WO2006041214A1

WO2006041214A1 - Ａｄａｍ活性阻害物質によるしわの防止または改善

Info

Publication number: WO2006041214A1
Application number: PCT/JP2005/019266
Authority: WO
Inventors: Yukiko Matsunaga; Satoshi Amano; Yuki Ogura
Original assignee: Shiseido Company, Ltd.
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2005-10-13
Publication date: 2006-04-20
Also published as: CN101039650B; JP2006137744A; KR20070072519A; CN101039650A; JP4777738B2; CN102156189A; EP1810656A4; HK1113739A1; TWI354564B; TW200628173A; EP1810656A1; US20080319084A1

Abstract

皮膚に存在するADAM(a　disintegrin　and　metalloprotease)の活性を阻害する物質からなるしわ防止または改善剤。皮膚に存在するADAMの活性を阻害する物質を皮膚に適用してしわを防止または改善する。皮膚、組織または細胞におけるADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを指標として被験物質の抗しわ効果を評価する。

Description

ADAM活性阻害物質によるしわの防止または改善技術分野

本発明は、 ADAM活性阻害物質を用いたしわの防止または改善、ならびに ADAM 活性阻害を指標とした抗しわ効果の評価方法に関するものである。

背景技術

年をとるにつれて皮膚老化の 1つの現象としてしわが増加するが、美容等の観点から特に女性においてしわの防止明および改善に対する関心が非常に高まっている。しわは、その発生部位や発生メカニズム等によって、大じわ、小じわ、およびちりめんじわに大きく分類される。大じゎ書は主に光老化によって額や首の後ろ等に生じる深いしわであり、小じわは目尻や口元に生じる比較的浅いしわであり、またちりめんじわは老人の腹部等の非露光部に生じるひだ状のしわである。

これまで、しわについての研究は主に光老化によって生じる大じわについて行われ、光老化による症状の 1つとして扱われてきた。光老化については、発生メ力ェズム等についての研究が進んでおり、また動物モデルゃヒトでの評価系も確立されている。光老化によるしわ形成の抑制の試みは、紫外線による皮膚への悪影響を防止または軽減することによるものがほとんどであり、例えば、紫外線による皮膚への障害を防止するために、酸化チタン、酸化亜鉛、パラメトキシ桂皮酸エステル、パラアミノ安息香酸エステル等の各種の紫外線吸収、散乱、遮蔽物質を配合した化粧料（サンスクリーン、サンプロテクト化粧品）が開発され、使用されている。また、 UV照射により皮膚に生じたフリーラジカルがコラーゲンやエラスチン等の皮膚を構成する線維成分に対する悪影響を及ぼすことが分かっており、酸化防止剤を含む化粧料が提案されている（例えば特表 2 0 0 1— 5 0 8 8 0 9号公報参照）。さらには、 UV暴露によって、コラーゲンやエラスチン等の真皮の結合組織を分解する MMPが誘発され、それによつて真皮の結合組織が破壊されることが皮膚の光老化の 1つの大きな要因であると考えられており、皮膚の光老化を防ぐために、例えば、 UVA遮断剤と、 UVB遮断剤と、レチノイド等の MMP 阻害剤とを配合した皮膚の光老化を抑制するための組成物が提案されている（例えば特表 2 0 0 1— 5 2 0 6 7 7号公報参照）。

一方で、近年、中高年の女性における美容に対する関心の高まりから、加齢に半う表皮角質層の保水能力の低下や表皮脂質の分泌低下による皮脂の減少によつて顕在化する、目尻や口元に生じる小じわに対する関心が高まっている。小じわは、皮膚の乾燥が原因と考えられており、その発生メカニズムや、形態学的、組織学的、または生化学的変化等において、光老化によって生じる大じわとは大きく異なると考えられている。例えば、角質層水分量と小じわの程度に相関性があることがヒトにおいて検証されている（例えば、芋川ら、 Fragrance Journal ; 1992 (11) 29-42参照）。また、不飽和脂肪酸で継続的にバリア機能を破壌すると、表皮性のしわが生じることが報告されている（例えば、正木仁香料会誌； 2001 Vol. 25, No. 1， 34- 38 参照）。しかしながら、そのような小じわを生じた皮膚において、タンパクレベルまたは遺伝子レベルでどのような生化学的変化が生じているかについて十分解明されておらず、小じわの防止および改善は、グリセリン、ソルビトール、植物液エキス等の保湿剤やコラーゲン等を含む化粧料による皮膚の乾燥からの保護による対処に頼らざるを得なかった。保湿剤等による皮膚の乾燥からの保護のみでは、小じわを十分に防止 '改善することはできず、より効果的に小じわを防止■改善することができる物質が強く望まれていた。

本発明は、上記のような事情に鑑み、皮膚における小じわ形成に関与する生化学的変化を解明し、かつその変化を抑制することができる物質を特定し、その物質を用いて、より効果的にしわを防止または改善することを目的とするものである。さらに、本発明は、上記の生化学的変化の抑制を指標として、より効率的かつ簡便に被験物質の抗しわ効果を評価できる方法を提供することを目的とするものである。

