CN104140987A - 恒定ph流加发酵法生产高纯度d-丙氨酸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用恒定pH流加发酵法生产高纯度D-丙氨酸的方法，属生物发酵和化学合成交叉领域。利用本方法可以显著提高D-丙氨酸纯度及产量，并克服现有D-丙氨酸制备方法的缺点。本发明通过下述技术方案予以实现：把自筛的、并经过诱变处理的微生物在适合的条件下培养，在培养基中添加D L-丙氨酸，在旋转式摇床或自控式发酵罐中通入大量空气，通过微生物特异性地消耗D L-丙氨酸中的L-丙氨酸，而余下的D-丙氨酸则被提取出来；在发酵过程中，通过不断流加酸或碱，使培养基中的pH值保持6.0-8.0不变，在发酵一定时间后，放罐取上清液，经活性炭脱色及浓缩后，冷藏结晶，再经过滤及乙醇重结晶进行精制，产品化学纯度和光学纯度高，生产成本低廉。
Description
所属技术领域
本发明涉及D-丙氨酸的生物法制备，尤其是高纯度D-丙氨酸，属于生物发酵和化学合成交叉的领域。
背景技术
D-丙氨酸作为L-丙氨酸光学异构体，存在于大的有机组织中，如作为细胞壁肽壁糖或肽抗生素的组成成分，是一种重要的手性有机化合物。
目前D-丙氨酸主要应用于药物生产和食品添加剂上。
药用上，D-丙氨酸是制药行业进行手性合成的手性原料，主要用于手性药物、药物中间体的合成。目前主要用于生产新型广谱抗生素、D-丙氨醇、多肽等。D-丙氨酸本身也是生产维生素B6的原料。D-丙氨酸具有伯胺基，能竞争性地替代仲胺与亚硝酸盐生成VANS lyke反应，分解为氮气和有机酸，从而抑制了致癌物质二甲基亚硝胺DMNA的生成。因此D-丙氨酸作为一种新的癌基因治疗方法在临床上被应用。
在食品添加剂工业，D-丙氨酸，主要应用于增加化学调味料的调味效果，改善人工甜味剂的味感，改善有机酸的酸味。因为D-丙氨酸本身具有强甜味，味感值是4，是氨基酸中最甜的一种。它可以和L-天冬氨酸合成二肽甜味剂阿力甜(2.2.4.4-tea-methylthietanylamine)。阿力甜甜味品质好，味道纯正，没有异味和不愉快的后味，而且只部分参与机体代谢，其最大的产热量只相当于相当甜度蔗糖的0.02％，符合人们目前对低热食品的追求。在糖尿病人的功能食品上具有重要作用。这些应用为该产品提供了巨大的市场空间。
现在D-丙氨酸的制取方法主要是微生物发酵法和化学合成法。
微生物发酵法可以通过短杆乳酪酵母将D-环丝氨酸生成D-丙氨酸制得。但是产物浓度低，生产周期长，设备投资大，有副反应，分离较复杂、污染大。而且由于丙氨酸的外消旋的活泼性，产物D-丙氨酸的光学纯度比较低。
D-丙氨酸的化学合成方法有两种，一种是利用不对称合成法直接得到D-丙氨酸，另一种是通过化学合成法得到D L-丙氨酸的混旋体，再利用各种光学拆分方法，得到D-丙氨酸。 化学合成法采用多种原料和工艺路线，成本较低，生产规模大，适应于工业化生产。但所得到的产物皆为DL-混型丙氨酸，必须进行光学拆分，才可以得到D-丙氨酸。目前用于分离DL-丙氨酸的方法因步骤多，成本高，工业化比较困难。而且化学合成反应机制复杂，工艺过程长；需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂，生产成本极高。
目前国外工业化生产D-丙氨酸普遍采用“氨基酸酰化酶拆分法”，该法利用的氨基酸价格昂贵，生产成本仍然较高，只能用于小规模工业化生产。
由于D-丙氨酸的生理作用被不断发现，其应用越来越广泛，需要研究开发一种适合大规模工业化、能显著降低生产成本的技术。依据微生物对手性与非手性底物的专一性识别机理，筛选可降解L-丙氨酸的菌种，从DL-混型丙氨酸中降解L-丙氨酸，从而得到D-丙氨酸。本发明也是基于此原理。
目前，自DL-丙氨酸制备D-丙氨酸的研究较少，与我们相类似的专利有3个。一类是利用微生物选择同化法制备(CN02824215.7)，其缺点是伴随L-丙氨酸的同化，L-丙氨酸分解为氨、二氧化碳、草酸、水等，分离液用离子交换树脂进行分离精制，既包括生化过程又包括化学过程，步骤繁多，操作繁琐，不利于工业化大生产。一类是不对称化学转换法制备(CN200610096375)，其缺点是反应机制复杂，工艺过程长，且手性试剂成本极高，不具备工业化应用价值。一类是微生物发酵法制备(CN200610040681.X)，其缺点是没有考虑培养过程中PH值的变化，而PH值的控制对发酵结果影响甚大，而且发酵液中D-丙氨酸分离提取步骤繁琐，操作不易。与本发明相比，首先是菌种的不同，本发明的菌种为自筛，且经过了紫外诱变，产率高；其次是本发明对从发酵液中提取分离D-丙氨酸的方法更加简练，工业使用时操控度更好，得率更高。
