CN102552698B - 铁皮石斛的药用用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种中药的新用途，即石斛抗衰老的作用用途，本发明以D-半乳糖致亚急性衰老小鼠模型和自然衰老小鼠模型，从整体水平观察石斛对衰老小鼠的影响，进行脏器系数的测定，对其重要脏器进行病理检查，以从整体上体现衰老的现象以及石斛抗衰老的作用，表明石斛能改善D-半乳糖致亚急性衰老小鼠子宫、卵巢等生殖器官的病理变化。而对于自然衰老模型，经过近2月的给药过程中，石斛也能明显地改善生殖器官的病变，抑制衰老的发展。

Description

铁皮石斛的药用用途
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及中药铁皮石斛的一种新的药用用途。
背景技术
《神农本草经》中记载：石斛“主伤中，除痹，下气，补五脏，虚痨羸瘦，强阴，久服厚肠胃”。李时珍的《本草纲目》记载：“强阴益精。久服，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱，定志除惊，轻身延年。益气除热，健阳，逐皮肤风痹，骨中久冷，补肾益力。治发热自汗，痈疽排脓内塞”。唐开元年间的道家经典著作《道藏》中讲到，铁皮石斛位居“中华九大仙草”之首(石斛、天山雪莲、三两重人参、百二十年首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草)，其延年益寿，补五脏虚劳的功效尤甚人参。
机体的衰老发生在整体水平，根据文献资料的综合报道，提出了“整体衰老假说”，认为机体“组织再生性细胞”减少是导致机体衰老的原因。组织再生性细胞的减少，不仅使组织从外观上逐渐表现出衰老，而且也使组织代谢功能不断减弱，到了一定年龄阶段后，由于整个组织细胞生长更新的减弱而使组织发生萎缩。而高等动物和人体细胞均只保存部分的合成功能，不能单独完成其生命活动，组织细胞和组织细胞之间必须在代谢活动过程中相互交换物质和补偿。由于机体细胞在代谢上的互补性，就造成了机体各种细胞“牵一发而动全身”的相互依存现象，任何组织出现功能衰退，都会直接影响到机体各种组织，因为衰老对于人体而言，均是在整体水平发生的。
基于上述理论，研究开发抗衰老药物，将会给临床提供新的药物。
发明内容
基于上述原因，申请人以D-半乳糖致亚急性衰老小鼠模型和自然衰老小鼠模型从整体水平观察铁皮石斛对衰老小鼠的影响，进行脏器系数的测定，从整体上体现衰老的现象以及铁皮石斛抗衰老的作用，表明铁皮石斛能改善D-半乳糖致亚急性衰老小鼠子宫、卵巢、睾丸等生殖器官的病理变化。而对于自然衰老模型，经过近2月的给药过程中，铁皮石斛也能明显地改善生殖器官的病变，抑制衰老的发展。
本发明通过下述技术方案实现的。
铁皮石斛在制备抗衰老药物中的应用。
上述所属抗衰老药物不限于铁皮石斛，包括鲜品、干品(枫斗)、石斛多糖等。
上述所述衰老包括但不限于生殖器官衰老。
上述所述的生殖器官包括但不限于子宫、卵巢、睾丸、前列腺、精囊腺等生殖器官。
药理试验例
实施例1
对去势雄性小鼠的影响
一、实验材料：
动物：昆明小鼠、SD大鼠，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2008-0020，凭证号：0043393、0062553、0062559、0062571、0062633、0064995、0065002、0065026、0065027。
7月龄昆明小鼠，由广东省实验动物检测所提供，动物合格证号：SCXK(粤)2008-0002，凭证号：0065751。
试药：铁皮石斛，永生源生物科技有限公司提供，来样日期：2009.11、2010.3。
铁皮石斛榨汁液，采用榨汁机榨新鲜铁皮石斛，纱布过滤滤去药渣取汁得榨汁液。
铁皮石斛水提液，取新鲜铁皮石斛，加入十倍量的水煎煮30min，共煎煮两次，合并两次煎煮液得水提液。
阳性药：参维灵片(广东永康药业有限公司，批号：100301，每片含灵芝菌干粉0.1g、蘑菇浸膏粉0.2g、维生素B62mg、人参粉0.1g)；
二实验方法
1.去势小鼠
1.1对去势雄性小鼠的影响
造模：腹腔注射水合氯醛0.02ml/10g(剂量200mg/kg)麻醉，背位固定，局部以碘酊消毒，以75％酒精去碘，与阴囊两侧各作一0.5cm长纵行切口，分离皮下组织，将睾丸拉出，于睾丸内侧穿线结扎，在睾丸与结扎线之间剪断，取出睾丸(连同附睾一并剪除)，分层或不分层缝合切口，局部涂以碘酊及75％酒精去碘，术后肌肉注射青霉素G钠1万u/只，正常饲养，供实验用。
分组：手术后15天，随机分成假手术组(不取睾丸)、模型组、铁皮石斛高剂量组(2g生药/kg)、铁皮石斛低剂量组(0.5g生药/kg)、阳性药组(1片/kg)，按体重连续给药30天，每天1次，每次灌胃容量为0.1ml/10g。
