡聚糖、山梨醇、淀粉、琼脂、藻酸盐、壳多糖、壳聚糖、果胶、黄芪胶、阿拉伯胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或聚乙烯吡咯烷酮。口服剂型可任选含其他有助于给药的成分，例如非活性的稀释剂，或润滑剂例如硬脂酸镁，或防腐剂例如尼泊金酯或山梨酸，或抗氧化剂例如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸，崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂或香味剂。另外，为了便于识别可加入染料或颜料。片剂可进一步用合适的、本领域已知的包衣材料处理。
另外，试验表明本发明化合物，包括曲前列环素、特别是结构I和II的化合物释放至十二指肠时提高了生物利用度。因此，本发明的一个实施方案涉及优先释放所需化合物至十二指肠，以及能够实现十二指肠释放的药物制剂。十二指肠给药可通过任何本领域已知的方法实现。在这些实施方案之一中，本发明化合物可配制成肠溶剂型。一般而言，肠溶剂型通常用聚合物包衣，该聚合物在低pH下不溶，但当暴露于pH 3或以上时能迅速溶解。该释放形式利用了胃和十二指肠pH的差别，胃中的pH约为1-2，而十二指肠中的pH倾向于大于4。
口服给药的液体剂型可为药学上可接受的乳剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、膏剂和溶液剂，这些剂型可含非活性稀释剂，例如水。药物制剂可如液体混悬剂或溶液剂那样，使用无菌液体例如但不限于油、水、醇及其组合制备。可加入药学上合适的表面活性剂、悬浮剂、乳化剂以用于经口或肠胃外给药。
如上所述，混悬剂可包括油。该油包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。混悬剂也可含脂肪酸酯例如油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。混悬剂可包含醇，例如但不限于乙醇、异丙醇、十六烷醇、甘油和丙二醇。醚，例如但不限于聚(乙二醇)、石油碳氢化合物例如矿物油和凡士林；和水也可用于混悬剂制剂。
注射剂型通常包括水性混悬剂或油性混悬剂，这些剂型可使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂制备。注射形式可为溶液相或为混悬剂形式，可用溶剂或稀释剂制备。可接受的溶剂或溶媒包括无菌水、林格氏液或等渗盐水溶液。或者，无菌油可用作溶剂或悬浮剂。优选油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成油、脂肪酸、甘油单-、二-或三-酯。
对注射剂而言，药物制剂可为适用于与如上所述的合适溶液再组成的粉末。这些粉末的实例包括但不限于冻干、旋转干燥或喷雾干燥粉末，无定形粉末、颗粒、沉淀物或微粒。对注射剂而言，制剂可任选含稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂及其组合。化合物可配制成肠胃外给药注射剂，例如一次性大剂量浓注(bolus)或连续输注。注射剂的单位剂型可为安瓿或为多剂量容器。
除了上述有代表性的那些剂型外，药学上可接受的赋形剂和载体通常对本领域技术人员而言是已知的，因此包括在本发明内。例如在″Remingtons Pharmaceutical Sciences″Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)中描述了这些赋形剂和载体，它通过引用结合到本文中。
本发明的制剂可设计成如下所述的短效、速释、长效和缓释制剂。因此，药物制剂也可配制成控释或缓释制剂。
本发明组合物也包含例如微团(micelles)或脂质体，或某些其他胶囊化形式，或可以延续释放形式给药以提供长时间储存和/或释放效果。因此，药物制剂可压制成微型药片或圆柱形，可在肌肉内植入或作为贮库注射剂皮下植入，或可做成如斯滕特氏印模(stents)植入片。此类植入片可采用已知的惰性材料例如硅氧烷和可生物降解的聚合物。
具体的剂量可根据疾病的情况、年龄、体重、一般健康情况、性别和患者的饮食、给药间隔、给药途径、排泄速度和联合用药调节。任何上述含有效量的剂型均在常规试验的范围内，因此也在本发明的范围内。
治疗有效剂量可随给药途径和剂型而变化。优选的本发明化合物为显示高治疗指数的制剂。治疗指数是毒性作用和治疗作用之间的剂量比率，它可用LD50和ED50之间的比率表示。LD50是总体50％的致死剂量，而ED50是总体50％的治疗有效剂量。LD50和ED50可通过动物细胞培养或试验动物的标准药学方法确定。
制备药物制剂的方法包括将任何上述化合物与药学上可接受的载体和水或水溶液混合。
本发明的药物制剂和药物包括上述结构I、II化合物或其药学上可接受盐的任何实施方案中的任何化合物与药学上可接受的载体的组合。因此，本发明化合物可用于制备药物和药物制剂。在某些此类实施方案中，药物和药物制剂包含结构I化合物或其药学上可接受盐的任何实施方案中的任何化合物。本发明也提供结构I、II化合物或其药学上可接受盐的任何实施方案中的任何化合物用于前列环素样作用的用途。本发明也提供结构I、II化合物或其药学上可接受盐的任何实施方案中的任何化合物在治疗肺动脉高血压中的用途。
