CN102565216A - 基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次建立了基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法，包括供试品溶液的制备、色谱条件的选择、测定、对照图谱的绘制以及样品的质量检测的步骤。进一步地，本发明以远志酸为对照品，建立远志HPLC标准指纹图谱，它能有效、准确地表征远志的质量。本发明的基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法能全面有效地监控远志的质量，保证其质量的稳定、均一、可控。具有方法简便，稳定性好、精密度高、重现性好等优点，可快速、准确地鉴别产品的优劣，为药品的质量检测提供可靠的依据。

Description

基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种远志的质量检测方法，具体地说，涉及一种基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法。

背景技术

远志为常用大宗药材，栽培区域分布广泛。近年来用远志开发了几百个新药、特药、中成药，随着市场需求量逐年增长，生产“安全、优质、稳定、可控”的，符合国内外对远志生产的技术与质量要求的远志药材，将带来巨大的社会经济效益。

由于产地不同，或采收季节不同，远志内在质量存在很大的差异，仅以其中指标成分远志酸的检测结果为例，含量上的差异可达到几倍。远志酸是远志中一个重要的有效成分，而含量相差悬殊，会导致制剂的内在质量失去可控性，其临床疗效更是无法保证。这样，势必导致产品内在质量难以保证，无法达到临床效果。中药材质量的不可控性，是制约我国传统中药走向世界的一个难以解决的瓶颈问题。

到目前为止，在中药生产和流通中，还没有一种质量控制手段能够全面地、综合地反映出中药产品的质量变异，可以有效地进行全过程的质量控制。通过对远志的系统研究，证明采用高效液相色谱方法(High Performance LiquidChromatography，HPLC)用指纹图谱作为质控标准是可行的。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：采用索氏提取法，具体为：精密称取不同来源的供试品远志粉末2g，置索氏提取器中，加入甲醇100ml，加热回流5h，减压浓缩提取液，回收甲醇至干；在上述提取物粉末中分别加入20ml的乙醚、乙酸乙酯及水饱和正丁醇超声，每次0.5h，分别回收乙醚、乙酸乙酯或正丁醇部位溶剂至干，加70％甲醇定容至10ml容量瓶，即得；

(2)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈-0.05％磷酸溶液梯度洗脱，洗脱梯度见表1；柱温30℃；流速1.0ml·min^-1；紫外检测波长为314nm；

表1乙腈-0.05％磷酸溶液梯度洗脱

(3)测定：精密吸取各供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，得到远志指纹图谱；

(4)对照图谱：采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对各供试品的指纹图谱进行分析，生成远志对照指纹图谱；

(5)远志样品的质量检测：取远志粉末样品，按步骤(1)至步骤(3)同法操作，得到远志样品指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对所述样品指纹图谱和远志对照指纹图谱进行分析。

本发明还提供远志高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其是按照上述的方法构建23批远志高效液相色谱指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件生成由16个共有峰构成的远志高效液相色谱标准指纹图谱。

本发明进一步提供远志的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：精密称取远志酸对照品，加入甲醇制成每ml含374μg的溶液；

(2)样品溶液的制备：采用索氏提取法，具体为：精密称取不同来源的供试品远志粉末1g，置索氏提取器中，加入甲醇100ml，加热回流5h，减压回收甲醇至干，残渣加入10％稀盐酸20ml，沸水浴回流2h，冷却，过滤并用蒸馏水洗涤沉淀至中性，用甲醇溶解沉淀并定容至10ml，即得；

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以体积比为7∶3的甲醇-0.2％磷酸溶液洗脱；理论塔板系数以远志酸计7190；柱温30℃；流速1.0ml·min^-1；紫外检测波长为210nm；

(4)测定及标准曲线的绘制：分别精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10、15、20、25、30μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以对照品质量X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理，得回归方程：Y＝3.8663x-0.3909，R＝0.9999；

(5)样品远志酸含量的测定：精密吸取样品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录远志酸峰面积，计算远志酸含量。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明首次建立了基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法，有利于全面监控产品的质量，为药品的质量检测提供可靠的依据。