方法：于末次给药后24h摘眼球取血，检测血液中SOD、MDA含量。脱颈椎处死，背部固定，在耻骨联合向上作纵行切口，切开皮肤直至胸骨剑突下，推开腹腔内肠道，暴露盆腔，找出前列腺和精液囊，在前列腺的底部剪断、剥离，放于滤纸上，剪除脂肪及其他不需要的组织器官(膀胱、尿道和输精管)，在分析天平上称重，然后仔细分离精液囊，称重，总重量减去精液囊重量为前列腺重量。比较各组的生殖器官/体重比值、SOD、MDA含量的差异。
1.2对去势雌性小鼠的影响
造模：腹腔注射水合氯醛0.02ml/10g(剂量200mg/kg)麻醉，腹位固定，剪去背部中线两侧毛，在躯干下1/3，局部以碘酊消毒，以75％酒精去碘，在脊柱附近作纵行切口，长约1cm，分离皮肤后，在两侧各1-2cm处作两个切口，分离肌肉层后，可见淡黄色脂肪团，卵巢即在其中，此时用小镊子拉出脂肪团，可找到一团细线状不规则呈肉色的组织即为卵巢，下接粗大管状组织为子宫角，此时在卵巢下端穿一丝线，结扎，剪去卵巢及余线，将组织推回腹腔，缝合肌肉层及皮肤层切口，局部涂以碘酊及75％酒精去碘，术后肌肉注射青霉素G钠1万u/只，正常饲养，供实验用。让动物恢复15d，以消除雌孕激素在体内的存留。
分组：手术后15天，随机分成假手术组(与其他切除卵巢的小鼠一样进行麻醉、消毒，剪开皮肤但不去卵巢，缝合，肌肉注射青霉素预防感染)、模型组、铁皮石斛高剂量组(2g生药/kg)、铁皮石斛低剂量组(0.5g生药/kg)、阳性药组(1片/kg)，按体重连续给药30天，每天1次，每次灌胃容量为0.1ml/10g。
方法：于末次给药后24h摘眼球取血，检测血液中SOD、MDA含量。脱颈椎处死，背部固定，打开腹腔，剪去整个子宫及阴道，放于滤纸上，除去系膜、脂肪组织、阴道、卵巢，吸去子宫内液体，立即在电子天平上称重。用游标卡尺(精确到0.02mm)量取子宫外径，每侧至少测量3次，取平均值。然后放入福尔马林溶液中固定用于HE染色小鼠的子宫经固定后，用常规梯度乙醇脱水，经二甲苯透明后用55℃低熔点石蜡包埋，石蜡切片厚度为4～5，恒温箱60℃烤60min，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；HE染色，中性树胶封片，镜下观察并拍照。
5)比较各组的生殖器官/体重比值、SOD、MDA含量的差异。
三、实验结果与结论
1.去势小鼠
1.1对去势雌性小鼠的影响
1.1.1对脏器系数的影响
表1药物对雌性小鼠胸腺、子宫等脏器指数的影响
注：与假手术组相比：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组相比：#P＜0.05，##P＜0.01。
由表1可见，对于胸腺指数，铁皮石斛高剂量能明显增加雌性小鼠的胸腺比例，体现更好的免疫作用。对于子宫指数，模型组与假手术比较，子宫指数明显减少，差异具有明显显著性差异。给药后，各给药组的子宫指数有增加的趋势，其中铁皮石斛高低剂量组与模型组相比，有增加子宫重量的作用，差异具有显著性差异。
1.1.2对子宫的病理影响
表2对子宫直径影响
  组别   子宫直径(显微测量)×10-4mm
  假手术组   1615±375
  模型组   1117±147**
  高剂量组   1305±186*#
注：与假手术组相比：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组相比：#P＜0.05，##P＜0.01。
病理组织学检测结果显示：假手术组内膜层较厚，内膜腔弯曲，内膜上皮增生呈高柱状；腺体增生、密集，上皮增生呈高柱状。模型组子宫内膜明显变薄，子宫外径明显减小，与正常组比较具有统计学意义(p＜0.05)；内膜腔小而直，内膜上皮矮柱状；腺体明显稀疏、减少，上皮立方状。高剂量组与模型组相比，子宫内膜增厚，子宫外径增大，与模型组比较具有统计学意义(p＜0.05)；腺体稍增生、密集，上皮部分呈柱状。
1.1.3对血清SOD、MDA的影响
表3药物对雌性小鼠SOD、MDA的影响
  组别   SOD活性单位(U/ml)   MDA含量(nmol/ml)
  假手术组   139.04±51.93   12.77±4.78
  模型组   117.67±22.63   13.70±4.10
  阳性组   161.39±16.79##   10.49±1.43
  铁皮石斛高剂量组   169.00±30.96##   10.65±1.98
  铁皮石斛低剂量组   143.17±16.77#   11.47±2.00
注：与假手术组相比：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组相比：#P＜0.05，##P＜0.01。
由表3可见，模型组的SOD较假手术组低，MDA含量较假手术高，说明去势手术对小鼠的影响。阳性药参维灵片与铁皮石斛高低剂量均能升高血清中SOD活性，与模型组相比具有显著性差异，铁皮石斛高剂量效果更明显。阳性药及铁皮石斛高低剂量均能降低血清中过氧化产物MDA的含量，但差异没有显著性区别。
2对去势雄性小鼠的影响
2.1对脏器系数的影响
表4药物对雄性小鼠精囊腺、前列腺、包皮腺等脏器指数的影响
注：与假手术组相比：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组相比：#P＜0.05，##P＜0.01。