発明の開示

本発明者は、ヘアレスマウスにテープストリツビングを繰り返し施すことによる皮膚の継続パリア破壌によって、ヒトの皮膚における小じわと同様の表皮およぴ真皮の変化がマウスの皮膚に生じることを見出し、小じわマウスモデルを作成することに成功した。本発明は、かかる小じわマウスモデルにおいて、 ADAM- 9、 ADAM- 10および ADAM- 17等の、デイスインテグリンとメタ口プロテアーゼドメインを有する ADAM (a disintegrin and metalloprotease)ファミリーに属するタンパク質（以下 ADAMと称する）、さらにはそれら ADAMによって細胞膜からの遊離および活性化がなされる HB- EGF (へパリン結合性 EGF様増殖因子； heparin- binding epidermal growth factor-l ike growth factor)および Amphiregul inの表皮における遺伝子発現が亢進していること、さらにはそれら ADAMの阻害剤を塗布することによって、表皮および真皮の肥厚ならびにしわ形成を抑制できることの発見に基づくものである。

ADAM_9、 ADAM- 10および ADAM-17等の ADAMは、皮膚の細胞表面に存在し、皮膚において HB-EGF、 Amphiregul in_N TNF- a TGF- α等の増殖因子を細胞膜から遊離させ活性化させる酵素である。皮膚のバリア破壌によって、皮膚においてそれら ADAMが活性化されまたは発現亢進され、 HB-EGF等の増殖因子の遊離■活性化を促進させ、表皮おょぴ真皮の肥厚を生じさせることが、小じわ形成の 1つの重要な機構であると考えられる。したがって、皮膚における ADAMの活性を抑制することによって、 HB-EGF等の活性亢進を抑えることができ、表皮および真皮の肥厚を抑制して、しわ、特に小じわを防止または改善できると考えられる。図 1に、皮膚における AMM の活性阻害によりしわを防止または改善する機構について説明した概略図を示す。

1つの態様において、本発明は、皮膚に存在する ADAMの活性を阻害する物質からなるしわ防止または改善剤に関するものである。

また、別の態様において、本発明は、皮膚に存在する ADAMの活性を阻害する物質を皮膚に適用することを含む、しわを防止または改善する方法に関するものである。

さらに別の態様において、本発明は、しわの防止または改善における ADAMの活性を阻害する物質の使用に関するものである。

さらに別の態様において、本発明は、しわを防止または改善するための組成物の製造における ADAMの活性を阻害する物質の使用に関するものである。組成物は、限定はされないが、化粧料、医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤であることが好ましく、より好ましくは化粧料である。

皮膚に存在する ADAMとして、例えば ADAM- 9、ADAM- 10、ADAM- 1²、ADAM- 15、ADAM- 17 およぴ ADAM- 19等が挙げられ、特に ADAM- 9、 ADAM- 10およぴ ADAM- 17は、細胞増殖因子の遊離■活性化に深く関与していることが分かっている。

本明細書において、「ADAMの活性を阻害する」とは、 ADAMの酵素活性を阻害するのみならず、遺伝子の発現やタンパク質生成を阻害する等、皮膚における ADAM の活性を低下させる任意の作用を含む。

さらに別の態様において、本発明は抗しわ効果の評価方法に関するものであり、ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、前記皮膚、組織または細胞における ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを検出し、 ADAM の酵素活性または遺伝子発現レベルを指標として被験物質の抗しわ効果を評価することを含む。

ADAMとして、例えば ADAM - 9、 ADAM - 10または ADAM- 17等が挙げられる。

例えば、皮膚細胞、特に表皮角化細胞を用いることによって、迅速かつ効率的に多数の被験物質の抗しわ効果を評価することができる。

本明細書において、「抗しわ効果」とは、しわの形成を防止し、または形成されたしわを改善する任意の効果を意味する。

ADAM の活性を阻害する物質を皮膚に適用することによって、 ADAM-9、 ADAM - 10 および ADAM- 17等の皮膚に存在する ADAMの活性を阻害して、皮脂の減少や洗顔等の様々な要因によって生じる皮膚のバリア破壌によって誘起される表皮および真皮における HB- EGF等の増殖因子の遊離■活性化を抑制し、表皮や真皮の肥厚を抑えることができ、非常に効果的にしわ、特に小じわを防止または改善することが可能である。

また、本発明の ADAM活性阻害を指標とした評価方法によって、効率的かつ簡便に、高い効果を有する抗しわ物質を特定することが可能である。

図面の簡単な説明

図 1は、表皮における ADAMの活性阻害によりしわを防止または改善する機構について説明した概略図である。

図 2は、テープストリツビングを施したマウス皮膚のレプリカ画像（図 2 A)、および皮膚組織切片を HE (へマトキシリンーェォジン）染色したものの顕微鏡写真（図 2 B ) である。図 3は、小じわマウスモデルにおける、 ADAM_9、 ADAM- 17、 HB-EGF、および Amphiregul inの遺伝子発現の変化を示す。

図 4は、小じわマウスモデルにおいて、各薬剤を塗布した皮膚のレプリカ画像 (図 4 A：)、および皮膚組織切片を HE (へマトキシリンーェォジン) 染色したものの顕微鏡写真（図 4 B ) である。

図 5は、視感判定での ADAM活性阻害物質の抗しわ効果を示すグラフである。図 6は、しわ面積（％) での ADAM活性阻害物質の抗しわ効果を示すグラフである。 ―

発明を実施するための最良の形態

ADAMは、接着と細胞外タンパク質分解という 2つの特性を有する多機能性タンパク質で、 30種類以上のフアミリーが存在するが、今尚その数は増加している。 ADAM は、様々な動物おょぴ組織において発現されており、皮膚に存在する ADAM として、例えば ADAM - 9、 ADAM- 10、 ADAM_12、 ADAM_15、 ADAM-17 および ADAM- 19 等が挙げられる。特に、 ADAM_9、 ADAM-10および ADAM-17は、細胞増殖因子の遊離■活性化に深く関与していることが分かっている。

