KR20070072519A - Ａｄａｍ 활성 저해물질에 의한 주름의 방지 또는 개선 - Google Patents

Abstract

피부에 존재하는 ADAM(a disintegrin and metalloprotease)의 활성을 저해하는 물질로 이루어지는 주름 방지 또는 개선제. 피부에 존재하는 ADAM의 활성을 저해하는 물질을 피부에 적용하여 주름을 방지 또는 개선한다. 피부, 조직 또는 세포에 있어서의 ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨을 지표로 하여 피검물질의 항주름 효과를 평가한다.

Description

ＡＤＡＭ 활성 저해물질에 의한 주름의 방지 또는 개선{PREVENTION OR IMPROVEMENT OF WRINKLES BY USING ADAM ACTIVATION INHIBITOR}

본 발명은, ADAM 활성 저해물질을 사용한 주름의 방지 또는 개선, 및 ADAM 활성 저해를 지표로 한 항주름 효과의 평가방법에 관한 것이다.

나이를 먹음에 따라서 피부노화의 하나의 현상으로서 주름이 증가하지만, 미용 등의 관점에서 특히 여성에 있어서 주름의 방지 및 개선에 대한 관심이 대단히 높아지고 있다. 주름은, 그 발생 부위나 발생 메커니즘 등에 따라, 굵은 주름, 잔주름, 및 쪼글쪼글한 주름으로 크게 분류된다. 굵은 주름은 주로 광노화에 의해 이마나 목의 뒤 등에 생기는 깊은 주름이며, 잔주름은 눈초리나 입가에 생기는 비교적 얕다 주름이며, 또 쪼글쪼글한 주름은 노인의 복부 등의 비노광부에 생기는 플리트(pleat) 형상의 주름이다.

지금까지, 주름에 관한 연구는 주로 광노화에 의해 생기는 굵은 주름에 대하여 행하여져, 광노화에 의한 증상의 하나로서 취급되어 왔다. 광노화에 대해서는, 발생 메커니즘 등에 관한 연구가 진행되어 있고, 또 동물 모델이나 인간에서의 평가계도 확립되어 있다. 광노화에 의한 주름 형성 억제의 시도는, 자외선에 의한 피부에의 악영향을 방지 또는 경감하는 것에 의한 것이 대부분이며, 예를 들면 자외 선에 의한 피부에의 장해를 방지하기 위해서, 산화티탄, 산화아연, 파라메톡시계피산 에스테르, 파라아미노안식향산 에스테르 등의 각종의 자외선 흡수, 산란, 차폐물질을 배합한 화장료(선 스크린, 선 프로텍트 화장품)가 개발되어, 사용되고 있다. 또한 UV 조사에 의해 피부에 생긴 프리라디칼이 콜라겐이나 엘라스틴 등의 피부를 구성하는 섬유 성분에 대한 악영향을 미치는 것을 알고 있어, 산화방지제를 함유하는 화장료가 제안되어 있다(예를 들면 일본 특허공표 2001-508809호 공보 참조). 또한, UV 폭로에 의해, 콜라겐이나 엘라스틴 등의 진피의 결합조직을 분해하는 MMP가 유발되어, 그것에 의해서 진피의 결합조직이 파괴되는 것이 피부의 광노화의 하나의 큰 요인이다라고 생각되고 있어, 피부의 광노화를 막기 위해서, 예를 들면 UVA 차단제와, UVB 차단제와, 레티노이드 등의 MMP 저해제를 배합한 피부의 광노화를 억제하기 위한 조성물이 제안되어 있다(예를 들면 일본 특허공표 2001-520677호 공보 참조).

한편으로, 최근, 중노년의 여성에 있어서의 미용에 대한 관심이 높아짐에 따라, 나이가 듬에 따르는 표피 각질층의 보수능력의 저하나 표피 지질의 분비 저하에 의한 피지의 감소에 의해 현재화되는, 눈초리나 입가에 생기는 잔주름 대한 관심이 높아지고 있다. 잔주름은, 피부의 건조가 원인이라 생각되고 있어, 그 발생 메커니즘이나, 형태학적, 조직학적, 또는 생화학적 변화 등에 있어서, 광노화에 의해 생기는 굵은 주름과는 크게 다르다고 여겨지고 있다. 예를 들면 각질층 수분량과 잔주름의 정도에 상관성이 있는 것이 인간에 있어서 검증되어 있다(예를 들면 이모카와 등, Fragrance Journal;1992(11)29-42 참조). 또한 불포화 지방산에서 계 속적으로 배리어 기능을 파괴하면, 표피성의 주름이 생기는 것이 보고되어 있다(예를 들면 마사키 진 향료회지;2001 Vol.25, No.1, 34-38 참조). 그러나, 그러한 잔주름을 발생시킨 피부에 있어서, 단백 레벨 또는 유전자 레벨에서 어떤 생화학적 변화가 발생되고 있는지에 대해서 충분히 해명되어 있지 않아, 잔주름의 방지 및 개선은, 글리세린, 소르비톨, 식물액 추출물 등의 보습제나 콜라겐 등을 함유하는 화장료에 의한 피부의 건조로부터의 보호에 의한 대처에 의지하지 않을 수 없었다. 보습제 등에 의한 피부의 건조로부터의 보호만으로는 잔주름을 충분하게 방지·개선하는 것은 불가능하여, 보다 효과적으로 잔주름을 방지·개선할 수 있는 물질이 강하게 요망되고 있었다.