由表4可见，模型组及给药组的精囊腺指数、前列腺指数、包皮腺指数均明显小于假手术组。铁皮石斛高剂量给药组能增加手术后的前列腺指数，与模型组相比具有差异。而对于包皮腺，铁皮石斛高剂量有增加的趋势。
2.2对精囊腺、包皮腺的病理影响
病理组织学检测结果显示：假手术组精囊腺腺体分泌旺盛，腺腔明显扩张，腺腔内大量分泌物潴留。模型组精囊腺腺腔明显缩小，腺体减少，仅少数腺腔内可见分泌物。高剂量组精囊腺腺体与模型组比较有增多，腺腔部分扩张，腺腔内较多分泌物潴留。
2.3对血清SOD、MDA的影响
表5药物对雄性小鼠SOD、MDA的影响
  SOD活性单位(u/ml)   MDA含量(nmol/ml)
  假手术组   105.76±21.26   10.68±1.23
  模型组   86.21±23.98   13.20±3.80
  阳性组   114.44±22.77##   9.53±1.12#
  铁皮石斛高剂量组   124.35±21.64##   9.05±1.70##
  铁皮石斛低剂量组   126.26±17.82##   8.78±1.66##
注：与假手术组相比：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组相比：#P＜0.05，##P＜0.01。
由表5可见，模型组的SOD较假手术组低，MDA含量较假手术高，说明去势手术对小鼠的影响。阳性药参维灵片与铁皮石斛高低剂量均能升高血清中SOD活性，与模型组相比具有显著性差异。阳性药参维灵片与铁皮石斛高低剂量均能降低血清中MDA含量，差异具有显著性差异，铁皮石斛高低剂量的效果较阳性药更明显。
实施例2
铁皮石斛对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠生殖器官的作用研究
试药
石斛汁：称取铁皮石斛鲜品(≤3mm的颗粒状)约10g，加蒸馏水100ml，榨汁至100ml，于电热套上加热至微沸，置4℃冰箱保存，可放置一周。
石斛水提液：称取铁皮石斛鲜品25g，加水250ml加热回流3次，每次1h，过滤，合并滤液，浓缩至200ml，备用。
石斛多糖：取铁皮石斛鲜品300g，加水3000ml，加热回流3次，每次1h，过滤(棉花抽滤)，合并滤液，置电磁炉上蒸去水分，浓缩至约2L，加95％乙醇约9.5L，用乙醇计调醇度为80％，静置36h，将乙醇醇沉液离心(3000r/min)10分钟，取滤渣置大蒸发皿中挥走乙醇，置60℃烘箱中烘干，干燥后用粉碎机粉碎，取100目筛下粉末，置干燥器备用。
用时取0.5g粗多糖，加蒸馏水100ml，超声60min，至完全溶解，备用。
石斛枫斗：取铁皮石斛枫斗50g，用粉碎机粉碎后过3号筛(50目)，取筛下粉末，置干燥器备用。
枫斗水提液：取铁皮石斛枫斗粉末5g，加水150ml，加热回流3次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩至200ml，备用。
阳性药：青春宝抗衰老片，正大青春宝药业有限公司，批号：0904002，生产日期：09.04.08，有效期至2011.03。
药物
D-半乳糖(广州威佳科技有限公司，规格25g，CAS#：59-23-4，批号：2K06D518)；
氯化钠注射液(昆明市宇斯药业有限责任公司，规格：500ml，批号：08091902，生产日期2008.09.19，有效期至2010.9.18)；
氯化钠注射液(中国广州百特医疗用品有限公司，规格：500ml，批号：GS1004006，有效期至2012.03)；
甲醛溶液(广州化学试剂厂，规格：500ml，批号：20090702-1)。
实验动物
昆明小鼠，SPF级，18-22g，雌性，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2008-0002，合格证号：0070152。动物放置在室温18℃～22℃，相对湿度为50～70％，12h明暗交替的环境下饲养。实验期间自由饮水、饮食，饲料为标准全价饲料。
实验方法
取昆明种成年小鼠130只，体重20±2g，雌雄各半。将动物随机分7组，分别为：正常对照组、衰老模型组、阳性药组、鲜品榨汁液组(以下简称鲜-榨汁组)、鲜品水提液组(以下简称鲜-水提组)、枫斗水提液组(以下简称干-水提组)，(鲜品)粗多糖组，每组18只。除正常对照组外，各鼠每天在颈背部皮下注射D-半乳糖(注射用水配制)125mg/kg，连续8周，普通饲料常规喂养。各组动物在造模第10d后，同时每日灌胃相应受试药液容量0.1ml/10g，正常对照组以同等剂量的蒸馏水灌胃。