本発明において用いることができる ADAMの活性を阻害する物質は、皮膚において ADAMの活性を低下させるものであれば特に限定されず、例えば、 ADAMの酵素活性を阻害する物質、 ADAM遺伝子の発現やタンパク質生成を阻害する物質等、任意のものを含む。またそれらは動植物由来物のような天然のものであっても、あるいは合成のものであっても差し支えない。

そのような ADAM の活性を阻害する物質として、限定はされないが、例えば TAPI-1 、 ~ (R) - (2- (Hydroxyaminocarbonyl) methyl) - 4- Methylpentanoyl- L- Nal- L- Alanine 2_ Aminoethyl amide； Immunex_s Seattle^ WA)、およひ 4 -メ卜キシベンゾヒドロキサム酸 (4-Methoxybenzohydroxami c acid) 等力列示される。限定はされないが、本発明の ADAMの活性を阻害する物質からなるしわ防止または改善剤は、好ましくは皮膚外用剤において使用する。

皮膚外用剤において、上記 ADAMの活性を阻害する物質を 1種単独でまたは 2種以上を組合せて配合して差し支えない。また、皮膚外用剤におけるそれら物質の配合量は、その使用態様や製品形態等によって異なり特に限定はされないが、例えば、皮膚外用剤全量に対して、好ましくは 0. 001質量％から 10質量％、より好ましくは 0. 005質量％から 5質量％、さらに好ましくは 0. 01質量％から 1質量％である。. - - ―

本明細書において、「皮膚外用剤」は、化粧料、医薬品、医薬部外品等を含む。また、その剤型も、水溶液系、可溶化系、乳化系、油液系、ゲル系、ペースト系、軟膏系、エアゾール系、水一油 2層系、水一油一粉末 3層など、任意の剤型を含む。また、シート状基剤に担持されたものも含む。

また、皮膚外用剤の採り得る製品形態および用途も任意であり、例えば、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフエーシャル、ボディまたは頭皮用の外用剤として用いることが可能である。

皮膚外用剤は、 ADAMの活性を阻害する物質の他に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる他の任意の成分を必要に応じて適宜配合し、目的とする剤形に応じて常法により製造することが出来る。例えば、上記の ADAMの活性を阻害する物質と、下記成分の 1種または 2種以上とを配合して皮膚外用剤を調製できる。

紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸（以下 PABAと略す）、 PABA モノグリセリンエステル、 , N-ジプロポキシ PABAェチルエステル、 N， N-ジェトキシ PABAェチルエステル、 N, N -ジメチル PABAェチルエステル、 N, N -ジメチル PABA プチルエステル、 N， N -ジメチル PABAメチルエステル等の安息香酸系紫外線吸収剤、ホモメンチル- N- ァセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、アミルサリシレート、メンチルサリシレート、ホモメンチルサリシレート、オタチルサリシレート、フエニルサリシレート、ベンジルサリシレート、 p-イソプロパノールフエ-ルサリシレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤、ォクチルシンナメート、ェチル -4-イソプロピルシンナメート、メチル _2， 5-ジイソプロピルシンナメート、ェチル -2， 4 -ジイソプロピルシンナメート、メチル- 2， 4 -ジイソプロピルシンナメート、プロピル -p-メトキシシンナメート、イソプロピル- p-メトキシシンナメート、イソァミル- p-メトキシシンナメート、ォクチル- p-メトキシシンナメート（2- ェチルへキシル -P -メトキシシンナメート）、 2-エトキシェチル- p - メトキシシンナメート、シクロへキシノレ- p- メトキシシンナメート、ェチノレ- _α _ シァノ― ]3 -フエニルシンナメート、 2 -ェチノレへキシル - a -シァノフエニルシンナメート、グリセリルモノ- 2 -ェチルへキサノィル-ジパラメトキシシンナメート、トリメトキシ桂皮酸メチルビス（トリメチルシロキサン）シリルイソペンチル等の桂皮酸系紫外線吸収剤、 ³- (4' -メチルベンジリデン）- d , 1_カンファー、 3- ベンジリデン- d, 1-カンファー、ゥロカ-ン酸、ゥロカニン酸ェチルエステノレ、 2- フェ二ノレ- 5-メチノレべンゾキサゾーノレ、 2， 2' -ヒドロキシ -5 -メチノレフェ二ノレべンゾトリァゾーノレ、 2- (2，-ヒドロキシ- 5，- 1-ォクチルフエ-ル）ベンゾトリァゾール、 2-（2， -ヒドロキシ- 5， _メチルフエニルベンゾトリァゾール、ジベンザラジン、ジァニソィルメタン、 4 -メトキシ- 4' - 1 -プチルジベンゾィルメタン、 5 -（3， 3-ジメチル- 2-ノルボル二リデン） -3-ペンタン- 2_オン、ジモルホリノピリダジノン等が挙げられ、任意の 1種または 2種以上を用いることができる。