本发明也涉及包含一种或多种结构I或II化合物的药剂盒以及使用这些化合物的说明。在另一个实施方案中，提供了含本文中描述的具有前列环素样作用的化合物与一种或多种p-糖蛋白抑制剂组合的药剂盒，以及使用该药剂盒的说明。
作为例证，本发明药剂盒可包括一种或多种含本发明生物增强剂的片剂、胶囊剂、胶囊形片剂、软胶囊或液体制剂，及一种或多种含本文中所描述的前列环素样作用化合物的片剂、胶囊剂、胶囊形片剂、软胶囊或液体制剂，剂量在上述范围内。此类药剂盒可在医院、诊所、医生办公室或患者家中使用，以便于增强剂和目标药物的联合给药。药剂盒也应包括增强剂和目标药物联合给药的插入印刷给药信息。
在本申请中使用下列缩写和定义：
通常，涉及某些元素例如氢或H是指包括所有该元素的同位素。例如，如果R基团定义为包括氢或H，它也包括氘和氚。
本文中所使用的术语“p-糖蛋白抑制剂”指抑制存在于肠中的、p-糖蛋白介导的活性转运系统活性的有机化合物。该转运系统将从肠腔吸收的药物主动转运进入肠上皮，并回收进入肠腔的药物。该p-糖蛋白介导的活性转运系统抑制将导致更少的药物被转运回肠腔，因此将增加通过肠上皮的净药物转运，并将增加药物最终在血中的量。
本文中所用的短语“口服生物利用度”和“经口给药生物利用度”指经口给予患者给定量药物的全身利用度(即血/血浆水平)。
短语“未取代烷基”指不含杂原子的烷基。因此该短语包括直链烷基例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。该短语也包括直链烷基的支链异构体，包括但不限于下列作为实例提供的基团：-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)及其他。该短语也包括环状烷基例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基及由如上所定义的直链和支链烷基取代的此类环。该短语也包括多环烷基，例如但不限于金刚烷基(adamantyl)降冰片基、双环[2.2.2]辛基和由如上所定义的直链和支链烷基取代的此类环。因此，短语未取代烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基。未取代烷基可与母体化合物中的一个或多个碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子连接。优选的未取代烷基包括直链和支链烷基和具有1-20个碳原子的环状烷基。更优选的此类未取代烷基具有1-10个碳原子，还更优选的此类基团具有1-5个碳原子。最优选的未取代烷基包括具有1-3个碳原子的直链和支链烷基并包括甲基、乙基、丙基和-CH(CH3)2。
短语“取代烷基”指如上所定义的未取代烷基，其中一个或多个与碳或氢相连的键被与非氢和非碳原子相连的键置换，这些原子包括例如但不限于卤化物中的卤原子例如F、Cl、Br和I；基团例如羟基、烷氧基、芳氧基和酯基中的氧原子；基团例如巯基、烷基和芳基硫化物基团、砜基、磺酰基和亚砜基中的硫原子；基团例如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳胺、烷基芳胺、二芳胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺中的氮原子；基团例如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；及各种其他基团中的其他杂原子。取代烷基也包括其中一个或多个与碳或氢原子相连的键被与杂原子相连的键置换的基团，这些杂原子如羰基、羧基和酯基中的氧原子；基团例如亚胺、肟、腙和腈中的氮原子。其中优选的取代烷基包括其中一个或多个与碳或氢原子相连的键被一个或多个与氟原子相连的键置换的烷基。取代烷基的一个实例为三氟甲基和含三氟甲基的其他烷基。其他烷基包括其中一个或多个与碳或氢原子相连的键被与氧原子相连的键置换的那些基团，因而取代烷基含羟基、烷氧基、芳氧基或杂环基氧基。其他烷基还包括具有胺、烷基胺、二烷基胺、芳胺、(烷基)(芳基)胺、二芳胺、杂环胺、(烷基)(杂环基)胺、(芳基)(杂环基)胺或二杂环基胺基团的烷基。
短语“未取代芳基烷基”指如上所定义的未取代烷基，其中未取代烷基的氢或碳键被与如上所定义的芳基相连的键置换。例如，甲基(-CH3)是未取代烷基。如果甲基的氢原子被与苯基相连的键置换，例如如果甲基的碳原子与苯的碳原子相连，那么该化合物为未取代芳基烷基(即苄基)。因此该短语包括但不限于例如苄基、二苯基甲基和1-苯基乙基(-CH(C6H5)(CH3))的基团。
短语“取代芳基烷基”具有关于未取代芳基烷基相同的含义，取代的芳基具有关于未取代芳基。然而，取代芳基烷基也包括其中该基团烷基部分的碳或氢键被与非碳或非氢原子相连的键置换的基团。取代芳基烷基的实例包括但不限于-CH2C(＝O)(C6H5)和-CH2(2-甲基苯基)。
“药学上可接受的盐”包括与无机碱、有机碱、无机酸、有机酸或碱性或酸性氨基酸成的盐。作为无机碱盐，本发明包括例如碱金属例如钠或钾的盐；碱土金属例如钙和镁或铝的盐；及氨盐。作为有机碱盐，本发明包括例如三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的盐。作为无机酸盐，本发明包括例如盐酸、氢硼酸(hydroboric acid)、硝酸、硫酸和磷酸的盐。作为有机酸盐，本发明包括例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、乳酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸的盐。作为碱性氨基酸盐，本发明包括例如精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的盐。酸性氨基酸包括例如天冬氨酸和谷氨酸。