给药9周后，取血后颈椎脱臼处死，称取其生殖器官(包括卵巢、子宫)，计算脏器系数。将卵巢、子宫等脏器，放入福尔马林溶液中固定用于HE染色(苏木精-伊红染色法，hematoxylin-eosinstaining)。固定后，用55℃低熔点石蜡包埋，石蜡切片厚度为3μm，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；HE染色，用常规梯度乙醇脱水，中性树胶封片，镜下观察并拍照。染色结果：细胞核呈蓝色，细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色，钙盐和各种微生物染成蓝色或蓝紫色。依据各种脏器的病变程度进行评分，分“-，+，++，+++”等四级，分数分别为“0，1，2，3”，分数越大表明病变越严重。
数据用均数±标准差表示，n为样本量。统计作图软件用MicrosoftExcel。统计方法用One-way t test，P＜0.05表示差异有统计学意义。
实验结果
(1)脏器系数
雄性情况见表6。
表6雄性小鼠情况
  组别   胸腺系数(％)   脾系数(％)   肾系数(％)   肝系数(％)   脑系数(％)
  正常组   1.74±0.57**   2.55±0.52**   13.00±2.05   37.99±2.01*   10.25±0.84*
  模型组   1.05±0.36   6.73±2.04   13.24±2.29   41.51±4.66*   10.85±0.67
  阳性组   1.27±0.46   4.31±1.32*   13.31±1.48   37.34±3.80   11.02±0.54
  鲜-榨汁组   1.88±0.28**   8.82±2.10   13.04±1.86   41.39±2.66   10.67±0.99
  鲜-水提组   1.58±0.38**   6.59±2.06   12.11±2.07   37.28±5.55   11.43±0.96
  干-水提组   1.94±0.40**   7.27±3.21   14.30±2.64   43.23±5.88   11.57±1.63
  粗多糖组   1.59±0.50*   8.71±2.86   13.97±1.34   44.46±4.84   10.59±0.54
注：与模型组相比：*P＜0.05  **P＜0.01
雌性情况见表7。
表7雌性小鼠情况
  组别   胸腺系数(％)   脾系数(％)   肾系数(％)   肝系数(％)   脑系数(％)
  正常组   2.84±0.60*   4.59±1.16**   9.88±1.83   38.14±4.98   14.67±1.47*
  模型组   2.34±0.26   6.94±1.61   10.11±1.12   40.10±4.63   13.23±0.64
  阳性组   2.65±0.68   6.23±1.69   10.95±1.16   38.88±4.42   13.03±1.09
  鲜-榨汁组   2.72±0.45*   5.15±2.43   9.80±1.32   36.59±5.51   13.50±1.48
  鲜-水提组   2.89±0.64*   8.10±1.72   10.08±1.25   38.01±4.82   13.74±0.93
  干-水提组   2.67±0.40*   7.74±3.67   10.02±0.99   38.69±3.04   13.10±0.92
  粗多糖组   3.05±0.28**   6.58±2.13   10.34±0.63   36.35±3.13*   12.42±0.71*
注：与模型组相比：*P＜0.05 **P＜0.01
结论：
1、胸腺系数：
①雄性：
模型组的胸腺系数明显减少，与正常组相比，差异具有显著性意义(P＜0.01)。其余各给药组，除阳性药组外，均能增加其胸腺系数，差异具有显著性意义(P＜0.01)，其中鲜榨汁和干水提更明显。粗多糖的作用较明显(P＜0.05)
②雌性：
模型组的胸腺系数明显减少(P＜0.05)，其余各给药组，除阳性药组外，均能增加其胸腺系数，差异具有显著性意义(P＜0.05)。粗多糖的作用较明显(P＜0.01)。
2、脾系数：
①雄性、雌性：
模型的脾系数与正常组相比明显升高，差异具有显著性意义(P＜0.01)。阳性药对脾系数有减少的趋势。
3、肾系数：
雌雄各组无明显差异。
4、肝系数：
模型组与正常组相比，肝脏系数有所增加。
雌性的给药组肝系数有减少的趋势。
雌性肝系数减少有显著性差异。
5、脑系数
各组脑系数差异不大。
2、雄性小鼠血清SOD含量情况见表8。
表8雄性小鼠血清SOD含量情况见表
  组别   SOD含量(U/mgprot)
  正常组   170.13±16.65**
  模型组   139.31±15.85
  阳性组   150.60±13.41
  鲜-榨汁组   164.27±36.20*
  鲜-水提组   168.75±15.04*
  干-水提组   141.94±22.15
  粗多糖组   147.73±23.17
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
雌性小鼠血清SOD含量情况见表9。
表9雌性小鼠血清SOD含量情况见表