紫外線散乱剤としては、酸化チタン、微粒子酸化チタン、酸化亜鉛、微粒子酸化亜鉛、酸化鉄、微粒子酸化鉄、酸化セリウムなどの粉末が挙げられる。

これら紫外線散乱剤は、通常、針状、紡錘状、球状、粒状の粉末が使用される。また、粒子径が 0. Ι μ ιη以下の微粒子粉末が好ましい。

メチルハイドロジエンポリシロキサンゃシランカツプリング剤などのシリコーン処理；金属石験処理；パーフルォロアルキルリン酸ジエタノールアミン塩ゃパ一フルォロアルキルシラン等のフッ素処理、デキストリン脂肪酸エステル処理等により、疎水化処理した紫外泉散乱剤も好ましい。

液体油脂としては、例えば、アポガド油、ツバキ油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリープ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦芽油、サザン力油、ヒマシ油、アマ-油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カャ油、コメヌ力油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン等が挙げられる。

固体油脂としては、例えば、カカオ脂、ヤシ油、馬脂、硬化ヤシ油、パーム油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、パーム核油、豚脂、牛骨脂、モクロウ核油、硬化油、牛脚脂、モクロウ、硬化ヒマシ油等が挙げられる。

ロウ類としては、例えば、ミツロウ、カンデリラロウ、綿ロウ、カルナウバロゥ、べィベリー口ゥ、ィボタロウ、鯨ロウ、モンタンロウ、ヌカロウ、ラノリン、カポックロウ、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ラウリン酸へキシル、還元ラノリン、ジョジョバロウ、硬質ラノリン、セラック口ゥ、 P0Eラノリンアルールエーテル、 P0Eラノリンアルコールアセテート、 P0E コレステロールエーテル、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、 P0E水素添加ラノリンアルコールエーテル等が挙げられる。

炭化水素油としては、例えば、流動パラフィン、ォゾケライト、スクヮラン、プリスタン、パラフィン、セレシン、スクヮレン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス、ポリエチレンワックス、フィッシャートロプッシュワックス等が挙げられる。

高級脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベへニン酸、ォレイン酸、ゥンデシレン酸、トール酸、リノール酸、リノレイン酸、エイコサペンタエン酸（EPA)、ドコサへキサェン酸（DHA) 等が挙げられる。

高級アルコールとしては、例えば、直鎖アルコール（例えば、ラウリルアルコ一ノレ、セチノレアノレコーノレ、ステアリノレアノレコースレ、ベへニノレアノレコーノレ、ミリスチルアルコール、ォレイルアルコール、セトステアリルァノレコール等）；分枝鎖ァルコール (例えば、モノステアリルグリセリンエーテル（バチルアルコール）、 2- デシノレテトラデシノーノレ、ラノリンァノレコーノレ、コレステロ一ノレ、フィトステロール、へキシルドデカノール、オタチルドデカノール等）等が挙げられる。

合成エステル油としては、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸ォクチルドデシル、パルミチン酸ィソプロピル、ステアリン酸プチル、ラウリン酸へキシル、ミリスチン酸ミリスチル、ォレイン酸デシル、ジメチルォクタン酸へキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、ステアリン酸ィソセチル、ィソステアリン酸ィソセチル、 12-ヒドロキシステアリン酸コレステリル、ジ- 2-ェチルへキサン酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸 N-アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジィソステアリル、ジ- 2-へプチルゥンデカン酸グリセリン、トリ- 2-ェチルへキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステァリン酸トリメチロールプロパン、テトラ- 2-ェチルへキサン酸ペンタエリスリトール、トリ- 2-ェチルへキサン酸グリセリン、トリオクタン酸グリセリン、トリイソパノレミチン酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セチル 2 -ェチルへキサノエート、 2-ェチルへキシル—パルミテート、トリミリスチン酸グリセリン、トリ- 2 -へプチルゥンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、ォレイン酸ォレイル、ァセトグリセライド、パルミチン酸 2-へプチノレゥンデシル、アジピン酸ジイソプチル、 N -ラウロイル - L-グルタミン酸- 2 -ォクチルドデシルエステル、ァジピン酸ジ -2-ヘプチルゥンデシル、ェチルラゥレート、セパシン酸ジ—2-ェチルへキシル、ミリスチン酸 2-へキシルデシル、パルミチン酸 2-へキシルデシル、アジピン酸 2-へキシルデシル、コハク酸 2-ェチルへキシル、タエン酸トリエチル、ポリオキシエチレン 'ポリオキシプロピレンランダム重合体メチルエーテル等が挙げられる。

シリコーン油としては、例えば、鎖状ポリシロキサン（例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフエ-ルポリシロキサン、ジフエ二ルポリシロキサン等）；環状ポリシロキサン (例えば、ォクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシク口へキサシロキサン等）、 3次元網目構造を形成しているシリコーン樹脂、シリコーンゴム、各種変性ポリシロキサン (ァミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等）等が挙げられる。

