WO2006041214A1 - Adam活性阻害物質によるしわの防止または改善 - Google Patents

Adam活性阻害物質によるしわの防止または改善 Download PDF

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WO2006041214A1
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adam
skin
wrinkle
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acid
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PCT/JP2005/019266
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Yukiko Matsunaga
Satoshi Amano
Yuki Ogura
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Shiseido Company, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to prevention or improvement of wrinkles using an ADAM activity inhibitor, and a method for evaluating an anti-wrinkle effect using ADAM activity inhibition as an index.
  • wrinkles increase as a phenomenon of skin aging over the years, wrinkle prevention and improvement in wrinkle prevention and improvement are particularly high from the viewpoint of beauty.
  • Wrinkles are broadly classified into large wrinkles, fine wrinkles, and chirimen wrinkles, depending on their location and mechanism.
  • Daijiku is a deep wrinkle that occurs mainly on the forehead and back of the neck due to photoaging, and fine wrinkles are relatively shallow wrinkles that occur in the corners of the eyes and mouth.
  • Chirimenwa is a non-exposed area such as the abdomen of the elderly. Wrinkled wrinkles.
  • wrinkle research has been conducted mainly on large wrinkles caused by photoaging and has been treated as one of the symptoms of photoaging.
  • photoaging research on developmental mechanisms, etc. is progressing, and animal models and human evaluation systems have been established.
  • Attempts to suppress wrinkle formation due to photoaging are mostly by preventing or reducing the adverse effects of UV rays on the skin.
  • titanium oxide, oxidation Cosmetics (sunscreen, sunprotect cosmetics) containing various UV absorbing, scattering, and shielding materials such as zinc, paramethoxycinnamate and paraaminobenzoate have been developed and used.
  • the present invention elucidates biochemical changes involved in fine wrinkle formation in the skin, identifies a substance capable of suppressing the change, and uses the substance for more effective effects.
  • the purpose is to prevent or improve wrinkles.
  • an object of the present invention is to provide a method that can more efficiently and easily evaluate the anti-wrinkle effect of a test substance using the suppression of the biochemical change as an index.
  • the present inventor has found that the continuous paralysis of the skin caused by repeated tape stripping on hairless mice causes epidermis and dermis changes similar to fine lines in human skin to occur in the mouse skin. Succeeded in creating a fine mouse model.
  • the present invention relates to a dish integrin and a metaprotease domain such as ADAM-9, ADAM-10 and ADAM-17.
  • ADAM a disintegrin and metalloprotease family
  • HB-EGF heparin-binding EGF-like growth that is released from the cell membrane and activated by these ADAMs
  • HB-EGF Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor
  • Amphiregul in gene expression in the epidermis
  • ADAMs such as ADAM_9, ADAM-10 and ADAM-17 are present on the skin cell surface, and in the skin, enzymes that release and activate growth factors such as HB-EGF and Amphiregul in N TNF-a TGF- ⁇ from the cell membrane. It is. Due to the barrier breakdown of the skin, these ADAMs are activated or increased in the skin, promoting the release of growth factors such as HB-EGF, and causing thickening of the epidermis and dermis, This is considered to be one important mechanism of fine wrinkle formation.
  • Figure 1 shows a schematic diagram illustrating the mechanism for preventing or improving wrinkles by inhibiting the activity of AMM in the skin.
  • the present invention relates to a wrinkle prevention or improvement agent comprising a substance that inhibits the activity of ADAM present in the skin.
  • the present invention relates to a method for preventing or improving wrinkles, comprising applying to the skin a substance that inhibits the activity of ADAM present in the skin.
  • the present invention relates to the use of a substance that inhibits the activity of ADAM in preventing or improving wrinkles.
  • the present invention relates to the use of a substance that inhibits the activity of ADAM in the manufacture of a composition for preventing or improving wrinkles.
  • the composition is preferably, but not limited to, an external preparation for skin such as cosmetics, pharmaceuticals, quasi drugs, and more preferably cosmetics.
  • ADAM present in a skin
  • ADAM- 9 ADAM- 10, ADAM- 1 2, ADAM- 15, ADAM- 17
  • ADAM-9, ADAM-10 and ADAM-17 are known to be deeply involved in the release and activation of cell growth factors.
  • inhibiting ADAM activity means not only inhibiting ADAM enzyme activity, but also any action that reduces ADAM activity in the skin, such as inhibiting gene expression or protein production. including.
  • the present invention relates to a method for evaluating an anti-wrinkle effect, comprising contacting a test substance with human or animal skin, skin tissue or cells, and the enzyme activity or gene of ADAM in said skin, tissue or cells This includes detecting the expression level and evaluating the anti-wrinkle effect of the test substance using ADAM enzyme activity or gene expression level as an index.
  • ADAM examples include ADAM-9, ADAM-10, and ADAM-17.
  • the anti-wrinkle effect of a large number of test substances can be evaluated quickly and efficiently.
  • anti-wrinkle effect means any effect that prevents the formation of wrinkles or improves the formed wrinkles.
  • ADAM-9, ADAM-10, ADAM-17, and other ADAM activities present in the skin are inhibited, resulting in various factors such as sebum reduction and facial cleansing.
  • the release of growth factors such as HB-EGF in the epidermis and dermis induced by the skin barrier rupture caused by the skin can suppress the thickening of the epidermis and dermis, which is very effective In particular, it is possible to prevent or improve fine lines.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a mechanism for preventing or improving wrinkles by inhibiting ADAM activity in the epidermis.
  • FIG. 2 shows a replica image of the mouse skin subjected to tape stripping (Fig. 2A) and a micrograph (Fig. 2B) of the skin tissue section stained with HE (hematoxylin eosin).
  • FIG. 3 shows changes in gene expression of ADAM_9, ADAM-17, HB-EGF, and Amphiregul in in the fine wrinkle mouse model.
  • Figure 4 shows a replica image of the skin to which each drug was applied (Figure 4A :) and a micrograph of a skin tissue section stained with HE (hematoxylin-eosin) in a fine wrinkle mouse model ( Figure 4). B).
  • FIG. 5 is a graph showing the anti-wrinkle effect of an ADAM activity inhibitor in visual judgment.
  • FIG. 6 is a graph showing the anti-wrinkle effect of an ADAM activity inhibitor in wrinkle area (%). -
  • ADAM is a multifunctional protein with two properties: adhesion and extracellular proteolysis, and there are more than 30 families, but the number is still increasing. ADAM is expressed in various animal tissues, and examples of ADAM present in the skin include ADAM-9, ADAM-10, ADAM_12, ADAM_15, ADAM-17 and ADAM-19. In particular, ADAM_9, ADAM-10 and ADAM-17 have been found to be deeply involved in the activation of cell growth factor release.
  • Substances that inhibit ADAM activity that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they reduce ADAM activity in the skin.
  • Examples of such substances that inhibit ADAM activity include, but are not limited to, TAPI-1, ⁇ (R)-(2- (Hydroxyaminocarbonyl) methyl)-4- Methylpentanoyl- L- Nal- L- Alanine 2_ Aminoethyl amide Immunex s Seattle ⁇ WA), and 4-Methoxybenzohydroxamic acid isotonic column.
  • the wrinkle prevention or improvement agent comprising a substance that inhibits the activity of ADAM of the present invention is preferably used in an external preparation for skin.
  • the above-mentioned substances that inhibit ADAM activity may be used alone or in combination of two or more.
  • the compounding amount of these substances in the external preparation for skin varies depending on the use mode, product form, etc., and is not particularly limited.
  • the total amount of the external preparation for skin is preferably 0.001 to 10% by mass, more preferably 0.005 to 5% by mass, and still more preferably 0.01 to 1% by mass. is there. ---
  • “external preparation for skin” includes cosmetics, pharmaceuticals, quasi drugs and the like.
  • the dosage form is also an aqueous system, solubilization system, emulsification system, oil liquid system, gel system, paste system, ointment system, aerosol system, water-oil-oil 2-layer system, water-oil-oil-powder 3-layer, etc. Including the dosage form. Also included are those supported on a sheet-like base.
  • the form and application of the external preparation for skin can be arbitrarily selected.
  • it can be used as an external preparation for facial, body, or scalp such as lotion, milky lotion, cream or pack.
  • external preparations for skin include other optional ingredients that are usually used in external preparations for skin, such as cosmetics and pharmaceuticals, as needed, depending on the intended dosage form.
  • Cosmetics and pharmaceuticals can be produced by conventional methods.
  • a skin external preparation can be prepared by blending the above-mentioned substance that inhibits ADAM activity and one or more of the following ingredients.
