CN102156189A - 用抑制adam活性的物质防止或改善皱纹 - Google Patents

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Abstract

含有能够抑制皮肤中存在的ADAM(解联蛋白和金属蛋白酶)活性的物质的皱纹防止剂或改善剂。通过将能够抑制皮肤中存在的ADAM活性的物质应用于皮肤而防止或改善皱纹。用其中将皮肤、皮肤组织或细胞中的ADAM的酶活性或基因表达水平用作指标的方法评价抗皱纹效果。

Description

用抑制ADAM活性的物质防止或改善皱纹
本申请是中国专利申请200580035389.2的分案申请，原申请的申请日是2005年10月13日，发明名称是“用抑制ADAM活性的物质防止或改善皱纹”。
技术领域
本发明涉及用抑制ADAM活性的物质防止或改善皱纹。本发明还涉及通过利用ADAM活性抑制作为指标来评价抗皱纹效果的方法。
背景技术
随着年龄增大，皱纹作为一种皮肤老化的现象增加。最近，从美容等的观点，人们特别是妇女对防止和改善皱纹有显著提高的兴趣。根据皱纹产生部位、皱纹发生机制等等，皱纹可以被大致分为大皱纹、细微皱纹和皱褶皱纹。大皱纹是发生在脖子后面等的深皱纹，主要是由于光老化。细微皱纹是发生在眼睛或嘴周围比较浅的皱纹。皱褶皱纹是发生在非暴露的身体部位如老人的腹部的褶状皱纹。
到目前为止，已进行了关于主要由于光老化发生的大皱纹的研究，且皱纹已被认为是一种由于光老化的症状。至于光老化，已进行了发生机制等的研究，且已建立了动物模型或人的评价体系。抑制由于光老化形成的皱纹的多数努力到目前为止已尝试了防止或减轻紫外线对皮肤的不利作用。例如，为了防止紫外线对皮肤的不利作用，已开发和使用了含有多种能吸收、分散或阻挡紫外线的物质如氧化钛、氧化锌、对甲氧基肉桂酸酯和对氨基苯甲酸酯的化妆品(遮蔽日光的(sun screen)化妆品和防止日光的(sun protect)化妆品)。同样，已发现由于紫外辐射在皮肤中产生的自由基不利地影响组成皮肤的纤维组分如胶原蛋白和弹性蛋白，且已提出了含有抗氧化剂的化妆品(参见参考文献，例如PCT日本公开号2001-508809)。更进一步，已考虑皮肤光老化的主要因素之一是由紫外辐射诱导分解真皮结缔组织如胶原蛋白和弹性蛋白的MMP以及从而真皮结缔组织被MMP破坏的现象。为防止皮肤的光老化，因而已提出了例如用于抑制皮肤光老化的组合物，该组合物包含UVA阻挡剂、UVB阻挡剂和MMP抑制剂如类视黄醇(参见参考文献，例如PCT日本公开号2001-520677)。
最近，中老年妇女对美容有了增加的兴趣且对发生在眼睛或嘴周围的细微皱纹有增加的兴趣，其细微皱纹的产生是由于随着年龄增加表皮角质层的水保留能力降低或由于随年龄增加表皮脂质的分泌降低导致发生的皮脂减少。认为细微皱纹由皮肤的干燥导致发生。同样认为在细微皱纹的发生机制和细微皱纹的形态学、组织学、生物化学改变上，细微皱纹与由于光老化发生的大皱纹显著不同。例如，已确认关于人角质层的水含量和小皱纹的程度彼此相关(参见参考文献，例如Imokawa等的文献Fragrance Journal；1992(11)29-42)。更进一步，已报道在屏障功能用不饱和脂肪酸连续破坏的情况下表皮皱纹发生(参见参考文献，例如JinMasaki的文献Perfume Transactions；2001，第25卷，No.1，34-38)。然而，还没有充分弄清在细微皱纹的皮肤里在蛋白质水平或基因水平上发生了何种生物化学改变，而且防止和改善细微皱纹必须依赖通过使用保湿剂如甘油、山梨醇或植物液提取物或含有胶原蛋白等的化妆品来保护皮肤免于干燥的方法。然而，仅仅通过使用保湿剂等保护皮肤免于干燥，细微皱纹不能被充分防止和改善。因此，存在对能防止和改善细微皱纹更加有效的物质的强烈需求。
鉴于上述情况，本发明的目的是阐明皮肤中参与细微皱纹形成的生物化学改变、详述能抑制所述生物化学改变的物质，并通过使用所述物质更有效地防止或改善皱纹。本发明的另一个目的是提供通过利用抑制前述生物化学改变作为指标使试验物质的抗皱纹效果能被更有效和更容易评价的方法。
发明内容
发明人已发现，对无毛的小鼠反复剥离胶带时，连续的皮肤屏障被随之破坏，同发生在人类皮肤中的细微皱纹相同的表皮和真皮改变发生在小鼠的皮肤中。发明人因此成功地建立了细微皱纹的小鼠模型。本发明基于发现在上述细微皱纹的小鼠模型中，具有解联蛋白和金属蛋白酶结构域的属于ADAM(解联蛋白和金属蛋白酶)家族的蛋白质(下文中称为ADAM)如ADAM-9、ADAM-10或ADAM-17的表皮基因表达提高，以及通过这些ADAM的作用而自细胞膜释放和活化的HB-EGF(肝素结合性表皮生长因子样生长因子)以及双调蛋白的表皮基因表达提高。本发明还基于发现通过应用这些ADAM的抑制剂，能够抑制表皮和真皮的肥厚及皱纹形成。