その他には、例えば、ポリエチレングリコール，グリセリン、 1, 3-プチレングリコール，エリスリトール，ソルビトール，キシリトール，マルチトール等の保湿斉 IJ ；セノレロース，ヒドロキシェチノレセノレロース，ヒドロキシプロピノレセノレロース，メチルヒドロキシプロピルセルロース，メチルセルロース，カノレポキシメチノレセノレロース，クィンスシード，カラギーナン，ぺクチン，マンナン，カードラン，コンドロイチン硫酸，デンプン，ガラクタン，デルマタン硫酸，グリコーゲン，アラビアガム，へパラン硫酸，ヒアルロン酸，ヒアルロン酸ナトリウム，トラガントガム，ケラタン硫酸，コンドロイチン，キサンタンガム，ムコイチン硫酸，ヒドロキシェチルダァガム，力ルポキシメチルダァガム，グァガム，デキストラン，ケラト硫酸，ローカストビーンガム，サクシノグルカン，カロニン酸，キチン，キトサン，力ルポキシメチルキチン，寒天等の増粘剤、エタノール等の低級アルコール；プチルヒドロキシトルエン，トコフエロール，フィチン等の酸化防止剤；安息香酸，サリチル酸，ソルビン酸，パラォキシ安息香酸アルキルェステル，へキサクロ口フェン等の抗菌剤；ァシルサルコシン酸（例えばラウロイルサルコシンナトリウム）、グルタチオン、クェン酸，リンゴ酸，酒石酸，乳酸等の有機酸；ビタミン A及びその誘導体、ビタミン B 6塩酸塩，ビタミン B 6 トリパルミテート，ビタミン B 6ジォクタノエート，ビタミン B 2及びその誘導体，ビタミン B 1 2，ビタミン B 1 5及びその誘導体等のビタミン B類、ァスコルビン酸，ァスコルビン酸硫酸エステル（塩），ァスコルビン酸リン酸エステル（塩），ァスコルビン酸ジパルミテート等のビタミン C類、ひ一トコフエロール， /3—トコフエロール， δ—トコフエロール，ビタミン Εアセテート等のビタミン Ε類、ビタミン D類、ビタミン Η、パントテン酸、パンテチン等のビタミン類；ニコチン酸アミド、ェコチン酸べンジノレ、 γ一オリザノーノレ、アラントイン、グリチノレリチン酸（塩）、グリチルレチン酸及びその誘導体、ヒノキチオール、ビサボロール、ユーカルプトーン、チモール、イノシトール、サイコサポニン、ニンジンサポニン、へチマサポニン、ムクロジサポニン等のサポニン類、パントテニノレエチノレエーテノレ、ェチニノレエストラジオ一ノレ、トラネキサム酸、アルブチン、セファランチン、プラセンタエキス等の各種薬剤、ギシギシ、クララ、コゥホネ、ォレンジ、セージ、ノコギリソゥ、ゼニァオイ、センプリ、タイム、トウキ、トウヒ、ノーチ、スギナ、へチマ、マロニエ、ユキノシタ、ァノレエ力、ユリ、ョモギ、シャクャク、アロエ、クチナシ、サワラ、セィヨウサンザシエキス、セィヨウオトギリソゥエキス、アイリス 'インエキス、ァセンャクエキス、ィチヨゥ葉エキス、イブキジヤコゥエキス、ウイキヨウエキス、ウーロン茶エキス、ウォーターリリ一エキス、ェィジツエキス、ェンメイソゥエキス、ォゥゴンエキス、才ゥ/ タエキス、ォドリコソゥエキス、カンゾゥエキス、クチナシエキス、紅茶エキス、セイカリユウエキス、トノレメンチラエキス、バラエキス、へチマエキス、ペパーミントエキス、ローズマリーエキス、ローヤノレゼリーエキス等の植物の抽出物、色素、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、セスキォレイン酸ソビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキセチレンソルビタン、ポリエチレングリコールモノォレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリグリコ^"/レジエーテル、ラウロイルジェタノールァマイド、脂肪酸イソプロパノールァマイド、マルチトールヒドロキシ脂肪酸エーテル、アルキル化多糖、アルキルダルコシド、シュガーエステル等の非イオン性活性剤、ステアリルトリメチルアンモ-ゥムク口ライド、塩化ベンザルコニゥム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン性界面活性剤、パルミチン酸ナトリゥム、ラウリン酸ナトリウム、ラウリル酸ナトリゥム、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールァミンエーテル、口ート油、リニアドデシルベンゼン硫酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油マレイン酸、ァシルメチルタウリン等のァニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、中和剤、 δ —トコフエロール、プチルヒドロキシトルエン等の酸化防止剤、フエノキシェタノール、パラベン等の防腐剤が挙げられる。

本方法において、上記の ADAMを阻害する物質は、皮膚への適用が可能でかつ本発明の目的を達成できる限り、任意の形態で皮膚に適用することができ、また単独で適用しても、あるいは他の任意の成分と共に配合して適用してもよい。また適用する皮膚の場所も限定されず、頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。限定はされないが、本発明の方法は、好ましくは美容方法として用いられる。本発明の抗しわ効果の評価方法は、ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織または細胞に被験物質を接触させる工程を含む。

本方法で用いることができるヒトまたは動物の皮膚は、本発明の目的を達成できる限り特に限定はされないが、例えば、皮膚にテープストリッビングを施して皮膚の角質層を剥離したヘアレスマウスの皮膚を用いることができる。ヘアレスマウスの皮膚にテープストリッビングを施すことによって皮膚の角質層を剥離して皮膚のバリアを継続的に破壊すると、小じわがマウスの皮膚に生じ、かつ ADAM-9、 ADAM- 10およぴ ADAM-17等の ADAMの酵素活性または遺伝子発現が亢進される。 ADAMの活性の亢進によって、 HB- EGF等の増殖因子の遊離■活性化が促進されて表皮および真皮の肥厚が生じることが、小じわ形成の 1つの原因であると考えられる。従って、本発明の評価方法において、例えば、そのような継続バリア破壊によって亢進された ADAM の遺伝子発現を低下させる物質を特定することによって、抗しわ物質を効率的に特定できると考えられる。本方法において用いる皮膚細胞は、皮膚の表皮部分を形成する上皮系細胞であり、表皮角化細胞等の表皮細胞、皮脂腺細胞、乳腺細胞、小腸上皮細胞、その他の粘膜上皮細胞等を例示すること-ができる。これらの中でも、表皮細胞の一つである表皮角化細胞（ケラチノサイト）は、培養細胞の入手が容易であり、かつ、本検出方法が、表皮の状態に関連する発明であることから、表皮角化細胞が、本方法において好適な皮膚細胞である。また、皮膚細胞の提供源はヒトであることが好ましい。さらに、本方法において用いられる皮膚細胞は、培養された細胞を用いることが好ましい。この培養された皮膚細胞は、常法により調製することができる。