  • UV absorber examples include paraaminobenzoic acid (hereinafter abbreviated as PABA), PABA monoglycerin ester,, N-dipropoxy PABA ethyl ester, N, N-jetoxy PABA ethyl ester, N, N-dimethyl PABA ethyl ester, N, N Benzoic acid UV absorbers such as -dimethyl PABA butyl ester, N, N-dimethyl PABA methyl ester, anthranilic acid UV absorbers such as homomenthyl-N-acetyl anthranilate, amyl salicylate, menthyl salicylate, homomenthyl salicylate , Salicylic acid UV absorbers such as octyl salicylate, phenyl salicylate, benzyl salicylate, p-isopropanol phenol salicylate, octylcinnamate, ethyl-4-isopropylc
  • Cinnamic acid UV absorber 3- (4'-methylbenzylidene) -d, 1_camphor, 3-benzylidene-d, 1-camphor, urocanic acid, urocanic acid ethyl ester, 2-pheninole-5- Metinolevenoxaxazonole, 2, 2'-Hydroxy-5-Metinolefeninorevenzo Triazolole, 2- (2, -Hydroxy-5, -1-octylphenol) benzotriazole, 2- (2,- Hydroxy-5, _methylphenylbenzotriazole, dibenzalazine, dianisulmethane, 4-methoxy-4'-1 -ptyldibenzoy Methane, 5- (3,3-dimethyl-2-norbornylidene) -3-pentane-2_one, dimorpholinopyridazinone, etc., and any one or more may be used. it can.
  • ultraviolet scattering agent examples include powders of titanium oxide, fine particle titanium oxide, zinc oxide, fine particle zinc oxide, iron oxide, fine particle iron oxide, cerium oxide and the like.
  • ultraviolet scattering agents needle-like, spindle-like, spherical and granular powders are usually used. Further, a fine particle powder having a particle size of not more than 0.3 ⁇ m is preferable.
  • Silicone treatment such as methylhydrene polysiloxane is a silane coupling agent; metal exploration treatment; perfluoroalkyl phosphate diethanolamine salt; fluorine treatment such as monofluoroalkylsilane; dextrin fatty acid ester treatment, etc.
  • a hydrophobized ultraviolet fountain scattering agent is also preferred.
  • liquid fats examples include apogado oil, camellia oil, turtle oil, macadamia nut oil, corn oil, mink oil, oil oil, rapeseed oil, egg yolk oil, sesame oil, persic oil, wheat bud oil, southern power oil, castor oil , Linseed oil, safflower oil, cottonseed oil, eno oil, soybean oil, peanut oil, teaseed oil, oyster oil, rice bran oil, cinnagiri oil, Japanese kiri oil, jojoba oil, germ oil, triglycerin, etc. .
  • solid fats examples include cacao butter, palm oil, horse fat, hardened palm oil, palm oil, beef tallow, sheep fat, hardened beef tallow, palm kernel oil, pork fat, beef bone fat, owl kernel oil, hardened oil, cattle Leg oil, owl, hydrogenated castor oil, etc.
  • waxes examples include beeswax, candelilla wax, cotton wax, carnauba lou, bayberry mouth, ibotarou, whale wax, montan wax, nukarou, lanolin, Kapok wax, lanolin acetate, liquid lanolin, sugar cane wax, lanolin fatty acid isopropyl, lauryl hexyl, reduced lanolin, jojoba wax, hard lanolin, shellac mouth, P0E lanolin alcohol ether, P0E lanolin alcohol acetate, P0E cholesterol ether, lanolin fatty acid polyethylene Examples include glycol and P0E hydrogenated lanolin alcohol ether.
  • hydrocarbon oil examples include liquid paraffin, ozokerite, squalane, pristane, paraffin, ceresin, squalene, petrolatum, microcrystalline wax, polyethylene wax, and Fischer Tropus wax.
  • higher fatty acids examples include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, undecylenic acid, toluic acid, linoleic acid, linolenic acid, eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaene Acid (DHA) and the like are listed.
  • higher alcohols examples include linear alcohols (for example, lauryl alcohol monole, cetenoleanoreconole, stearinoleanorecoleure, beheninoleanoreconole, myristyl alcohol, oleyl alcohol, cetostearyl anno.
  • Branched alcohols eg, monostearyl glycerin ether (batyl alcohol), 2-decinoletetradecinole, lanolinanolenole, cholesterol, phytosterol, hexyldodecanol, Otatildodecanol, etc.).
  • Synthetic ester oils include isopropyl myristate, cetyl octanoate, octyldodecyl myristate, isopropyl palmitate, ptyl stearate, hexyl laurate, myristyl myristate, decyl oleate, hexyldecyl dimethyloctanoate, cetyl lactate, lactic acid Myristyl, lanolin acetate, isosecetyl stearate, isosecetyl isostearate, cholesteryl 12-hydroxystearate, ethylene glycol di-2-ethylhexanoate, dipentaerythritol fatty acid ester, monoisostearic acid N-alkyl glycol, dicapric acid Neopentyl glycol, disostearyl malate, glycerin di-2-heptylundecanoate, trimethylolprop
  • silicone oils include chain polysiloxanes (for example, dimethylpolysiloxane, methylphenol polysiloxane, diphenylpolysiloxane, etc.); cyclic polysiloxanes (for example, octamethylcyclotetrasiloxane, decamethylcyclopentasiloxane) ), Silicone resin that forms a three-dimensional network structure, silicone rubber, various modified polysiloxanes (amino-modified polysiloxane, polyether-modified polysiloxane, alkyl-modified polysiloxane, fluorine-modified polysiloxane) Siloxane etc.).
  • chain polysiloxanes for example, dimethylpolysiloxane, methylphenol polysiloxane, diphenylpolysiloxane, etc.
  • cyclic polysiloxanes for example, octamethylcyclotetrasiloxane, deca
  • moisturizing IJ such as polyethylene glycol, glycerin, 1,3-petitenglycol, erythritol, sorbitol, xylitol, maltitol, etc .; cenorelose, hydroxychetinoresenorelose, hydroxypropinore Senorelose, methylhydroxypropylcellulose, methylcellulose, canolepoxymethinorecenorelose, quinceseed, carrageenan, pectin, mannan, curdlan, chondroitin sulfate, starch, galactan, dermatan sulfate, glycogen, gum arabic, heparan sulfate, hyaluronic acid, Sodium hyaluronate, gum tragacanth, keratan sulfate, chondroitin, xanthan gum, mucoitin sulfate, hydroxykistilda gum, strength lupoxime Tilda
  • Antioxidants such as ptylhydroxytoluene, tocopherol, and phytin
  • Antibacterial agents such as benzoic acid, salicylic acid, sorbic acid, alkyl ester of paraoxybenzoic acid, hexaclonal phen
  • asil sarcosine acid for example, lauroyl sarcosine
  • glutathione glutathione, citrate, malic acid, tartaric acid, lactic acid and other organic acids
  • vitamin A and its derivatives vitamin B 6 hydrochloride, vitamin B 6 tripalmitate, vitamin B 6 dioctanoate, vitamin B 2 and its derivatives
  • vitamin Vitamin B such as B12, Vitamin B15 and derivatives thereof, Ascorbic acid, Ascorbic acid sulfate (salt), Ascorbic acid phosphate (salt), Vitamin C such as ascorbic acid dipalmitate, One tocopherol , / 3—Toko Vitamins such as ferrol, ⁇ -tocophe
  • the above-mentioned substance that inhibits ADAM can be applied to the skin in any form as long as it can be applied to the skin and the object of the present invention can be achieved. Or you may mix
  • the place of the skin to apply is not limited, and includes any skin on the body surface including the scalp.
  • the method of the present invention is preferably used as a cosmetic method.
  • the method for evaluating an anti-wrinkle effect of the present invention comprises a step of bringing a test substance into contact with human or animal skin, skin tissue or cells.
  • the human or animal skin that can be used in the present method is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved.
  • the skin of a hairless mouse in which the skin stratum corneum is peeled by tape stripping the skin. Can be used.
  • the skin stratum corneum of the skin can be used.
  • ADAM-9, ADAM-10 and ADAM Enzyme activity or gene expression of ADAM such as -17 is enhanced.
  • the increase in ADAM activity promotes the release of growth factors such as HB-EGF, leading to thickening of the epidermis and dermis.
  • the skin cells used in this method are epithelial cells that form the epidermis part of the skin.
  • Examples include epidermal cells such as epidermal keratinocytes, sebaceous gland cells, breast cells, small intestinal epithelial cells, and other mucosal epithelial cells. be able to.
  • epidermal keratinocytes which are one of the epidermal cells, are easy to obtain cultured cells, and this detection method is an invention related to the state of the epidermis.
  • Cells are suitable skin cells in the present method.
  • the source of skin cells is preferably human.
  • the cultured skin cells can be prepared by a conventional method.
  • the skin cells are human epidermal keratinocytes, adipose tissue and blood are removed from excess skin fragments in plastic surgery, dermatology, surgery, etc., and the dermis part is further treated with protease treatment, etc.
  • Human epidermis obtained by separation can be prepared, epidermal keratinocytes can be isolated from this human epidermis, and primary culture can be performed by a conventional method using KGM medium or the like.
  • the primary cultured cells of human epidermal keratinocytes can be subcultured using protease or the like by a conventional method to obtain the desired cultured human epidermal keratinocytes.
  • Such epidermal keratinocytes are commercially available, and in the present invention, such commercially available products can also be used.
  • Detection of ADAM enzyme activity can be performed, for example, by measuring the amount of ADAM substrate released such as HB-EGF.
  • the gene expression level may be detected by, for example, RT-PCR using Northern plotting or the like to amplify and / or measure cDNA, or detect and / or detect proteins using ELISA or Western plotting. Or you may measure.