本发明上下文中的“治疗”指减轻与生物学病症、障碍或疾病相关的症状，或阻止那些症状的进一步发展或恶化，或防止或预防疾病或障碍。例如，在治疗患肺动脉高血压患者的有关内容中，成功的治疗可包括减少肺和/或全身动脉血管床的直接血管舒张及抑制血小板聚集。该血管舒张的结果通常将减少右和左心室的后负荷并增加心脏输出和心搏排血量。也可产生剂量相关的负性肌肉收缩和松弛作用。这些身体作用的外在表现可包括减少高血压症状，例如呼吸急促，和增加运动能力。
如此一般描述的本发明，通过参考下列实施例将更易于理解，这些实施例为例证目的提供，无意限定本发明。
实施例
实施例1
在该实施例中，比较了大鼠经口、十二指肠内、结肠内及通过门静脉内给药后曲前列环素的生物利用度，以确定对生物利用度可能存在的障碍。除生物利用度外，还测定了许多药代动力学参数。
动物给药
曲前列环素的生物利用度用Sprague-Dawley雄性大鼠评价。十五只手术改变大鼠购自Hilltop Lab Animals(Scottdale，PA)。动物从Hilltop运送至吸收系统的West Chester University设施(West Chester，PA)，它们在用于该研究之前至少在其中饲养二十四小时。给药前动物禁食约16小时。将十五只用于该研究的大鼠分成五组(I、II、III、IV和V)。
动物的重量和给药方案列于表1。
表1
Figure BSA00000721150400501
在下列时间点取样。
IV和IPV：0(给药前)2、5、15、30、60、120、240、360、480分钟
ID、IC和口服：0(给药前)、5、15、30、60、120、240、360、480分钟
从插套管大鼠的颈静脉中收集约0.50-0.75mL全血。将血转移至肝素化试管中，置于冰上直到离心。离心后，将血浆置于冰上直至于-70℃冷冻，然后运送至吸收系统。
血浆样品分析
样品用下列方法进行分析：
给药溶液的制备
给药溶液通过将15.2mg曲前列环素二乙醇胺(12.0mg游离酸形式)与24mL 5％葡萄糖混合制备。然后超声该溶液直到溶解，最终浓度为0.5mg/mL。给药溶液的最终pH为4.6。给药时，该给药溶液为澄清和均匀。
标准品和样品的制备
为了测定大鼠血浆样品中曲前列环素的浓度，用收集在肝素中的大鼠血浆制备标准品，使分别含1000、300、100、30、10、3、1和0.3ng/mL曲前列环素，所用肝素从Lampire生物实验室(Lot#021335263)获得。血浆标准品与血浆样品同样方法处理。
血浆样品经固相萃取制备。萃取板平衡后，将150μL血浆样品置于孔中并抽真空。然后萃取床用600μL乙腈∶去离子水(25∶75)(含0.2％甲酸)洗涤。化合物用600μL90％乙腈和10％乙酸铵洗脱。收集洗脱液并蒸发至干。残渣再用150μL乙腈∶去离子水(50∶50)(含0.5μg/ml1-丁基-3-对甲苯磺酰基脲(用作内标))重新组成。
HPLC条件
色谱柱：Keystone Hypersil BDS C1830×2mm i.d.，3μm。
流动相缓冲液：25mM NH4OH至pH 3.5w/85％甲酸。
储器A：10％缓冲液和90％水。
储器B：10％缓冲液和90％乙腈。
流动相组成：
梯度程序：
  时间   持续时间   梯度曲线   ％A   ％B
  -0.1   0.10   0   80   20
  0   3.00   1.0   10   90
  3.00   1.00   1.0   0   100
  4.00   2.00   0   80   20
流速：300μL/min
进样量：10μL
运行时间：6.0min.
保留时间：2.6min.
质谱
仪器：PE SCIEX API 2000
接口：电喷雾(″Turbo离子喷雾″)
方式：多反应监控(MRM)
  前体离子   产物离子
  曲前列环素   389.2   331.2
  IS   269.0   170.0
喷雾气体：25干燥气体：60，350℃屏障气体：25
离子喷雾：-5000V
孔：-80V  环：-350V    Q0：10V  IQ1：11V
ST：15V
R01：11V  IQ2：35V R02：40V IQ3：55V R03：45V
CAD气体：4
方法验证
表2列出了大鼠血浆曲前列环素峰值平均回收率(n＝6)和变异系数(c.v.)。所有样品均与用50∶50 dH2O∶乙腈(含0.5μg/mL 1-丁基-3-对甲苯磺酰基脲)制备的标准曲线比较，以确定曲前列环素从血浆中回收的百分率。
表2：方法的准确度和精密度
  峰浓度   回收百分率   变异系数
  1000ng/mL   85.6   5.2
  100ng/mL   89.6   11.6
  10ng/mL   98.8   7.0
药代动力学分析
对各时间点的平均血浆浓度进行了药代动力学分析。
数据用药代动力学程序WinNonlin v.3.1(2)进行非房室分析。
结果
临床观察
在开始试验前，应注意曲前列环素的上限-药理剂量必须达到能以适当灵敏度分析的血浆浓度。用1mg/kg的剂量，在静脉内和门静脉内给药的动物中观察到某些副作用。
