CN101984066B

CN101984066B - 一种生物法生产l-苯丙氨酸的方法

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Publication number: CN101984066B
Application number: CN201010581049A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 堵国成; 王天文; 胡云
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: CN101984066A

Abstract

本文公开了一种生物法生产L-苯丙氨酸的方法，属于生物工程技术领域。通过在重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)的延滞期控制初始葡萄糖浓度，在对数生长期以一定的细胞比生长速率指数流加葡萄糖，在稳定期恒速流加葡萄糖，有效地降低乙酸对重组大肠杆菌合成L-苯丙氨酸的影响，显著地提高目的产物L-苯丙氨酸的产量。

Description

一种生物法生产L-苯丙氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生物法生产L-苯丙氨酸的方法，具体涉及利用重组大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

近年来，大肠杆菌被广泛地用来发酵生产重组蛋白，氨基酸和其它的一些具有高附加值的生物物质。由于其生产成本低，生产过程简单等优点，工业上主要利用重组大肠杆菌通过发酵来生产L-苯丙氨酸。然而大肠杆菌在发酵中会积累副产物-乙酸，乙酸的形成速率和大肠杆菌的细胞比生长速率或葡萄糖的消耗速率密切相关。通常在分批发酵中，大肠杆菌的生长速率主要由限制性底物-葡萄糖的添加速率所决定：特别地，当大肠杆菌的细胞比生长速率超过临界值时就会快速地生成乙酸。乙酸作为一种副产物能够在很低的浓度（0.5g/L）时就限制菌体的生长和目的产物的合成。并且，乙酸的生成还能使原本用以合成目的产物的碳源导向其它的途径，过量的乙酸还能抑制DNA，RNA，蛋白质和脂类物质的合成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是降低大肠杆菌副产物乙酸对L-苯丙氨酸发酵生产的影响。

为解决上述问题，本发明技术方案如下：1）在延滞期，控制初始培养基中葡萄糖浓度；2）在对数生长期，采用指数流加的方式以一定的细胞比生长速率流加葡萄糖；3）在稳定期，恒速流加葡萄糖。

所述具体方法如下：

1）0-12小时，初始培养基中葡萄糖浓度为20g/L；

2）12-36小时，细胞比生长速率2.0-3.0指数流加葡萄糖；

3）36-62小时，以9-11 g (h·L)^-1流加葡萄糖。

本发明采用的出发菌株为WSH-Z06 (pAP-B03) ，该菌株为重组大肠杆菌。(Zhou, H., X. Liao, T. Wang, G. Du & J. Chen Enhanced l-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheA(fbr) and aroF(wt). Bioresour Technol, 101:4151-6.)

所述对数生长期指数流加的目的在于维持菌体的快速生长和产物的合成，同时控制乙酸的大量分泌，避免乙酸对菌体生长和产物合成的副作用。

所述恒速流加葡萄糖的目的在于维持稳定期L-苯丙氨酸的大量积累，其速率控制在9-11 g (h·L)^-1。

本发明技术原理为：从附图1中可以看出，虽然初始葡萄糖浓度为20 g/L时L-苯丙氨酸的产量较高，但是菌体生物量较低（附图2）；提高初始葡萄糖浓度，虽然生物量明显提高，但是L-苯丙氨酸的产量略为下降。其原因在于，初始葡萄糖浓度〉20 g/L时乙酸含量大幅提高（附图3），而初始葡萄糖浓度为20 g/L时无法满足发酵过程中菌体对碳源的需要（表1）。通过附图4可知，初始葡萄糖浓度为20 g/L时，菌体最大细胞比生长速率为3.0，控制细胞比生长速率在3.0以下可以将乙酸维持在较低的水平同时提供充足的碳源。

表1初始葡萄糖浓度对菌体生物量的影响

初始葡萄糖浓度（g/L）	20	25	30	35
					最大干重（g/L）	13.06	14.02	15.18	15.67

本发明提供的方法可以有效地降低乙酸对重组大肠杆菌合成L-苯丙氨酸的影响，显著地提高目的产物L-苯丙氨酸的产量。

附图说明

图1：初始葡萄糖浓度对L-苯丙氨酸产量的影响

—○—20 g/L ；—△—25 g/L；—▲—30 g/L；—□—35g/L

图2：初始葡萄糖浓度对副产物乙酸分泌的影响

—○—20 g/L；—△—25 g/L；—▲—30 g/L；—□—35g/L

图3：初始葡萄糖浓度对应的细胞比生长速度

A：35g/L ；B：30g/L； C：25g/L； D：20g/L。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐述本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明的具体实验方法，基本上都是补料分批发酵常规的技术手段。