  • the process of evaluating the anti-wrinkle effect of a test substance using the enzyme activity or gene expression level of ADAM as an index is, for example, a skin to which no test substance is added or a substance that is known not to affect ADAM activity is added.
  • tissue, cells, etc. as a control, and comparing the ADAM enzyme activity or gene expression level when the test substance is added to the ADAM enzyme activity or gene expression level in the control.
  • a test substance that reduces the enzyme activity or gene expression level of ADAM compared to the ADAM enzyme activity or gene expression level in a control has an anti-wrinkle effect. It can be specified as a substance (an anti-wrinkle substance, or a wrinkle prevention or improvement agent).
  • the usage mode of the method for evaluating the anti-wrinkle effect of the present invention is not particularly limited, and can be used, for example, in the screening of anti-wrinkle substances.
  • the skin barrier is weakened or broken due to various factors such as sebum loss and facial cleansing, and moisture transpiration from the skin surface increases, resulting in dry skin and formation of fine lines. Therefore, in hairless mice, a tape model was repeatedly applied to the skin to peel off the stratum corneum and disrupt the skin barrier, thereby producing a fine wrinkle mouse model.
  • HR-1 male 6-week-old, Hoshino experimental animal
  • TEWL water transpiration meter MEEC0; Meeco, USA
  • Tape stripping was performed using cellophane tape while adjusting the number of times to 4 to 6 mg / cm 2 / h. Normally, the first time was about 4 times, and finally tape stripping was repeated 7-8 times. Tape stripping was performed 3 times a week for 4 weeks. The right side of the back was left untreated.
  • FIG. 2 shows a replica image of the skin subjected to tape stripping as described above (FIG. 2A) and a micrograph (FIG. 2B) of the skin tissue section stained with HE (hematoxylin-eosin).
  • HE hematoxylin-eosin
  • Table 1 compares the morphological and histological changes in the fine wrinkle mouse model produced as described above with those in the photo-aged mouse model produced by UV irradiation (10 weeks). And summarized. Comparison between continuous barrier disrupted mice and UVB irradiated mice
  • mice subjected to tape stripping by the above method showed changes similar to fine wrinkles in human skin.
  • the wrinkle appearance and epidermal thickening are different from the photo-aged mouse model produced by W irradiation clearly and completely different from the photo-aging large wrinkle model. It was suggested that a fine wrinkle model could be created.
  • the gene expression level was measured using the RT-PCR method. Extract total RNA from the dorsal skin sample collected over time from the left side (tape stripping treatment: T) and right side (untreated: N) of the fine wrinkle mouse model prepared as described above. After preparation, RT-PCR was performed using primers specific to the gene to be tested. Similarly, the housekeeping gene daryseraldehyde-3-phosphoric acid, which has a constant expression level per cell. Acid dehydrogenase (GAPDH; glyceraldehydes-3-phosphate-dehydrogenase) was also measured as a standard.
  • GPDH Acid dehydrogenase
  • ADAM-9 and ADAM-17 have increased gene expression 24 hours and 48 hours after tape stripping, respectively, and the same HB-EGF that is released and activated by ADAM.
  • the gene expression of Amphiregulin belonging to the HB-EGF family also increased from 24 hours to 1 week later.
  • Fig. 4 shows a replica image (Fig. 4A) after 1 week, 2 weeks, and 4 weeks after application of each drug, and a skin tissue section after 4 weeks was stained with HE (hematoxylin and eosin). A micrograph of the object is shown (Fig. 4B). The results are summarized in Table 3 using the following evaluation criteria.
  • TAPI-1 an ADAM activity inhibitor, suppressed wrinkle formation in the fine wrinkle mouse model and markedly suppressed epidermal and dermal thickening.
  • CGS27023A N-Hydroxy _2-[[(4-Methoxyphenyl) sulfol] 3-picolinol] amino]-3-is an MMP inhibitor that showed the effect of preventing wrinkle formation in the photoaged mouse model. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p. 2525-2532
  • the humectant glycerin cannot suppress wrinkle formation at all in the fine wrinkle mouse model.
  • dermal thickening could not be suppressed.
  • oleic acid an unsaturated fatty acid that promotes rough skin, promoted wrinkle formation and increased thickening of the epidermis and dermis.
  • moisturizer alone cannot sufficiently prevent or improve fine lines, and by inhibiting ADAM activity and inhibiting growth factor release in the skin, epidermal and dermal thickening can be achieved. It was suggested that it can be effectively prevented or improved by suppressing.
  • the wrinkle formation inhibitor CGS27023A a wrinkle formation inhibitory effect in the photoaging mouse model, was unable to suppress wrinkle formation in the fine wrinkle mouse model, suppression of wrinkle formation by the substance that inhibits ADAM in the present invention was suppressed.
  • HB-EGF-AP / HT-1080 human fibrosarcoma-derived culture modified to forcibly express a fusion protein with the addition of thermostable phosphatase (AP) to the N-terminus of human HB-EGF
  • AP thermostable phosphatase
  • Cells having ADAM enzyme inhibitory activity were screened using cells HT-1080).
  • the full-length HB-EGF molecule is expressed on the cell surface of the cell line HB-EGF-AP / HT-1080 used in the form fused with alkaline phosphatase.
  • the ADAM enzyme on the cell membrane surface is activated and cleaves HB-EGF molecules. Since cleaved free HB-EGF is bound to alfa phosphatase, the activity of the compound can be indirectly measured by measuring alfa phosphatase activity in the culture supernatant. It can be measured.
  • HB-EGF-AP / HT-1080 with the cell number adjusted to 2.0 X 10 5 cells / ml was seeded in 0.2 ml / we 11 each on a 96-well culture microplate. And incubated overnight at 37 ° C. After removing the medium and washing with PBS (-), 0.1 ml / well of the medium containing the test substance was added and pretreated by incubation at 37 ° C for 30 minutes.
  • the culture supernatant is removed, and a medium containing the test substance and 60 nM TPA (phorbol ester: 12- ⁇ Tetradecanoylphorbol-acetate; Sigma P8139) is added again at a rate of 0.2 ml / well and further incubated for 60 minutes. Was treated.
  • 0.1 ml of the culture supernatant of each well is transferred to the well of a microplate for the determination of alfa phosphatase activity and incubated at 65 ° C for 10 minutes to eliminate endogenous alfa phosphatase. I made it live.
  • a hairless mouse (HR_1, male 6 weeks old, Hoshino laboratory animal) had a transdermal water transpiration (TEWL) (water transpiration measuring device MEEC0; measured using Meeco, USA) 4_8mg / cra 2 / h on the left back of the hairless mouse. Tape stripping 3 times a week for 4 weeks, so that each time immediately after tape stripping, 100 ⁇ ⁇ of TAPI-1 or 4-methoxybenzohydroxamic acid is added to the left side of the mouse. It applied one by one. 4-Methoxybenzohydroxamic acid used was dissolved in 50% aqueous ethanol solution to 1%. Also TAPI-1 (Peptide Laboratories) was evaluated by IraM concentration. In addition, a 50% aqueous ethanol solution (Vehicle) was similarly applied as a negative target.
  • TEWL transdermal water transpiration measuring device MEEC0; measured using Meeco, USA
  • the wrinkle occurrence after 4 weeks was scored by visual judgment.
  • the evaluation criteria for wrinkle occurrence were “no wrinkles; 0”, “light wrinkles; 1”, “obvious wrinkles; 2”, “deep wrinkles; 3”, and scored in increments of 0.5. The larger the score, the deeper the wrinkle.
  • the average value and standard deviation of each group were calculated, and the results are shown in FIG.
  • the vehicle score is 1.17 on average, whereas TAPI-1 is 0.43 and 4-methoxybenzohydroxamic acid is 0.91, all of these ADAM activity inhibitors are compared to Vehicle. And showed significant wrinkle suppression effect.
  • TAPI-1 and 4-methoxybenzohydroxamic acid which are ADAM activity inhibitors, inhibit the release of epidermal growth factor HB-EGF by inhibiting ADAM enzyme and prevent or improve wrinkles. It was suggested to get.

