CN101979586B - 分离的荧光素酶及其用途 - Google Patents

分离的荧光素酶及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101979586B
CN101979586B CN2010105056541A CN201010505654A CN101979586B CN 101979586 B CN101979586 B CN 101979586B CN 2010105056541 A CN2010105056541 A CN 2010105056541A CN 201010505654 A CN201010505654 A CN 201010505654A CN 101979586 B CN101979586 B CN 101979586B
Authority
CN
China
Prior art keywords
luciferase
lual
pcdna3
dna
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN2010105056541A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101979586A (zh
Inventor
S·戈尔茨
B·卡尔托夫
S·马科瓦
L·弗兰克
E·维索特斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer Schering Pharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Schering Pharma AG filed Critical Bayer Schering Pharma AG
Publication of CN101979586A publication Critical patent/CN101979586A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101979586B publication Critical patent/CN101979586B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90241—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)

Abstract

本发明涉及荧光素酶LuAL、Lu164和Lu22的核苷酸和氨基酸序列，以及它们的活性和用途。

Description

分离的荧光素酶及其用途
本申请是国际申请日为2001年11月22日的国际申请PCT/EP 01/13597进入中国、申请号为200510118849.X的题为“分离的荧光素酶及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及荧光素酶LuAL、Lu164、Lu16、Lu39、Lu45、Lu52和Lu22的核苷酸和氨基酸序列以及它们的活性和用途。
背景技术
荧光素酶
发光表示发射可见光谱范围内的光子，这种发射是通过激发发光分子产生的。与荧光不同，这种光的能量不是以较短波长的辐射形式从外部提供的。
在化学发光和生物发光之间存在差别。化学发光表示一种化学反应，这种反应导致分子受到激发，当被激发的电子回到基态时，该分子自身发出光线。如果该反应是由酶催化时就叫做生物发光。参与所述反应的酶通常被称为荧光素酶。
有关发光生物的综述可以参见Hastings等1995。
荧光素酶是过氧化物酶或单加氧酶和双加氧酶。形成所述发光产物的原始物质的酶底物被称为荧光素。不同物种之间的荧光素有所不同。所述系统的量子产率为0.1-0.9个光子/转化底物分子(Idelgaufts，1993)。
可以根据其来源或酶促特性对荧光素酶进行分类。下面提供了某些类型荧光素酶的概述：
细菌荧光素酶
Figure BSA00000301305400011
表1：细菌荧光素酶
Coelenterazine-依赖型真核荧光素酶
Figure BSA00000301305400021
表2：Coelenterazine-依赖型真核荧光素酶
Coelenterazine-非依赖型真核荧光素酶
Figure BSA00000301305400031
表3：Coelenterazine-非依赖型真核荧光素酶
还可以根据某些荧光素酶的底物专一性区分各种荧光素酶。最重要的底物包括Coelenterazine(Jones等1999)和荧光素，以及这两种物质的衍生物。下面示出了这两种底物及其通过荧光素酶进行的转化的示意图：