给药五分钟后，所有静脉内给药的大鼠均显示出极度嗜眠的迹象，但是给药后三十分钟完全恢复正常活动。另外，给药后十五分钟，所有三只门静脉内给药的动物显示出嗜眠的迹象。在取三十分钟样品前，有一只大鼠(#123)死亡。其他大鼠完全恢复。其余动物在给予化合物后未显示出任何副反应。
样品分析
各给药途径的平均血浆浓度列于表3。
表3
平均(n＝3)血浆浓度(ng/mL)
Figure BSA00000721150400531
*n＝2，
λ浓度在定量分析方法的限度之下(LOQ)
静脉内、门静脉内、十二指肠内、结肠内和口服给药的血浆浓度对时间曲线如图1和2所示。图3显示所有五种给药途径的平均血浆浓度对时间曲线。在这些图所显示的试验中，使用二乙醇胺盐。表4显示所测定的曲前列环素的药代动力学参数。各大鼠个体的生物利用度列于表5。
表4
大鼠中曲前列环素平均生物利用度和药代动力学参数
Figure BSA00000721150400541
*归一化至大鼠的平均重量
ND：未测定
Ψ推断值
表5
大鼠个体的曲前列环素生物利用度
Figure BSA00000721150400551
NA：不适用
ND：未测定
结论
曲前列环素的末旗血浆半衰期为94分钟。曲前列环素的分布相具有10.3分钟的半衰期，并且该化合物超过90％的分布和消除出现在给药后60分钟。分布体积(Vd＝1.98L/kg)大于大鼠体内总水量(0.67L/kg)，提示其在组织内更广泛的分配。曲前列环素的全身清除率(88.54mL/min/kg)大于肝血流量，表明该化合物的消除涉及肝外清除机制。
曲前列环素的首过肝消除致使平均门静脉内生物利用度为40.3％。十二指肠内、结肠内和口服给药后观察到迅速但不完全的吸收(Tmax≤5min)。通过将门静脉内生物利用度(40.3％)和十二指肠内的生物利用度(24.1％)相比，发现似乎约60％的化合物在肠内被吸收。平均十二指肠内生物利用度几乎比口服生物利用度大三倍，提示曲前列环素在胃中的降解或胃排空可能影响其全身吸收的程度。
实施例2
在该实施例中，在经口给予雄性Sprague-Dawley大鼠单剂量的下列化合物后，测定曲前列环素浓度：
Figure BSA00000721150400561
曲前列环素苄酯
Figure BSA00000721150400562
曲前列环素二甘氨酸酯
Figure BSA00000721150400571
曲前列环素甲酯
实验
给药溶液的制备
所有给药溶媒均在给药前少于2小时制备。
1.曲前列环素甲酯
曲前列环素甲酯溶液通过将2.21mg曲前列环素甲酯溶解于0.85mL二甲基乙酰胺(DMA)制备。然后用7.65mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀释该溶液。给药溶媒的最终浓度为0.26mg/mL曲前列环素甲酯，相当于0.25mg/mL曲前列环素。给药溶媒在给药时为澄清溶液。
2.曲前列环素苄酯
曲前列环素苄酯溶液通过将2.58mg曲前列环素苄酯溶解于0.84mL二甲基乙酰胺(DMA)制备。然后用7.54mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀释该溶液。给药溶媒的最终浓度为0.268mg/mL曲前列环素苄酯，相当于0.25mg/mL曲前列环素。给药溶媒在给药时为澄清溶液。
3.曲前列环素二甘氨酸酯
曲前列环素二甘氨酸酯溶液通过将1.86mg化合物溶解于0.58mL二甲基乙酰胺(DMA)制备。然后用5.18mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀释该溶液。给药溶媒的最终浓度为0.323mg/mL曲前列环素二甘氨酸酯，相当于0.25mg/mL曲前列环素。给药溶媒在给药时为澄清溶液。
动物给药
给予各前药后曲前列环素的血浆浓度用Sprague-Dawley雄性大鼠评价。大鼠购自Hilltop Lab Animals(Scottdale，PA)。动物从Hilltop运送至吸收系统的West Chester大学设施(West Chester，PA)。在用于该研究之前至少在其中饲养二十四小时。给药前动物禁食约16小时。将用于该研究的大鼠分成三组(I、II和III)。组I-III在同一天给药。
动物的重量和给药方案列于表6。
表6-研究设计
Figure BSA00000721150400581
*该前药剂量＝0.500mg/kg活性曲前列环素
动物通过经口管饲给药。血样在下列时间点从颈静脉插管内取样：
0(给药前)、5、15、30、60、120、240、360和480分钟
取血样并置于含30μL 500单位/mL肝素盐水溶液的试管中，以13,000rpm离心10分钟。然后移取约200μL血浆并分散在含4μL乙酸的合适标记的聚丙烯试管中，以稳定样品中剩余的任何前药。于-20℃冷冻血浆样品并连冰一起转移至吸收系统Exton设施。将它们储存于-80℃冰箱待分析取用。
血浆样品分析
血浆样品按实施例1所描述方法分析。简而言之，通过液-液萃取法从血浆中萃取曲前列环素，然后进行LC/MS/MS分析。分析验证结果在实施例1中已报道。分析方法的定量下限(LLOQ)为0.01ng/mL。不测定样品中的未变化前药。
分析运行的接受标准