ADAM如ADAM-9、ADAM-10或ADAM-17是在皮肤细胞表面存在的酶，在皮肤中发挥从细胞膜释放生长因子如HB-EGF、双调蛋白、TNF-α和TGF-α及活化上述生长因子的作用。认为一种重要的细微皱纹形成的机制是ADAM在皮肤中被活化或在皮肤中表达提高，从而ADAM促进生长因子如HB-EGF的释放与活化、以及导致发生表皮和真皮的肥厚。因此，认为通过抑制皮肤中ADAM的活性，能够抑制HB-EGF等的活性提高，抑制表皮和真皮肥厚，以及能够防止或改善皱纹特别是细微皱纹的形成。图1是对通过抑制皮肤中ADAM的活性而防止或改善皱纹的机制进行说明的概略图。
在本发明的一个方面，本发明提供了组合物，其含有防止或改善皱纹有效量的能够抑制存在于皮肤中的ADAM的活性的物质。
在本发明的另一个方面，本发明提供了防止或改善皱纹的方法，其包括抑制存在于皮肤中的ADAM的活性的步骤。通过向皮肤应用能够抑制ADAM的活性的物质，能防止或改善皱纹。根据本发明的防止或改善皱纹的方法能优选地用作美容方法。
在本发明的进一步的方面，本发明涉及能够抑制ADAM活性的物质的用途，用于防止或改善皱纹。能够抑制ADAM的活性的物质能用于防止或改善皱纹的美容处理中。
在本发明的更进一步的方面，本发明涉及能够抑制ADAM活性的物质的用途，用于产生防止或改善皱纹的组合物。对于组合物的种类没有限制。然而，组合物应优选地是一种用于皮肤外用的制品，如化妆品、药品和准药品。组合物应更优选地是一种化妆品。
存在于皮肤中的ADAM的例子包括ADAM-9、ADAM-10、ADAM-12、ADAM-15、ADAM-17和ADAM-19。尤其是已发现ADAM-9、ADAM-10和ADAM-17深度参与细胞生长因子的释放与活化。
在文中使用的术语“抑制ADAM的活性”包含抑制ADAM的酶活性和用于降低皮肤中ADAM的活性的任意作用，如抑制基因表达和蛋白质形成的作用。
在本发明的另一方面，本发明提供了评价抗皱纹效果的方法，其包括以下步骤：
1)将受试物质与人或动物的皮肤、皮肤组织或细胞接触；
2)检测所述皮肤、皮肤组织或细胞中ADAM的酶活性或基因表达水平；
3)通过使用ADAM的酶活性或基因表达水平作为指标，评价受试物质的抗皱纹效果。
ADAM可以是例如ADAM-9、ADAM-10或ADAM-17。
例如，在利用皮肤细胞尤其是表皮角质形成细胞时能快速和有效评价多种受试物质的抗皱纹效果。
在文中使用的术语“抗皱纹效果”是指防止皱纹形成或改善已形成的皱纹的任意效果。
将能抑制ADAM活性的物质应用至皮肤时，能抑制如ADAM-9、ADAM-10或ADAM-17这样的在皮肤中存在的ADAM的活性，能抑制由于多种主要原因如皮脂减少和洗脸引起的皮肤屏障破坏所致表皮和真皮中生长因子如HB-EGF的释放和活化，能抑制表皮和真皮的肥厚。从而能被显著有效地防止或改善皱纹尤其是细微皱纹的形成。
另外，用根据本发明的其中将ADAM活性抑制用作指标的评价抗皱纹效果的方法，能有效地和容易地具体指定有巨大效果的抗皱纹物质。
附图简述
图1是显示通过抑制表皮中的ADAM活性而防止或改善皱纹的机制的概略图；
图2A是显示受到胶带剥离的小鼠皮肤的复制图像；
图2B是显示小鼠皮肤的皮肤组织切片的显微摄影图，其中小鼠皮肤组织切片已用HE(苏木精-伊红)染色，
图3是显示在细微皱纹的小鼠模型中ADAM-9、ADAM-17、HB-EGF和双调蛋白的基因表达的改变图，
图4A是显示在细微皱纹的小鼠模型中已应用不同药物的皮肤的复制图像，
图4B是显示小鼠皮肤组织切片的显微摄影图，其中小鼠皮肤组织切片已用HE(苏木精-伊红)染色，
图5是显示ADAM活性抑制物质的抗皱纹效果图，其中抗皱纹效果从视觉判断获得，
图6是显示ADAM活性抑制物质的抗皱纹效果图，其中抗皱纹效果以皱纹面积(％)表示。
实施发明的最佳方式
ADAM是有两种特征即粘附和细胞外蛋白分解的多功能蛋白，且至少有30种家族的ADAM。现在，ADAM家族的种类数量还在增加。ADAM在多种动物和多种组织中表达。存在于皮肤中的ADAM的例子包括ADAM-9、ADAM-10、ADAM-12、ADAM-15、ADAM-17和ADAM-19。尤其是已发现ADAM-9、ADAM-10和ADAM-17深度参与细胞生长因子的释放与活化。
能用于本发明的能够抑制ADAM的活性的物质可选自能降低皮肤中ADAM的活性的广泛多种物质。例如，能够抑制ADAM的活性的物质可以是能抑制ADAM的酶活性的物质，或者是能够抑制ADAM基因表达或蛋白质形成的物质。另外，能够抑制ADAM的活性的物质可以是天然物质，如动物来源的物质或植物来源的物质。可选择地，能够抑制ADAM的活性的物质可以是合成物质。