例えば、皮膚細胞が、ヒト表皮角化細胞である場合には、形成外科、皮膚科、外科手術等での余剰皮膚片から、脂肪組織や血液を除去し、さらには真皮部分をプロテアーゼ処理等により分離して得たヒト表皮を調製し、このヒト表皮から表皮角化細胞を分離し、 K GM培地等を用いる常法により、初代培養を行うことができる。次に、常法により、ヒト表皮角化細胞の初代培養細胞を、プロテアーゼ等を用いて、継代培養を行い、所望する培養ヒト表皮角化細胞を得ることができる。なお、このような表皮角化細胞は、市販されており、本発明においては、かかる市販品を用いることも可能である。

ADAMの酵素活性の検出は、例えば HB- EGFなどの ADAMの基質が遊離する量を測定することによって行うことができる。

また遺伝子発現レベルの検出は、例えば、 RT- PCRゃノーザンプロット法等を用 Vヽて cDNAを増幅およびまたは測定してもよいし、あるいは ELISAやウェスタンプロット法等を用いてタンパク質を検出および/または測定してもよい。

ADAM の酵素活性または遺伝子発現レベルを指標として被験物質の抗しわ効果を評価する工程は、例えば、被験物質を添加しないかあるいは ADAMの活性に影響を与えないことが分かっている物質を添加した皮膚、組織、細胞等を対照として用い、被験物質を添加した際の ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを、対照における ADAM の酵素活性または遺伝子発現レベルと比較することを含んでいてょレ、。例えば、対照における ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルと比較して、 ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを低下させる被験物質を、抗しわ効果を有する物質（抗しわ物質、あるいはしわ防止または改善剤）として特定することができる。

本発明の抗しわ効果の評価方法の使用態様は特に限定されず、例えば抗しわ物質のスクリーニングゃ評価等において用いることができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

実施例

小じわマウスモデルの作製

皮脂の減少や洗顔等の様々な要因により皮膚のバリアが弱められまたは破壌されて、皮膚表面からの水分蒸散が増加することによって、皮膚が乾燥して小じわが形成されると考えられる。そこで、ヘアレスマウスにおいて、皮膚にテープストリッビングを繰り返し施すことによって、角質層を剥がして皮膚のバリアを破壌して、小じわマウスモデルを作製した。簡単に説明すると、ヘアレスマウス（HR-1_: 雄 6週齢、星野実験動物）の背部左側の皮膚に、経皮水分蒸散量（TEWL) (水分蒸散量測定装置 MEEC0； Meeco社、 USAを用いて測定） 4〜6mg/cm²/hになるように回数を調整しながらセロハンテープを用いてテープストリッビングを施した。通常初回は 4回程度で、最終的には 7〜8回テープストリツビングを操り返した。週 3回、 4週間継続してテープストリッビングを行った。背部右側は未処置のままにした。

図 2に、上記のようにテープストリツビングを施した皮膚のレプリカ画像（図 2 A)、および皮膚組織切片を HE (へマトキシリン一ェォジン）染色したものの顕微鏡写真（図 2 B ) を示す。レプリカ画像（図 2 A) において、テープストリッビング開始 24時間後（24h) および 48時間後（48h) に皮溝が深くなつた後、 1 週間後（1W) には皮溝の方向が一定になり、 4週間後（4W) にはしわ様の外観を示した。また、皮膚組織の顕微鏡写真（図 2 B ) において、未処置（NT) のものと比較して、 24時間後から表皮が肥厚し始め、 2週間後（2W) においても表皮肥厚が維持された。以下の表 1に、上記のように作製した小じわマウスモデルにおける形態学的、組織学的変化等を、 UV照射（10週間）によって作製した光老化マウスモデ^/におけるそれら変化と比較してまとめた。継続バリァ破壊マウスと U V B照射マウスとの比較

上記の方法でテープストリッビングを施したマウスの皮膚は、ヒトの皮膚における小じわと同様の変化を示した。一方で、そのしわの外観や表皮肥厚等において、明ら力に W照射によって作製した光老化マウスモデルとは異なっており、上記の方法によって、光老化による大じゎモデルとは全く異なる、小じわモデルを作製できたことが示唆された。

小じわマウスモデルにおける生化学的変化の検討

上記のように作製した小じわマウスモデルにおいて、表皮および真皮の肥厚が生じており、テープストリツビングによるバリア破壌の刺激によって、表皮および真皮において細胞増殖因子が活性化されていることが予測された。そこで、表皮に存在する細胞増殖因子である HB - EGF、 Araphiregulin, ならびにそれら増殖因子を細胞膜から遊離'活性化させる酵素である ADAM- 9および ADAM- 17の遺伝子発現について検討した。