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Abstract

皮膚に存在するADAM(a disintegrin and metalloprotease)の活性を阻害する物質からなるしわ防止または改善剤。皮膚に存在するADAMの活性を阻害する物質を皮膚に適用してしわを防止または改善する。皮膚、組織または細胞におけるADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを指標として被験物質の抗しわ効果を評価する。

Description

ADAM活性阻害物質によるしわの防止または改善 技術分野
本発明は、 ADAM活性阻害物質を用いたしわの防止または改善、 ならびに ADAM 活性阻害を指標とした抗しわ効果の評価方法に関するものである。
背景技術
年をとるにつれて皮膚老化の 1つの現象としてしわが増加するが、 美容等の観 点から特に女性においてしわの防止明および改善に対する関心が非常に高まってい る。 しわは、 その発生部位や発生メカニズム等によって、 大じわ、 小じわ、 およ びちりめんじわに大きく分類される。 大じゎ書は主に光老化によって額や首の後ろ 等に生じる深いしわであり、小じわは目尻や口元に生じる比較的浅いしわであり、 またちりめんじわは老人の腹部等の非露光部に生じるひだ状のしわである。
これまで、 しわについての研究は主に光老化によって生じる大じわについて行 われ、 光老化による症状の 1つとして扱われてきた。 光老化については、 発生メ 力ェズム等についての研究が進んでおり、 また動物モデルゃヒトでの評価系も確 立されている。 光老化によるしわ形成の抑制の試みは、 紫外線による皮膚への悪 影響を防止または軽減することによるものがほとんどであり、 例えば、 紫外線に よる皮膚への障害を防止するために、 酸化チタン、 酸化亜鉛、 パラメ トキシ桂皮 酸エステル、 パラアミノ安息香酸エステル等の各種の紫外線吸収、 散乱、 遮蔽物 質を配合した化粧料 (サンスクリーン、 サンプロテクト化粧品) が開発され、 使 用されている。 また、 UV照射により皮膚に生じたフリーラジカルがコラーゲンや エラスチン等の皮膚を構成する線維成分に対する悪影響を及ぼすことが分かって おり、 酸化防止剤を含む化粧料が提案されている (例えば特表 2 0 0 1— 5 0 8 8 0 9号公報参照)。 さらには、 UV暴露によって、 コラーゲンやエラスチン等の 真皮の結合組織を分解する MMPが誘発され、 それによつて真皮の結合組織が破壊 されることが皮膚の光老化の 1つの大きな要因であると考えられており、 皮膚の 光老化を防ぐために、 例えば、 UVA遮断剤と、 UVB遮断剤と、 レチノイド等の MMP 阻害剤とを配合した皮膚の光老化を抑制するための組成物が提案されている (例 えば特表 2 0 0 1— 5 2 0 6 7 7号公報参照)。
一方で、 近年、 中高年の女性における美容に対する関心の高まりから、 加齢に 半う表皮角質層の保水能力の低下や表皮脂質の分泌低下による皮脂の減少によつ て顕在化する、 目尻や口元に生じる小じわに対する関心が高まっている。 小じわ は、 皮膚の乾燥が原因と考えられており、 その発生メカニズムや、 形態学的、 組 織学的、 または生化学的変化等において、 光老化によって生じる大じわとは大き く異なると考えられている。 例えば、 角質層水分量と小じわの程度に相関性があ ることがヒ トにおいて検証されている (例えば、 芋川ら、 Fragrance Journal ; 1992 (11) 29-42参照)。また、不飽和脂肪酸で継続的にバリア機能を破壌すると、 表皮性のしわが生じることが報告されている (例えば、 正木仁 香料会誌; 2001 Vol. 25, No. 1, 34- 38 参照)。 しかしながら、 そのような小じわを生じた皮膚に おいて、 タンパクレベルまたは遺伝子レベルでどのような生化学的変化が生じて いるかについて十分解明されておらず、小じわの防止および改善は、グリセリン、 ソルビトール、 植物液エキス等の保湿剤やコラーゲン等を含む化粧料による皮膚 の乾燥からの保護による対処に頼らざるを得なかった。 保湿剤等による皮膚の乾 燥からの保護のみでは、 小じわを十分に防止 '改善することはできず、 より効果 的に小じわを防止■改善することができる物質が強く望まれていた。
本発明は、 上記のような事情に鑑み、 皮膚における小じわ形成に関与する生化 学的変化を解明し、 かつその変化を抑制することができる物質を特定し、 その物 質を用いて、 より効果的にしわを防止または改善することを目的とするものであ る。 さらに、 本発明は、 上記の生化学的変化の抑制を指標として、 より効率的か つ簡便に被験物質の抗しわ効果を評価できる方法を提供することを目的とするも のである。
発明の開示
本発明者は、 ヘアレスマウスにテープス トリツビングを繰り返し施すことによ る皮膚の継続パリア破壌によって、 ヒトの皮膚における小じわと同様の表皮およ ぴ真皮の変化がマウスの皮膚に生じることを見出し、 小じわマウスモデルを作成 することに成功した。 本発明は、 かかる小じわマウスモデルにおいて、 ADAM- 9、 ADAM- 10および ADAM- 17等の、 デイスインテグリンとメタ口プロテアーゼドメイ ンを有する ADAM (a disintegrin and metalloprotease)ファミリーに属するタン パク質(以下 ADAMと称する)、 さらにはそれら ADAMによって細胞膜からの遊離お よび活性化がなされる HB- EGF (へパリン結合性 EGF様増殖因子; heparin- binding epidermal growth factor-l ike growth factor)および Amphiregul inの表皮にお ける遺伝子発現が亢進していること、さらにはそれら ADAMの阻害剤を塗布するこ とによって、 表皮および真皮の肥厚ならびにしわ形成を抑制できることの発見に 基づくものである。
ADAM_9、 ADAM- 10および ADAM-17等の ADAMは、 皮膚の細胞表面に存在し、 皮膚 において HB-EGF、 Amphiregul inN TNF- a TGF- α等の増殖因子を細胞膜から遊離 させ活性化させる酵素である。 皮膚のバリア破壌によって、 皮膚においてそれら ADAMが活性化されまたは発現亢進され、 HB-EGF等の増殖因子の遊離■活性化を促 進させ、 表皮おょぴ真皮の肥厚を生じさせることが、 小じわ形成の 1つの重要な 機構であると考えられる。 したがって、皮膚における ADAMの活性を抑制すること によって、 HB-EGF等の活性亢進を抑えることができ、表皮および真皮の肥厚を抑 制して、 しわ、 特に小じわを防止または改善できると考えられる。 図 1に、 皮膚 における AMM の活性阻害によりしわを防止または改善する機構について説明し た概略図を示す。
1つの態様において、本発明は、皮膚に存在する ADAMの活性を阻害する物質か らなるしわ防止または改善剤に関するものである。
また、別の態様において、本発明は、皮膚に存在する ADAMの活性を阻害する物 質を皮膚に適用することを含む、 しわを防止または改善する方法に関するもので ある。
さらに別の態様において、本発明は、 しわの防止または改善における ADAMの活 性を阻害する物質の使用に関するものである。
さらに別の態様において、 本発明は、 しわを防止または改善するための組成物 の製造における ADAMの活性を阻害する物質の使用に関するものである。組成物は、 限定はされないが、 化粧料、 医薬品、 医薬部外品等の皮膚外用剤であることが好 ましく、 より好ましくは化粧料である。
皮膚に存在する ADAMとして、例えば ADAM- 9、ADAM- 10、ADAM- 12、ADAM- 15、ADAM- 17 およぴ ADAM- 19等が挙げられ、 特に ADAM- 9、 ADAM- 10およぴ ADAM- 17は、 細胞増 殖因子の遊離■活性化に深く関与していることが分かっている。
本明細書において、 「ADAMの活性を阻害する」 とは、 ADAMの酵素活性を阻害す るのみならず、遺伝子の発現やタンパク質生成を阻害する等、 皮膚における ADAM の活性を低下させる任意の作用を含む。
さらに別の態様において、本発明は抗しわ効果の評価方法に関するものであり、 ヒトまたは動物の皮膚、 皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、 前記皮膚、 組織または細胞における ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを検出し、 ADAM の酵素活性または遺伝子発現レベルを指標として被験物質の抗しわ効果を評価す ることを含む。
ADAMとして、 例えば ADAM - 9、 ADAM - 10または ADAM- 17等が挙げられる。
例えば、 皮膚細胞、 特に表皮角化細胞を用いることによって、 迅速かつ効率的 に多数の被験物質の抗しわ効果を評価することができる。
本明細書において、 「抗しわ効果」 とは、 しわの形成を防止し、 または形成され たしわを改善する任意の効果を意味する。