如上所述的能够抑制ADAM的活性的物质的例子包括TAPI-1(N-(R)-(2-(羟氨基羰基)甲基)-4-甲基戊酰基-L-Na1-L-丙氨酸2-氨乙基酰胺；Immunex，西雅图，WA)和4-甲氧基苯基异羟肟酸。然而，能够抑制ADAM的活性的物质并不局限于上述物质的例子。
能够抑制ADAM的活性的物质应优选地用于皮肤外用制品中。但是，能够抑制ADAM的活性的物质的用途不限于上述应用。
在皮肤外用制品中，可只含有一种能够抑制ADAM的活性的物质。可选择地，在皮肤外用制品中，可含有组合混合的至少两种能抑制ADAM的活性的物质。另外，在皮肤外用制品中这些能够抑制ADAM活性的物质的混合比例可根据使用方式、产品形式等等改变，并不局限于特定值。然而，例如能够抑制ADAM活性的物质的混合比例相对于皮肤外用制品的总量而言应优选地落在0.001质量％到10质量％的范围内，更优选地落在0.005质量％到5质量％的范围内，且最优选地落在0.01质量％到1质量％的范围内。
文中使用的术语“皮肤外用制品”包含化妆品、药品、准药品等等。同样，皮肤外用制品可以采用广泛的多种制品形式，如水溶液型、增溶型、乳剂型、油液型、凝胶型、膏型、软膏型、气溶胶型、水-油双层型和油-水-粉末三层型。更进一步，皮肤外用制品可以采用负载在片状基础材料上的形式。
另外，皮肤外用制品可以具有多种产品形式并可以在多种应用中使用。例如皮肤外用制品可以化妆水、乳液、皮肤用霜和面膜的产品形式用作用于脸部、身体和头部皮肤的外用制品。
根据需要，除了能够抑制ADAM的活性的物质以外，皮肤外用制品也可以含有其它通常在皮肤外用制品如化妆品和药品中使用的任意的组分。另外，皮肤外用制品可以根据目的制品形式按照常规方法产生。例如上述能够抑制ADAM活性的物质和至少一种选自下述组分的组分可以一起混合，并因此可制备用于皮肤外用的制品。
特别地，皮肤外用制品可以含有至少一种紫外线吸收剂。紫外线吸收剂的例子包括苯甲酸型紫外线吸收剂如对氨基苯甲酸(以下缩写为PABA)、PABA单甘油脂、N，N-二丙氧基PABA乙脂、N，N-二乙氧基PABA乙脂、N，N-二甲基PABA乙脂、N，N-二甲基PABA丁脂和N，N-二甲基PABA甲脂；邻氨基苯甲酸型紫外线吸收剂，如N-乙酰基邻氨基苯甲酸高薄荷醇脂；水杨酸型紫外线吸收剂如水杨酸戊酯、水杨酸薄荷醇酯、水杨酸高薄荷醇酯、水杨酸辛酯、水杨酸苯酯、水杨酸苯甲酯和水杨酸对异丙醇苯酯；肉桂酸型紫外线吸收剂如肉桂酸辛酯、4-异丙基肉桂酸乙酯、2，5-二异丙基肉桂酸甲酯、2，4-二异丙基肉桂酸乙酯、2，4-二异丙基肉桂酸甲酯、对甲氧基肉桂酸丙酯、对甲氧基肉桂酸异丙酯、对甲氧基肉桂酸异戊酯、对甲氧基肉桂酸辛酯(对甲氧基肉桂酸2-乙基己基酯)、对甲氧基肉桂酸2-乙氧基乙酯、对甲氧基肉桂酸环己基酯、α-氰基-β-苯基肉桂酸乙酯、α-氰基-β-苯基肉桂酸2-乙基己基酯、甘油基单-2-乙基己酰-二对甲氧基肉桂酸酯和三甲氧基肉桂酸甲基双(三甲基硅氧烷)甲硅烷基异戊脂；3-(4’-甲基苯亚甲基)-d，l-樟脑；3-苯亚甲基-d，l-樟脑；尿刊酸；尿刊酸乙脂；2-苯基-5-甲基苯并
Figure BDA0000051851880000071
唑；2，2’-羟基-5-甲基苯基苯并三唑；2-(2’-羟基-5’-叔辛基苯基)苯并三唑；2-(2’-羟基-5’-甲基苯基)苯并三唑；二苄连氮(dibenzalazine)；二-甲氧苯酰基甲烷；4-甲氧基-4’-叔丁基二苯甲酰甲烷；5-(3，3-二甲基-2-降冰片烯(norbornylidene))-3-戊-2-酮；和二吗啉代哒嗪酮。
可以使用的紫外线分散剂的例子包括颗粒如氧化钛、微粒氧化钛、氧化锌、微粒氧化锌、氧化铁、微粒氧化铁、氧化铈。
通常地，紫外线分散剂以针状颗粒、纺锤状颗粒、球状颗粒和粒状颗粒的形式使用。另外，紫外线分散剂应优选地是粒径最多为0.1μm的细微颗粒。
也优选地使用已受到疏水化加工的紫外线分散剂如使用甲基氢聚硅氧烷或硅烷偶联剂的硅氧烷加工；金属皂加工；使用全氟烷基磷酸二乙醇胺盐、全氟烷基甲硅烷等的氟加工；或糊精脂肪酸脂加工。
可以使用的液态脂肪和油的例子包括鳄梨油、山茶油、鳖脂、马卡达姆坚果油、玉米油、水貂油、橄榄油、菜籽油、卵黄油、麻油、桃仁油、小麦胚芽油、油茶(sasanqua)油、蓖麻豆油、亚麻子油、红花油、棉籽油、紫苏油、大豆油、花生油、茶籽油、椰子油、米糠油、中国油桐油、日本油桐油、霍霍巴油、胚芽油和三甘油。
可以使用的固态脂肪和油的例子包括可可脂、椰子油、马脂、固化椰子油、棕榈油、牛脂、羊脂、固化牛脂、棕榈仁油、猪脂、牛骨脂、日本腊仁油、固化油、牛腿脂、日本腊和固化蓖麻豆油。