遺伝子発現量の測定は、 RT- PCR法を用いて行った。上記のように作製した小じわマウスモデルの左側（テープストリツビング処置： T) と右側（未処置： N) から経時的に採取した背部皮膚試料から全 RNAを抽出し、 cD皿を調製後、試験対象の遺伝子に特異的なプライマーを用いて RT- PCRを行った。また同様に、細胞あたりの発現量が一定であるハウスキーピング遺伝子のダリセルアルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH； glyceraldehydes— 3— phosphate— dehydrogenase) についても基準として測定した。

結果を図 3Ίこ示す。 ADAM- 9および ADAM- 17は、それぞれテープストリッビングを施した皮膚の 24時間後、 48時間後においてその遺伝子発現が亢進しており、またそれら ADAMによって遊離 ·活性化される HB - EGFおよび同じ HB - EGFファミリ一に属する Amphiregulinも 24時間後から 1週間後にかけてその遺伝子発現が亢進していた。

小じわマウスモデルにおける各種薬剤塗布による抗しわ効果の検討

次に、以下の表 2に示す各種薬剤を塗布することによる、小じわマウスモデルにおける抗しわ効果について検討した。

表 2

* : N -ヒドロキシ- 2_ [ [ (4 -メトキシフエ二ル）スルホニル] 3-ピコリル]ァミノ] -3- メチノレブタンアミド塩酸塩] (J. Med. Chem. 1997, Vol. 40， p. 2525-2532) 上記の方法でヘアレスマウスにテープストリッビングを施し、各テープストリッビング処置の後に表 2の各薬剤を 100 1ずつ塗布した。図 4に、各薬剤を塗布した皮膚の 1週間後、 2週間後および 4週間後のレプリカ画像（図 4 A)、ならびに 4週間後の皮膚組織切片を HE (へマトキシリン一ェォジン）染色したものの顕微鏡写真（図 4 B ) を示す。また、その結果を、以下の評価基準を用いてまとめたものを表 3に示す。

〇：改善

△：変化なし

X ：悪化小じわマウスモデルにおける各種薬剤の抗しわ効果

ADAM活性阻害物質である TAPI- 1は、小じわマウスモデルにおいてしわ形成を抑制し、また表皮および真皮の肥厚も顕著に抑制した。一方、光老化マウスモデルでしわ形成防止効果を示した MMP 阻害剤である CGS27023A (N-ヒドロキシ _2 - [ [ (4-メトキシフエ-ル）スルホ -ル] 3-ピコリノレ]ァミノ]- 3 -メチルブタンァミド塩酸塩]ひ. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p. 2525- 2532)、ならびに保湿剤であるグリセリンは、小じわマウスモデルでは全くしわ形成を抑制することができず、また表皮および真皮の肥厚も抑制できなかった。さらに、肌荒れ促進作用を有する不飽和脂肪酸のォレイン酸は、しわ形成を促進させ、また表皮および真皮の肥厚も亢進させた。

これらの結果から、保湿剤のみでは小じわを十分に防止または改善することができず、皮膚において ADAMの活性を阻害して増殖因子の遊離■活性化を阻害することによって、表皮や真皮の肥厚を抑制して小じわを効果的に防止または改善し得ることが示唆された。また、光老化マウスモデルでしわ形成抑制効果を示した匪 P阻害剤の CGS27023Aが、小じわマウスモデルではしわ形成を抑制できなかつたことから、本発明における ADAMを阻害する物質によるしわ形成の抑制が、 MMP 阻害剤とは別の機構による作用であることが示唆された。

新規な ADAM活性阻害物質の探索およぴ抗しわ効果の評価

次に、 ADAM活性を阻害する新規な化合物を探索し、小じわマウスモデルにおいてその抗しわ効果を評価した。化合物の配合量は特に断りのない限り質量。 /₀である。 ( 1 ) ADAM活性阻害物質のスクリーニング

まず、 HB- EGF- AP/HT- 1080 (ヒト HB- EGFの N末端に耐熱性アル力リフォスファターゼ（AP) を付加した融合蛋白質を強制的に発現するように改変したヒト線維肉腫由来培養細胞 HT- 1080)を用いて ADAM酵素阻害活性を有する化合物のスクリ一-ングを行った。用いた細胞株 HB- EGF- AP/HT- 1080の細胞表面上にはアルカリフォスファターゼと融合した形で HB- EGF全長分子が発現している。この細胞をホルポールエステルで刺激すると、細胞膜表面上の ADAM酵素が活性化されて HB-EGF 分子を切断する。切断されて遊離型となった HB - EGFにはアル力リフォスファタ一ゼが結合しているため、培養上清中のアル力リフォスファターゼ活性を測定することで化合物の ADAM酵素阻害活性を間接的に測定できる。