荧光素酶底物
下面通过举例形式示出了某些荧光素酶底物及其转化。本文所示出的所有底物是通过酶促转化的，同时释放出光和二氧化碳(CO2)并且消耗氧气(O2)。所述反应对辅因子或能量载体(例如，对于萤火虫荧光素酶来说是ATP)的依赖性是酶专一性的。
Coelenterazine
Figure BSA00000301305400032
     Coelenterazine                             Coelenteramide
水母蛋白在将Coelenterazine转化成Coelenteramide时，会发出波长为470纳米的光线。
荧光素
             荧光素                              羟基荧光素
萤火虫荧光素在将荧光素转化成羟基荧光素时，会发出波长为560纳米的光线。
Vargula-荧光素
Figure BSA00000301305400042
        Vargula-荧光素                             Vargula-羟基荧光素
Vargula荧光素酶在将Vargula荧光素转化成Vargula-羟基荧光素时会发出波长为460纳米的光线。
报导系统
报导基因或指示基因通常是一种基因，其基因产物可以通过简单的生物化学或组织化学方法方便地检测到。至少有两种类型的报导基因是可以区别的。
1.抗性基因。抗性基因是一种基因，其表达会使细胞产生对抗生素或其他物质的抗性。在缺乏该抗性基因时，所述抗生素或其他物质在生长培养基中的存在会导致细胞死亡。
2.报导基因。在基因工程技术中，报导基因的产物是作为融合的或未融合的指示剂使用的。最常见的报导基因包括β-半乳糖苷酶(Alam等1990)，碱性磷酸酶(Yang等1997；Cullen等1992)，荧光素酶和其他发光蛋白(Shinomura，1985；Phillips GN，1997；Snowdowne等，1984)。
Metridia longa物种的分类
节肢动物门→甲壳纲→挠足亚纲
Metridia longa种属于甲壳纲，特别是挠足亚纲或浮游动物。
发明内容
分离cDNA
为了研究Metridia longa种的生物发光活性，从白海(Biologische Station Kartesh，俄罗斯)获得样品，并且保存在液氮中。为了制备Metridia longa的cDNA库，通过Krieg(Krieg等1996)的方法使用异硫氰酸盐分离RNA。
进行RT-PCR以便制备cDNA。为此，按照以下方案将10微克RNA与逆转录酶(Superscribt Gold II)一起培养：
PCR    1.    30秒钟    95℃
       2.    6分钟     68℃
       3.    10秒钟    95℃
       4.    6分钟     68℃
在步骤3之后进行步骤4，进行17个循环
为了使聚合酶失活，在37℃下用蛋白酶K培养反应产物30分钟，并且用乙醇使cDNA沉淀。将cDNA溶解在水中，并且在37℃用SfiI培养1小时。对反应产物进行凝胶过滤，以便分离出小片段。然后将分离的cDNA连接到SfiI裂解过的并且脱磷酸化的λTriplEx2载体上。然后为了制备λ噬菌体表达库，使用体外包装系统中的SMART cDNA库构建试剂盒(Clontech)将克隆的cDNA片段包封到λ噬菌体中。
通过实施库筛选鉴定含有具有表达Colenterazin依赖型荧光素酶的潜力的cDNA插入片段的重组噬菌体。
为此，将由大肠杆菌XL1-Blue得到的菌苔铺平铺到90毫米的培养皿上，并且在37℃下培养10小时。然后每个培养皿用2500个噬菌体感染，然后在37℃下培养8小时，以便形成噬菌斑。然后将培养皿在4℃下保存1小时，以便使软的琼脂糖变硬。
为了进行复制铺板，用大肠杆菌XL1-Blue悬浮液饱和硝酸纤维素膜并且干燥。将干燥的膜在噬菌斑上放置60秒，然后铺放在新的琼脂糖平板上。然后在37℃下培养所述琼脂糖平板2小时，并且添加4毫升SOB培养基(+10mM MgSO4，0.2％麦芽糖)。分离菌苔，重新悬浮在LB培养基中(+20mM IPTG)，并且在37℃下培养1小时。通过离心收获细菌，并且通过超声波破碎，在添加Coelenterazin之后，在发光计中测定生物发光活性。