可以使用的腊的例子包括蜂腊、小烛树腊、棉腊、腊棕榈腊、昆虫腊、鲸腊、牡丹腊、米糠腊、羊毛脂、木棉花腊、羊毛脂醋酸盐、液态羊毛脂、芦黍腊、羊毛脂脂肪酸异丙脂、月桂酸己脂、还原的羊毛脂、霍霍巴腊、硬羊毛脂、虫胶腊、POE羊毛脂醇醚、POE羊毛脂醇醋酸酯、POE胆固醇醚、羊毛脂脂肪酸聚乙二醇和POE氢化羊毛脂醇醚。
可以使用的烃油的例子包括液态石蜡、地腊、角鲨烷、姥鲛烷、石蜡、地腊、角鲨烯、凡士林、微晶腊、聚乙烯腊、和Fischer-Tropsch腊。
可以使用的高级脂肪酸的例子包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、萮树酸、油酸、十一烯酸、甲基苯甲酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。
可以使用的高级醇的例子包括直链醇(如月桂醇、鲸蜡醇、硬脂酰醇、山萮醇、肉豆蔻醇、十八碳-9-烯基醇和十六醇十八醇混合物)和支链醇(如单硬脂酰甘油醚(鲨肝醇)、2-癸基四癸炔羊毛脂醇、胆固醇、植物甾醇、己基十二醇、辛基十二醇)。
可以使用的合成酯油的例子包括肉豆蔻酸异丙酯、辛酸鲸蜡酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、油酸癸酯、癸基二甲基辛酸己酯、醋酸鲸蜡酯、醋酸肉豆蔻酯、醋酸羊毛脂酯、硬脂酸异十六烷基酯、异硬脂酸异十六烷基酯、12-羟基硬脂酸胆固醇酯、二-2-乙基己酸乙二醇酯、脂肪酸二戊赤藓醇酯、单-异硬脂酸N-烷基乙二醇酯、二葵酸新戊基乙二醇酯、苹果酸二-异硬脂酰酯、二-2-庚基十一酸甘油酯、三-2-乙基己酸三羟甲基丙酯、三异硬脂酸三羟甲基丙酯、四-2-乙基己酸戊赤藓醇酯、三-2-乙基己酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三-异棕榈酸甘油酯、三-异硬脂酸三羟甲基丙酯、己酸鲸蜡基-2-乙酯、棕榈酸2-乙基己酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三-2-庚基十一酸甘油酯、蓖麻豆油脂肪酸甲酯、油酸油酯、乙酰甘油、棕榈酸2-庚基十一烷酯、己二酸二异丁酯、N-月桂酰基-L-谷氨酸-2-辛基十二烷基酯、己二酸二-2-庚基十一烷基酯、月桂酸乙酯、癸二酸二-2-乙基己酯、肉豆蔻酸2-己基癸酯、棕榈酸2-己基癸酯、己二酸2-己基癸酯、琥珀酸2-乙基己酯、柠檬酸三乙酯、聚氧乙烯和聚氧丙稀随机聚合物甲酯。
可以使用的硅氧烷油的例子包括链状聚硅氧烷(如二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷和二苯基聚硅氧烷)、环状聚硅氧烷(如辛甲基环四硅氧烷、十甲基-环五硅氧烷和十二甲基环六硅氧烷)、已形成三维网状结构的硅氧烷树脂、硅氧烷橡胶和多种修饰的聚硅氧烷(如氨基修饰的聚硅氧烷、聚醚修饰的聚硅氧烷、烷基修饰的聚硅氧烷和氟修饰的聚硅氧烷)。
更进一步，用于皮肤外用的制品可以含有例如保湿剂如聚乙二醇、甘油、1，3-丁烯乙二醇、赤藓醇、山梨醇、木糖醇和麦芽醇；增稠剂如纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、温悖籽、角叉菜聚糖、果胶、甘露聚糖、凝胶多糖、硫酸软骨素、淀粉、半乳聚糖、硫酸皮肤素、糖原、阿拉伯树胶、硫酸乙酰肝素、透明质酸、透明质酸钠、黄蓍胶、硫酸角质素、软骨素、苍耳烷胶、硫酸粘多糖、羟乙基瓜耳胶、羧甲基瓜耳胶、瓜耳胶、右旋糖酐、硫酸角质、豆角胶、琥珀酰葡聚糖、charonin酸、几丁质、壳聚糖、羧甲基几丁质和琼脂；低级醇如乙醇；抗氧化剂如丁基羟基甲苯、维生素E和肌醇六磷酸钙镁；抗菌剂如苯甲酸、水杨酸、山梨酸、对-羟基苯甲酸烷基酯和六氯酚；有机酸如酰基肌氨酸(例如月桂酰N-甲基-甘氨酸(carcosine)钠)、谷胱甘肽、柠檬酸、苹果酸、酒石酸和乳酸；维生素如维生素A及其衍生物、维生素B如维生素B6盐酸盐、维生素B6三棕榈酸盐、维生素B6二辛酸盐、维生素B2及其衍生物、维生素B12、维生素B15及其衍生物、维生素C如抗坏血酸、抗坏血酸硫酸酯(盐)、抗坏血酸磷酸酯(盐)和抗坏血酸二棕榈酸盐、维生素E如α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和维生素E醋酸盐、维生素D、维生素H、泛酸和泛酰巯基乙胺；多种药品如烟酸酰胺、烟酸苄酯、γ-谷维素、尿囊素、甘草酸(盐)、甘草酸及其衍生物、扁柏酚、没药醇、桉叶素、百里酚、肌醇、皂草苷如柴胡皂草苷、胡萝卜皂草苷、丝瓜皂草苷和突二皂草苷、泛酰乙基醚、乙炔基孕二烯酮、凝血酸、熊果甙、塞发冉质和胎盘提取物；植物提取物如羊蹄(Rumex japonicus Houtt)、苦参(Sophora flavescens Aiton)、日本萍蓬草(Nuphar japonicum DC)、柑桔、药鼠尾草(Salvia officinalis)、高山蓍草(Achillea alpine L)、Malva sylvestris L.var.mauritiana Mill.