(2)本发明的方法以远志酸为对照品，建立的远志HPLC标准指纹图谱能有效、准确地表征远志的质量。

(3)本发明的质量检测方法能有效地监控远志的质量，保证其质量的稳定、均一、可控。具有方法简便，稳定性好、精密度高、重现性好等优点，可快速、准确地鉴别产品的优劣。

附图说明

图1为本发明方案I洗脱条件色谱图(314nm，S：4034826，11.89％(最高峰(s)面积占总峰面积百分比，下同)。

图2为本发明调整方案II洗脱条件色谱图(314nm，S1：4113125，11.21％)。

图3为本发明调整方案III洗脱条件色谱图(314nm，S2：4268599，12.45％)。

图4为本发明调整方案IV洗脱条件色谱图(314nm，S3：4069812，12.55％)。

图5为本发明调整方案V洗脱条件色谱图(314nm，S4：4274578，12.34％)。

图6为本发明调整方案VI洗脱条件色谱图(314nm，S5：4221269，12.29％)。

图7为本发明调整方案VII洗脱条件色谱图(314nm，S6：4314750，12.87％)。

图8为本发明远志指纹图谱精密度考察结果。

图9为本发明远志指纹图谱稳定性考察结果。

图10为本发明远志指纹图谱重现性考察结果。

图11为本发明远志药材共有模式对照指纹图谱。

图12为栽培远志与不同产地野生远志指纹图谱。

图13为不同采收月份与生长时间栽培远志指纹图谱。

图14为栽培与野生远志根心对照谱图。

图15为栽培与野生远志根心指纹图谱。

图16为远志标准品(上)与样品(下)色谱图。

图17为不同海拔与纬度样品中远志酸含量变化。

图18为不同生长月份远志药材与根心远志酸含量变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1远志高效液相色谱指纹图谱的建立

1.1仪器、试剂与材料

11.1仪器

2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；2996二级阵列检测器(DAD)(美国Waters公司)；Water化学色谱工作站(美国Waters公司)；索氏提取仪；BUG25-12超声仪；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。

1.1.2试剂

甲醇，乙腈为色谱纯，磷酸、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等为分析纯，水为重蒸水。

1.1.3材料

不同产地远志药材23份，栽培远志不同生长期药材5份，远志根心8份(表2和表3)。

1.2实验方法考察

1.2.1供试品制备方法考察

9.2.1.1供试品制备方案的筛选

以甲醇为提取溶剂，分别考察了索式提取法及超声提取法。

(1)索氏提取法

精密称取60℃下干燥至恒重的远志粉末约2g(过4号筛)，置索氏提取器中，加甲醇100ml，加热回流5h，减压浓缩提取液，回收甲醇至干，得远志总成分。

(2)超声提取法

精密称取60℃下干燥至恒重的远志粉末约2g(过4号筛)，置50ml具塞三角瓶中，加70％甲醇25ml，超声提取30min，静置、过滤，再加70％甲醇25ml，重复上述操作，将两次提取的滤液合并，减压浓缩提取液，回收甲醇至干。

在上述索氏或超声提取物粉末中分别加入乙醚、乙酸乙酯或水饱和正丁醇超声，每次0.5h，20ml，分别回收乙醚、乙酸乙酯或正丁醇部位溶剂至干，加适量溶剂定容，试验方法见表4。

1.2.1.2供试品溶液制备方法的确定

考察表4共15种供试品溶液制备方法，结果表明：用甲醇或70％甲醇提取远志总成分后再用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇分部位提取远志总成分，远志各部位所提成分的指纹图谱峰均在总成分指纹图谱峰中表达出来，且分离效果相同，因此选择总成分指纹图谱峰进行远志指纹图谱分析。

在远志总成分的提取方法中，以甲醇索氏提取、甲醇定容所得指纹图谱总峰面积最大，70％甲醇超声提取两次、70％甲醇定容所得指纹图谱总峰面积远大于70％甲醇超声提取两次、甲醇定容所得指纹图谱总峰面积，因而供试品溶液制备方法选择甲醇索氏提取5小时，再以70％甲醇定容至10ml容量瓶。