每次分析时采用每条曲线最少五个点的两条标准曲线和最少两个质量控制样品(QCs)。将各给药途径通过用于后-计算的标准曲线括入括弧。为了使运行被接受，标准品和QCs必须在±15％(20％，LLOQ)准确度和精密度内。至少75％的所有标准品和QCs必须通过接受标准。
药代动力学分析
在各时间点，对每只大鼠的曲前列环素血浆浓度进行了药代动力学分析，并对各时间点上各组中所有三只大鼠的平均血浆浓度进行了药代动力学分析。数据用药代动力学程序WinNonlin v.3.1(2)进行非房室分析。
结果
研究观察
经口给予曲前列环素甲酯、曲前列环素苄酯或曲前列环素二甘氨酸酯后，未观察到副反应。
酸化大鼠血浆中前药的血浆稳定性
为了终止前药向活性物质的任何转化，取样后将血浆酸化。在离心除去红细胞之后，向各血浆样品中立即加入乙酸(v/v)至浓度为2％。在体外进行了各前药血浆稳定性的测试，以确保化合物在酸化血浆中稳定。进行该测试时，向从Lampire Biological获得的空白大鼠血浆中加入2％乙酸。加入前药前，于37℃平衡该酸化大鼠血浆三分钟。各前药最初的浓度为1000ng/mL。于0、60和120分钟取100μL等分血浆(n＝3，每时间点)。将各等分试样与20μL HCl合并并旋转。然后进行液-液萃取并测定各样品中的曲前列环素浓度。酸化大鼠血浆中各时间点的曲前列环素浓度列于表7。少量的曲前列环素似乎存在于纯曲前列环素甲酯和曲前列环素二甘氨酸酯化合物样品中。在整个试验过程中曲前列环素的浓度保持不变，表示在酸化血浆中未发生前药向活性化合物的转化。
表7-酸化大鼠(dog)血浆中前药的血浆稳定性
Figure BSA00000721150400601
给予曲前列环素甲酯、曲前列环素苄酯或曲前列环素二甘氨酸酯后的平均曲前列环素血浆浓度如表8所示。
表8-曲前列环素浓度(平均值±SD(n＝3)血浆浓度(ng/mL)
Figure BSA00000721150400611
*由于所收集的样品量不足，该时间点为n＝2大鼠的平均值
图4-7包含给予各前药后大鼠中曲前列环素血浆浓度对时间曲线。表9列出了各图和所显示的信息。
表9-附图目录
药代动力学分析
测定了前药相对于基于实施例1的活性化合物的生物利用度，实施例1中给予大鼠曲前列环素。使用下列公式确定相对生物利用度(F)：
相对F＝(AUC(前药剂量)/剂量)/(AUC(曲前列环素剂量)/剂量)*100
也测定了相对于实施例1中确定的大鼠曲前列环素静脉内剂量的生物利用度。结果列于表10。
表10-大鼠中曲前列环素的平均相对生物利用度和药代动力学参数
Figure BSA00000721150400621
结论
在该研究中，用大鼠测定了曲前列环素前药的相对口服生物利用度。曲前列环素甲酯致使曲前列环素的血浆浓度对时间曲线下面积(AUCs)小于给予活性化合物后的AUCs。前药曲前列环素苄酯和曲前列环素二甘氨酸酯的曲前列环素平均AUCs均大于给予活性化合物后的AUCs。曲前列环素二甘氨酸酯具有433％的最高相对生物利用度，超过4倍多的曲前列环素进入全身循环。给予曲前列环素二甘氨酸酯后曲前列环素的Cmax9ng/mL出现在给药后240分钟。给予曲前列环素后的Cmax为5ng/mL并且仅出现在给药后5分钟。曲前列环素苄酯的相对生物利用度为226±155％，Cmax7.2ng/mL出现在给药后120分钟。应注意：AUCs不应被外推至无限大。
参考文献
1.WinNonlin User′s Guide，3.1版，1998-1999，Pharsight Co.，Mountain View，CA 94040。
实施例3
该实施例举例说明了经十二指肠单剂量给予曲前列环素及各种本发明前药后的曲前列环素药代动力学研究。
在该研究中，比较了经十二指肠内单剂量给予曲前列环素单磷酸酯(环状)、曲前列环素单缬氨酸酯(环状)、曲前列环素单丙氨酸酯(环状)或曲前列环素单丙氨酸酯(链状)、曲前列环素前药后，雄性Sprague-Dawley大鼠中曲前列环素的曲线下面积。这些化合物如下所示：
Figure BSA00000721150400631
具有下列取代基：
Figure BSA00000721150400632
实验部分
给药溶液的制备
在给药前少于2小时制备所有给药溶媒。
1.曲前列环素单磷酸酯(环状)
曲前列环素单磷酸酯(环状)的给药溶液通过将1.01mg曲前列环素单磷酸酯(环状)溶解于0.167mL二甲基乙酰胺(DMA)制备。该溶液进一步用1.50mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀释。给药溶媒的最终浓度为0.603mg/mL前药，相当于0.5mg/mL曲前列环素。给药溶媒在给药时为澄清溶液。
2.曲前列环素单缬氨酸酯(环状)
曲前列环素单缬氨酸酯(环状)的50mg/mL溶液用二甲基乙酰胺(DMA)制备。然后用175μLDMA和1.8mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀释25μL等分试样的50mg/mL储液。给药溶媒的最终浓度为0.625mg/mL前药，相当于0.5mg/mL曲前列环素。给药溶媒在给药时为澄清溶液。
3.曲前列环素单丙氨酸酯(环状)
曲前列环素单丙氨酸酯(环状)溶液通过将1.05mg曲前列环素单丙氨酸酯(环状)溶解于0.178mL二甲基乙酰胺(DMA)制备。该溶液进一步用1.60mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀释。给药溶媒的最终浓度为0.590mg/mL曲前列环素单丙氨酸酯(环状)，相当于0.5mg/mL曲前列环素。给药溶媒在给药时为澄清溶液。