본 발명은, 상기와 같은 사정을 감안하여, 피부에 있어서의 잔주름 형성에 관여하는 생화학적 변화를 해명하고, 또한 그 변화를 억제할 수 있는 물질을 특정하고, 그 물질을 이용하여, 보다 효과적으로 주름을 방지 또는 개선하는 것을 목적으로 하는 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 생화학적 변화의 억제를 지표로 하고, 보다 효율적이고 또한 간편하게 피검물질의 항주름 효과를 평가할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명자는, 헤어리스 마우스에 테이프 스트립핑을 반복해 실시하는 것에 의한 피부의 계속 배리어 파괴에 의해, 인간의 피부에 있어서의 잔주름과 같은 표피 및 진피의 변화가 마우스의 피부에 생기는 것을 찾아내고, 잔주름 마우스 모델을 제작하는 것에 성공했다. 본 발명은, 이러한 잔주름 마우스 모델에 있어서, ADAM-9, ADAM-10 및 ADAM-17 등의, 디스인테그린과 메탈로프로테아제 도메인을 갖는 ADAM(a disintegrin and metalloprotease) 패밀리에 속하는 단백질(이하 ADAM이라고 칭함), 또한 그들 ADAM에 의해 세포막으로부터의 유리 및 활성화가 이루어지는 HB-EGF(헤파린 결합성 EGF 같은 증식인자;heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor) 및 암피레귤린(Amphiregulin)의 표피에 있어서의 유전자 발현이 항진되어 있는 것, 또한 그들 ADAM의 저해제를 도포함으로써, 표피 및 진피의 비후(hyperplasia) 및 주름 형성을 억제할 수 있는 것의 발견에 근거하는 것이다.

ADAM-9 , ADAM-m 및 ADAM-17 등의 ADAM은, 피부의 세포 표면에 존재하고, 피부에 있어서 HB-EGF, 암피레귤린, TNF-α, TGF-α 등의 증식인자를 세포막으로부터 유리시켜 활성화시키는 효소이다. 피부의 배리어 파괴에 의해, 피부에 있어서 그들 ADAM이 활성화되거나 또는 발현 항진되어, HB-EGF 등의 증식인자의 유리·활성화를 촉진시켜, 표피 및 진피의 비후를 발생시키는 것이, 잔주름 형성의 하나의 중요한 기구라고 생각된다. 따라서, 피부에 있어서의 ADAM의 활성을 억제함으로써, HB-EGF 등의 활성 항진을 억제할 수 있고, 표피 및 진피의 비후를 억제하여, 주름, 특히 잔주름을 방지 또는 개선할 수 있다고 생각된다. 도 1에, 피부에 있어서의 ADAM의 활성 저해에 의해 주름을 방지 또는 개선하는 기구에 대하여 설명한 개략도를 나타낸다.

하나의 형태에 있어서, 본 발명은, 피부에 존재하는 ADAM의 활성을 저해하는 물질로 이루어지는 주름 방지 또는 개선제에 관한 것이다.

또한 별도의 형태에 있어서, 본 발명은, 피부에 존재하는 ADAM의 활성을 저해하는 물질을 피부에 적용하는 것을 포함하는, 주름을 방지 또는 개선하는 방법에 관한 것이다.

또한 별도의 형태에 있어서, 본 발명은, 주름의 방지 또는 개선에 있어서의 ADAM의 활성을 저해하는 물질의 사용에 관한 것이다.

또한 별도의 형태에 있어서, 본 발명은, 주름을 방지 또는 개선하기 위한 조성물의 제조에 있어서의 ADAM의 활성을 저해하는 물질의 사용에 관한 것이다. 조성물은, 한정은 되지 않지만, 화장료, 의약품, 의약 부외품 등의 피부 외용제인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 화장료이다.

피부에 존재하는 ADAM으로서, 예를 들면 ADAM-9, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-15, ADAM-17 및 ADAM-19 등을 들 수 있고, 특히 ADAM-9, ADAM-10 및 ADAM-17은, 세포 증식인자의 유리·활성화에 깊게 관여하고 있는 것을 알고 있다.

본 명세서에 있어서, 「ADAM의 활성을 저해한다」란, ADAM의 효소 활성을 저해할뿐만 아니라, 유전자의 발현이나 단백질 생성을 저해하는 등, 피부에 있어서의 ADAM의 활성을 저하시키는 임의의 작용을 포함한다.

또한 별도의 형태에 있어서, 본 발명은 항주름 효과의 평가방법에 관한 것으로서, 인간 또는 동물의 피부, 피부조직 또는 세포에 피검물질을 접촉시켜, 상기 피부, 조직 또는 세포에 있어서의 ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨을 검출하고, ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨을 지표로 하여 피검물질의 항주름 효과를 평가하는 것을 포함한다.

ADAM으로서, 예를 들면 ADAM-9, ADAM-10 또는 ADAM-17 등을 들 수 있다.

예를 들면 피부세포, 특히 표피각화 세포를 사용함으로써, 신속 또한 효율적으로 다수의 피검물질의 항주름 효과를 평가할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「항주름 효과」란, 주름의 형성을 방지하거나, 또는 형성된 주름을 개선하는 임의의 효과를 의미한다.

ADAM의 활성을 저해하는 물질을 피부에 적용함으로써, ADAM-9, ADAM-10 및 ADAM-17 등의 피부에 존재하는 ADAM의 활성을 저해하고, 피지의 감소나 세안 등의 여러가지 요인에 의해 생기는 피부의 배리어 파괴에 의해 유도 야기되는 표피 및 진피에 있어서의 HB-EGF 등의 증식인자의 유리·활성화를 억제하여, 표피나 진피의 비후를 억제할 수 있고, 매우 효과적으로 주름, 특히 잔주름을 방지 또는 개선하는 것이 가능하다.

또한 본 발명의 ADAM 활성 저해를 지표로 한 평가방법에 의해, 효율적 또한 간편하게, 높은 효과를 갖는 항주름 물질을 특정하는 것이 가능하다.

도 1은, 표피에 있어서의 ADAM의 활성 저해에 의해 주름을 방지 또는 개선하는 기구에 대하여 설명한 개략도이다.

도 2는, 테이프 스트립핑을 실시한 마우스 피부의 레플리커 화상(도 2(A)),및 피부조직 절편을 HE(헤마톡실린-에오신) 염색한 것의 현미경 사진(도 2(B))이다.

도 3은, 잔주름 마우스 모델에 있어서의, ADAM-9, ADAM-17, HB-EGF, 및 ㅇ아 암피레귤린의 유전자 발현의 변화를 나타낸다.