表2 HPLC指纹图谱测定不同产地远志样品

表3不同生长期与不同采收月份药材(去心)与根心样品

表4供试品溶液制备方法考察

1.2.2指纹图谱色谱条件的优化

1.2.2.1流动相梯度洗脱条件的筛选

用乙腈-0.05％磷酸水溶液不同比例(表5)，不同洗脱时间考察远志指纹图谱梯度洗脱条件。

表5方案I

该方案峰分离度较好(图1)，但所用洗脱时间太长，为此考察了以下调整方案(表6～表10，表1)。

表6调整方案II

表7调整方案III

表8调整方案IV

表9调整方案V

表10调整方案VI

表1调整方案VII

1.2.2.2流动相梯度洗脱条件的确定

检测波长为314nm时，各调整方案中(图2～图7)，各个最高峰(S1-S6)峰面积为S1：4113125、S2：4268599、S3：4069812、S4：4274578、S5：4221269、S6：431475，最高峰面积占总峰面积百分比为S1：11.21％、S2：12.45％、S3：12.55％、S4：12.34％、S5：12.29％、S6：12.87％。从上可以看出，最高峰面积占总峰面的百分比，方案VII的比列为最大，调整方案VII中指纹图谱峰形及峰的分离度与其它各方案图谱相比，均较好。

调整方案VII所确定洗脱条件缩短了梯度洗脱的时间，各峰分离度较好，参照峰峰高虽有所降低，但总峰面积增大，故将调整方案VII确定为指纹图谱梯度洗脱条件。

1.2.2.3指纹图谱检测波长的选择

在已确定远志指纹图谱洗脱条件下，对供试品进行全波长扫描，比较不同波长出峰情况，结果各个色谱峰在检测波长为314nm时峰形与分离度较好，保留时间适中，故选择检测波长为314nm。

1.2.2.4远志指纹图谱色谱条件的确定

经上述优化后的指纹图谱色谱条件为：色谱柱：Kromasil C₁₈(250mm×4.6mm ID，5μm)；流动相：乙腈-0.05％磷酸水溶液梯度洗脱，洗脱梯度见表1；运行时间70min；柱温30℃；流速1.0ml·min^-1；检测波长314nm。

1.2.3精密度试验

取批号为17的远志药材，按上述提取方法制备供试液，1天内连续进样6次，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。由表11和表12可知，本试验色谱指纹图谱的相似度不小于0.950，满足《中药注射液色谱指纹图谱实验研究技术指南》(试行)要求，对主要色谱峰的相对峰面积进行统计，RSD＜3.0％，表明试验仪器精密度良好(图8)。

表11精密度考察相对峰面积

表12精密度试验相似度

1.2.4稳定性实验

取批号为17的远志药材，按上述提取方法制备供试液，分别在0、3、6、9、12和24h进样，测得色谱指纹图谱的相似度不小于0.950，各共有色谱峰相对峰面积RSD＜3.0％，表明供试品溶液在24h内稳定(表13和表14)。

表13稳定性试验相似度

表14稳定性考察相对峰面积

稳定性考察结果如图9所示。

1.2.5重现性实验

取批号为17的远志药材6份，按上述提取方法制备供试液，考察各色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果如表15和表16所示，6份供试品色谱指纹图谱相似度不小于0.951，各共有色谱峰相对峰面积RSD＜3.0％，重现性良好。

表15重现性试验相似度

表16重现性考察相对峰面积

重现性考察结果如图10所示。

1.3样品测定

精密吸取供试品溶液15μl，注入高效液相色谱仪，记录70min色谱图。

1.4数据处理

用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”(国家药典委员会编)进行数据处理，生成对照图谱，计算样品相似度。

1.5指纹图谱的建立

1.5.1共有指纹峰的标定

采用相对保留时间标定共有指纹峰，以图谱中12号峰为内参比峰(图11)，将各指纹峰保留时间与同一图谱中内参比峰保留时间(设定为1)相比较，其比值为各指纹峰的相对保留时间。根据23批远志药材指纹图谱检测结果，计算各指纹峰相对保留时间，确定共有色谱峰16个，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”，生成远志药材共有模式对照指纹图谱(图11，表17)。

表17远志对照指纹图谱共有峰资料

1.5.2共有指纹峰的相对峰面积

通过23批药材测定，以图谱中12号峰为内参比峰(图11)，将各共有指纹峰面积与同一图谱中内参比峰的峰面积比较，其比值为共有指纹峰的相对峰面积。据“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求”规定，各共有指纹峰的面积比值必须相对固定：单峰面积占总峰面积≥20％，其差值＜20％；单峰面积占总峰面积≥10％而＜20％，其差值＜25％；单峰面积占总峰面积＜10％，峰面积比值不作要求，仅需检定相对保留时间。