4.曲前列环素单丙氨酸酯(链状)
曲前列环素单丙氨酸酯(链状)溶液通过将0.83mg曲前列环素单丙氨酸酯(链状)溶解于0.14mL二甲基乙酰胺(DMA)制备。该溶液进一步用1.26mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀释。给药溶媒的最终浓度为0.591mg/mL曲前列环素单丙氨酸酯(链状)，相当于0.5mg/mL曲前列环素。给药溶媒在给药时为澄清溶液。
动物给药
经口给予各前药后曲前列环素的血浆浓度用Sprague-Dawley雄性大鼠评价。十二只大鼠购自Hilltop Lab Animals(Scottdale，PA)。动物从Hilltop运送至吸收系统West Chester大学设施(West Chester，PA)。在用于该研究之前至少在其中饲养二十四小时。给药前动物禁食约16小时。将12只用于该研究的大鼠分成四组。所有组在该研究的第1天给药。动物的重量和给药方案列于表11。
表11
Figure BSA00000721150400651
*该前药剂量＝0.500mg/kg曲前列环素
动物通过十二指肠内留置插管给药。血样在下列时间点从颈静脉插管中取样：0(给药前)、5、15、30、60、120、240、360和480分钟。
取血样并置于含30μL 500单位/mL肝素盐水溶液的试管中，以13,000rpm离心10分钟。然后移取约200μL血浆并分散在含4μL乙酸的合适标记的聚丙烯试管中，以稳定样品中剩余的任何前药。于-20℃冷冻血浆样品并连冰一起转移至吸收系统Exton设施。将它们储存于-80℃冰箱待分析取用。
血浆样品分析
血浆样品用上述方法分析。简而言之，通过固相萃取法从血浆中萃取曲前列环素，然后进行LC/MS/MS分析。分析方法的定量下限(LLOQ)为0.03ng/mL。
分析运行的接受标准
每次分析时采用每条曲线最少五个点的四条标准曲线和最少3个浓度的两个质量控制样品(QCs)。将各前药组通过用于后-计算的标准曲线括入括弧。为了使运行被接受，标准品和QCs必须在±15％(20％，LLOQ)准确度和精密度内。至少75％的所有标准品和QCs必须通过接受标准。
药代动力学分析
在各时间点，对每只大鼠的曲前列环素血浆浓度进行了药代动力学分析，并对各时间点上各组中的所有三只大鼠的平均血浆浓度进行了药代动力学分析。
数据用药代动力学程序WinNonlin v.3.1(2)进行非房室分析。
结果
研究观察
经十二指肠内给予曲前列环素单磷酸酯(环状)、曲前列环素单缬氨酸酯(环状)、曲前列环素单丙氨酸酯(环状)或曲前列环素单丙氨酸酯(链状)后，未观察到副反应。
酸化大鼠血浆中前药的离体血浆稳定性
为了终止前药向活性物质的任何转化，取样后将血浆酸化。在分离红细胞之后，向各血浆样品中立即加入乙酸(v/v)至浓度为2％。在体外进行了各前药血浆稳定性的测试，以确保化合物在酸化血浆中稳定。进行该测试时，向从Lampire Biological获得的空白大鼠血浆中加入2％乙酸。加入前药前，将该酸化大鼠血浆于室温放置三分钟。各前药最初的浓度为1000ng/mL。于0、60和120分钟取100μL血浆等分试样(n＝3，每时间点)。如上所描述进行各血浆样品的样品制备并监控曲前列环素的浓度。
在该试验的两小时内，在任何含前药的酸化血浆样品中曲前列环素浓度未增加。
样品分析
给予曲前列环素单磷酸酯(环状)、曲前列环素单缬氨酸酯(环状)、曲前列环素单丙氨酸酯(环状)或曲前列环素单丙氨酸酯(链状)后的平均曲前列环素血浆浓度如表12所示。
表12：平均值±SD(N＝3)
血浆曲前列环素浓度(NG/ML)
Figure BSA00000721150400671
图8-12包含给予各前药后大鼠中曲前列环素血浆浓度对时间的曲线。表13列出了各图和所显示的信息。
表13
  图   说明
  8  十二指肠内给予曲前列环素单磷酸酯(环状)
  9  十二指肠内给予曲前列环素单缬氨酸酯(环状)
  10  十二指肠内给予曲前列环素单丙氨酸酯(环状)
  11  十二指肠内给予曲前列环素单丙氨酸酯(链状)
  12  十二指肠内给予各前药与实施例1中的曲前列环素单独给药比较
药代动力学分析
测定了前药相对于基于前述研究的活性化合物的生物利用度，前述研究中给予大鼠曲前列环素。使用下列公式确定相对生物利用度(F)：
相对F＝(AUC(前药剂量)/剂量)/(AUC(曲前列环素剂量)/剂量)*100
用实施例1中测定的大鼠曲前列环素静脉内给药数据，也估算了绝对生物利用度。结果列于表14。
表14
附图目录
  图  说明
  8  十二指肠内给予曲前列环素单磷酸酯(环状)
  9  十二指肠内给予曲前列环素单缬氨酸酯(环状)
  10  十二指肠内给予曲前列环素单丙氨酸酯(环状)
  11  十二指肠内给予曲前列环素单丙氨酸酯(链状)
  12  十二指肠内给予各前药与实施例1中的曲前列环素单独给药比较
结论
用大鼠测定了曲前列环素四个前药的相对十二指肠内生物利用度。所有化合物的相对十二指肠内生物利用度均小于活性化合物的。曲前列环素单磷酸酯(环状)和曲前列环素单丙氨酸酯(环状)分别具有最高相对十二指肠内生物利用度56％和38％。曲前列环素单磷酸酯(环状)和曲前列环素单丙氨酸酯(链状)的Tmax出现在给药后5分钟。曲前列环素单缬氨酸酯(环状)、曲前列环素单丙氨酸酯(环状)具有更长的吸收时间，其Tmax值分别为120和60分钟。曲前列环素单磷酸酯(环状)和曲前列环素单丙氨酸酯(链状)给药后的最大曲前列环素浓度最高。它们给药后5分钟达到约9ng/mL。当测定曲前列环素血浆水平时，十二指肠内给药的生物利用度比口服给药的大得多。