도 4는, 잔주름 마우스 모델에 있어서, 각 약제를 도포한 피부의 레플리커 화상(도 4(A)), 및 피부조직 절편을 HE(헤마톡실린-에오신) 염색한 것의 현미경 사진(도 4(B))이다.

도 5는, 시감 판정에서의 ADAM 활성 저해물질의 항주름 효과를 나타내는 그래프이다.

도 6은, 주름 면적(%)에 의한 ADAM 활성 저해물질의 항주름 효과를 나타내는 그래프이다.

ADAM은, 접착과 세포외 단백질 분해라고 하는 2가지 특성을 갖는 다기능성 단백질로, 30종류 이상의 패밀리가 존재하지만, 지금 또한 그 수는 증가하고 있다. ADAM은, 여러가지 동물 및 조직에 있어서 발현되어지고 있어, 피부에 존재하는 ADAM으로서, 예를 들면 ADAM-9, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-15, ADAM-17 및 ADAM-19 등을 들 수 있다. 특히, ADAM-9, ADAM-10 및 ADAM-17은, 세포 증식인자의 유리·활성화에 깊게 관여하고 있는 것을 알고 있다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 ADAM의 활성을 저해하는 물질은, 피부에 있어서 ADAM의 활성을 저하시키는 것이면 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면 ADAM의 효소 활성을 저해하는 물질, ADAM 유전자의 발현이나 단백질 생성을 저해하는 물질 등, 임의의 것을 포함한다. 또 그들은 동식물 유래물과 같은 천연의 것이어도, 혹은 합성의 것이어도 지장을 주지 않는다.

그러한 ADAM의 활성을 저해하는 물질로서, 한정은 되지 않지만, 예를 들면 TAPI-1(N-(R)-(2-(히드록시아미노카르보닐)메틸)-4-메틸펜타노일-L-Nal-L-알라닌 2-아미노에틸 아미드;Immunex, Seattle, WA), 및 4-메톡시벤조히드록삼산(4-Methoxybenzohydroxamic acid) 등이 예시된다.

한정은 되지 않지만, 본 발명의 ADAM의 활성을 저해하는 물질로 이루어지는 주름 방지 또는 개선제는, 바람직하게는 피부 외용제에 있어서 사용한다.

피부 외용제에 있어서, 상기 ADAM의 활성을 저해하는 물질을 1종 단독으로 또는 2종 이상을 조합시켜서 배합해도 지장이 없다. 또한 피부 외용제에 있어서의 그들 물질의 배합량은, 그 사용 형태나 제품 형태 등에 따라 달라 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 피부 외용제 전량에 대하여, 바람직하게는 0.001질량%∼10질량%, 보다 바람직하게는 0.005질량%∼5질량%, 더욱 바람직하게는 0.01질량%∼1질량%이다.

본 명세서에 있어서, 「피부 외용제」는, 화장료, 의약품, 의약 부외품 등을 포함한다. 또한 그 제형도, 수용액계, 가용화계, 유화계, 유액계, 겔계, 페이스트계, 연고계, 에어로졸계, 물-기름 2층계, 물-기름-분말 3층 등, 임의의 제형을 포함한다. 또한 시트상 기제에 담지된 것도 포함한다.

또한 피부 외용제의 채용할 수 있는 제품 형태 및 용도도 임의이고, 예를 들면 화장수, 유액, 크림, 팩 등의 페이셜, 바디 또는 두피용의 외용제로서 사용하는 것이 가능하다.

피부 외용제는, ADAM의 활성을 저해하는 물질의 이외에, 통상 화장품이나 의 약품 등의 피부 외용제에 사용되는 기타의 임의의 성분을 필요에 따라 적당하게 배합하고, 목적으로 하는 제형에 따라 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면 상기 ADAM의 활성을 저해하는 물질과, 하기 성분의 1종 또는 2종 이상을 배합해서 피부 외용제를 조제할 수 있다.

자외선 흡수제로서는, 예를 들면 파라아미노안식향산(이하 PABA로 약기함), PABA 모노글레세린에스테르, N,N-디프로폭시 PABA 에틸에스테르, N,N-디에톡시 PABA 에틸에스테르, N,N-디메틸 PABA 에틸에스테르, N,N-디메틸 PABA 부틸에스테르, N,N-디메틸 PABA 메틸에스테르 등의 안식향산계 자외선 흡수제, 호모멘틸-N-아세틸안트라닐레이트 등의 안트라닐산계 자외선 흡수제, 아밀살리실레이트, 멘틸살리실레이트, 호모멘틸살리실레이트, 옥틸살리실레이트, 페닐살리실레이트, 벤질살리실레이트, p-이소프로판올페닐살리실레이트 등의 살리실산계 자외선 흡수제, 옥틸신나메이트, 에틸-4-이소프로필신나메이트, 메틸-2,5-디이소프로필신나메이트, 에틸-2,4-디이소프로필신나메이트, 메틸-2,4-디이소프로필신나메이트, 프로필-p-메톡시신나메이트, 이소프로필-p-메톡시신나메이트, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 옥틸-p-메톡시신나메이트(2-에틸헥실-p-메톡시신나메이트), 2-에톡시에틸-p-메톡시신나메이트, 시클로헥실-p-메톡시신나메이트, 에틸-α-시아노-β-페닐신나메이트, 2-에틸헥실-α-시아노-β-페닐신나메이트, 글리세릴모노-2-에틸헥사노일-디파라메톡시신나메이트, 트리메톡시계피산 메틸비스(트리메틸실록산)실릴이소펜틸 등의 계피산계 자외선 흡수제, 3-(4'-메틸벤질리덴)-d,1-캄파, 3-벤질리덴-d,1-캄파, 유로카닌산, 유로카닌산 에틸에스테르, 2-페닐-5-메틸벤조크사졸, 2,2'-히드록시-5-메 틸페닐벤조트리아졸, 2-(2'-히드록시-5'-t-옥틸페닐)벤조트리아졸, 2-(2'-히드록시-5'-메틸페닐)벤조트리아졸, 디벤잘라진, 디아니소일메탄, 4-메톡시-4'-t-부틸벤조일메탄, 5-(3,3-디메틸-2-노르보르닐리덴)-3-펜탄-2-온, 디모르폴리노 피리다지논 등을 들 수 있고, 임의의 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다.