ADAM の活性を阻害する物質を皮膚に適用することによって、 ADAM-9、 ADAM - 10 および ADAM- 17等の皮膚に存在する ADAMの活性を阻害して、皮脂の減少や洗顔等 の様々な要因によって生じる皮膚のバリア破壌によって誘起される表皮および真 皮における HB- EGF等の増殖因子の遊離■活性化を抑制し、表皮や真皮の肥厚を抑 えることができ、 非常に効果的にしわ、 特に小じわを防止または改善することが 可能である。
また、本発明の ADAM活性阻害を指標とした評価方法によって、効率的かつ簡便 に、 高い効果を有する抗しわ物質を特定することが可能である。
図面の簡単な説明
図 1は、表皮における ADAMの活性阻害によりしわを防止または改善する機構に ついて説明した概略図である。
図 2は、 テープストリツビングを施したマウス皮膚のレプリカ画像 (図 2 A)、 および皮膚組織切片を HE (へマトキシリンーェォジン) 染色したものの顕微鏡写 真 (図 2 B ) である。 図 3は、 小じわマウスモデルにおける、 ADAM_9、 ADAM- 17、 HB-EGF、 および Amphiregul inの遺伝子発現の変化を示す。
図 4は、 小じわマウスモデルにおいて、 各薬剤を塗布した皮膚のレプリカ画像 (図 4 A:)、 および皮膚組織切片を HE (へマトキシリンーェォジン) 染色したも のの顕微鏡写真 (図 4 B ) である。
図 5は、 視感判定での ADAM活性阻害物質の抗しわ効果を示すグラフである。 図 6は、 しわ面積(%) での ADAM活性阻害物質の抗しわ効果を示すグラフであ る。 ―
発明を実施するための最良の形態
ADAMは、接着と細胞外タンパク質分解という 2つの特性を有する多機能性タン パク質で、 30種類以上のフアミリーが存在するが、 今尚その数は増加している。 ADAM は、 様々な動物おょぴ組織において発現されており、 皮膚に存在する ADAM として、 例えば ADAM - 9、 ADAM- 10、 ADAM_12、 ADAM_15、 ADAM-17 および ADAM- 19 等が挙げられる。 特に、 ADAM_9、 ADAM-10および ADAM-17は、 細胞増殖因子の遊 離■活性化に深く関与していることが分かっている。
本発明において用いることができる ADAMの活性を阻害する物質は、皮膚におい て ADAMの活性を低下させるものであれば特に限定されず、 例えば、 ADAMの酵素 活性を阻害する物質、 ADAM遺伝子の発現やタンパク質生成を阻害する物質等、任 意のものを含む。 またそれらは動植物由来物のような天然のものであっても、 あ るいは合成のものであっても差し支えない。
そのような ADAM の活性を阻害する物質として、 限定はされないが、 例えば TAPI-1 、 ~ (R) - (2- (Hydroxyaminocarbonyl) methyl) - 4- Methylpentanoyl- L- Nal- L- Alanine 2_ Aminoethyl amide; Immunexs Seattle^ WA)、 およひ 4 -メ 卜 キシベンゾヒドロキサム酸 (4-Methoxybenzohydroxami c acid) 等力 列示される。 限定はされないが、本発明の ADAMの活性を阻害する物質からなるしわ防止また は改善剤は、 好ましくは皮膚外用剤において使用する。
皮膚外用剤において、上記 ADAMの活性を阻害する物質を 1種単独でまたは 2種 以上を組合せて配合して差し支えない。 また、 皮膚外用剤におけるそれら物質の 配合量は、 その使用態様や製品形態等によって異なり特に限定はされないが、 例 えば、皮膚外用剤全量に対して、好ましくは 0. 001質量%から 10質量%、 より好 ましくは 0. 005質量%から 5質量%、さらに好ましくは 0. 01質量%から 1質量% である。. - - ―
本明細書において、 「皮膚外用剤」 は、 化粧料、 医薬品、 医薬部外品等を含む。 また、 その剤型も、水溶液系、 可溶化系、 乳化系、 油液系、 ゲル系、ペースト系、 軟膏系、 エアゾール系、 水一油 2層系、 水一油一粉末 3層など、 任意の剤型を含 む。 また、 シート状基剤に担持されたものも含む。
また、 皮膚外用剤の採り得る製品形態および用途も任意であり、 例えば、 化粧 水、 乳液、 クリーム、 パック等のフエーシャル、 ボディまたは頭皮用の外用剤と して用いることが可能である。
皮膚外用剤は、 ADAMの活性を阻害する物質の他に、 通常化粧品や医薬品等の皮 膚外用剤に用いられる他の任意の成分を必要に応じて適宜配合し、 目的とする剤 形に応じて常法により製造することが出来る。例えば、上記の ADAMの活性を阻害 する物質と、 下記成分の 1種または 2種以上とを配合して皮膚外用剤を調製でき る。
紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸(以下 PABAと略す)、 PABA モノグリセリンエステル、 , N-ジプロポキシ PABAェチルエステル、 N, N-ジェトキ シ PABAェチルエステル、 N, N -ジメチル PABAェチルエステル、 N, N -ジメチル PABA プチルエステル、 N, N -ジメチル PABAメチルエステル等の安息香酸系紫外線吸収剤、 ホモメンチル- N- ァセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、 アミルサリシレート、 メンチルサリシレート、 ホモメンチルサリシレート、 オタ チルサリシレート、 フエニルサリシレート、 ベンジルサリシレート、 p-イソプロ パノールフエ-ルサリシレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤、 ォクチルシンナ メート、 ェチル -4-イソプロピルシンナメート、 メチル _2, 5-ジイソプロピルシン ナメート、 ェチル -2, 4 -ジイソプロピルシンナメート、 メチル- 2, 4 -ジイソプロピ ルシンナメート、 プロピル -p-メ トキシシンナメート、 イソプロピル- p-メ トキシ シンナメート、 イソァミル- p-メ トキシシンナメート、 ォクチル- p-メ トキシシン ナメート(2- ェチルへキシル -P -メ トキシシンナメート)、 2-エトキシェチル- p - メ トキシシンナメート、 シクロへキシノレ- p- メ トキシシンナメート、 ェチノレ- α _ シァノ― ]3 -フエニルシンナメート、 2 -ェチノレへキシル - a -シァノ フエニルシ ンナメート、 グリセリルモノ- 2 -ェチルへキサノィル-ジパラメ トキシシンナメー ト、 トリメ トキシ桂皮酸メチルビス (トリメチルシロキサン) シリルイソペンチ ル等の桂皮酸系紫外線吸収剤、 3- (4' -メチルベンジリデン)- d , 1_カンファー、 3- ベンジリデン- d, 1-カンファー、 ゥロカ-ン酸、 ゥロカニン酸ェチルエステノレ、 2- フェ二ノレ- 5-メチノレべンゾキサゾーノレ、 2, 2' -ヒ ドロキシ -5 -メチノレフェ二ノレべンゾ トリァゾーノレ、 2- (2,-ヒ ドロキシ- 5,- 1-ォクチルフエ-ル)ベンゾトリァゾール、 2-(2, -ヒ ドロキシ- 5, _メチルフエニルベンゾトリァゾール、 ジベンザラジン、 ジ ァニソィルメタン、 4 -メ トキシ- 4' - 1 -プチルジベンゾィルメタン、 5 -(3, 3-ジメチ ル- 2-ノルボル二リデン) -3-ペンタン- 2_オン、 ジモルホリノピリダジノン等が挙 げられ、 任意の 1種または 2種以上を用いることができる。
紫外線散乱剤としては、 酸化チタン、 微粒子酸化チタン、 酸化亜鉛、 微粒子酸 化亜鉛、 酸化鉄、 微粒子酸化鉄、 酸化セリウムなどの粉末が挙げられる。
これら紫外線散乱剤は、通常、針状、紡錘状、球状、粒状の粉末が使用される。 また、 粒子径が 0. Ι μ ιη以下の微粒子粉末が好ましい。
メチルハイ ドロジエンポリシロキサンゃシランカツプリング剤などのシリコー ン処理;金属石験処理;パーフルォロアルキルリン酸ジエタノールアミン塩ゃパ 一フルォロアルキルシラン等のフッ素処理、 デキストリン脂肪酸エステル処理等 により、 疎水化処理した紫外泉散乱剤も好ましい。
液体油脂としては、 例えば、 アポガド油、 ツバキ油、 タートル油、 マカデミア ナッツ油、 トウモロコシ油、 ミンク油、 オリープ油、 ナタネ油、 卵黄油、 ゴマ油、 パーシック油、 小麦 芽油、 サザン力油、 ヒマシ油、 アマ-油、 サフラワー油、 綿実油、 エノ油、 大豆油、 落花生油、 茶実油、 カャ油、 コメヌ力油、 シナギリ油、 日本キリ油、 ホホバ油、 胚芽油、 トリグリセリン等が挙げられる。
固体油脂としては、 例えば、 カカオ脂、 ヤシ油、馬脂、硬化ヤシ油、 パーム油、 牛脂、 羊脂、 硬化牛脂、 パーム核油、 豚脂、 牛骨脂、 モクロウ核油、 硬化油、 牛 脚脂、 モクロウ、 硬化ヒマシ油等が挙げられる。
ロウ類としては、 例えば、 ミツロウ、 カンデリラロウ、 綿ロウ、 カルナウバロ ゥ、べィベリー口ゥ、 ィボタロウ、鯨ロウ、 モンタンロウ、 ヌカロウ、 ラノリン、 カポックロウ、 酢酸ラノリン、 液状ラノリン、 サトウキビロウ、 ラノリン脂肪酸 イソプロピル、 ラウリン酸へキシル、 還元ラノリン、 ジョジョバロウ、 硬質ラノ リン、セラック口ゥ、 P0Eラノリンアル ールエーテル、 P0Eラノリンアルコール アセテート、 P0E コレステロールエーテル、 ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコ ール、 P0E水素添加ラノリンアルコールエーテル等が挙げられる。