材料和方法：

发酵培养基（g/L）：20.00 葡萄糖，5.00 硫酸铵，3.00 磷酸氢二钾，3.00 七水合硫酸镁，1.00 氯化钠，1.50 柠檬酸三钠，0.015 二水合氯化钙，0.01125七水合硫酸亚铁，0.075 硫胺-盐酸，0.40 L-酪氨酸，3.00 酵母粉，0.04 卡那霉素，1.5mL/L 微量元素溶液。

微量元素溶液成分（g/L）：2.00 十八水合硫酸铝，0.75 七水合硫酸钴，2.50 五水合硫酸铜，24.00 七水合硫酸锰，3.00 二水合钼酸钠，2.50 六水合硫酸镍，15.00 七水合硫酸锌。

葡萄糖补料培养基：700g/L葡萄糖。

指数流加方法方程为

Figure 2010105810492100002DEST_PATH_IMAGE001

，X、S分别为发酵罐中细胞、底物浓度，μ为细胞比生长速率，V为发酵液体积，F为底物流加速率，S _F为补加底物的浓度，Y _X/S为细胞对底物的得率系数，X ₀为培养体系的初始生物量。

葡萄糖测定：葡萄糖在发酵液稀释了一定倍数之后通过葡氨测定仪SBA-40C（山东科学研究院研制）测定。

乙酸的测定：乙酸通过高效液相测定。HPLC条件：：Zorbax SB-Aq 反相柱，柱温：35 ℃，流动相：A为19.7g/LNa₂HPO₃，用H₃PO₄调节pH至2.0，B为乙腈，A，B的混合比例为99:1，流速：1.0mL/min，进样体积：10μL，检测器：210nm。

L-苯丙氨酸的测定：紫外分光光度法测定发酵液中的L-苯丙氨酸。试剂：0.025mol/L的稀盐酸。仪器：2102C---紫外可见光分光光度计。步骤：取50μL样于50mL容量瓶中，用稀盐酸定容至刻度，并摇匀，分别在206nm，208nm，222nm三个波长测吸光值A。同时取50μL 1%的L-苯丙氨酸于50mL，用稀盐酸定容至刻度摇匀，分别在206nm，208nm，222nm三个波长测吸光值A。

计算：用公式ΔA样=A₂₀₆+0.2727A₂₀₈-0.9682A₂₂₂

ΔAL-苯丙氨酸= A₂₀₆+0.2727A₂₀₈-0.9682A₂₂₂

L-苯丙氨酸含量=ΔA样/ΔAL-苯丙氨酸

实施例1细胞比生长速率为0.2

1）0-12小时，控制初始培养基中葡萄糖浓度为20g/L；

2）12-36小时，采用指数流加的方式以细胞比生长速率0.2流加葡萄糖补料培养基；

3）36-62小时，以9 g· (h·L)^-1恒速流加葡萄糖补料培养基。

最终L-苯丙氨酸的产量37.6 g/L。

实施例2细胞比生长速率为0.25

1）0-12小时，控制初始培养基中葡萄糖浓度为20g/L；

2）12-36小时，采用指数流加的方式以细胞比生长速率0.25流加葡萄糖补料培养基；

3）36-62小时，以10 g· (h·L)^-1恒速流加葡萄糖补料培养基。

最终L-苯丙氨酸的产量41.4 g/L。

实施例3细胞比生长速率为0.3

1）0-12小时，控制初始培养基中葡萄糖浓度为20g/L；

2）12-36小时，采用指数流加的方式以细胞比生长速率0.3流加葡萄糖补料培养基；

3）36-62小时，以11g· (h·L)^-1恒速流加葡萄糖补料培养基。

最终L-苯丙氨酸的产量达45.5 g/L。

对比例初糖浓度为20g/L，发酵过程中不补料

初始葡萄糖浓度为20g/L，发酵过程中不补料，最终L-苯丙氨酸的产量为：4.54g/L。

Claims

1.一种生物法生产L-苯丙氨酸的方法，以重组大肠杆菌WSH-Z06为出发菌株，其特征在于，具体步骤如下：

1）0-12小时，初始培养基中葡萄糖浓度为20g/L；

2）12-36小时，按照细胞比生长速率0.3h^-1指数流加葡萄糖补料培养基；

3）36-62小时，以11 g (h·L)^-1恒速流加葡萄糖补料培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖补料培养基浓度为700g/L。