자외선 산란제로서는, 산화티탄, 미립자 산화티탄, 산화아연, 미립자 산화아연, 산화철, 미립자 산화철, 산화세륨 등의 분말을 들 수 있다.

이들 자외선 산란제는, 통상, 침상, 방추상, 구상, 입상의 분말이 사용된다. 또한 입자지름이 0.1㎛ 이하의 미립자 분말이 바람직하다.

메틸하이드로젠 폴리실록산이나 실란 커플링제 등의 실리콘 처리; 금속 비누처리; 퍼플루오로알킬인산 디에탄올아민염이나 퍼플루오로알킬실란 등의 불소처리, 덱스트린 지방산 에스테르 처리 등에 의해, 소수화 처리한 자외선 산란제도 바람직하다.

액체 유지로서는, 예를 들면 아보카도유, 동백유, 거북이유, 마카다미아 너트 오일, 옥수수유, 밍크유, 올리브유, 채종유, 난황유, 참깨유, 살구씨유, 소맥배아유, 애기동백유, 피마자유, 아마씨유, 홍화씨유, 면실유, 들께유, 대두유, 낙화생유, 차유(tea seed oil), 비자나무 기름, 쌀겨 기름, 중국 오동나무유, 일본 오동나무유, 호호바유, 배아유, 트리글리세린 등을 들 수 있다.

고체 유지로서는, 예를 들면 카카오 기름, 야자유, 마지, 경화 야자유, 팜유, 우지, 양지, 경화 유지, 팜핵유, 돈지, 우골지, 목랍핵유, 경화유, 우각지(beef leg tallow),목랍, 경화 피마자유 등을 들 수 있다.

납류로서는, 예를 들면 밀랍, 칸데릴라 왁스, 면랍, 카르나우바 왁스, 베이베리 왁스, 백랍, 고래납, 몬탄 왁스, 쌀겨왁스, 라놀린, 케이폭 왁스, 초산 라놀린, 액상 라놀린, 사탕수수 왁스, 라놀린 지방산 이소프로필, 라우린산 헥실, 환원 라놀린, 호호바 왁스, 경질 라놀린, 셀락왁스, POE 라놀린알코올에테르, POE 라놀린알코올아세테이트, POE 콜레스테롤에테르, 라놀린 지방산 폴리에틸렌글리콜, POE 수소첨가 라놀린알코올에테르 등을 들 수 있다.

탄화수소유로서는, 예를 들면 유동파라핀, 지랍, 스쿠알란, 프리스테인, ㅍ파라핀, 세레신, 스쿠알렌, 바셀린, 마이크로크리스탈린 왁스, 폴리에틸렌 왁스, 피셔-트롭스크 왁스(Fischer-Tropsch wax) 등을 들 수 있다.

고급 지방산으로서는, 예를 들면 라우린산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 베헤닌산, 올레인산, 운데실렌산, 톨루산, 리놀산, 리놀레인산, 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 등을 들 수 있다.

고급 알코올로서는, 예를 들면 직쇄 알코올(예를 들면 라우릴 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 베헤닐 알코올, 미리스틸 알코올, 올레일 알코올, 세토스테아릴 알코올 등); 분기쇄 알코올(예를 들면 모노스테아릴글리세릴에테르(바틸 알코올), 2-데실테트라데시놀, 라놀린 알코올, 콜레스테롤, 피토스테롤, 헥실도데카놀, 옥틸도데카놀 등) 등을 들 수 있다.

합성 에스테르유로서는, 미리스틴산 이소프로필, 옥탄산 세틸, 미리스틴산 옥틸도데실, 팔미틴산 이소프로필, 스테아린산 부틸, 라우린산 헥실, 미리스틴산 미리스틸, 올레인산 데실, 디메틸옥탄산 헥실데실, 유산 세틸, 유산 미리스틸, 초 산 라놀린, 스테아린산 이소세틸, 이소스테아린산 이소세틸, 12-히드록시스테아린산 콜레스테릴, 디-2-에틸헥산 에틸렌글리콜, 디펜타에리스리톨 지방산 에스테르, 모노이소스테아린산 N-알킬글리콜, 디카프린산 네오펜틸글리콜, 말산 디이소스테아릴, 디-2-헵틸운데칸산 글리세린, 트리-2-에틸헥산 트리메티롤프로판, 트리이소스테아린산 트리메티롤프로판, 테트라-2-에틸헥산 펜타에리스리톨, 트리-2-에틸헥산 글리세린, 트리옥탄산 글리세린, 트리이소팔미틴산 글리세린, 트리이소스테아린산 트리메티롤프로판, 세틸-2-에틸헥사노에이트, 2-에틸헥실팔미테이트, 트리미리스틴산 글리세린, 트리-2-헵틸운데칸산 글리세리드, 피마자유 지방산 메틸에스테르, 올레인산 올레일, 아세토글리세라이드, 팔미틴산 2-헵틸운데실, 아디핀산 디이소부틸, N-라우로일-L-글루타민산-2-옥틸도데실에스테르, 아디핀산 디-2-헵틸운데실, 에틸라울레이트, 세바신산 디-2-에틸헥실, 미리스틴산 2-헥실데실, 팔미틴산 2-헥실데실, 아디핀산 2-헥실데실, 숙신산 2-에틸헥실, 구연산 트리에틸, 폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌 랜덤 중합체 메틸에테르 등을 들 수 있다.

실리콘유로서는, 예를 들면 쇄상 폴리실록산(예를 들면 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 디페닐폴리실록산 등); 환상 폴리실록산(예를 들면 옥타메틸시클로테트라실록산, 데카메틸시클로펜타실록산, 도데카메틸시클로헥사실록산 등), 3차원 그물코 구조를 형성하고 있는 실리콘 수지, 실리콘 고무, 각종 변성 폴리실록산(아미노 변성 폴리실록산, 폴리에테르 변성 폴리실록산, 알킬 변성 폴리실록산, 불소 변성 폴리실록산 등) 등을 들 수 있다.