发明内容
为了克服工业上制取D-丙氨酸的不足，本发明专利利用化学合成的成本低廉的DL-丙氨酸在恒定Ph下流加发酵生产高纯度D-丙氨酸。
本发明所采用的技术方案是：一种D、L-丙氨酸微生物工业化拆分方法，具体步骤和特征如下：
我们在葡萄园的土壤中筛选到了一株微生物，可快速利用DL-丙氨酸中的L-丙氨酸而对D-丙氨酸利用极少。我们在实验室对本菌株进行了UV诱变，使得它对D-丙氨酸的利用基本为零。通过实验室自控发酵罐和工业化大生产实验，采用低浓度流加酸碱液以中和发酵液， 找出了该微生物发酵生产D-丙氨酸的培养基配方和发酵工艺条件，生产出的D-丙氨酸符合AJI的质量标准，具体如下：
1.种子液制备
斜面培养基采用培养细菌常用的肉汤培养基，液体种子培养基为每100mL培养基含葡萄糖1-5g、尿素2-5g、玉米浆2-6g、KH2PO40.02-0.3g、K2HPO40.02-0.3g、MgSO47H2O0.01-0.3g的自来水配制，pH为7.0-7.5，包扎后，121℃、1×105Pa灭菌30min。
菌种活化：将保存菌种转接，30±5℃斜面培养4天。
种子液制备：500mL摇瓶装量按上述摇瓶培养基配方，接种一环斜面菌种，放入旋转式摇床，转速180r/min，30±5℃培养3天后，得到种子培养液。
摇瓶种子培养：将上述一级种子接入摇瓶种子试验培养基中(接种量按体积比为10％)，放置于摇床在30±5℃规定转速下培养7天。
2.发酵液制备
发酵培养基采用DL-丙氨酸底物培养基，其配方为每100mL培养基含DL-丙氨酸2.5-6g玉米浆1.5-5g、KH2PO40.1-1g、K2HPO40.1-1g、MgSO47H2O0.05-0.5g，pH为7.0-7.5，121℃灭菌30分钟，发酵过程中通过流加酸碱控制恒定pH6.5-7.0，温度30～33度，通气比：1∶0.8，发酵30-72小时结束，放罐获得发酵液。
3、D-丙氨酸提取分离及精制
发酵结束后将发酵液通过离心机离心，去除菌体后，将上清液用活性炭脱色处理，脱色温度60-80℃，脱色到透光98％以上，将脱色液真空浓缩，待有结晶出现后，将浓缩液置于4℃冷却，待大量结晶完成后，进行抽滤，得D-丙氨酸粗品，将此粗品用乙醇浸泡后再次进行抽滤，然后把结晶烘干，就可以得到精制纯品D-丙氨酸。每升上述发酵液可以生产D-丙氨酸500-1800克。产品光学纯度高达99.9％、化学纯度可以达到99.9％；此生产过程因用微生物处理，生产条件温和，能耗小，生产成本低，工业上具有可行性。
离心后的微生物菌体可以反复使用六至八次，此时酶活力已基本失去，再弃去，也可以将菌体固定化后反复使用一到二个月，可大大节约生产成本。
D，L-丙氨酸可以由化学合成法简便地合成，成本低廉，本发明技术方案实现了以成本较低的D，L-丙氨酸为原料，通过微生物转化来简便地制备高纯D-丙氨酸。采用本技术，能使D-丙氨酸的收率在95％以上，相对于底物D，L-丙氨酸，目标产物的得率在47％以上，D-丙氨酸纯度提高了该产品的经济效益。
具体实施方式
实施例如下，用实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例中使用的原料是旋光度为零的DL-丙氨酸。
实施例1：
调配发酵培养基：采用DL-丙氨酸底物培养基，其配方为每100mL培养基含DL-丙氨酸1.5g、玉米浆1.5g、KH2PO40.1g、K2HPO40.1g、MgSO47H2O0.05g，pH为7.0-7.5，121℃灭菌30分钟，冷却后，接入斜面菌种，每个250毫升三角烧瓶中，装入100毫升发酵液，共十瓶，发酵过程中通过流加酸碱控制恒定pH6.5-7.0，摇床转速180rpm，温度30度，发酵32小时结束，放罐获得发酵液。