具体的には、 2. 0 X 10⁵ cells/ml になるように細胞数を調整した HB - EGF- AP/HT- 1080を 96ゥエル培養用マイクロプレートに 0. 2 ml /we 11ずつ播種し、 37°Cで一晩培養した。培地を除去し PBS (-)で洗浄後、被験物質を含む培地を 0. 1 ml/wellずつ添加し、 37°Cで 30分間インキュベートして前処置した。その後、培養上清を除去し、再度被験物質と 60 nM TPA (ホルボールエステル： 12-^Tetradecanoylphorbol-acetate ; Sigma P8139) を含む培地を 0. 2 ml/well ずつ添加し、さらに 60分間インキュベートして処置した。処置終了後の各ゥエルの培養上清 0. l mlをアル力リフォスファターゼ活性測定用マイクロプレートのゥエルに移し、 65°Cにて 10分間ィンキュベートし、内在性のアル力リフォスファターゼを失活させた。 1 mg/mlの AP基質（^nitrophenylphosphate, Wako ; 141-02341) を 0. 1 ml/wellずつ各ゥエルに添加し、直ちに各ゥルの 405 nmでの吸光度を測定した。遮光して室温にて 2時間インキュベートしたのち、再び各ゥエルの 405 nra での吸光度を測定した。 2時間ィンキュベート後の吸光度から AP基質添加直後の吸光度を減じたものを各ゥエルの吸光度とした。 0%阻害コントロール（TPAのみを含む培地）の吸光度を A0、 100%阻害コントロール（培地のみ）の吸光度を A100、試料の吸光度を ASとし、以下の式により阻害率（％) を算出した：阻害率（％) = (AO- AS)バ AO- A100) * 100 その結果、 4-メトキシベンゾヒドロキサム酸（4 - Methoxybenzohydroxamic acid) に高い HB-EGF遊離抑制効果が認められ、 ADAM活性を阻害することが示唆された。 4ニメトキシベンゾヒドロキサム酸の構造式を以下に示す。またその遊離阻害率を表 4に示す。

4-メトキシベンゾヒドロキサム酸

(4-Methoxybenzohydroxam i c aci d)

表 4

( 2 ) ADAM活性阻害物質の抗しわ効果の評価

次に、小じわマウスモデルを用いて、 ADAM活性阻害物質である TAPI-1および 4 -メトキシベンゾヒドロキサム酸の抗しわ効果について検討した。

ヘアレスマウス（HR_1，雄 6週齢、星野実験動物）の左側背部に経皮水分蒸散量 (TEWL) (水分蒸散量測定装置 MEEC0;Meeco社、 USAを用いて測定）が 4_8mg/cra²/h になるようにテープストリツビングを週 3回、 4週間継続して行い、テープストリッビング処置直後に毎回、 TAPI- 1または 4-メトキシベンゾヒドロキサム酸をそれぞれマウス左側背部に 100 μ ΐずつ塗布した。 4-メトキシベンゾヒドロキサム酸は、 1 %になるように 50%エタノール水溶液に溶解させたものを用いた。また TAPI-1 (ぺプチド研究所）は IraMの濃度で評価した。さらに、陰性対象として 50% ェタノール水溶液 (Vehicle)を同様に塗布した。

4—週間後のしわの発生状況を視感判定によりスコアィ匕-した。しわの発生状況の評価基準は「しわなし； 0」、「うすいしわ； 1」、「明らかなしわ； 2」、「深いしわ； 3」とし、 0. 5刻みで点数化した。評点が大きいほどしわが深いことを示す。各群の平均値および標準偏差を算出し、結果を図 5に示す。

Vehicleのスコアが平均値で 1. 17であるのに対して、 TAPI- 1は 0. 43、 4-メトキシベンゾヒドロキサム酸は 0. 91であり、それら ADAM活性阻害物質はいずれも Vehicleと比較して有意なしわ抑制効果を示した。

次に、マウス背部のレプリカをしわ解析装置（浜野エンジニアリング）を用いて解析し、しわ面積（％) を算出した。しわ面積のパーセンテージが低いほどしわ形成が抑制されていることを表す。結果を図 6に示す。

図 6より明らかなように、 TAPI-1 および 4-メトキシベンゾヒドロキサム酸のしわ面積（％) の平均値は Vehicleよりも有意に低く、それら ADAM活性阻害物質は高いしわ抑制効果を示した。

これらの結果から、 ADAM活性阻害物質である TAPI-1および 4-メトキシベンゾヒドロキサム酸は、 ADAM酵素を阻害することにより表皮増殖因子である HB- EGF の遊離を抑制し、しわを防止または改善し得ることが示唆された。

Claims

請求の範囲皮膚に存在する ADAM ( isintegrin §nd etalloprotease)の活性を阻害する物質からなるしわ防止または改善剤。

2 . 前記 ADAMが ADAM - 9、 ADAM- 10または ADAM - 17であることを特徴とする請求項 1記載のしわ防止または改善剤。

3 . 皮膚に存在する ADAMの活性を阻害する物質を皮膚に適用することを含む、しわを防止または改善する方法。

4 . 前記 ADAMが ADAM- 9、 ADAM- 10または ADAM - 17であることを特徴とする請求項 3記載の方法。

5 . しわの防止または改善における ADAMの活性を阻害する物質の使用。

6 . しわを防止または改善するための組成物の製造における ADAMの活性を阻害する物質の使用。

7 . 前記組成物が化粧料であることを特徴とする請求項 6記載の使用。

8 . ヒトまたは動物の皮膚、皮膚組織または細胞に被験物質を接触させ、前記皮膚、組織または細胞における ADAMの酵素活性または遺伝子発現レベルを検出し、 ADAM の酵素活性または遺伝子発現レベルを指標として被験物質の抗しわ効果を評価することを含む、抗しわ効果の評価方法。

9 . 前記 ADAMが ADAM- 9、 ADAM- 10または ADAM-17であることを特徴とする請求項 8記載の方法。

1 0 . 表皮角化細胞を用いることを特徴とする請求項 8または 9記載の方法。