그 밖에는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 에리 스리톨, 소르비톨, 크실리톨, 말티톨 등의 보습제; 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 모과씨, 카라기난, 펙틴, 만난, 커드란, 콘드로이틴 황산, 전분, 갈락탄, 데르마탄황산, 글리코겐, 아라비아 고무, 헤파란 황산, 히알루론산, 히알루론산 나트륨, 트래거캔스 고무, 케라탄 황산, 콘드로이틴, 크산탄 고무, 무코이틴 황산, 히드록시에틸 구아고무, 카르복시메틸 구아고무, 구아고무, 덱스트란, 케라토황산, 로커스트빈 고무, 석시노글루칸, 카로닌산, 키틴, 키토산, 카르복시메틸 키틴, 한천 등의 증점제, 에탄올 등의 저급 알코올; 부틸히드록시톨루엔, 토코페놀, 피틴 등의 산화방지제; 안식향산, 살리실산, 소르빈산, 파라옥시안식향산 알킬에스테르, 헥사클로로펜 등의 항균제; 아실사르코신산(예를 들면 라우로일 사르코신 나트륨), 글루타티온, 구연산, 말산, 주석산, 락산 등의 유기산; 비타민A 및 그 유도체, 비타민B6 염산염, 비타민B6 트리팔미테이트, 비타민B6 디옥타노에이트, 비타민B2 및 그 유도체, 비타민B12, 비타민B15 및 그 유도체 등의 비타민B류, 아스코르빈산, 아스코르빈산 황산 에스테르(염), 아스코르빈산 인산 에스테르(염), 아스코르빈산 디팔미테이트 등의 비타민C류, α-토코페롤, β-토코페놀, δ-토코페놀, 비타민E 아세테이트 등의 비타민E류, 비타민D류, 비타민H, 판토텐산, 판테틴 등의 비타민류; 니코틴산 아미드, 니코틴산 벤질, γ-오리자놀, 알란토인, 글리실리틴산(염), 글리실레틴산 및 그 유도체, 히노키티올, 비사보롤, 유칼립톨, 티몰, 이노시톨, 사이코사포닌, 당근 사포닌, 수세미 사포닌, 무크로디사포닌 등의 사포닌류, 판토테닐에틸에테르, 에티닐에스트라디올, 트라넥삼산, 알부틴, 세파란 틴, 태반 추출물 등의 각종 약제, 참소리쟁이, 고삼, 개연꽃, 오렌지, 세이지, 톱풀, 당아욱, 스워티 허브(swertie herb), 타임, 당귀, 페티그레인, 버치, 쇠뜨기, 수세미, 가시칠엽수, 범의귀, 아르니카, 백합, 쑥, 작약, 알로에, 치자나무, 화백나무, 서양 산사나무 추출액, 서양 고추나물 추출물, 아이리스인 추출물, 감비르 추출물, 은행나무 잎 추출물, 백리향 추출물, 회향 추출물, 우롱차 추출물, 수련 추출물, 로즈후르츠 추출물, 방아풀 추출물, 황금 추출물, 황백 추출물, 광대수염 추출물, 감초 추출물, 치자나무 추출물, 홍차 추출물, 서하류 추출물, 토멘틸라 추출물, 장미 추출물, 수세미 추출물, 페퍼민트 추출물, 로즈메리 추출물, 로열젤리 추출물 등의 식물의 추출물, 색소, 모노라우린산 소르비탄, 모노팔미틴산 소르비탄, 세스퀴올레인산 소르비탄, 트리올레인산 소르비탄, 모노라우린산 폴리옥시에틸렌소르비탄, 모노스테아린산 폴리옥세틸렌소르비탄, 폴리에틸렌글리콜모노올레이트, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리글리콜디에테르, 라우로일디에탄올아미드, 지방산 이소프로판올아마이드, 말티톨히드록시 지방산 에테르, 알킬화 다당, 알킬글루코시드, 슈거에스테르 등의 비이온성 활성제, 스테아릴트리메틸암모늄클로라이드, 염화벤잘코늄, 라우릴아민옥사이드 등의 양이온성 계면활성제, 팔미틴산나트륨, 라우린산나트륨, 라우릴산나트륨, 라우릴황산칼륨, 알킬황산트리에탄올아민에테르, 로트유, 리니어도데실벤젠황산, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 말레인산, 아실메틸타우린 등의 음이온성 계면활성제, 양성 계면활성제, 중화제, δ-토코페놀, 부틸히드록시톨루엔 등의 산화방지제, 페녹시에탄올, 파라벤 등의 방부제를 들 수 있다.

본 방법에 있어서, 상기의 ADAM을 저해하는 물질은, 피부에의 적용이 가능하고 또한 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 형태로 피부에 적용할 수 있고, 또 단독으로 적용해도, 또는 다른 임의의 성분과 함께 배합해서 적용해도 좋다. 또 적용하는 피부의 장소도 한정되지 않고, 두피를 포함하는 체표면의 모든 피부를 포함한다. 한정은 되지 않지만, 본 발명의 방법은, 바람직하게는 미용방법으로서 사용된다.

본 발명의 항주름 효과의 평가방법은, 인간 또는 동물의 피부, 피부조직 또는 세포에 피검물질을 접촉시키는 공정을 포함한다.

본 방법에서 사용할 수 있는 인간 또는 동물의 피부는, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 피부에 테이프 스트립핑을 실시해서 피부의 각질층을 박리한 헤어리스 마우스의 피부를 사용할 수 있다. 헤어리스 마우스의 피부에 테이프 스트립핑을 실시함으로써 피부의 각질층을 박리해서 피부의 배리어를 계속적으로 파괴하면, 잔주름이 마우스의 피부에 생기고, 또한 ADAM-9, ADAM-10 및 ADAM-17 등의 ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현이 항진된다. ADAM의 활성의 항진에 의해, HB-EGF 등의 증식인자의 유리·활성화가 촉진되어서 표피 및 진피의 비후가 생기는 것이, 잔주름 형성의 하나의 원인이다라고 생각된다. 따라서, 본 발명의 평가방법에 있어서, 예를 들면 그러한 계속 배리어 파괴에 의해 항진된 ADAM의 유전자 발현을 저하시키는 물질을 특정함으로써, 항주름 물질을 효율적으로 특정할 수 있다고 생각된다.