炭化水素油としては、 例えば、 流動パラフィン、 ォゾケライ ト、 スクヮラン、 プリスタン、 パラフィン、 セレシン、 スクヮレン、 ワセリン、 マイクロクリスタ リンワックス、 ポリエチレンワックス、 フィッシャートロプッシュワックス等が 挙げられる。
高級脂肪酸としては、 例えば、 ラウリン酸、 ミリスチン酸、 パルミチン酸、 ス テアリン酸、ベへニン酸、 ォレイン酸、 ゥンデシレン酸、 トール酸、 リノール酸、 リノレイン酸、 エイコサペンタエン酸 (EPA)、 ドコサへキサェン酸 (DHA) 等が挙 げられる。
高級アルコールとしては、 例えば、 直鎖アルコール (例えば、 ラウリルアルコ 一ノレ、 セチノレアノレコーノレ、 ステアリノレアノレコースレ、 ベへニノレアノレコーノレ、 ミ リス チルアルコール、 ォレイルアルコール、セトステアリルァノレコール等);分枝鎖ァ ルコール (例えば、 モノステアリルグリセリンエーテル(バチルアルコール)、 2- デシノレテトラデシノーノレ、 ラノリンァノレコーノレ、 コレステロ一ノレ、 フィ トステロ ール、 へキシルドデカノール、 オタチルドデカノール等) 等が挙げられる。
合成エステル油としては、 ミリスチン酸イソプロピル、 オクタン酸セチル、 ミ リスチン酸ォクチルドデシル、パルミチン酸ィソプロピル、ステアリン酸プチル、 ラウリン酸へキシル、 ミリスチン酸ミリスチル、 ォレイン酸デシル、 ジメチルォ クタン酸へキシルデシル、 乳酸セチル、 乳酸ミ リスチル、 酢酸ラノリン、 ステア リン酸ィソセチル、ィソステアリン酸ィソセチル、 12-ヒドロキシステアリン酸コ レステリル、ジ- 2-ェチルへキサン酸エチレングリコール、ジペンタエリスリ トー ル脂肪酸エステル、 モノイソステアリン酸 N-アルキルグリコール、 ジカプリン酸 ネオペンチルグリコール、 リンゴ酸ジィソステアリル、ジ- 2-へプチルゥンデカン 酸グリセリン、 トリ- 2-ェチルへキサン酸トリメチロールプロパン、 トリイソステ ァリン酸トリメチロールプロパン、テトラ- 2-ェチルへキサン酸ペンタエリスリ ト ール、 トリ- 2-ェチルへキサン酸グリセリン、 トリオクタン酸グリセリン、 トリイ ソパノレミチン酸グリセリン、 トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、 セ チル 2 -ェチルへキサノエート、 2-ェチルへキシル—パルミテート、 トリミリスチン 酸グリセリン、 トリ- 2 -へプチルゥンデカン酸グリセライ ド、 ヒマシ油脂肪酸メチ ルエステル、 ォレイン酸ォレイル、 ァセトグリセライド、 パルミチン酸 2-へプチ ノレゥンデシル、 アジピン酸ジイソプチル、 N -ラウロイル - L-グルタミン酸- 2 -ォク チルドデシルエステル、ァジピン酸ジ -2-ヘプチルゥンデシル、ェチルラゥレート、 セパシン酸ジ—2-ェチルへキシル、 ミリスチン酸 2-へキシルデシル、 パルミチン 酸 2-へキシルデシル、 アジピン酸 2-へキシルデシル、 コハク酸 2-ェチルへキシ ル、 タエン酸トリエチル、 ポリオキシエチレン 'ポリオキシプロピレンランダム 重合体メチル エーテル 等が挙げられる。
シリコーン油としては、 例えば、 鎖状ポリシロキサン (例えば、 ジメチルポリ シロキサン、 メチルフエ-ルポリシロキサン、 ジフエ二ルポリシロキサン等) ;環 状ポリシロキサン (例えば、 ォクタメチルシクロテトラシロキサン、 デカメチル シクロペンタシロキサン、 ドデカメチルシク口へキサシロキサン等)、 3次元網目 構造を形成しているシリコーン樹脂、 シリ コーンゴム、 各種変性ポリシロキサン (ァミノ変性ポリシロキサン、 ポリエーテル変性ポリシロキサン、 アルキル変性 ポリシロキサン、 フッ素変性ポリシロキサン等) 等が挙げられる。
その他には、 例えば、 ポリエチレングリコール, グリセリン、 1, 3-プチレング リコール, エリスリ トール, ソルビトール, キシリ トール, マルチトール等の保 湿斉 IJ ; セノレロース, ヒ ドロキシェチノレセノレロース, ヒ ドロキシプロピノレセノレロー ス, メチルヒ ドロキシプロピルセルロース, メチルセルロース, カノレポキシメチ ノレセノレロース, クィンスシード, カラギーナン, ぺクチン, マンナン, カードラ ン, コンドロイチン硫酸, デンプン, ガラクタン, デルマタン硫酸, グリコーゲ ン, アラビアガム, へパラン硫酸, ヒアルロン酸, ヒアルロン酸ナトリウム, ト ラガントガム, ケラタン硫酸, コンドロイチン, キサンタンガム, ムコイチン硫 酸, ヒ ドロキシェチルダァガム, 力ルポキシメチルダァガム, グァガム, デキス トラン, ケラト硫酸, ローカストビーンガム, サクシノグルカン, カロニン酸, キチン, キトサン, 力ルポキシメチルキチン, 寒天等の増粘剤、 エタノール等の 低級アルコール;プチルヒ ドロキシトルエン, トコフエロール, フィチン等の酸 化防止剤;安息香酸, サリチル酸, ソルビン酸, パラォキシ安息香酸アルキルェ ステル, へキサクロ口フェン等の抗菌剤;ァシルサルコシン酸 (例えばラウロイ ルサルコシンナトリウム)、 グルタチオン、 クェン酸, リンゴ酸, 酒石酸, 乳酸等 の有機酸; ビタミン A及びその誘導体、 ビタミン B 6塩酸塩, ビタミン B 6 トリ パルミテート, ビタミン B 6ジォクタノエート, ビタミン B 2及びその誘導体, ビタミン B 1 2, ビタミン B 1 5及びその誘導体等のビタミン B類、 ァスコルビ ン酸, ァスコルビン酸硫酸エステル(塩), ァスコルビン酸リン酸エステル(塩), ァスコルビン酸ジパルミテート等のビタミン C類、 ひ一トコフエロール, /3—ト コフエロール, δ—トコフエロール, ビタミン Εアセテート等のビタミン Ε類、 ビタミン D類、 ビタミン Η、 パントテン酸、 パンテチン等のビタミン類;ニコチ ン酸アミ ド、 ェコチン酸べンジノレ、 γ一オリザノーノレ、 アラントイン、 グリチノレ リチン酸 (塩)、 グリチルレチン酸及びその誘導体、 ヒノキチオール、 ビサボロー ル、 ユーカルプトーン、 チモール、 イノシトール、 サイコサポニン、 ニンジンサ ポニン、 へチマサポニン、 ムクロジサポニン等のサポニン類、 パントテニノレエチ ノレエーテノレ、 ェチニノレエス トラジオ一ノレ、 トラネキサム酸、 アルブチン、 セファ ランチン、 プラセンタエキス等の各種薬剤、 ギシギシ、 クララ、 コゥホネ、 ォレ ンジ、 セージ、 ノコギリソゥ、 ゼニァオイ、 センプリ、 タイム、 トウキ、 トウヒ、 ノ ーチ、 スギナ、 へチマ、 マロニエ、 ユキノシタ、 ァノレエ力、 ユリ、 ョモギ、 シ ャクャク、 アロエ、 クチナシ、 サワラ、 セィヨウサンザシエキス、 セィヨウオト ギリソゥエキス、アイリス 'インエキス、ァセンャクエキス、ィチヨゥ葉エキス、 イブキジヤコゥエキス、 ウイキヨウエキス、 ウーロン茶エキス、 ウォーターリ リ 一エキス、 ェィジツエキス、 ェンメイソゥエキス、 ォゥゴンエキス、 才ゥ/ タエ キス、 ォドリコソゥエキス、 カンゾゥエキス、 クチナシエキス、 紅茶エキス、 セ イカリユウエキス、 トノレメンチラエキス、 バラエキス、 へチマエキス、 ペパーミ ントエキス、 ローズマリーエキス、 ローヤノレゼリーエキス等の植物の抽出物、 色 素、 モノラウリン酸ソルビタン、 モノパルミチン酸ソルビタン、 セスキォレイン 酸ソ ビタン、 トリオレイン酸ソルビタン、 モノラウリン酸ポリオキシエチレン ソルビタン、 モノステアリン酸ポリオキセチレンソルビタン、 ポリエチレングリ コールモノォレート、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリグリコ^"/レジ エーテル、ラウロイルジェタノールァマイド、脂肪酸イソプロパノールァマイ ド、 マルチトールヒドロキシ脂肪酸エーテル、アルキル化多糖、アルキルダルコシド、 シュガーエステル等の非イオン性活性剤、 ステアリルトリメチルアンモ-ゥムク 口ライド、 塩化ベンザルコニゥム、 ラウリルアミンオキサイド等のカチオン性界 面活性剤、 パルミチン酸ナトリゥム、 ラウリン酸ナトリウム、 ラウリル酸ナトリ ゥム、 ラウリル硫酸カリウム、 アルキル硫酸トリエタノールァミンエーテル、 口 ート油、 リニアドデシルベンゼン硫酸、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油マレイ ン酸、 ァシルメチルタウリン等のァニオン性界面活性剤、 両性界面活性剤、 中和 剤、 δ —トコフエロール、 プチルヒ ドロキシトルエン等の酸化防止剤、 フエノキ シェタノール、 パラベン等の防腐剤が挙げられる。
本方法において、上記の ADAMを阻害する物質は、皮膚への適用が可能でかつ本 発明の目的を達成できる限り、 任意の形態で皮膚に適用することができ、 また単 独で適用しても、 あるいは他の任意の成分と共に配合して適用してもよい。 また 適用する皮膚の場所も限定されず、 頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。 限 定はされないが、 本発明の方法は、 好ましくは美容方法として用いられる。 本発明の抗しわ効果の評価方法は、 ヒ トまたは動物の皮膚、 皮膚組織または細 胞に被験物質を接触させる工程を含む。