将能产生阳性生物发光信号的培养皿划分成多个扇区，并进行新的复制铺板。连续进行复制铺板，直到鉴定了活性个体噬菌斑。为了亚克隆阳性噬菌斑的噬菌体cDNA插入片段，按照SMART cDNA库构建试剂盒的生产商的方法在大肠杆菌BM25.8中的pTriplEx2载体中进行。在含有浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的LB培养基中在37℃下培养pTriplEx2-cDNA转染过的大肠杆菌过夜。为了获得超量表达，用LB培养基将过夜培养物按1∶150倍稀释，并且在37℃下培养1小时。然后通过添加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至20mM的浓度进行培养。将诱导的培养基在37℃下培养1小时，并且通过离心收获细菌。通过在0.5毫升SM缓冲液中超声处理破碎所述细胞。在添加10微升Coelenterazin(10-4M，溶解在甲醇中)之后在发光计中测定化学发光。
鉴定了具有Coelenterazine依赖性荧光素酶活性的三种荧光素酶。所述荧光素酶被命名为Lu164、LuAL和Lu22。下面将详细披露所述荧光素酶。
本发明还涉及这三种荧光素酶的功能性等同物。功能性等同物是具有可比较的底物范围的荧光素酶，这种荧光素酶是分泌的并且具有至少70％的同源性。优选80％或90％的同源性。特别优选95％的同源性。
荧光素酶适合用作细胞系统的报导基因，特别是用作受体、离子通道、转载体、转录因子或诱导系统的报导基因。
可以将荧光素酶用于细菌系统中，例如，用于效价测定或用作生物化学系统，特别是蛋白酶的底物。
荧光素酶还可以用作与抗体或其他蛋白连接的报导酶，例如，用于ELISA，用于免疫组织化学或用于Western印迹。
可以将荧光素酶用于BRET(生物发光共振能量转移)系统。
荧光素酶还适合用作融合蛋白，用于进行共聚焦显微分析，或用于分析蛋白-蛋白相互作用。
荧光素酶还可用作与生物素、NHS，CN-Br或其他结合介体连接的报导酶，例如，用于ELISA或用于固定化。
另外，可以将荧光素酶用作与DNA或RNA寡核苷酸连接的报导酶，例如，用于Northern和Southern印迹或用于实时PCR。
本发明还涉及作为野生型或标记蛋白纯化荧光素酶，并且涉及荧光素酶在体外翻译系统中的应用。
本发明涉及一种DNA或RNA分子，它们具有Seq.ID NO.：1；Seq.ID NO.：3；Seq.ID NO.：5；Seq.ID NO.：7；Seq.ID NO.：8；Seq.ID NO.：9；或Seq.ID NO.：10的序列，其中所述序列包括位于该序列5’端的功能性启动子。
本发明还涉及重组DNA或RNA载体，其中上述分子作为重组DNA或RNA载体的一部分。
本发明还涉及包含所述载体的生物。
本发明还涉及一种寡核苷酸，它包括与上述DNA或RNA序列相同或互补的10个以上的连续核苷酸。
核苷酸和氨基酸序列
LuAL
荧光素酶LuAL是分子量为23.7kDa，等电点为8.32的蛋白。其编码核苷酸序列为：
5`atggatatgagggttatctttgctcttgttttctcatcattggttcaggccaaatcaactgaattcgatccta
acattaacattgttggtttagaaggaaaatttggtataacaaaccttgagacggatttattcacaatatgggaga
caatggatgtcatcaaatcagatattacagatactgatagagtcagcaactttgttgcaactgaaaccgatgcta
accgtgggaaaatgcctggcaaaaaactgccactggcagttatcatggaaatggaagccaatgctttcaaagctg
gctgcaccaggggatgccttatctgtctttcaaaaataaagtgtacagccaaaatgaaggtgtacattccaggaa
gatgtcatgattatggtggtgacaagaaaactggacaggcaggaatagttggtgcaattgttgacattcccgaaa
tctctggatttaaggagatggcacccatggaacagttcattgctcaagttgatctttgcgctacctgcactactg
gatgtctcaaaggtcttgccaatgttaagtgctctgaactcctgaagaaatggctgcctggcagatgtgcaagtt
ttgctgacaagattcaaaaagaagttcacaatatcaaaggcatggctggagatcgttga 3`
它能产生以下氨基酸序列：
MDMRVIFALVFSSLVQAKSTEFDPNINIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMDVIKSDITDTD
RVSNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPG
RCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMAPMEQFIAQVDLCATCTTGCLKGLANVKCS
ELLKKWLPGRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
和以下氨基酸组成：
Ala：18(8.3％) Cys：10(4.6％) Asp：14(6.4％) Glu：12(5.5％)
Phe：10(4.6％) Gly：19(8.7％) His：2(0.9％)  Ile：18(8.3％)
Lys：21(9.6％) Leu：15(6.9％) Met：10(4.6％) Asn：8(3.7％)
Pro：7(3.2％)  Gln：5(2.3％)  Arg：7(3.2％)  Ser：9(4.1％)
Thr：15(6.9％) Val：14(6.4％) Trp：2(0.9％)  Tyr：2(0.9％)
Lu164
荧光素酶Lu164是分子量为23.8kDa，等电点为7.81的蛋白。其编码核苷酸序列为：
5`atggatataaaggttgtctttactcttgttttctcagcattggttcaggcaaaatcaactgaattcgatccta
acattgacattgttggtttagaaggaaaatttggtataacaaaccttgagacggatttattcacaatatgggaga
caatggaggtcatgatcaaagcagatattgcagatactgatagagccagcaactttgttgcaactgaaaccgatg
ctaaccgtggaaaaatgcctggcaaaaaactgccactggcagttatcatggaaatggaagccaatgctttcaaag
ctggctgcaccaggggatgccttatctgtctttcaaaaataaagtgtacagccaaaatgaaggtgtacattccag
gaagatgtcatgattatggtggtgacaagaaaactggacaggcaggaatagttggtgcaattgttgacattcccg
aaatctctggatttaaggagatggcacccatggaacagttcattgctcaagttgaacgttgcgcttcctgcacta
ctggatgtctcaaaggtcttgccaatgttaagtgctctgaactcctgaagaaatggctgcctgacagatgtgcaa
gttttgctgacaagattcaaaaagaagttcacaatatcaaaggcatggctggagatcgttga 3`
它能产生以下氨基酸序列：
MDIKVVFTLVFSALVQAKSTEFDPNIDIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMEVMIKADIADT
DRASNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIP
GRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMAPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKC
SELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
并且具有以下氨基酸组成：
Ala：21(9.6％)  Cys：10(4.6％) Asp：15(6.8％) Glu：13(5.9％)
Phe：10(4.6％)  Gly：18(8.2％) His：2(0.9％)  Ile：18(8.2％)
Lys：22(10.0％) Leu：14(6.4％) Met：10(4.6％) Asn：7(3.2％)
Pro：7(3.2％)   Gln：5(2.3％)  Arg：7(3.2％)  Ser：8(3.7％)
Thr：14(6.4％)  Val：14(6.4％) Trp：2(0.9％)  Tyr：2(0.9％)
Lu22
荧光素酶Lu22是分子量为20.2kDa，等电点为7.89的蛋白。其编码核苷酸序列为：
5`atgggagtcaaacttatttttgctgttgtttgtgtcgcagttgcccaggctgccacaattcaggaaaattttg
aagacattgatcttgtagccataggtggcagctttgcatcagatgttgatgctaacagaggtggacatggtggac