본 방법에 있어서 사용하는 피부세포는, 피부의 표피부분을 형성하는 상피계 세포이며, 표피각화 세포 등의 표피세포, 피지선 세포, 유선 세포, 소장 상피세포, 그 밖의 점막 상피세포 등을 예시할 수 있다. 이들 중에서도, 표피세포의 하나인 표피각화 세포(케라티노사이트)는, 배양세포의 입수가 용이하며, 또한, 본 검출방법이 표피의 상태에 관련되는 발명이므로, 표피각화 세포가 본 방법에 있어서 바람직한 피부세포이다. 또한 피부세포의 제공원은 인간인 것이 바람직하다. 또한, 본 방법에 있어서 사용되는 피부세포는, 배양된 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 이 배양된 피부세포는 통상의 방법에 의해 조제할 수 있다.

예를 들면 피부세포가 인간 표피각화 세포일 경우에는, 성형 외과, 피부과, 외과수술 등에서의 잉여 피부편으로부터 지방조직이나 혈액을 제거하고, 또한 진피부분을 프로테아제 처리 등에 의해 분리해서 얻은 인간 표피를 조제하고, 이 인간 표피로부터 표피각화 세포를 분리하여, KGM 배지 등을 사용하는 통상의 방법에 의해 초대배양을 행할 수 있다. 다음에 통상의 방법에 의해, 인간 표피각화 세포의 초대배양 세포를, 프로테아제 등을 이용하여 계대배양을 행하고, 원하는 배양 인간 표피각화 세포를 얻을 수 있다. 또, 이러한 표피각화 세포는 시판되고 있어, 본 발명에 있어서는 이러한 시판품을 사용하는 것도 가능하다.

ADAM의 효소 활성의 검출은, 예를 들면 HB-EGF 등의 ADAM의 기질이 유리되는 양을 측정함으로써 행할 수 있다.

또 유전자 발현 레벨의 검출은, 예를 들면 RT-PCR이나 노던블롯법 등을 이용하여 cDNA를 증폭 및/또는 측정해도 좋고, 혹은 ELISA나 웨스턴블롯법 등을 이용하여 단백질을 검출 및/또는 측정해도 좋다.

ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨을 지표로 하여 피검물질의 항주름 효과를 평가하는 공정은, 예를 들면 피검물질을 첨가하지 않거나 혹은 ADAM의 활성에 영향을 주지 않는 것을 알고 있는 물질을 첨가한 피부, 조직, 세포 등을 대조로서 사용하고, 피검물질을 첨가했을 때의 ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨을, 대조에 있어서의 ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨과 비교하는 것을 포함하고 있어도 좋다. 예를 들면 대조에 있어서의 ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨과 비교하여, ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨을 저하시키는 피검물질을, 항주름 효과를 갖는 물질(항주름 물질, 혹은 주름 방지 또는 개선제)로서 특정할 수 있다.

본 발명의 항주름 효과의 평가방법의 사용 형태는 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면 항주름 물질의 스크리닝이나 평가 등에 있어서 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

잔주름 마우스 모델의 제작

피지의 감소나 세안 등의 여러가지 요인에 의해 피부의 배리어가 약화되거나 또는 파괴되어서, 피부 표면으로부터의 수분증산이 증가함으로써 피부가 건조해서 잔주름이 형성된다고 생각된다. 그래서, 헤어리스 마우스에 있어서, 피부에 테이프 스트립핑을 반복하여 실시함으로써, 각질층을 벗겨서 피부의 배리어를 파괴하고, 잔주름 마우스 모델을 제작했다. 간단하게 설명하면, 헤어리스 마우스(HR-1, 수컷 6주령, 호시노 실험동물)의 등부 좌측의 피부에, 경피 수분증산량(TEWL)(수분증산량 측정장치 MEECO; Meeco사, USA를 이용하여 측정)이 4∼6㎎/㎠/h가 되도록 회수를 조정하면서 셀로판 테이프를 이용하여 테이프 스트립핑을 실시했다. 통상 첫회는 4회 정도로, 최종적으로는 7∼8회 테이프 스트립핑을 반복했다. 주 3회, 4주간 계속해서 테이프 스트립핑을 행하였다. 등부 우측은 미처치인 채로 했다.

도 2에, 상기한 바와 같이 테이프 스트립핑을 실시한 피부의 레플리커 화상(도 2(A)), 및 피부조직 절편을 HE(헤마톡실린-에오신) 염색한 것의 현미경 사진(도 2(B))을 나타낸다. 레플리커 화상(도 2(A))에 있어서, 테이프 스트립핑 개시 24시간 후(24h) 및 48시간 후(48h)에 피부 골이 깊어진 후, 1주간 후(1W)에는 피부 골의 방향이 일정해지고, 4주간 후(4W)에는 주름과 같은 외관을 나타냈다. 또한 피부조직의 현미경 사진(도 2(B))에 있어서, 미처치(NT)의 것과 비교하여, 24시간 후부터 표피가 비후하기 시작하고, 2주간 후(2W)에 있어서도 표피 비후가 유지되었다. 이하의 표 1에, 상기한 바와 같이 제작한 잔주름 마우스 모델에 있어서의 형태학적, 조직학적 변화 등을, UV조사(10주간)에 의해 제작한 광노화 마우스 모델에 있어서의 그들 변화와 비교해서 정리했다.

상기의 방법으로 테이프 스트립핑을 실시한 마우스의 피부는, 인간의 피부에 있어서의 잔주름과 같은 변화를 나타냈다. 한편으로, 그 주름의 외관이나 표피 비후 등에 있어서, 분명하게 UV조사에 의해 제작한 광노화 마우스 모델과는 다르고, 상기의 방법에 의해, 광노화에 의한 굵은 주름 모델과는 완전히 다른, 잔주름 모델을 제작할 수 있었던 것이 시사되었다.