  组别   SOD含量(U/mgprot)
  正常组   159.03±9.35
  模型组   152.55±8.21
  阳性组   171.23±17.72**
  鲜-榨汁组   169.76±4.92**
  鲜-水提组   163.77±21.91**
  干-水提组   175.82±3.66**
  粗多糖组   182.52±14.16**
注：与模型组相比：*P＜0.05 **P＜0.01
分析：血液SOD：SOD是酶促防御系统的重要组成部分，主要清除体内的超氧阴离子自由基，催化其发生歧化反应，阻断和防止一系列自由基连锁反应的加剧，抑制脂质过氧化反应。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，是反映机体抗氧化能力的重要指标。本研究显示：
①雄性：
模型组的血清SOD明显减少，与正常组相比，差异具有显著性意义(P＜0.01)。鲜-榨汁组及鲜-水提组与模型组相比有改善(P＜0.05)
②雌性：
模型组的血清SOD明显减少，与正常组相比，差异具有显著性意义(P＜0.01)。各给药组与模型组相比，均增加其SOD活性(P＜0.05)。
实验结果说明试药可提高小鼠血液抗氧化能力，雄性以鲜-榨汁组及鲜-水提组血清SOD活性增强为主要表现，雌性所有给药组血清SOD活性均明显增强。
3.血清T-AOC
雄性小鼠血清T-AOC含量情况见表10。
表10雄性小鼠血清T-AOC含量情况见表
  组别   T-AOC含量(单位/ml)
  正常组   4.96±1.97
  模型组   4.79±2.93
  阳性组   5.82±2.78
  鲜-榨汁组   3.60±1.15
  鲜-水提组   3.05±2.85
  干-水提组   5.04±3.06
  粗多糖组   6.23±3.26
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
雌性小鼠血清T-AOC含量情况见表11。
表11雌性小鼠血清T-AOC含量情况见表
  组别   T-AOC含量(单位/ml)
  正常组   3.43±1.68*
  模型组   1.17±2.00
  阳性组   2.14±5.23
  鲜-榨汁组   2.78±1.45*
  鲜-水提组   3.05±2.85
  干-水提组   2.39±2.29
  粗多糖组   3.18±1.52*
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
结论：血液T-AOC：机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系，该防御体系有酶促与非酶促两个体系，许多酶是以微量元素为活性中心，例如：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等，非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。例如：VE、胡萝卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、葡萄糖、铜兰蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等。这个体系的防护氧化作用主要通过三条途径：(1)消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；(2)分解过氧化物，阻断过氧化链；(3)除去起催化作用的金属离子。防御体系各成份之间相互起到了协同作用，以及代偿作用与依赖作用。本研究显示：
①雄性：
各组数据无明显差异。
②雌性：
模型组的血清T-AOC明显减少，与正常组相比，差异具有显著性意义(P＜0.05)。其余各给药组与模型组比较，鲜-榨汁组及粗多糖组T-AOC均明显增加，差异具有显著性意义(P＜0.05)。
实验结果说明试药可提高小鼠血液抗氧化能力，雌性以鲜-榨汁组及粗多糖组T-AOC活性增强为主要表现。
4.血清GSH-PX
雄性小鼠血清GSH-PX含量情况见表12。
表12雄性小鼠血清GSH-PX含量情况见表
  GSH-PX含量(酶活力单位)
  正常组   780.00±300.84
  模型组   786.00±155.19
  阳性组   1007.25±161.68**
  鲜-榨汁组   1488.67±58.82**
  鲜-水提组   1193.33±153.07**
  干-水提组   1450.67±105.12**
  粗多糖组   912.00±158.75
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
雌性小鼠血清GSH-PX含量情况见表13。
表13雌性小鼠血清GSH-PX含量情况见表
  GSH-PX含量(酶活力单位)
  正常组   997.71±263.63
  模型组   850.80±136.91
  阳性组   1200.00±180.25*