1.5.3非共有峰面积

通过23批远志药材供试品的测定，统计各批非共有峰总面积与总峰面积的百分比，其结果符合指纹图谱研究不得大于10％的检测要求。

1.6结果与分析

1.6.1栽培远志与不同产区野生远志HPLC指纹图谱相似度评价

表18、图12中，S12、S13分别为山西省闻喜县与山西省农科院经作所栽培远志，其与对照色谱指纹图谱的相似度分别为0.886与0.951，可见远志野生变家栽后，其有效物质群与野生药材相比，相差非常小，栽培药材与野生药材质量相当。23批远志药材中与对照色谱指纹图谱的相似度大于0.9的有11批，大于0.8有22批，小于0.8的只有一批(S9山西忻州)。从上述结果可以看出，远志药材指纹图谱的相似度较高，不同居群远志有效物质群具有一定的稳定性，但不同产地的远志居群有效物质群仍具有一定的变异，因而远志药材生产应固定产地，加强道地药材的生产。

1.6.2不同采收月份与生长时间栽培远志指纹图谱分析

表19中不同采收月份与生长时期栽培远志指纹图谱与对照指纹图谱除S26外，相似度均大于0.891，可见远志不同采收月份有效物质群种类较为稳定，生长时间对远志有效物质种类影响不大。S26为生长6个月栽培远志，其与对照图谱相似度为0.805，但与其它月份远志指纹图谱相似度较低，不超过0.567，如图13，表20所示，S26指纹图谱所含主要色谱峰与其它生长月份远志基本相似，只是色谱峰面积比有所不同，其色谱峰面积大都大于其它生长月份远志的相应色谱峰。

表19不同采收月份与生长时间栽培远志指纹图谱相似度

表20不同采收月份与生长时间栽培远志指纹图谱共有峰

1.6.3栽培与野生远志根心指纹图谱分析

表21中栽培与野生远志根心指纹图谱与对照指纹图谱相似度分别为0.871、0.905、0.953、0.98、0.988、0.985、0.807、0.835，表明远志野生变家栽后，其根心物质群与野生远志根心相差非常小。远志根心对照图谱共有峰(图14和图15)与药材相差不大，只是含量较低，因而根心中也含有一定的有效物质，制药企业提取远志中某些化合物时，远志根心可以与药材一同作为原料使用。

表21栽培与野生远志根心指纹图谱相似度

实施例2远志指标成分远志酸含量测定

1.1仪器、试剂与材料

1.1.1仪器

戴安公司Summit HPLC，Detector UVD 170U，Column Thermostat TCC-100；浙江大学N2000色谱数据工作站，索氏提取器。

1.1.2试剂

甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)、重蒸水等。

对照品：远志酸(成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室提供)。

1.1.2材料

样品：远志药材21份(野生样品16份，栽培样品5份)，根心5份，叶11份(见表22～表24)。

已鉴定所有样品为远志Polygala tenuifolia Willd和卵叶远志P.sibirical L。

1.2试验方法

1.2.1色谱条件

采用18烷基硅烷键合硅胶色谱柱Welchrom C₁₈(5μm，250mm×4.6mm)；流动相甲醇-0.2％磷酸溶液(v∶v＝7∶3)；检测波长210nm；理论塔板系数以远志酸计7190；流速：1mL/min；柱温30℃；进样量：远志药材5μl、根心或叶20μl。标准品及样品色谱图见图16。

1.2.2供试品溶液的制备

取60℃下干燥至恒重的远志粉末(4号筛)约1g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇100ml，回流5小时，减压回收甲醇至干，残渣加10％稀盐酸20ml，沸水浴回流2h，冷却，过滤并用蒸馏水洗涤沉淀至中性，用甲醇溶解沉淀并定容至10ml，即得供试品溶液。

1.2.3对照品溶液的制备

精密称取远志酸对照品3.74mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得(每1ml含远志酸374μg)。

1.2.4标准曲线的绘制

分别精密吸取对照品溶液(0.374mg/ml)1、2、4、6、8、10、15、20、25、30μl进样，按上述色谱条件测定，以对照品质量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理，得回归方程：Y＝3.8663x-0.3909，R＝0.9999，远志酸在0.374～11.22μg与峰面积呈良好的线性关系。

1.2.5精密度试验

精密吸取同一远志供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，每次5μl，测定峰面积，RSD＝0.38％，表明精密度良好。