(树银葵)、獐牙菜(Swertie Herb)、Thymus vulgaris L(普通百里香)、日本当归根、苦桔皮、白桦、问荆(Equisetum arvense L.)、丝瓜、欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum L)(马栗)、虎耳草(Saxifraga stoloniferaMeerb)、山生阿尼菊(Arnica Montana)(阿尼菊属)、百合、魁蒿(Artemisia Princeps Pampan)、芍药(Paeonia lactiflora Pall)、芦荟、栀子(Gardenia jasminoides Ellis forma grandiflora(Lour)Makino)、日本花柏(Chamaecyparis pisifera Endi)的提取物、山楂(Crataegus oxyacantha L)(英格兰山楂)提取物、贯叶金丝桃(Hypericum perforatum L)提取物、鸢尾属提取物、棕儿茶提取物、Ginkgo biloba L(银杏)提取物、地椒(Thymus quinquecostatus Celak)提取物、Foeniculum vulgare Mill(小茴香)提取物、乌龙茶提取物、水百合提取物、玫瑰果提取物、日本香茶菜(Isodon japonicus(Barm)Hara)提取物、黄芩根提取物、黄檗树皮提取物、野芝麻变种(Lamium album L.var.barbatum)(Sieb.Et Zucc.)Franch.Et Savat提取物、甘草提取物、栀子(Gardenia jasminoides Ellis forma grandiflora(Lour.)Makino)提取物、黑茶提取物、中国Tamarisk Twing提取物、委陵菜(Potentilla tonnebtilla Schrank)提取物、玫瑰提取物、loofan提取物、薄荷提取物、迷迭香提取物及蜂王浆提取物；着色剂；非离子型表面活性剂如失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单棕榈酸酯、失水山梨糖醇倍半油酸酯、失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇单油酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚乙二醇二醚、月桂酰二乙醇酰胺、脂肪酸异丙醇酰胺、麦芽糖醇羟基脂肪酸酯、烷基化多糖、烷基糖苷和糖酯；阳离子型表面活性剂如十八烷基三甲基氯化铵、苯扎氯胺和十二烷基氧化胺；阴离子型表面活性剂如棕榈酸钠、月桂酸钠、sodium laurylate、月桂基硫酸钾、烷基硫酸三乙醇胺醚、土耳其红油、线性十二烷基苯硫酸盐、聚氧乙烯固化蓖麻籽油马来酸酯和酰基甲基牛磺酸；两性表面活性剂；中和剂；抗氧化剂如γ-生育酚和丁基羟基甲苯；及防腐剂如苯氧基乙醇和对羟基苯甲酸酯。
在根据本发明的方法中，上述能够抑制ADAM活性的物质可以多种形式之一应用到皮肤，由此该物质能够用于皮肤，并由此能够实现本发明的目的。另外，上述能够抑制ADAM活性的物质可以单独应用。备选地，上述能够抑制ADAM的活性的物质可以与其它任意组分混合应用。更进一步，对上述能够抑制ADAM活性的物质应用到的皮肤部位没有限制。特别地，上述能够抑制ADAM活性的物质可以应用到身体表面皮肤的每个部位，包括头部皮肤。根据本发明的方法应优选地用作美容方法，但不限于用作美容方法。
根据本发明的评价抗皱纹效果的方法包括将受试物质与人或动物的皮肤、皮肤组织或皮肤细胞相接触的步骤。
根据本发明的评价抗皱纹效果的方法可以通过利用人和动物的多种皮肤之一实施，由此可以实现本发明的目的。例如，根据本发明的评价抗皱纹效果的方法可以通过利用无毛小鼠的皮肤实施，其皮肤己受到胶带剥离用于剥去皮肤的角质层。特别地，可以对无毛小鼠的皮肤剥离胶带，这样可剥去皮肤的角质层，因此可连续破坏皮肤屏障。在这种情况下，小鼠的皮肤出现细微皱纹，且ADAM如ADAM-9、ADAM-10或ADAM-17的酶活性或基因表达提高。认为细微皱纹形成的原因之一是通过提高ADAM的活性促进生长因子如HB-EGF的释放与活化，并且由此导致发生表皮和真皮的肥厚。因此，认为用根据本发明的评价抗皱纹效果的方法，例如通过指定能够降低已通过上述的连续皮肤屏障破坏而提高的ADAM基因表达的物质，能够有效地指定抗皱纹物质。