本方法で用いることができるヒトまたは動物の皮膚は、 本発明の目的を達成で きる限り特に限定はされないが、 例えば、 皮膚にテープストリッビングを施して 皮膚の角質層を剥離したヘアレスマウスの皮膚を用いることができる。 ヘアレス マウスの皮膚にテープストリッビングを施すことによって皮膚の角質層を剥離し て皮膚のバリアを継続的に破壊すると、 小じわがマウスの皮膚に生じ、 かつ ADAM-9、 ADAM- 10およぴ ADAM-17等の ADAMの酵素活性または遺伝子発現が亢進さ れる。 ADAMの活性の亢進によって、 HB- EGF等の増殖因子の遊離■活性化が促進さ れて表皮および真皮の肥厚が生じることが、 小じわ形成の 1つの原因であると考 えられる。 従って、 本発明の評価方法において、 例えば、 そのような継続バリア 破壊によって亢進された ADAM の遺伝子発現を低下させる物質を特定することに よって、 抗しわ物質を効率的に特定できると考えられる。 本方法において用いる皮膚細胞は、 皮膚の表皮部分を形成する上皮系細胞であ り、 表皮角化細胞等の表皮細胞、 皮脂腺細胞、 乳腺細胞、 小腸上皮細胞、 その他 の粘膜上皮細胞等を例示すること-ができる。 これらの中でも、 表皮細胞の一つで ある表皮角化細胞 (ケラチノサイト) は、 培養細胞の入手が容易であり、 かつ、 本検出方法が、 表皮の状態に関連する発明であることから、 表皮角化細胞が、 本 方法において好適な皮膚細胞である。 また、 皮膚細胞の提供源はヒ トであること が好ましい。 さらに、 本方法において用いられる皮膚細胞は、 培養された細胞を 用いることが好ましい。 この培養された皮膚細胞は、 常法により調製することが できる。
例えば、 皮膚細胞が、 ヒト表皮角化細胞である場合には、 形成外科、 皮膚科、 外科手術等での余剰皮膚片から、 脂肪組織や血液を除去し、 さらには真皮部分を プロテアーゼ処理等により分離して得たヒ ト表皮を調製し、 このヒト表皮から表 皮角化細胞を分離し、 K GM培地等を用いる常法により、 初代培養を行うことが できる。 次に、 常法により、 ヒ ト表皮角化細胞の初代培養細胞を、 プロテアーゼ 等を用いて、 継代培養を行い、 所望する培養ヒト表皮角化細胞を得ることができ る。 なお、 このような表皮角化細胞は、 市販されており、 本発明においては、 か かる市販品を用いることも可能である。
ADAMの酵素活性の検出は、例えば HB- EGFなどの ADAMの基質が遊離する量を測 定することによって行うことができる。
また遺伝子発現レベルの検出は、例えば、 RT- PCRゃノーザンプロット法等を用 Vヽて cDNAを増幅および または測定してもよいし、あるいは ELISAやウェスタン プロット法等を用いてタンパク質を検出および/または測定してもよい。
ADAM の酵素活性または遺伝子発現レベルを指標として被験物質の抗しわ効果 を評価する工程は、例えば、被験物質を添加しないかあるいは ADAMの活性に影響 を与えないことが分かっている物質を添加した皮膚、 組織、 細胞等を対照として 用い、被験物質を添加した際の ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを、対照 における ADAM の酵素活性または遺伝子発現レベルと比較することを含んでいて ょレ、。例えば、対照における ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルと比較して、 ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを低下させる被験物質を、抗しわ効果を 有する物質 (抗しわ物質、 あるいはしわ防止または改善剤) として特定すること ができる。
本発明の抗しわ効果の評価方法の使用態様は特に限定されず、 例えば抗しわ物 質のスクリーニングゃ評価等において用いることができる。
以下、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、 本発明は下記の実施例に 限定されるものではない。
実施例
小じわマウスモデルの作製
皮脂の減少や洗顔等の様々な要因により皮膚のバリアが弱められまたは破壌さ れて、 皮膚表面からの水分蒸散が増加することによって、 皮膚が乾燥して小じわ が形成されると考えられる。 そこで、 ヘアレスマウスにおいて、 皮膚にテープス トリッビングを繰り返し施すことによって、 角質層を剥がして皮膚のバリアを破 壌して、小じわマウスモデルを作製した。簡単に説明すると、ヘアレスマウス(HR-1: 雄 6週齢、 星野実験動物) の背部左側の皮膚に、 経皮水分蒸散量 (TEWL) (水分蒸 散量測定装置 MEEC0; Meeco社、 USAを用いて測定) 4〜6mg/cm2/hになるよう に回数を調整しながらセロハンテープを用いてテープストリッビングを施した。 通常初回は 4回程度で、 最終的には 7〜8回テープストリツビングを操り返した。 週 3回、 4週間継続してテープストリッビングを行った。 背部右側は未処置のま まにした。
図 2に、 上記のようにテープストリツビングを施した皮膚のレプリカ画像 (図 2 A)、 および皮膚組織切片を HE (へマトキシリン一ェォジン) 染色したものの 顕微鏡写真 (図 2 B ) を示す。 レプリカ画像 (図 2 A) において、 テープストリ ッビング開始 24時間後 (24h) および 48時間後 (48h) に皮溝が深くなつた後、 1 週間後 (1W) には皮溝の方向が一定になり、 4週間後 (4W) にはしわ様の外観を 示した。 また、 皮膚組織の顕微鏡写真 (図 2 B ) において、 未処置 (NT) のもの と比較して、 24時間後から表皮が肥厚し始め、 2週間後 (2W) においても表皮肥 厚が維持された。 以下の表 1に、 上記のように作製した小じわマウスモデルにお ける形態学的、 組織学的変化等を、 UV照射(10週間) によって作製した光老化マ ウスモデ^/におけるそれら変化と比較してまとめた。 継続バリァ破壊マウスと U V B照射マウスとの比較
Figure imgf000015_0001
上記の方法でテープストリッビングを施したマウスの皮膚は、 ヒ トの皮膚にお ける小じわと同様の変化を示した。 一方で、 そのしわの外観や表皮肥厚等におい て、明ら力に W照射によって作製した光老化マウスモデルとは異なっており、上 記の方法によって、 光老化による大じゎモデルとは全く異なる、 小じわモデルを 作製できたことが示唆された。
小じわマウスモデルにおける生化学的変化の検討
上記のように作製した小じわマウスモデルにおいて、 表皮および真皮の肥厚が 生じており、 テープストリツビングによるバリア破壌の刺激によって、 表皮およ び真皮において細胞増殖因子が活性化されていることが予測された。 そこで、 表 皮に存在する細胞増殖因子である HB - EGF、 Araphiregulin, ならびにそれら増殖因 子を細胞膜から遊離'活性化させる酵素である ADAM- 9および ADAM- 17の遺伝子発 現について検討した。
遺伝子発現量の測定は、 RT- PCR法を用いて行った。 上記のように作製した小じ わマウスモデルの左側 (テープストリツビング処置: T) と右側 (未処置: N) か ら経時的に採取した背部皮膚試料から全 RNAを抽出し、 cD皿を調製後、試験対象 の遺伝子に特異的なプライマーを用いて RT- PCRを行った。また同様に、細胞あた りの発現量が一定であるハウスキーピング遺伝子のダリセルアルデヒド- 3-リン 酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH; glyceraldehydes— 3— phosphate— dehydrogenase) に ついても基準として測定した。
結果を図 3Ίこ示す。 ADAM- 9および ADAM- 17は、それぞれテープストリッビング を施した皮膚の 24時間後、 48時間後においてその遺伝子発現が亢進しており、 またそれら ADAMによって遊離 ·活性化される HB - EGFおよび同じ HB - EGFファミ リ 一に属する Amphiregulinも 24時間後から 1週間後にかけてその遺伝子発現が亢 進していた。
小じわマウスモデルにおける各種薬剤塗布による抗しわ効果の検討
次に、 以下の表 2に示す各種薬剤を塗布することによる、 小じわマウスモデル における抗しわ効果について検討した。
表 2
Figure imgf000016_0001
* : N -ヒ ドロキシ- 2_ [ [ (4 -メ トキシフエ二ル)スルホニル] 3-ピコリル]ァミノ] -3- メチノレブタンアミ ド塩酸塩] (J. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p. 2525-2532) 上記の方法でヘアレスマウスにテープストリッビングを施し、 各テープストリ ッビング処置の後に表 2の各薬剤を 100 1ずつ塗布した。図 4に、各薬剤を塗布 した皮膚の 1週間後、 2週間後および 4週間後のレプリカ画像 (図 4 A)、 ならび に 4週間後の皮膚組織切片を HE (へマトキシリン一ェォジン) 染色したものの顕 微鏡写真 (図 4 B ) を示す。 また、 その結果を、 以下の評価基準を用いてまとめ たものを表 3に示す。