atcctggcaaaaagatgccaaaagaagtacttatggaaatggaagccaatgctaaacgagctggctgccacaggg
gttgtctggtttgtctgtcacacatcaagtgcacagcacaaatgcagaagtttatcccaggaagatgccatagtt
atgcaggagacaaggattctgctcagggaggaattgccggtggtgccattgttgatatacctgaaattgccggat
ttaaagaaatgaagcccatggaacagttcattgctcaagttgatctctgtgaagattgcacaactggatgcctca
aaggtcttgccaatgttcattgctctgatctcctgaagaagtggctgccatcaagatgtaagacatttgcttcca
aaattcaatctcaagtggataccatcaaaggtttggctggagatcgttga 3`
它能产生以下氨基酸序列：
MGVKLIFAVVCVAVAQAATIQENFEDIDLVAIGGSFASDVDANRGGHGGHPGKKMPKEVLME
MEANAKRAGCHRGCLVCLSHIKCTAQMQKFIPGRCHSYAGDKDSAQGGIAGGAIVDIPEIAG
FKEMKPMEQFIAQVDLCEDCTTGCLKGLANVHCSDLLKKWLPSRCKTFASKIQSQVDTIKGL
AGDR
并且具有以下氨基酸组成：
Ala：21(11.1％) Cys：11(5.8％)  Asp：12(6.3％) Glu：9(4.7％)
Phe：7(3.7％)   Gly：21(11.1％) His：6(3.2％)  Ile：13(6.8％)
Lys：16(8.4％)  Leu：12(6.3％)  Met：7(3.7％)  Asn：4(2.1％)
Pro：6(3.2％)   Gln：9(4.7％)   Arg：6(3.2％)  Ser：9(4.7％)
Thr：6(3.2％)   Val：13(6.8％)  Trp：1(0.5％)  Tyr：1(0.5％)
在序列表中也示出了上述序列。
荧光素酶的酶促活性和生物化学表征
蛋白LuAL、Lu164和Lu22是在转化Coelenterazin时能发出光线的酶。因此，它们属于荧光素酶。荧光素酶可以在细菌和真核细胞中有效表达。在真核细胞中表达的荧光素酶LuAl、Lu164和Lu22是分泌型的，不会发生与细菌表达相关的分泌。
荧光素酶的活性是温度依赖型的。测定荧光素酶LuAL和Lu164的最佳温度分别为22℃(LuAL)和27℃(Lu164)。荧光素酶Lu22活性的最佳温度为4℃或更低。
具体实施方式
实施例
质粒/结构
用于制备下文所披露的结构的载体是购自Clontech公司的载体pcDNA3.1(+)和pTriplEx2，以及载体pASMplr(具有cAMP-敏感型启动子元件的固有结构；cre)。所述载体的衍生物被命名为pcDNA3-x、pTriplEx2-x和pASM-x。
LuAL
图1表示载体pTriplEX2-LuAL、pcDNA3-LuAL和pASM-LuAL的质粒图谱。
图2表示载体pTriplEX2-Lu164、pcDNA3-Lu164和pASM-Lu164的质粒图谱。
图3表示载体pTriplEX2-Lu22、pcDNA3-Lu22和pASM-Lu22的质粒图谱。
作为Lu164底物的Coelenterazin衍生物
为了鉴定Lu164的底物，在每一种情况下将10微升不同的Coelenterazin衍生物(10-4M)的溶液与来自CHO-pcDNA3-Lu164细胞系的10微升上清液一起培养，并且测定发光。Coelenterazine获自Molecular Probes(USA)。
荧光素酶LuAL和Lu22与荧光素酶Lu164相比没有差别。确定未修饰过的Colenterazin(图B，Coelenterazin a)是Lu164、LuAl和Lu22的最佳底物。
图4表示作为Lu164的潜在底物的Coelenterazin衍生物和在发光计(RLU，相对光学单位)中以8.7kV的电压测定发光30秒所获得的曲线；以及Coelenterazin衍生物的分子结构示意图。
荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22依赖于Coelenterazin的酶促活性
细菌表达