在根据本发明的评价抗皱纹效果的方法中使用的皮肤细胞是形成皮肤表皮区域的上皮细胞。上皮细胞的例子包括表皮细胞如表皮角质形成细胞、皮脂腺细胞、乳腺细胞、小肠上皮细胞和其它粘膜上皮细胞。在上述列举的上皮细胞的例子中，作为表皮细胞的一个例子的表皮角质形成细胞具有能够容易地培养细胞的优点。另外，这种检测方法是与表皮状态相关的技术。因此，表皮角质形成细胞是对于本方法优选的皮肤细胞。另外，皮肤细胞供给来源应优选地是人。更进一步，在本方法中使用的皮肤细胞应优选地是经培养的细胞。经培养的细胞能够用常规方法制备。
例如，在皮肤细胞是人表皮角质形成细胞的情况下，可以通过从皮肤切片中去除其中的脂肪组织和血液及通过蛋白酶处理分离其中的真皮部分等加工，从修复外科、皮肤病学、外科手术等获得的过剩的皮肤切片制备人表皮。另外，可以从这样制备的人表皮中分离表皮角质形成细胞并可通过常规方法利用KGM培养基原代培养表皮角质形成细胞并可以根据常规方法通过利用蛋白酶等等传代培养原代培养细胞。以这种方式，能够得到所需的培养的人表皮角质形成细胞。所述类型的表皮角质形成细胞是商业上可得的。在本发明中也可使用商业上可得的表皮角质形成细胞。
ADAM的酶活性的检测能够通过例如测量ADAM底物如HB-EGF的释放量。
另外，为了检测待检测的基因表达水平，例如可以通过利用RT-PCR、Northern印迹技术等扩增和/或测定cDNA。作为选择，可以通过利用ELISA、Western印迹技术等检测和/或测定蛋白质。
通过将ADAM的酶活性或基因表达水平用作指数评价受试物质的抗皱纹效果的步骤可以包括例如这样的技术，其中未加入受试物质或加入已知不影响ADAM的活性的物质的皮肤、皮肤组织或皮肤细胞用作对照，并将其中加入了受试物质时的ADAM的酶活性或基因表达水平与对照中的ADAM的酶活性或基因表达水平相比较。例如，作为与对照的ADAM的酶活性或基因表达水平相比较的结果，可指定发现降低ADAM的酶活性或基因表达水平的物质作为具有抗皱纹效果的物质(即抗皱纹物质或皱纹防止或改善剂)。
对根据本发明的评价抗皱纹效果的方法的使用方式没有任何限制。例如根据本发明的评价抗皱纹效果的方法可用于筛选和评价抗皱纹物质等。
本发明将通过下述非限制性实施例进一步阐明。
实施例
制备细微皱纹小鼠模型
认为在多种主要因素如皮脂减少和洗脸削弱或破坏皮肤屏障及从皮肤表面的水蒸发增加的情况下，皮肤变干并形成细微皱纹。因此，在无毛小鼠的皮肤上反复剥离胶带，因而剥去角质层并破坏皮肤屏障。以这种方式可制备细微皱纹小鼠模型。特别地，用玻璃纸胶带通过调整剥离胶带的次数以使经皮的水分损失(TEWL)(通过利用由美国Meeco公司提供的水蒸发量测量装置MEECO测量)可以落到4mg/cm2/h到6mg/cm2/h的范围内，在无毛小鼠(HR-1，雄性，六周龄，由Hoshino Experimental Animals提供)背部左侧的皮肤上剥离胶带。通常，在起始阶段重复大概四次剥离胶带。在最后阶段重复大概七到八次剥离胶带。每周在三个阶段剥离胶带并持续四周。将无毛小鼠背部右侧留作非处理区域。
图2A是显示已经受到上述方式剥离胶带的小鼠皮肤的复制图像。图2B是显示小鼠皮肤的皮肤组织切片的显微摄影图，其中小鼠皮肤组织切片已用HE(苏木精-伊红)染色。如复制形象图(图2A)所示，皮肤沟渠在开始剥离胶带后的24小时阶段(24h)和开始剥离胶带后的48小时阶段(48h)变深。在开始剥离胶带后的一周(1W)阶段，皮肤沟渠的方向与预定的方向相同。在开始剥离胶带后的四周(4W)阶段，皱纹状的外表出现。另外，如皮肤组织的显微摄影图(图2B)所示，当与非处理区域(NT)比较时发现表皮在开始剥离胶带后的24小时阶段开始肥厚。在开始剥离胶带后的两周阶段(2W)表皮保持肥厚。下表1显示了已用上述方式制备的细微皱纹小鼠模型的形态学上的改变、组织学上的改变等，并显示了已用紫外线辐射(10周)制备的光老化小鼠模型的形态学上的改变、组织学上的改变等。
表1  细微皱纹小鼠模型和光老化小鼠模型之间的比较
Figure BDA0000051851880000141
已用上述方式受到剥离胶带的小鼠的皮肤显示出与人类皮肤细微皱纹的改变相同的改变。另外，已用上述方式受到剥离胶带的小鼠的皮肤在皱纹外观、表皮肥厚等等方面与已用紫外线辐射制备的光老化小鼠模型显著地不同。因此表明用上述方法能够制备与由光老化制备的大皱纹小鼠模型显著地不同的细微皱纹小鼠模型。