잔주름 마우스 모델에 있어서의 생화학적 변화의 검토

상기한 바와 같이 제작한 잔주름 마우스 모델에 있어서, 표피 및 진피의 비후가 생기고 있어, 테이프 스트립핑에 의한 배리어 파괴의 자극에 의해, 표피 및 진피에 있어서 세포 증식인자가 활성화되어 있는 것이 예측되었다. 그래서, 표피에 존재하는 세포 증식인자인 HB-EGF, 암피레귤린, 및 그들 증식인자를 세포막으로부터 유리·활성화시키는 효소인 ADAM-9 및 ADAM-17의 유전자 발현에 대해서 검토했다.

유전자 발현량의 측정은, RT-PCR법을 사용해 행하였다. 상기와 같이 제작한 잔주름 마우스 모델의 좌측(테이프 스트립핑 처치:T)과 우측(미처치:N)으로부터 경시적으로 채취한 등부 피부시료로부터 모든 RNA를 추출하고, cDNA를 조제한 후, 시험 대상의 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 행하였다. 또 마찬가지로, 세포당의 발현량이 일정한 하우스키핑 유전자의 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나제(GAPDH;glyceraldehydes-3-phosphate-dehydrogenase)에 대해서도 기준으로서 측정했다.

결과를 도 3에 나타낸다. ADAM-9 및 ADAM-17은, 각각 테이프 스트립핑을 실시한 피부의 24시간 후, 48시간 후에 있어서 그 유전자 발현이 항진되어 있고, 또 그들 ADAM에 의해 유리·활성화되는 HB-EGF 및 같은 HB-EGF 패밀리에 속하는 암피레귤린도 24시간 후부터 1주간 후에 걸쳐서 그 유전자 발현이 항진되어 있었다.

잔주름 마우스 모델에 있어서의 각종 약제 도포에 의한 항주름 효과의 검토

다음에 이하의 표 2에 나타내는 각종 약제를 도포하는 것에 의한, 잔주름 마우스 모델에 있어서의 항주름 효과에 대해서 검토했다.

상기의 방법에서 헤어리스 마우스에 테이프 스트립핑을 실시하고, 각 테이프 스트립핑 처치의 뒤에 표2 의 각 약제를 100μl씩 도포했다. 도 4에, 각 약제를 도포한 피부의 1주간 후, 2주간 후 및 4주간 후의 레플리커 화상(도 4(A)), 및 4주간 후의 피부조직 절편을 HE(헤마톡실린-에오신) 염색한 것의 현미경 사진(도 4(B))을 나타낸다. 또한 그 결과를, 이하의 평가기준을 이용하여 정리한 것을 표 3에 나타낸다.

○ : 개선

△ : 변화없음

× : 악화

ADAM 활성 저해물질인 TAPI-1은, 잔주름 마우스 모델에 있어서 주름 형성을 억제하고, 또 표피 및 진피의 비후도 현저하게 억제했다. 한편, 광노화 마우스 모델에서 주름 형성 방지 효과를 나타낸 MMP 저해제인 CGS27023A(N-히드록시-2-[[(4-메톡시페닐)술포닐]3-피코릴]아미노]-3-메틸부탄아미드 염산염](J. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p.2525-2532), 및 보습제인 글리세린은, 잔주름 마우스 모델에서는 전혀 주름 형성을 억제할 수 없고, 또 표피 및 진피의 비후도 억제할 수 없었다. 또한, 피부 거침 촉진 작용을 갖는 불포화 지방산의 올레인산는, 주름 형성을 촉진시키고, 또 표피 및 진피의 비후도 항진시켰다.

이들의 결과로부터, 보습제만으로는 잔주름을 충분하게 방지 또는 개선할 수 없고, 피부에 있어서 ADAM의 활성을 저해해서 증식인자의 유리·활성화를 저해함으로써, 표피나 진피의 비후를 억제해서 잔주름을 효과적으로 방지 또는 개선할 수 있는 것이 시사되었다. 또한 광노화 마우스 모델에서 주름 형성 억제 효과를 나타낸 MMP 저해제의 CGS27023A가, 잔주름 마우스 모델에서는 주름 형성을 억제할 수 없었던 것으로부터, 본 발명에 있어서의 ADAM을 저해하는 물질에 의한 주름 형성의 억제가, MMP 저해제와는 다른 기구에 의한 작용인 것이 시사되었다.

신규한 ADAM 활성 저해물질의 탐색 및 항주름 효과의 평가

다음에 ADAM 활성을 저해하는 신규한 화합물을 탐색하고, 잔주름 마우스 모델에 있어서 그 항주름 효과를 평가했다. 화합물의 배합량은 특별히 기재하지 않는 한 질량%이다.

(1)ADAM 활성 저해물질의 스크리닝

우선, HB-EGF-AP/HT-1080(인간 HB-EGF의 N말단에 내열성 알카린포스파타제(AP)를 부가한 융합 단백질을 강제적으로 발현되도록 개변한 인간 섬유육종 유래 배양세포 HT-D80)을 이용하여 ADAM 효소 저해 활성을 갖는 화합물의 스크리닝을 행하였다. 사용한 세포주 HB-EGF-AP/HT-1080의 세포 표면 상에는 알카린포스파타제와 융합된 형태로 HB-EGF 전체길이 분자가 발현되어 있다. 이 세포를 포르볼에스테르(phorbol ester)로 자극하면, 세포막 표면 상의 ADAM 효소가 활성화되어서 HB-EGF 분자를 절단한다. 절단되어서 유리형으로 된 HB-EGF에는 알카린포스파타제가 결합되어 있기 때문에, 배양 상청 중의 알카린포스파타제 활성을 측정함으로써 화합물의 ADAM 효소 저해활성을 간접적으로 측정할 수 있다.