细菌表达是通过用表达质粒pTriplEX2-Lu164、pTriplEX2-LuAL和pTriplEX2-Lu22转化细菌在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行的。在37℃下，在LB培养基中培养转化过的细菌3小时，通过添加IPTG至1mM的最终浓度诱导表达4小时。通过离心收获诱导过的细菌，重新悬浮在PBS中，并且通过超声波破碎。将Coelenterazin(10-4M，溶解在甲醇中)或荧光素(萤火虫荧光素)添加到5微升裂解物(5mg/ml)中，并且测定化学发光。
所述测定，用RLU(相对发光单位)表示，是在9.5kV的电压下进行30秒。所测定的Lu164、LuAL和Lu22的值分别为230000、320000和260000RLU。所述表达是使用载体pTriplEx2-Lu164、pTriplEx2-LuAL和pTriplEx2-Lu22在大肠杆菌BL21(DE3)中进行的。
真核表达
在瞬时实验中，通过用表达质粒pcDNA3-Lu164、pcDNA3-LuAL和pcDNA3-Lu22转染细胞影响在CHO细胞中的组成型真核表达。为此，在96孔微量滴定板的每个孔中接种10000个悬浮在DMEM-F12培养基中的细胞，并且在37℃下培养过夜。转染是用Fugene 6试剂盒(Roche)按照生产商的说明进行的。转染过的细胞在37℃下，在DMEM-F 12培养基中培养过夜。在添加Coelenterazin(10-4M，溶解在甲醇中)之后，在室温下，用发光计以9.5kV的电压测定培养基(5微升)和细胞裂解物(5微升)中的化学发光30秒。
所测定的Lu164、LuAL和Lu22的值分别为680000、670000和510000RLU(相对发光单位)。所述表达是使用载体pcDNA3-Lu164、pcDNA3-LuAL和pcDNA3-Lu22在CHO细胞中进行的。
荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22的发光光谱
为了测定发光光谱，用质粒pTriplEx2-Lu164、pTriplEx2-LuAL和pTriplEx2-Lu22转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并且按照下面的3.1部分所披露的方法进行超量表达。将50微升Coelenterazin(10-4M)添加到100微升体积的细菌裂解物中，并且测定发光光谱。荧光素酶的发光光谱曲线如下文所示。
对于荧光素酶LuAL、Lu164和Lu22来说，通过所述的底物转化所产生的最大发光发生在大约490纳米的波长下。
图5表示在细菌表达之后荧光素酶Lu164(A)、LuAL(B)和Lu22(C)的发光光谱(RLU，相对发光单位)。
荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22从CHO细胞中的分泌，以Lu164和LuAL为例
为了表征荧光素酶LuAL、Lu164和Lu22在真核细胞中的表达，用质粒pcDNA3-LuAl、pcDNA3-Lu164、pcDNA3-Fireluc和pcDNA3.1(+)稳定转染CHO细胞。所得到的克隆在DMEM-F12培养基中培养。将萤火虫荧光素酶用作非分泌型荧光素酶的阳性对照。将质粒pcDNA 3.1(+)用作对照质粒，检测CHO亲本细胞中的潜在内源活性。
为了检测荧光素酶的分泌，将2000个细胞平铺到384孔微量滴定板上。在24小时之后，取出培养基，并且用Tyrode溶液洗涤细胞，并且添加30微升新的培养基。对于萤火虫荧光素酶来说，在添加5微升Coelenterazin(10-4M)或荧光素之后，用发光计以9.5kV的电压首次测定(0小时)30秒。在经过1-5小时之后进行1-5小时的测定。
图6表示培养基中荧光素酶活性随着时间的提高。没有分泌萤火虫荧光素酶。荧光素酶LuAL、Lu164和Lu22是分泌型荧光素酶。
图6表示在用pcDNA3-LuAL、pcDNA3-Firefly、pcDNA3-Lu164和pcDNA3作为对照载体的无cDNA插入片段的转染之后CHO细胞培养基(5微升)中的荧光素酶活性(RLU，相对发光单位；h是小时；Firefly：萤火虫荧光素酶)。
荧光素酶活性对温度的依赖性
为了测定荧光素酶Lu22、Lu164和LuAL对温度的依赖性，用载体pcDNA3-Lu22、pcDNA3-Lu164和pcDNA3-LuAL瞬时转染CHO细胞，并且在0-47℃下测定上清液中的荧光素酶活性。为此，让细胞上清液和Coelenterazin溶液适应测定温度5分钟。测定是在发光计中以9.5kV的电压进行30秒。