  鲜-榨汁组   1292.67±204.6**
  鲜-水提组   1193.33±153.07*
  干-水提组   888.75±334.90
  粗多糖组   1092.75±114.54
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
结论：血液GSH-PX：谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解的酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)对氢过氧化物的还原反应，一般认为它在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化链锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。此酶含硒，硒是GSH-PX的必须组成部分。每克分子酶含4克原子硒。GSH-PX的活性中心是硒半胱氨酸。测定GSH-PX活力可以作为衡量机体硒水平的一项生化指标。本研究显示：
①雄性：
与正常组相比，模型组的血清GSH-PX有所增加。其余各给药组与模型组相比，除粗多糖组外，GSH-PX均明显增加，差异具有显著性意义(P＜0.01)。
②雌性：
与正常组相比，模型组的血清GSH-PX有所减少。其余各给药组与模型组比较，阳性组(P＜0.05)、鲜-榨汁组(P＜0.01)及鲜-水提组(P＜0.05)GSH-PX均明显增加，差异具有显著性意义。
实验结果说明试药可提高小鼠血液抗氧化能力，雄性除粗多糖组外，GSH-PX均明显增加，雌性以阳性组(P＜0.05)、鲜-榨汁组(P＜0.01)及鲜-水提组(P＜0.05)GSH-PX明显增加为主要表现。
5病理检查
5.1子宫
表14对其上皮病变、腺体改变、炎症反应、纤维增生、血管增生等情况进行评分。
  正常组   模型组   阳性组   鲜榨汁   干水提   鲜水提   粗多糖
 -   15   11   9   9   14   10   14
 +   0   3   3   6   1   5   1
 ++   0   1   3   0   0   0   0
 +++   0   0   0   0   0   0   0
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
正常组：子宫内膜上皮完整，未见上皮细胞增生，未见细胞变性、坏死及脱落；固有层腺体分布均匀，未见腺体增生或萎缩；间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；肌层未见炎症反应，未见小血管增生。
模型组：与正常组相比，个别子宫管径减小，粘膜上皮未见明显变化，固有层腺体萎缩减少，间质及肌层未见明显病变。
阳性组：与模型组相比，子宫管径增大；粘膜上皮增生呈高柱状，并形成皱襞；固有层腺体增生、密集，间质轻度水肿，间质细胞肥大；肌层未见明显病变。
鲜品榨汁组：与阳性组病变相似，程度稍轻。
鲜品水提组：与阳性组病变相似，程度稍轻。
干品水提组：与正常组基本相似。
粗多糖组：与正常组基本相似。
5.2卵巢
表15对卵巢大小、卵泡萎缩、黄体萎缩等情况进行评分
  正常组   模型组   阳性组   鲜榨汁   干水提   鲜水提   粗多糖
 -   9   0   4   9   9   8   6
 +   0   0   2   0   0   1   2
 ++   0   0   3   0   0   0   1
 +++   0   9   0   0   0   0   0
  **   **   **   **   **   **
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
正常组：卵巢体积较大，各级卵泡发育良好，黄体数目较多，体积较大，排列紧密。
模型组：卵巢明显萎缩，体积减小；各级卵泡及黄体数目明显减小。
阳性组：卵巢体积、各级卵泡及黄体数目基本恢复正常。
鲜品榨汁组：与阳性组基本相似。
鲜品水提组：卵巢体积、各级卵泡及黄体数目轻度减小。
干品水提组：与阳性组基本相似。
粗多糖组：个别标本卵巢体积、各级卵泡及黄体数目减小，其余标本与阳性组基本相似。
5.3睾丸
表15对曲细精管萎缩情况进行评分
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
正常组：睾丸曲细精管排列致密，支持细胞呈高柱状，胞浆丰富，各级生精细胞排列呈多层。
模型组：睾丸曲细精管明显萎缩，排列疏松，支持细胞短缩，各级生精细胞萎缩，细胞层变薄。
阳性组：曲细精管形态基本恢复正常。
鲜品榨汁组：曲细精管稍疏松，细胞形态基本正常。
鲜品水提组：曲细精管稍疏松，细胞形态基本正常。
干品水提组：与阳性组基本相似。
粗多糖组：曲细精管稍疏松，细胞层轻度萎缩、变薄。
5.4脾脏
表16对白髓萎缩情况进行评分