研究细微皱纹小鼠模型的生物化学改变
就已经用上述方式制备的细微皱纹小鼠模型而言，推断已发生表皮和真皮的肥厚，且表皮和真皮中的细胞生长因子已由通过剥离胶带导致发生的屏障破坏刺激而活化。因此，研究了关于存在于表皮中的细胞生长因子HB-EGF和双调蛋白的基因表达，及发挥从细胞膜释放上述生长因子和活化生长因子的作用的酶ADAM-9、ADAM-17的基因表达。
通过利用RT-PCR法测定表达量。特别地，从已用上述方式制备的细微皱纹小鼠模型的左侧(剥离胶带处理：T)和右侧(非处理：N)经时取样的背部皮肤样品提取总RNA。另外，在已制备cDNA后，通过利用特异于受试目标基因的引物进行RT-PCR。更进一步，作为参考，与如上所述的相同方式测定具有在每一细胞的表达量与预定量相同的特性的持家基因甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAPDH)。
得到如图3中表示的结果。如图3所示，关于ADAM-9和ADAM-17，在已于皮肤上剥离胶带后的24小时阶段和在已于皮肤上剥离胶带后的48小时阶段基因表达提高。另外，关于属于同一HB-EGF家族的由ADAM释放与活化的HB-EGF和双调蛋白，在已于皮肤上剥离胶带后的24小时阶段到已于皮肤上剥离胶带后的一周阶段基因表达提高。
药物应用在细微皱纹小鼠模型上的抗皱纹效果的研究
研究了下列表2所示的多种药物在细微皱纹小鼠模型上应用的抗皱纹效果。
表2
Figure BDA0000051851880000151
＊：N-羟基-2-[[(4-甲氧基苯基)磺酰基]3-皮考基]氨基]-3-甲基丁烷酰胺盐酸盐](J.Med.Chem.1997，40卷，2525-2332页)
特别地，在无毛的小鼠上以上述方式剥离胶带。在每一胶带剥离处理后，应用每种列于表2的药物100μl到无毛小鼠的皮肤上。图4A是显示在细微皱纹的小鼠模型中已应用不同药物的皮肤的复制图像，其中复制图像已在应用每种药物后的一周、两周和四周阶段获得。图4B是显示在使用每种药物后的四周阶段小鼠皮肤组织切片的显微摄影图，其中皮肤组织切片已用HE(苏木精-伊红)染色。下面的表3表示根据下述的评价标准获得的结果。
○：改善
△：未发现改变
×：恶化
表3各种药物在细微皱纹小鼠模型上的抗皱纹效果
Figure BDA0000051851880000161
作为ADAM活性抑制物质的TAPI-1在细微皱纹小鼠模型中抑制细微皱纹形成并显著地抑制表皮和真皮的肥厚。作为MMP抑制剂的在光老化的小鼠模型上显示防止皱纹形成效果的CGS27023A(N-羟基-2-[[(4-甲氧基苯基)磺酰基]3-皮考基]氨基)-3-甲基丁烷酰胺盐酸盐)(J.Med.Chem.1997，40卷，2525-2332页)和作为保湿剂的甘油对于细微皱纹小鼠模型而言均根本不能抑制皱纹形成，且不能抑制表皮和真皮的肥厚。另外，有促进皮肤变粗糙作用的不饱和脂肪酸油酸促进皱纹形成且加速表皮和真皮肥厚。
从上述结果表明仅仅用保湿剂不能充分地防止或改善细微皱纹的形成。也表明当抑制皮肤中ADAM的活性，并因而抑制生长因子的释放与活化时，能抑制表皮和真皮的肥厚，并能有效地防止或改善细微皱纹的形成。更进一步，从对于光老化的小鼠模型而言显示抑制皱纹形成效果的作为MMP抑制剂的CGS27023A不能抑制皱纹形成的结果表明通过本发明的能抑制ADAM活性的物质抑制皱纹的形成是由不同于MMP抑制剂的作用机制得到的效果。
寻找新的ADAM活性抑制物质并评价抗皱纹效果
寻找能够抑制ADAM活性的新化合物，且使用细微皱纹小鼠模型评价新化合物的抗皱纹效果。除非另外指出，化合物的混合比例以质量％的方式表示。
(1)筛选ADAM活性抑制物质
首先，通过利用HB-EGF-AP/HT-1080(经修饰以实现融合蛋白的强制表达的人纤维肉瘤来源的培养细胞HT-800，其中将耐热的碱性磷酸酶(AP)加到人HB-EGF的N末端)筛选有ADAM酶抑制活性的化合物。在使用的细胞株HB-EGF-AP/HT-1080的细胞表面上，HB-EGF全长分子以与碱性磷酸酶融合的形式表达。在佛波醇酯刺激细胞的情况下，活化了在细胞膜表面的ADAM酶以切割HB-EGF分子。既然碱性磷酸酶已结合到已切割成释放形式的HB-EGF上，在测量培养上清液中的碱性磷酸酶活性的情况下，能够间接地测量化合物的ADAM酶抑制活性。