参考文献
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实施例4
在该实施例中，经口或十二指肠内单剂量给予雄性Sprague-Dawley大鼠下列结构II化合物后，测定曲前列环素浓度：
Figure BSA00000721150400691
结构II化合物具有下列取代基：
Cpd.   R1   R2   R3
A   -CH2CONH2   H   H
B   -CH2CON(CH2)2OH   H   H
C   -CH2CON(CH3)2   H   H
D   -CH2CONHOH   H   H
E   -CH2C6H4NO2(p)*   H   H
F   -CH2C6H4OCH3(p)*   H   H
G   -CH2C6H4Cl(o)*   H   H
H   -CH2C6H4(NO2)2(o，p)*   H   H
I   -CH2C6H4F(p)*   H   H
J   H   -PO3H3   H
K   H   H   -PO3H3
L   H   -COCH2NH2   H
M   H   H   -COCH2NH2
N   H   -COCH(CH3)NH2   H
O   H   H   -COCH(CH3)NH2
P   H   -COCH(CH3)NH2   -COCH(CH3)NH2
*-o表示邻位取代，m表示间位取代，p表示对位取代。
这些化合物的实例包括：
Figure BSA00000721150400701
Figure BSA00000721150400711
前药的制备和分析将按上述实施例1和2所述方法进行。另外，曲前列环素、曲前列环素钠及实施例2和该实施例所示化合物将与各种不同p-糖蛋白抑制化合物以不同浓度、以极接近或同时给予并测试口服生物利用度，以确定p-糖蛋白抑制剂对这些化合物的口服生物利用度的影响。p-糖蛋白抑制剂将静脉内和口服给药。
实施例5
曲前列环素二乙醇胺的临床研究
介绍
在用UT-15C(曲前列环素二乙醇胺)的缓释(SR)固体剂型直接进入临床研究之前，进行了口服“即时释放”溶液的药代动力学测定。第一项临床研究(01-101)评估了剂量逐渐增高的UT-15C口服溶液达到血浆可检测水平的能力、潜在的剂量-血浆浓度关系、生物利用度和UT-15C的总安全性。以模拟缓释制剂释放药物的方式，用大约8小时给予志愿者该溶液。
第二项临床研究(01-102)评价了两种SR固体剂型原型(即1.微丸胶囊和2.片剂)达到血浆可检测水平的能力和食物对这些血浆药物浓度的潜在影响。SR原型设计成在大约8小时的时间内释放UT-15C。
两项临床研究的细节描述如下。
临床研究01-101
多次逐渐增高剂量给予健康成人志愿者UT-15C(曲前列环素二乙醇胺)口服溶液的安全性、耐受性和药代动力学研究(包括生物利用度的研究)。
给予24个健康志愿者UT-15C口服溶液，评价UT-15C的安全性和药代动力学曲线以及其生物利用度。为了模拟SR释放特征，每两小时给予四个剂量：0.05mg/剂量(总量＝0.2mg)、0.125mg/剂量(总量＝0.5mg)、0.25mg/剂量(总量＝1.0mg)或0.5mg/剂量(总量＝2.0mg)。研究终点包括标准安全性评价(不良事件、生活征、实验室参数、体格检查及心电图)以及药代动力学参数。
所有患者接受所有四个预定剂量并完成全部研究。给予UT-15C口服溶液剂量后，可检测到所有患者的曲前列环素血浆浓度。AUCinf和Cmax均以线性方式随每四个剂量等分剂量增加。在2.0mg UT-15C总剂量的第三个0.25mg溶液等分剂量后，在该研究中观察到的最高浓度为5.51ng/mL。基于曲前列环素钠静脉内给药历史数据，UT-15C在0.2mg、0.5mg、1.0mg和2.0mg剂量的平均绝对生物利用度值分别估算为21％、23％、24％和25％。该研究结果分别如图13A-13D所示。
在所有设定的剂量下，大多数患者对UT-15C都能很好地耐受。无血液学、临床化学、尿分析、生活征、体格检查和ECGs的临床显著、治疗紧急变化。最常见的不良事件为面红、头痛和头晕。UT-15C(曲前列环素二乙醇胺)的该安全性特征与报道的安全特性征、Remodulin(曲前列环素钠)的产品标签及其他前列环素类似物一致。因此，按照特定的给药方案(即一天总剂量分成每2小时给予的四个单剂量)，改变曲前列环素盐的形式不引起任何意外的安全性问题。
临床研究01-102
比较给予禁食和进食状态的健康成人志愿者单剂量UT-15C(曲前列环素二乙醇胺)缓释胶囊和片剂的安全性、耐受性和药代动力学研究。
01-102研究设计为评价和比较在禁食和进食状态下(l)UT-15CSR片剂原型和(2)UT-15C SR胶囊原型(微丸胶囊)的安全性和药代动力学曲线。各SR剂型设计成在大约8小时内释放UT-15C(1mg)。分配十四位健康成人志愿者接受SR片剂，而分配另外十四位志愿者接受SR胶囊剂。在禁食和进食状态下患者随机接受单剂量(1mg)他们所分配的SR原型。采用七天间歇期分隔进食/禁食状态的交叉设计。在该研究的进食部分，患者接受高卡路里、高脂肪餐。研究终点包括标准安全性评价(不良事件、生活征、实验室参数、体格检查及心电图)以及药代动力学参数。