1.2.6稳定性试验

取同一远志药材供试液，室温放置，在上述色谱条件下，分别在0、3、6、9、12、24h进样1次，每次5μl，测定峰面积，计算远志酸含量，共考察24h，RSD＝0.31％，表明样品溶液在至少24h内稳定。

10.2.7重现性试验

精密称取同一样品6份，分别按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，按上述色谱条件测定远志酸含量，RSD＝2.87％，表明该方法重现性良好。

1.2.8加样回收率试验

精密称取已知含量的远志药材粉末各0.5g，共6份，按供试品溶液制备方法制得供试液，精密加入远志酸对照品溶液(浓度为0.374mg/ml)1ml，按上述色谱条件测定远志酸含量，计算回收率，见表25，结果远志酸平均回收率为98.45％，RSD＝2.80％。

表25加样回收率试验(n＝6)

1.3样品测定

分别取制备好的样品溶液，按上述色谱条件，进样，测定，记录远志酸峰面积，计算远志酸含量。

1.4结果与分析

采用Excell计算各样品远志酸含量，采用SPSS13.0进行F测验，比较各样品间远志酸含量差异，试验结果见表22～表24。

1.4.1产地对远志酸含量的影响

对山西、陕西、甘肃、四川四省16份药材远志酸含量测定结果表明(表22)，不同产地远志酸含量差异达极显著水平(P＝0.01，n＝3)，产地对远志次生代谢产物远志酸含量影响显著。

1.4.2纬度与海拔对远志酸含量的影响

海拔高度(422～2309m)与纬度(31°41′～39°31′)对远志酸含量具有一定影响(图17)。海拔高度在422～698m时远志酸含量较高，均大于1％，其余海拔高度远志酸含量一般不大于1％。纬度对远志酸积累的影响呈波浪形变化，纬度34°09′～35°52′、37°15′～39°31′，随着纬度的增高，远志酸含量呈下降趋势，在纬度35°52′～36°50′，远志酸含量呈上升趋势，总体上来说远志酸含量在纬度34°09′～35°20′区间含量较高，大于1％，该纬度区间山西闻喜、陕西西安等地也是远志主产区，可能与这些地区夏季高温干燥的气候环境有利于远志有效物质群的积累有关，可以选择这一区域建立远志GAP生产基地，远志酸含量在其余纬度区间一般不高于1％。

表22不同产地远志(去心)远志酸含量(n＝3)

远志酸是远志皂苷的水解产物，不同海拔地区远志酸含量存在一定差异，变化幅度0.45％～1.59％，平均含量0.86％。海拔高度在422～698m的地区远志酸含量明显高于其余海拔地区，随着海拔升高，远志酸含量呈现一定的下降趋势。

远志酸的积累通常是在一定的海拔高度与纬度下共同作用的结果，将二者结合起来分析，能够进一步接近远志酸积累的实际状况，为此将远志分布的纬度与海拔高度分别进行加权换算，以最高纬度39°31′与最高海拔高度2309m的加权数均为1，通过下式进行换算：

某远志加权数＝该远志纬度/39°55′+该远志海拔高度/2309

以远志加权数为横坐标，远志酸含量为纵坐标，绘制散点图(图17)，纬度与海拔加权数大于1.05时，随着加权数的增加，远志酸含量具有逐渐降低的趋势，纬度与海拔加权数在1.05～1.20、1.42时远志酸含量均较高，大于1％。

1.4.3生长期与采收月份对远志酸含量变化的影响

该试验以栽培远志“汾远1号”为试验材料，在大田栽培条件下进行试验，方差分析表明，不同生长时间与采收月份，远志酸含量达极显著差异(P＝0.01，n＝3)，2007年与2008年6、7、8三个月份采收远志的远志酸含量极显著高于同年10、11两个月份采收的远志，在2007年10月份与11月份采收的远志，远志酸含量相差不显著(P＝0.05，n＝3)。

由表23与图18可知，2008年不同月份采收的远志，远志酸含量均明显高于2007年同期采收的远志，可见远志栽培2～3年后采收，是合理的。在同一年中，远志酸含量随着生长时间的延长而逐渐降低，因此远志在达到生长年限后应选择6、7月份采收较好，这与传统的根类药材应在地上部分将要枯萎或枯后采收的观点有些不符，值得进一步研究。