〇:改善
△:変化なし
X :悪化 小じわマウスモデルにおける各種薬剤の抗しわ効果
Figure imgf000017_0001
ADAM活性阻害物質である TAPI- 1は、 小じわマウスモデルにおいてしわ形成を 抑制し、 また表皮および真皮の肥厚も顕著に抑制した。 一方、 光老化マウスモデ ルでしわ形成防止効果を示した MMP 阻害剤である CGS27023A (N-ヒ ドロキシ _2 - [ [ (4-メ トキシフエ-ル) スルホ -ル] 3-ピコリノレ]ァミノ]- 3 -メチルブタンァ ミド塩酸塩]ひ. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p. 2525- 2532)、 ならびに保湿剤であ るグリセリンは、小じわマウスモデルでは全くしわ形成を抑制することができず、 また表皮および真皮の肥厚も抑制できなかった。 さらに、 肌荒れ促進作用を有す る不飽和脂肪酸のォレイン酸は、 しわ形成を促進させ、 また表皮および真皮の肥 厚も亢進させた。
これらの結果から、 保湿剤のみでは小じわを十分に防止または改善することが できず、皮膚において ADAMの活性を阻害して増殖因子の遊離■活性化を阻害する ことによって、 表皮や真皮の肥厚を抑制して小じわを効果的に防止または改善し 得ることが示唆された。 また、 光老化マウスモデルでしわ形成抑制効果を示した 匪 P阻害剤の CGS27023Aが、 小じわマウスモデルではしわ形成を抑制できなかつ たことから、 本発明における ADAMを阻害する物質によるしわ形成の抑制が、 MMP 阻害剤とは別の機構による作用であることが示唆された。
新規な ADAM活性阻害物質の探索およぴ抗しわ効果の評価
次に、 ADAM活性を阻害する新規な化合物を探索し、 小じわマウスモデルにおい てその抗しわ効果を評価した。 化合物の配合量は特に断りのない限り質量。 /0であ る。 ( 1 ) ADAM活性阻害物質のスクリーニング
まず、 HB- EGF- AP/HT- 1080 (ヒ ト HB- EGFの N末端に耐熱性アル力リフォスファ ターゼ (AP) を付加した融合蛋白質を強制的に発現するように改変したヒト線維 肉腫由来培養細胞 HT- 1080)を用いて ADAM酵素阻害活性を有する化合物のスクリ 一-ングを行った。 用いた細胞株 HB- EGF- AP/HT- 1080の細胞表面上にはアルカリ フォスファターゼと融合した形で HB- EGF全長分子が発現している。この細胞をホ ルポールエステルで刺激すると、細胞膜表面上の ADAM酵素が活性化されて HB-EGF 分子を切断する。切断されて遊離型となった HB - EGFにはアル力リフォスファタ一 ゼが結合しているため、 培養上清中のアル力リフォスファターゼ活性を測定する ことで化合物の ADAM酵素阻害活性を間接的に測定できる。
具体的には、 2. 0 X 105 cells/ml になる よ う に細胞数を調整した HB - EGF- AP/HT- 1080を 96ゥエル培養用マイクロプレートに 0. 2 ml /we 11ずつ播種 し、 37°Cで一晩培養した。 培地を除去し PBS (-)で洗浄後、 被験物質を含む培地を 0. 1 ml/wellずつ添加し、 37°Cで 30分間インキュベートして前処置した。その後、 培養上清を除去し、 再度被験物質と 60 nM TPA (ホルボールエステル : 12-^Tetradecanoylphorbol-acetate ; Sigma P8139) を含む培地を 0. 2 ml/well ずつ添加し、 さらに 60分間インキュベートして処置した。処置終了後の各ゥエル の培養上清 0. l mlをアル力リフォスファターゼ活性測定用マイクロプレートのゥ エルに移し、 65°Cにて 10分間ィンキュベートし、内在性のアル力リフォスファタ ーゼを失活させた。 1 mg/mlの AP基質(^nitrophenylphosphate, Wako ; 141-02341) を 0. 1 ml/wellずつ各ゥエルに添加し、 直ちに各ゥ ルの 405 nmでの吸光度を測 定した。遮光して室温にて 2時間インキュベートしたのち、再び各ゥエルの 405 nra での吸光度を測定した。 2時間ィンキュベート後の吸光度から AP基質添加直後の 吸光度を減じたものを各ゥエルの吸光度とした。 0%阻害コントロール (TPAのみ を含む培地)の吸光度を A0、 100%阻害コントロール(培地のみ)の吸光度を A100、 試料の吸光度を ASとし、 以下の式により阻害率 (%) を算出した: 阻害率 (%) = (AO- AS)バ AO- A100) * 100 その結果、 4-メ トキシベンゾヒドロキサム酸(4 - Methoxybenzohydroxamic acid) に高い HB-EGF遊離抑制効果が認められ、 ADAM活性を阻害することが示唆された。 4ニメ トキシベンゾヒドロキサム酸の構造式を以下に示す。 またその遊離阻害率を 表 4に示す。
Figure imgf000019_0001
4-メ トキシベンゾヒドロキサム酸
(4-Methoxybenzohydroxam i c aci d)
表 4
Figure imgf000019_0002
( 2 ) ADAM活性阻害物質の抗しわ効果の評価
次に、 小じわマウスモデルを用いて、 ADAM活性阻害物質である TAPI-1および 4 -メ トキシベンゾヒドロキサム酸の抗しわ効果について検討した。
ヘアレスマウス (HR_1, 雄 6週齢、 星野実験動物) の左側背部に経皮水分蒸散 量 (TEWL) (水分蒸散量測定装置 MEEC0;Meeco社、 USAを用いて測定)が 4_8mg/cra2/h になるようにテープストリツビングを週 3回、 4週間継続して行い、 テープスト リッビング処置直後に毎回、 TAPI- 1または 4-メ トキシベンゾヒドロキサム酸をそ れぞれマウス左側背部に 100 μ ΐずつ塗布した。 4-メ トキシベンゾヒドロキサム酸 は、 1 %になるように 50%エタノール水溶液に溶解させたものを用いた。 また TAPI-1 (ぺプチド研究所)は IraMの濃度で評価した。 さらに、陰性対象として 50% ェタノール水溶液 (Vehicle)を同様に塗布した。
4—週間後のしわの発生状況を視感判定によりスコアィ匕-した。 しわの発生状況の 評価基準は 「しわなし; 0」、 「うすいしわ; 1」、 「明らかなしわ; 2」、 「深いし わ; 3」 とし、 0. 5刻みで点数化した。評点が大きいほどしわが深いことを示す。 各群の平均値および標準偏差を算出し、 結果を図 5に示す。
Vehicleのスコアが平均値で 1. 17であるのに対して、 TAPI- 1は 0. 43、 4-メト キシベンゾヒドロキサム酸は 0. 91であり、 それら ADAM活性阻害物質はいずれも Vehicleと比較して有意なしわ抑制効果を示した。
次に、 マウス背部のレプリカをしわ解析装置 (浜野エンジニアリング) を用い て解析し、 しわ面積 (%) を算出した。 しわ面積のパーセンテージが低いほどし わ形成が抑制されていることを表す。 結果を図 6に示す。
図 6より明らかなように、 TAPI-1 および 4-メ トキシベンゾヒドロキサム酸の しわ面積(%) の平均値は Vehicleよりも有意に低く、 それら ADAM活性阻害物質 は高いしわ抑制効果を示した。
これらの結果から、 ADAM活性阻害物質である TAPI-1および 4-メ トキシベンゾ ヒドロキサム酸は、 ADAM酵素を阻害することにより表皮増殖因子である HB- EGF の遊離を抑制し、 しわを防止または改善し得ることが示唆された。

Claims

請求の範囲 皮膚に存在する ADAM ( isintegrin §nd etalloprotease)の活性を阻害 する物質からなるしわ防止または改善剤。
2 . 前記 ADAMが ADAM - 9、 ADAM- 10または ADAM - 17であることを特徴とする請求 項 1記載のしわ防止または改善剤。
3 . 皮膚に存在する ADAMの活性を阻害する物質を皮膚に適用することを含む、 しわを防止または改善する方法。
4 . 前記 ADAMが ADAM- 9、 ADAM- 10または ADAM - 17であることを特徴とする請求 項 3記載の方法。
5 . しわの防止または改善における ADAMの活性を阻害する物質の使用。
6 . しわを防止または改善するための組成物の製造における ADAMの活性を阻害 する物質の使用。
7 . 前記組成物が化粧料であることを特徴とする請求項 6記載の使用。
8 . ヒ トまたは動物の皮膚、 皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、 前記 皮膚、組織または細胞における ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを検出し、 ADAM の酵素活性または遺伝子発現レベルを指標として被験物質の抗しわ効果を 評価することを含む、 抗しわ効果の評価方法。
9 . 前記 ADAMが ADAM- 9、 ADAM- 10または ADAM-17であることを特徴とする請求 項 8記載の方法。
1 0 . 表皮角化細胞を用いることを特徴とする請求項 8または 9記載の方法。
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