所有服用UT-15C SR片剂和胶囊的患者均具有可检测的曲前列环素血浆浓度。零至二十四小时曲线下面积(AUC0-24)的计算显示总暴露于UT-15C SR以下列顺序出现：片剂进食＞胶囊禁食＞片剂禁食＞胶囊进食。图14显示在禁食和进食状态下两制剂的药代动力学曲线。
大多数患者对UT-15C SR片剂和胶囊都能耐受。所有不良事件的严重程度为轻至中等，并类似于研究01-101及Remodulin产品标签中所描述的。另外，在整个研究过程中无生活征、实验室参数、体格检查或心电图的治疗紧急变化。
这些结果显示：可从UT-15C的固体剂型获得可检测和潜在治疗药物浓度，这些浓度可通过缓释制剂技术在延长的时间内维持。
曲前列环素二乙醇胺的多晶型物
鉴别出UT-15C的两种晶型以及无定形形式。第一种为亚稳态，称为晶型A。第二种在热力学上更稳定，为晶型B。每种形式均描述了其特征，并进行了互变研究以证明何种形式是热力学稳定的。根据表15中的方法制备了晶型A。晶型B以表16的方法、由晶型A制备。
表15
Figure BSA00000721150400751
a.FE＝快速蒸发；SE＝缓慢蒸发；SC＝缓慢冷却
b.IS＝不足的样品；PO＝优选取向；LC＝低结晶度；pk＝峰
c.XRPD＝X-射线粉末衍射
表16
Figure BSA00000721150400761
a.加入样品#1480-58-01(A+B)的晶种
b.样品未分析
晶型的特征描述：
晶型A
用X-射线粉末衍射(XRPD)、差式扫描量热法(DSC)、热重量分析法(TG)、热态显微镜检查、红外(IR)和拉曼光谱以及水分吸收描述了合成的最初物质(称为晶型A)。晶型A的代表性XRPD如图15所示。晶型A的IR和拉曼光谱分别如图16和17所示。晶型A的热数据如图18所示。DSC热分析图显示于103℃有热吸收并且熔化(热态显微镜检查)。观察到样品从冷却的熔化物中重新析出针状结晶。TG数据显示最高达100℃测量不到失重，提示该物质不是溶剂化物。水分吸收数据如图19所示。在试验过程中晶型A物质显示明显的增重(＞33％)(开始在65-75％RH之间)，提示该物质易吸湿。另外，用大约52％RH和68％RH的湿度室评价了曲前列环素二乙醇胺的吸湿性。在～52％RH和～68％RH的湿度室中23天后，观察到样品分别增重4.9％和28％。
基于上述特征数据，晶型A为结晶态、无水物质，它易吸湿并于103℃熔化。
晶型B
晶型B曲前列环素二乙醇胺由如表16所示的在1，4-二氧六环和甲苯中加热晶型A的浆状物(50℃)制备。从1，4-二氧六环中分离的物质用于晶型B的全部特征描述。晶型B的代表性XRPD图如图20所示。晶型A和晶型B的XRPD图类似，然而，在大约12-17°2θ(图20)的范围内观察到明显的不同。
晶型B的热数据如图21所示。DSC热分析图(样品ID 1557-17-01)显示于107℃有单一吸热线，与熔化情况一致(由热态显微镜检查测定)。TG显示最高达100℃有最小失重。
晶型B的水分吸收/解吸数据如图22所示。在5％RH有最小失重并且于95％RH物质吸收大约49％水。在从95％降到5％RH解吸时，样品损失大约47％。
晶型A和晶型B很容易用DSC曲线检测。基于上述特征数据，晶型B显然为在107℃熔化的结晶态物质。
热力学性质：
为了确定在不同温度下热力学上最稳定的形式，进行了互变试验。这些研究用晶型A和晶型B物质在两种不同的溶剂中进行，数据归纳于表17。在异丙醇中的试验显示于室温、15℃和30℃，分别在7天、11天和1天后，完全转化为晶型B。在四氢呋喃中的试验也显示于室温、15℃和30℃条件下，转化为晶型B。于15℃11天后和于30℃1天后，获得完全转化。然而，在室温条件下，根据获得的XRPD数据，7天后仍有少量晶型A。延长打浆时间可能出现完全转化。基于这些打浆互变试验，晶型B显然是热力学上最稳定的形式。晶型A和晶型B似乎单向转变性相关，且晶型B在热力学上更稳定。
表17
曲前列环素二乙醇胺的互变研究
Figure BSA00000721150400781
a.样品ID 1557-21-03饱和溶液
b.样品ID 1519-96-03饱和溶液
c.样品ID 1519-96-02饱和溶液
d.在加入固体之前制备的饱和溶液
e.曲前列环素二乙醇胺的未分析样品的溶解度(于50℃)非常高并且溶液变色。
本文中公开的所有参考文献通过引用结合到本文中。
虽然举例说明并描述了优选的实施方案，但应理解可根据本领域常规技能进行修改和改变，而不背离本文中所定义的本发明广义范围。

Claims (11)

1.以下结构的化合物在制备用于治疗患者中的缺血性疾病的药物中的应用：
Figure FSA00000721150300011
2.权利要求1的应用，所述化合物在约107℃熔化。
3.权利要求1的应用，所述化合物的X-射线粉末衍射图谱如图20所示。
4.权利要求1的应用，所述患者为人。
5.权利要求1的应用，所述药物为口服药物。
6.权利要求1的应用，所述药物为缓释制剂。
7.权利要求1的应用，所述药物为缓释胶囊。
8.权利要求1的应用，所述药物为缓释片剂。
9.权利要求1的应用，所述缺血性疾病是雷诺现象。
10.权利要求1的应用，所述缺血性疾病是硬皮病。
11.权利要求1的应用，所述缺血性疾病是肾机能不全。
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