将收获的1L发酵液离心后，取上清液加热到60℃，加入1g活性碳脱色30分钟后抽滤。将滤液真空浓缩至有结晶出现，再将浓缩液冷却至4℃，待结晶完全后，用抽滤法分离结晶出的D-丙氨酸粗品7g，粗品浸泡于150毫升工业酒精中，抽滤，结晶烘干即得纯品6.6g，产品光学纯度99.9％，化学纯度99.5％。
实施例2
调配发酵培养基：采用DL-丙氨酸底物培养基，其配方为每100mL培养基含DL-丙氨酸2.5g、玉米浆3g、KH2PO40.3g、K2HPO40.3g、MgSO47H2O0.15g，pH为7.0-7.5，121℃灭菌30分钟，冷却后，接入斜面菌种，每个1000毫升三角烧瓶中，装入500毫升发酵液，共二瓶，发酵过程中通过流加酸碱控制恒定pH6.5-7.0，摇床转速180rpm，温度30度，发酵40小时结束，放罐获得发酵液。
将收获的1L发酵液用实施例1中的方法进行分离精制，得D-丙氨酸精制品11.5g，产品光学纯度99.9％，化学纯度99.7％。
实施例3
调配培养基：采用1L三角瓶和10L液体发酵罐进行种子培养和发酵工业生产，种子培养基为每100mL培养基含葡萄糖2g、尿素3g、玉米浆4g、KH2PO40.1g、K2HPO40.1g、MgSO47H2O0.1g，用自来水配制，调pH为7.0-7.5，每个1000毫升三角烧瓶中，装入500毫升发酵液，包扎后，121℃、1×105Pa灭菌30min。冷却后，接入菌种后，33℃培养24小时后接入发酵罐进行培养。
配制含DL-丙氨酸底物的发酵培养基7L，每100mL培养基含DL-丙氨酸3g、玉米浆4g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO47H2O0.3g，pH为7.0-7.5，121℃灭菌30分钟，冷却后，接入培养好的种子液，发酵过程中通过流加酸碱控制恒定pH6.5-7.0，温度30度，通气比为1∶0.8，发酵30小时结束，放罐获得发酵液。
将收获的发酵液用实施例1中的方法进行分离精制，得D-丙氨酸精制品145g，产品光学纯度99.9％，化学纯度99.8％。
Claims (6)
1.一种恒定pH流加发酵法生产高纯度D-丙氨酸的制备技术，其步骤如下：
1)将在种子液体培养基中培养好的菌种以体积比5-15％的接种量转接到含D，L-丙氨酸的发酵培养基中；
2)在本菌种适宜的培养条件下：温度20-37℃，摇床转速100-200rpm，或自控发酵罐中进行有氧发酵培养15-36h，流加酸碱进入培养基，使发酵罐中培养基的pH值控制在6-8之间；
3)将发酵液离心所得的上清液用活性炭脱色，再经旋转蒸发浓缩至合适浓度，冷藏结晶，过滤后再用乙酵浸洗，重结晶。
2.根据权利要求1所复述的恒定pH流加发酵法生产高纯度D-丙氨酸的制备技术，其特征在于所述的菌种为自筛的菌种，并经过了UV诱变。
3.根据权利要求1所述的恒定pH流加发酵法生产高纯度D-丙氨酸的制备技术，其特征在于用于所述经培养的种子菌种的培养基组成为：每100mL培养基含葡萄糖1-5g、尿素2-5g、玉米浆2-6g、KH2PO40.02-0.3g、K2HPO40.02-0.3g、MgSO47H2O0.01-0.3g的自来水配制，pH为7.0-7.5。
4.根据权利要求1所述的恒定pH流加发酵法生产高纯度D-丙氨酸的制备技术，其特征在于所述经培养的种子菌种的培养方法为：装液量50-100mL/250mL三角瓶，接种量为一根长满的试管斜面，培养箱温度为25-37℃，摇床转速为100-200r/min。
5.根据权利要求1所述的恒定pH流加发酵法生产高纯度D-丙氨酸的制备技术，其特征在于所述的发酵培养基组成为：每100mL培养基含DL-丙氨酸2.5-6g玉米浆1.5-5g、KH2PO40.1-1g、K2HPO40.1-1g、MgSO47H2O0.05-0.5g，pH为7.0-7.5。
6.根据权利要求1所述的恒定pH流加发酵法生产高纯度D-丙氨酸的制备技术，其特征在于发酵培养时装液量为50-150mL/250mL三角瓶，150-250mL/500mL三角瓶，400-600mL/1000mL三角瓶，接种量均为体积比5-15％，摇床转速为100-200r/min，培养箱温度为25-35℃。
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