特别地，已将细胞数调整为2.0×105个细胞/孔的HB-EGF-AP/HT-1080以0.2ml/孔的比率播种到96孔微量培养板并在37℃过夜培养。在去除培养基和用PBS(-)洗涤后，以0.1ml/孔的比率加入含有受试物质的培养基，并在37℃孵育30分钟。这样进行预处理。此后去除上清液，并以0.2ml/孔的比率加入含有受试物质和60nM TPA(佛波醇酯：12-o-四癸酰佛波醇醋酸酯；Sigma P8139)的培养基。然后孵育60分钟并这样处理。在处理后，将每孔中的0.1ml培养上清液转移到微量培养板的孔中用于碱性磷酸酶活性检测。另外，在65℃孵育10分钟，且内源的碱性磷酸酶因而灭活。进一步，以0.1ml/孔的比率向每孔中加入1mg/ml的AP底物(对硝基苯基磷酸盐，Wako；141-02341)，并立即在405nm波长处测量每孔中的吸光度。在蔽光条件下在室温孵育2小时后，再次在405nm波长处测量每孔中的吸光度。通过从在两小时孵育后的阶段测量的吸光度减去在加入AP底物后的阶段立即测量的吸光度得到的值作为每孔的吸光度。抑制率用下面表示的公式计算：
抑制率(％)＝(A0-AS)/(A0-A100)＊100
其中A0表示0％抑制对照(仅仅含有TPA的培养基)的吸光度，A100表示100％抑制对照(仅仅有培养基)的吸光度，且AS表示样品的吸光度。
作为结果，发现用4-甲氧基苯基异羟肟酸高效抑制HB-EGF释放，且表明4-甲氧基苯基异羟肟酸能抑制ADAM活性。4-甲氧基苯基异羟肟酸可用下示结构式表示。另外，4-甲氧基苯基异羟肟酸的释放抑制率示于下面的表4中。
Figure BDA0000051851880000181
4-甲氧基苯基异羟肟酸
表4
Figure BDA0000051851880000182
(2)评价ADAM活性抑制物质的抗皱纹效果
通过利用细微皱纹小鼠模型研究作为ADAM活性抑制物质的TAPI-1和4-甲氧基苯基异羟肟酸的抗皱纹效果。
特别地，在无毛小鼠(HR-1，雄性，六周龄，由Hoshino Experimental Animals提供)背部左侧的皮肤上每周在三个阶段剥离胶带且持续四周以使经皮水损失(TEWL)(通过利用由美国Meeco公司提供的水蒸发量测量设备MEECO测量)可落在4mg/cm2/h到8mg/cm2/h的范围内。在完成了每一阶段的剥离胶带处理后，立即将100μl的TAPI-1或4-甲氧基苯基异羟肟酸应用到小鼠背部左侧的皮肤。在这时，将4-甲氧基苯基异羟肟酸溶于50％含水乙醇溶液中以使4-甲氧基苯基异羟肟酸的浓度可变为等于1％，且以所得溶液的形式使用4-甲氧基苯基异羟肟酸。另外，以1mM的浓度评价TAPI-1(由Peptide Research Institute提供)。更进一步，作为阴性对照，50％含水乙醇溶液(即媒介物)以与如上所述相同的方式应用。
用视觉判断的分值表示在四周过去后皱纹发生的状态。用下述等级评价皱纹发生的状态。
0：无皱纹
1：浅皱纹
2：明显皱纹
3：深皱纹
通过每隔0.5的分值表示皱纹发生的状态。大分值表示深皱纹。计算每组的平均值和标准偏差。得到图5所示的结果。
如图5所示，媒介物分值的平均值等于1.17。另外，TAPI-1分值的平均值等于0.43，而4-甲氧基苯基异羟肟酸分值的平均值等于0.91。作为ADAM活性抑制物质的TAPI-1和4-甲氧基苯基异羟肟酸的每一个与媒介物对比显示了显著的皱纹抑制效果。
此后，通过利用皱纹分析设备(由Hamano Engineering提供)分析小鼠背部的复制物并计算皱纹面积(％)。低皱纹面积百分比表示已抑制了皱纹形成。得到图6所示结果。
由图6可见，TAPI-1皱纹面积(％)的平均值与4-甲氧基苯基异羟肟酸皱纹面积(％)的平均值显著地低于媒介物皱纹面积的平均值(％)。因而作为ADAM活性抑制物质的TAPI-1和4-甲氧基苯基异羟肟酸的每一个显示高皱纹抑制效果。
从上述结果表明作为ADAM活性抑制物质的TAPI-1和4-甲氧基苯基异羟肟酸的每一个能通过抑制ADAM酶抑制作为表皮生长因子的HB-EGF的释放，并能防止或改善皱纹。

Claims (3)

1.鉴定抗皱纹物质的方法，其包括以下步骤：
i)将受试物质与人或动物的皮肤、皮肤组织或细胞接触；
ii)检测所述皮肤、皮肤组织或细胞中解联蛋白和金属蛋白酶的酶活性或基因表达水平；
iii)通过使用解联蛋白和金属蛋白酶的酶活性或基因表达水平作为指标，评价受试物质的抗皱纹效果。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述解联蛋白和金属蛋白酶选自解联蛋白和金属蛋白酶-9、解联蛋白和金属蛋白酶-10和解联蛋白和金属蛋白酶-17。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中使用表皮角质形成细胞。
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