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
正常组：白髓较多，白髓/红髓比例较大，白髓、红髓界限清晰。
模型组：白髓明显减少，白髓/红髓比例明显减小，白髓、红髓界限不清。
阳性组：与模型组相比，白髓明显增多，白髓/红髓比例明显增大，白髓、红髓界限较清晰。
鲜品榨汁组：病变恢复良好，与阳性组基本相似。
鲜品水提组：病变恢复良好，个别标本白髓轻度萎缩。
干品水提组：病变恢复良好，个别标本白髓轻度萎缩。
粗多糖组：与模型组相比，未见明显改善。
5.5肾脏
表16对肾小球减少、肾小球萎缩/肥大、肾小管病变、间质病变等情况进行评分
  正常组   模型组   阳性组   鲜榨汁   干水提   鲜水提   粗多糖
 -   12   9   10   11   12   11   10
 +   0   3   2   1   0   1   2
 ++   0   0   0   0   0   0   0
 +++   0   0   0   0   0   0   0
注：与模型组相比：*P＜0.05**P＜0.01
正常组：肾小球未见减少，未见萎缩及代偿性肥大，基底膜未见增厚，系膜细胞未见增生；肾小管上皮细胞未见水肿及变性、坏死，未见管腔扩张及上皮萎缩，未见管型；间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生。
模型组：肾小球数稍减少，未见明显肥大及系膜增生，肾小管及间质未见明显病变。
阳性组：个别标本肾小球数稍减少，未见明显肥大及系膜增生，肾小管及间质未见明显病变。
鲜品榨汁组：与阳性组基本相似。
鲜品水提组：与阳性组基本相似。
干品水提组：与正常组基本相似，未见明显病变。
粗多糖组：与阳性组基本相似。
实施例3
铁皮石斛对自然衰老雌性小鼠生殖器官的作用研究
试药
铁皮石斛榨汁液，给药剂量：1g/kg(按生药量算，即含多糖约0.3g/kg)；粗多糖溶液，给药剂量：0.32g/kg(即含多糖约0.3g/kg)，均由广州中医药大学新药开发研究中心提供。
石斛汁：称取铁皮石斛鲜品(≤3mm的颗粒状)约10g，加蒸馏水100ml，榨汁至100ml，于电热套上加热至微沸，置4℃冰箱保存，可放置一周。
石斛水提液：称取铁皮石斛鲜品25g，加水250ml加热回流3次，每次1h，过滤，合并滤液，浓缩至200ml，备用。
石斛多糖：取铁皮石斛鲜品300g，加水3000ml，加热回流3次，每次1h，过滤(棉花抽滤)，合并滤液，置电磁炉上蒸去水分，浓缩至约2L，加95％乙醇约9.5L，用乙醇计调醇度为80％，静置36h，将乙醇醇沉液离心(3000r/min)10分钟，取滤渣置大蒸发皿中挥走乙醇，置60℃烘箱中烘干，干燥后用粉碎机粉碎，取100目筛下粉末，置干燥器备用。
用时取0.5g粗多糖，加蒸馏水100ml，超声60min，至完全溶解，备用。
石斛枫斗：取铁皮石斛枫斗50g，用粉碎机粉碎后过3号筛(50目)，取筛下粉末，置干燥器备用。
枫斗水提液：取铁皮石斛枫斗粉末5g，加水150ml，加热回流3次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩至200ml，备用。
实验动物
青年组：昆明小鼠，SPF级，17-20g(2010.10.14)，雌性，25只，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2008-0002，合格证号：0073131。普通饲料常规喂养1个月。
衰老组：昆明小鼠，9月龄，雌性，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2008-0002，合格证号：0070142。普通饲料常规喂养3个月至12月龄。
动物放置在室温18℃～22℃，相对湿度为50～70％，12h明暗交替的环境下饲养。实验期间自由饮水、饮食，饲料为标准全价饲料。
实验方法
将12月龄衰老动物随机分3组，分别为：衰老模型组、榨汁液组(1g生药/kg)、多糖组(0.32g/kg，相当于1g生药/kg)，以3月龄青年小鼠作为青年对照组，每组14只，普通饲料常规喂养。各组动物每日灌胃相应受试药液0.1ml/10g。衰老模型组和青年对照组以同等剂量的蒸馏水灌胃，给药期间，每周测定两次体重。
给药10周后，取血后颈椎脱臼处死，称取其生殖器官(卵巢、子宫等)，计算脏器系数。取卵巢、子宫等脏器，按上述亚急性衰老模型小鼠中脏器病理检查的方法。
实验结果
各组小鼠脏器系数的情况见表17。
(1)子宫系数
12月龄衰老小鼠的子宫随着卵巢的水肿而重量明显增加，解剖可见粗大的子宫附近血丝明显，而3月龄青年小鼠的子宫颜色较淡，弹性较好，附近不见明显血丝。青年小鼠和衰老小鼠的子宫系数两者相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
(2)卵巢系数
12月龄的衰老小鼠卵巢萎缩，与青年小鼠相比具有显著性差异(P＜0.05)，给衰老小鼠灌胃给药铁皮石斛榨和多糖后，小鼠的卵巢没有明显肿大，与衰老模型组相比，差异具有统计学意义。