2007年，生长2个月在11月采收的远志与生长8个月在10月采收的远志，远志酸含量差异不显著，说明远志酸积累不仅与生长年限有关，与远志收获月份也关系密切。由于“汾远1号”为系选材料，亲缘关系一致，生长于同一块试验田中，远志生长环境比较一致，因而远志酸含量差异只能由三个因素造成，一为远志生长发育阶段，二为远志生长年限，三为远志采收时期，本实验结果表明，远志酸生物积累与远志生长年限与收获时期密切相关，而与远志生长发育阶段关系可能并不密切。7月份采收远志酸含量较高，说明生产地在6～7月份的高温干燥环境能够刺激远志酸生物合成的各种关键酶，从而提高远志酸的生物积累，同一份试验材料在7月份采收时远志酸含量显著高于10月份远志，说明外界环境条件改变时，已经合成的远志酸能够自行分解，可见在进行远志规模化生产时，选择适宜的生长年限与采收时期比发育阶段更为重要，生长年限与采收期对远志药材质量影响较大。

1.4.4远志根心中远志酸含量变化

远志根心中含有一定量的远志酸(见表23，图18)，远志酸积累随生长期的延长有逐步增加的趋势，远志根心中远志酸积累模式与远志药材(远志根皮)有所区别，远志根心在2007或2008年同年中8～10月份远志酸含量逐渐增加，与远志药材中远志酸积累模式正好相反。远志根心与药材远志酸积累具有负相关的趋势，根心与药材远志酸积累是否具有相关性，有待进一步研究。

表23不同生长期与采收时间药材(去心)与根心远志酸含量(n＝3)

注：生长期不计算枯萎期(约六个月)

1.4.5远志叶中远志酸含量变化

对不同产地远志叶中远志酸含量测定表明(表24)，不同产地远志(Polygalatenuifolia Willd)叶中远志酸含量均非常低，几乎不含有远志酸，但四川荗县与九龙山卵叶远志叶(P.sibirical L)中远志酸含量较高，达0.4％以上，具有一定的开发价值。远志与卵叶远志叶中远志酸含量差异说明二者种间的遗传差异影响到了叶中化学成分的生物合成。

表24远志叶中远志酸含量(n＝3)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.基于高效液相色谱指纹图谱的远志的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：采用索氏提取法，具体为：精密称取不同来源的供试品远志粉末2g，置索氏提取器中，加入甲醇100ml，加热回流5h，减压浓缩提取液，回收甲醇至干；在上述提取物粉末中分别加入20ml的乙醚、乙酸乙酯及水饱和正丁醇超声，每次0.5h，分别回收乙醚、乙酸乙酯或正丁醇部位溶剂至干，加70％甲醇定容至10ml容量瓶，即得；

(2)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈-0.05％磷酸溶液梯度洗脱，洗脱梯度见下表；柱温30℃；流速1.0ml·min^-1；紫外检测波长为314nm；

乙腈-0.05％磷酸溶液梯度洗脱

(3)测定：精密吸取各供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，得到远志指纹图谱；

(4)对照图谱：采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对各供试品的指纹图谱进行分析，生成远志对照指纹图谱；

(5)远志样品的质量检测：取远志粉末样品，按步骤(1)至步骤(3)同法操作，得到远志样品指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对所述样品指纹图谱和远志对照指纹图谱进行分析。

2.远志高效液相色谱标准指纹图谱的构建方法，其特征在于，按照权利要求1或2所述的方法构建23批远志高效液相色谱指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件生成由16个共有峰构成的远志高效液相色谱标准指纹图谱。

3.远志的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：精密称取远志酸对照品，加入甲醇制成每ml含374μg的溶液；

(2)样品溶液的制备：采用索氏提取法，具体为：精密称取不同来源的供试品远志粉末1g，置索氏提取器中，加入甲醇100ml，加热回流5h，减压回收甲醇至干，残渣加入10％稀盐酸20ml，沸水浴回流2h，冷却，过滤并用蒸馏水洗涤沉淀至中性，用甲醇溶解沉淀并定容至10ml，即得；

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以体积比为7∶3的甲醇-0.2％磷酸溶液洗脱；理论塔板系数以远志酸计7190；柱温30℃；流速1.0ml·min-1；紫外检测波长为210nm；

(4)测定及标准曲线的绘制：分别精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10、15、20、25、30μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以对照品质量X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理，得回归方程：Y＝3.8663x-0.3909，R＝0.9999；

(5)样品远志酸含量的测定：精密吸取样品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录远志酸峰面积，计算远志酸含量。

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