구체적으로는, 2.0×10⁵cells/ml이 되도록 세포수를 조정한 HB-EGF-AP/HT-1080을 96웰 배양용 마이크로 플레이트에 0.2ml/well씩 파종하고, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 배지를 제거해 PBS(-)로 세정한 후, 피검물질을 포함하는 배지를 0.1ml/well씩 첨가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트해서 전처치했다. 그 후에 배양 상청을 제거하고, 다시 피검물질과 60nM TPA(포르볼에스테르:12-o-Tetradecanoylphorbol-acetate; Sigma P8139)를 포함하는 배지를 0.2ml/well씩 첨가하고, 또한 60분간 인큐베이트해서 처치했다. 처치 종료 후의 각 웰의 배양 상청 0.1ml를 알카린포스파타제 활성 측정용 마이크로 플레이트의 웰에 옮기고, 65℃에서 10분간 인큐베이트하여, 내재성의 알카린포스파타제를 실활시켰다. 1mg/ml의 AP 기질(p-nitrophenylphosphate, Wako; 141-02341)을 0.1ml/well씩 각 웰에 첨가하고, 즉시 각 웰의 405nm에서의 흡광도를 측정했다. 차광해서 실온에서 2시간 인큐베이트한 뒤, 다시 각 웰의 405nm에서의 흡광도를 측정했다. 2시간 인큐베이트 후의 흡광도로부터 AP 기질첨가 직후의 흡광도를 뺀 것을 각 웰의 흡광도로 했다. 0% 저해 대조(TPA만을 포함하는 배지)의 흡광도를 A0, 100% 저해 대조(배지만)의 흡광도를 A100, 시료의 흡광도를 AS로 하고, 이하의 식에 의해 저해율(%)을 산출하였다:

저해율(%)=(A0-AS)/(A0-A100)*100

그 결과, 4-메톡시벤조히드록삼산(4-Methoxybenzohydroxamic acid)에 높은 HB-EGF 유리 억제 효과가 확인되어, ADAM 활성을 저해하는 것이 시사되었다. 4-메톡시벤조히드록삼산의 구조식을 이하에 나타낸다. 또 그 유리 저해율을 표 4에 나타낸다.

(2)ADAM 활성 저해물질의 항주름 효과의 평가

다음에 잔주름 마우스 모델을 이용하여, ADAM 활성 저해물질인 TAPI-1 및 4-메톡시벤조히드록삼산의 항주름 효과에 대해서 검토했다.

헤어리스 마우스(HR-1, 수컷 6주령, 호시노 실험동물)의 좌측 등부 경피 수분증산량(TEWL)(수분증산량 측정장치 MEECO;Meeco사, USA를 이용하여 측정)이 4-8㎎/㎠/h가 되도록 테이프 스트립핑을 주 3회, 4주간 계속해서 행하고, 테이프 스트립핑 처치 직후에 매회, TAPI-1 또는 4-메톡시벤조히드록삼산을 각각 마우스 좌측 등부에 100μl씩 도포했다. 4-메톡시벤조히드록삼산은, 1%로 되도록 50% 에탄올 수용액에 용해시킨 것을 사용했다. 또 TAPI-1(펩티드 연구소)은 1mM의 농도에서 평가했다. 또한, 음성 대상으로서 50% 에탄올 수용액(Vehicle)을 마찬가지로 도포했다.

4주간 후의 주름의 발생 상황을 시감 판정에 의해 스코어화했다. 주름의 발생 상황의 평가기준은 「주름 없슴;0」, 「얕은 주름;1」, 「명확한 주름;2」, 「깊은 주름;3」으로 하고, 0.5 간격으로 점수화했다. 평점이 클수록 주름이 깊은 것을 나타낸다. 각 군의 평균치 및 표준편차를 산출하고, 결과를 도 5에 나타낸다.

Vehicle의 스코어가 평균치에서 1.17인 것에 대해서, TAPI-1은 0.43, 4-메톡시벤조히드록삼산은 0.91이며, 그들 ADAM 활성 저해물질은 어느 것이나 Vehicle과 비교해서 유의한 주름 억제 효과를 나타냈다.

다음에 마우스 등부의 레플리커를 주름 해석장치(하마노 엔지니어링)를 이용하여 해석하고, 주름 면적(%)을 산출했다. 주름 면적의 퍼센티지가 낮을수록 주름 형성이 억제되어 있는 것을 나타낸다. 결과를 도 6에 나타낸다.

도 6으로부터 명확한 바와 같이, TAPI-1 및 4-메톡시벤조히드록삼산의 주름 면적(%)의 평균치는 Vehicle보다 유의하게 낮고, 그들 ADAM 활성 저해물질은 높은 주름 억제 효과를 나타냈다.

이들의 결과로부터, ADAM 활성 저해물질인 TAPI-1 및 4-메톡시벤조히드록삼산은, ADAM 효소를 저해함으로써 표피 증식인자인 HB-EGF의 유리를 억제하고, 주름을 방지 또는 개선할 수 있는 것이 시사되었다.

Claims (10)

1. 피부에 존재하는 ADAM(a disintegrin and metalloprotease)의 활성을 저해하는 물질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 주름 방지 또는 개선제.
2. 제1항에 있어서, 상기 ADAM이 ADAM-9, ADAM-10 또는 ADAM-17인 것을 특징으로 하는 주름 방지 또는 개선제.
3. 피부에 존재하는 ADAM의 활성을 저해하는 물질을 피부에 적용하는 것을 포함하는, 주름을 방지 또는 개선하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 ADAM이 ADAM-9, ADAM-10 또는 ADAM-17인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 주름의 방지 또는 개선에 있어서의 ADAM의 활성을 저해하는 물질의 사용.
6. 주름을 방지 또는 개선하기 위한 조성물의 제조에 있어서의 ADAM의 활성을 저해하는 물질의 사용.
7. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 화장료인 것을 특징으로 하는 사용.
8. 인간 또는 동물의 피부, 피부조직 또는 세포에 피검물질을 접촉시켜, 상기 피부, 조직 또는 세포에 있어서의 ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨을 검출하고, ADAM의 효소 활성 또는 유전자 발현 레벨을 지표로 하여 피검물질의 항주름 효과를 평가하는 것을 포함하는, 항주름 효과의 평가방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 ADAM이 ADAM-9, ADAM-10 또는 ADAM-17인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 표피각화 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.

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