表17铁皮石斛对自然衰老雌性小鼠脏器系数的情况(n＝12)
  卵巢系数(‰)   子宫系数(‰)
  青年组   0.69±0.16**   2.99±0.86*
  衰老组   0.48±0.16   3.71±0.97
  榨汁组   0.56±0.31   2.48±0.79**
  多糖组   0.58±0.50   2.37±0.76**
注：与衰老组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
各脏器病理检查
(1)子宫：
青年对照组：子宫内膜上皮完整，未见上皮细胞增生，未见细胞变性、坏死及脱落；固有层腺体分布均匀，未见腺体增生或萎缩；间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生；肌层未见炎症反应，未见小血管增生。
模型组：与对照组相比，个别子宫管径减小，粘膜上皮未见明显变化，固有层腺体发布不均，部分腺腔扩张；间质及肌层纤维组织及小血管增生，炎细胞浸润明显。
榨汁组：与模型组病变相似，病变程度减轻。
多糖组：与模型组病变相似，病变程度减轻。
(2)卵巢：
青年对照组：卵巢体积较大，各级卵泡发育良好，黄体数目较多，体积较大，排列紧密；间质细胞较肥大、致密。
模型组：卵巢萎缩，体积减小；各级卵泡及黄体明显减少，黄体体积减小；间质细胞萎缩、减少，纤维组织及小血管增生。
榨汁组：与模型组病变相似，病变程度减轻。
多糖组：与模型组病变相似，病变程度减轻。
表18雌性小鼠脏器病理损伤程度评分表(n＝6)
  子官   卵巢
  青年组   0.00±0.00**   0.00±0.00**
  衰老组   2.83±1.60   4.33±2.34
  榨汁组   1.17±0.75*   2.75±1.26
  多糖组   1.33±1.21*   2.60±1.95
注：与衰老组相比：*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结论：
D-半乳糖致衰老是一种易获得的衰老模型。D-半乳糖诱导的衰老模型与糖代谢紊乱、D-半乳糖醇中毒和活性氧自由基过剩等相关。衰老的代谢学说认为，衰老是极度代谢性障碍的结果，糖代谢在三大物质代谢中具有很重要的意义；糖代谢紊乱必然会引起心，肝，肾，脑，肺等重要脏器代谢异常，最终出现衰老。
在一定时期内连续给动物注射D-半乳糖，使机体细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇，这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，功能障碍、代谢紊乱，破坏并消耗机体抗氧化防御系统，使自由基积聚。同时在半乳糖还原成半乳糖醇的过程中又产生(O2-)，这样使细胞膜脂质受损，过氧化脂质、脂褐质等增高，出现衰老。
脏器病理检查分析表明铁皮石斛能改善D-半乳糖致亚急性衰老小鼠子宫、卵巢等生殖器官的病理变化。
随着增龄，动物机体的组织器官出现退行性变化而表现出老化征象，选用老龄动物作为自然衰老动物模型，比人工造成的衰老模型在衰老的生理进程中更符合人类衰老的特点，为最理想的衰老模型。但饲养周期较长，所受影响因素较多，动物个体差异较大。实验过程中，动物易感染疾病甚至出现死亡，因此需严格控制饲养条件：保证通风及光照良好，室温控制在18～25℃，配以营养全面的混合饲料饲养，饮水、垫料每日更换，饮水器及鼠笼隔日清洗，保持清洁。
由上述结果可见，12月龄小鼠的卵巢严重萎缩，子宫有肿大的现象，病理检查见卵巢各级卵泡及黄体明显减少，黄体体积减小，间质细胞萎缩、减少，子宫间质及肌层纤维组织及小血管增生，炎细胞浸润明显，表明其子宫、卵巢出现明显的病理改变。
铁皮石斛能明显改善雌性衰老小鼠生殖器官(子宫、卵巢)等发生老化的病理组织学改变。在衰老的进程中，生殖器官最先出现病理学上的改变，而在近2月的给药过程中，铁皮石斛能明显地改善生殖器官的病变，抑制衰老的发展。
动物机体的代谢合成，除神经组织细胞外，主要集中在生长旺盛的组织再生细胞。组织再生性细胞总是随着年龄的增加而在组织中的比例不断减少，这种减少不仅使组织外观表现出逐渐衰老，而且也使组织代谢功能不断减弱，到了一定年龄阶段后，由于整个组织细胞的生长更新减弱而使组织发生萎缩。再生性细胞之所以在组织中的比例减少，原因是分化速率大于分裂速率之故。各种组织中再生性细胞的减少，是组织的代谢合成功能降低，从而使体液中所含的有效成分(维持生命活动的成分)随之减少，反过来又影响组织再生性细胞的合成速率，使分化加速，是机体进入进行性的衰老状态。从各种器官的病理检查可看出，铁皮石斛能从整体上改善衰老的状态，促进组织再生性细胞的合成，抑制其分化。
铁皮石斛从整体和组织器官的层面上表现出其抗衰老的作用效果。

Claims (1)

1.铁皮石斛在制备抗生殖器官衰老药物中的应用，其中生殖器官为子宫、睾丸、前列腺或精囊腺。
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