图7表示所测定的荧光素酶LuAl、Lu164和Lu22依赖于温度的发光情况。LuAL的荧光素酶活性的最佳温度为27℃。对于Lu164最佳温度为22℃和对于Lu22所测定的最佳温度为4℃或更低。
图7表示在用pcDNA3-LuAL、pcDNA3-Firefly和pcDNA3-Lu164转染之后CHO细胞培养基(5微升)中的温度依赖型荧光素酶活性(RLU：相对发光单位；培养基：DMEM-F12+10％FCS)
在CHO细胞中诱导荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22表达，以LuAL为例
在瞬时实验中，通过用表达质粒pASM-LuAL转染细胞在CHO细胞中诱导真核表达。为此，在96孔微量滴定板的每个孔中接种10000个悬浮在DMEM-F12培养基中的细胞，并且在37℃下培养过夜。用Fugene6试剂盒(Roche)按照生产商的说明进行转染。转染过的细胞在37℃下，在DMEM-F12培养基中培养过夜。然后用毛喉萜(Forskolin)(10-5M)诱导所述细胞5小时。在添加Coelenterazin(10-4M，溶解在甲醇中)之后，用发光计以9.5kV的电压测定培养基和细胞裂解物的化学发光30秒。
图8表示LuAL在CHO细胞中的诱导表达。在37℃下用毛喉萜(10-5M)诱导表达5小时。测定10微升细胞上清液中的活性(RLU：相对发光单位；诱导因子：诱导过的RLU与未诱导过的RLU的比例)
在细胞系统中用荧光素酶Lu164、LuAL和Lu22作为报导基因，以报导体NPY2和A2A为例，并且使用LuAL作为报导基因
为了能够分析受体专一性配体在基于细胞的系统中对G蛋白结合受体的激活作用，将荧光素酶LuAL的cDNA序列克隆到表达载体pASMplr中。表达载体pASMplr含有cAMP-敏感型启动子元件(CRE)，它能够间接测定cAMP的细胞内浓度。在该系统中，荧光素酶被用作报导基因。
以G蛋白结合受体NPY2(神经肽受体2)和A2A(腺苷受体2a)为例说明了在细胞系统中将荧光素酶Lu22、Lu164和Lu22用作报导基因的用途。为此，用载体pcDNA3-NPY2或pcDNA3-A2A对稳定克隆CHO-pASM-LuAL进行瞬时转染。受体NPY2是Gi结合受体，A2A受体是Gs结合受体。
通过添加1μM NECA活化A2A受体4小时。在存在10-5M毛喉萜的条件下，通过添加10μM NPY2肽活化NPY2受体。在添加Coelenterazin(10-4M)之后用发光计以9.5kV的电压测定培养基(30微升)中的荧光素酶活性30秒。
图9表示将荧光素酶用作细胞系统的报导基因的用途，以G蛋白结合受体A2A和NPY2为例(RLU：相对发光单位)。
附图说明
图1：载体pTriplEX2-LuAL、pcDNA3-LuAL和pASM-LuAL的质粒图谱。
图2：载体pTriplEX2-Lu164、pcDNA3-Lu164和pASM-Lu164的质粒图谱。
图3：载体pTriplEX2-Lu22、pcDNA3-Lu22和pASM-Lu22的质粒图谱。
图4：作为Lu164的潜在底物的Coelenterazin衍生物。
A.在发光计(RLU，相对光学单位)中以8.7kV的电压测定发光30秒所获得的曲线；
B.Coelenterazin衍生物的分子结构示意图。
图5：在细菌表达之后荧光素酶Lu164(A)、LuAL(B)和Lu22(C)的发光光谱(RLU，相对发光单位)。
图6：在用pcDNA3-LuAL、pcDNA3-Firefly、pcDNA3-Lu164和pcDNA3作为对照载体的无cDNA插入片段的转染之后CHO细胞培养基(5微升)中的荧光素酶活性(RLU，相对发光单位；h是小时；Firefly：萤火虫荧光素酶)。
图7：在用pcDNA3-LuAL、pcDNA3-Firefly和pcDNA3-Lu164转染之后CHO细胞培养基(5微升)中的温度依赖型荧光素酶活性(RLU：相对发光单位；培养基：DMEM-F12+10％FCS)。
图8：LuAL在CHO细胞中的诱导表达。在37℃下用毛喉萜(10-5M)诱导表达5小时。测定10微升细胞上清液中的活性(RLU：相对发光单位；诱导因子：诱导过的RLU与未诱导过的RLU的比例)。
图9：将荧光素酶用作细胞系统的报导基因的用途，以G蛋白结合受体A2A和NPY2为例(RLU：相对发光单位)。
参考文献/专利文献
Apley EC，Wagner R，Engelbrecht S.，以36kDa的分子纯化形式快速制备铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶的方法，，Anal Biochem.1985Oct；150(1)：145-54.
Berestovskaya NG，Shaloiko LA，Gorokhovatsky AY，Bondar VS，Vysotski Es，Maximov JE，von Doehren H，Alakhov YB.活性发光蛋白obelin在无细胞翻译系统中的共翻译形成：翻译过程的直接超高灵敏测定。Anal Biochem.1999 Mar 1；268(1)：72-8.
Bonin等Photinus pyralis荧光素酶。Gene.1994141：75-77
Alam J，Cook JL.报导基因：用于研究哺乳动物基因转录。AnalBiochem.1990 Aug 1；188(2)：245-54
Cullen Bryan R.，Malim Michael H.，作为真核报导基因的分泌型胎盘碱性磷酸酶。Methods in Enzymology.216：362ff
Hastings，Cell Physiology：Source book，Sperelakis N.(ed.)，Academic press，pp 665-681，1995
Head JF，Inouye S.Teranishi K，Shimomura O.，在2.3埃分辨率下发光蛋白水母蛋白的晶体结构。Nature.2000 May 18；405(6784)：372-6.
Gould S.，Suresh S.，作为分子和细胞生物学工具的萤火虫荧光素酶。Anal.Biochem.1988，161：501-507
Idelgaufts H.，来自A-Z的重组DNA技术。VCH Verlag，Weinheim，1993
Inouye S.Noguchi M，Sakaki Y，Takagi Y，Miyata T，IwanagaS.Miyata T，Tsuji FI.发光蛋白水母蛋白的克隆和cDNA序列分析。Proc Natl Acad Sci USA 1985 May；82(10)：3154-8
Inouye，S.，Kakoi，H.，Goto，T.，Tetrahedron Lett.，34，2971-2974(1976)
Inouye，S.，Watanebe，H.，Nakamura，H.and Shimomura，O.，FEBS letters 481(2000)19-25
Jones Keith，Hibbert Frank，Keenan Martine.Glowingjellyfish，发光和被称为coelenterazine的分子。Tibtech.1999.17：477ff
Kendall Jonathan M.，Badminton Michael N.进入激动人心的新纪元的Aequoria victoria生物发光。Tibtech.199816：216
Krieg，S.，Castles，C.，Allred，D.，Benedix，M.，Fuqua S.，分子空气干燥冷冻切片的RNA用于RT-PCR和示差展示。Biotechniques.1996Sep；21(3)：425-8.
Lorenz WW，McCann RO，Longiaru M，Cormier MJ.，编码Renillareniformis荧光素酶的cDNA的分离和表达。Proc Natl Acad Sci USA.1991May 15；88(10)：4438-42.
Lorenz WW，Cormier MJ，O′Kane DJ，Hua D，Escher AA，SzalayAA.，在哺乳动物细胞中表达Renilla reniformis荧光素酶基因。JBiolumin Chemilumin.1996 Jan-Feb；11(1)：31-7.
Mathews J.C.等，rernilla reniformis荧光素酶的纯化和特性。Biochemistry.1977，16(1)：85-91
Matveev SV，Lewis JC，Daunert S.，在肽测定中将遗传工程obelin用作生物发光标记。Anal Biochem.1999May 15；270(1)：69-74.
Phillips GN.绿色荧光蛋白的结构和动力学。Curr Opin StructBiol.1997 Dec；7(6)：821-7
Sala-Newby等，重组萤火虫荧光素酶的表达。Biochem Soc.Transact.1992，20：143S
Shimomura O，Johnson FH.，生物发光蛋白水母蛋白的特性。Biochemistry.1969 Oct；8(10)：3991-7.
Shimomura O.，海洋中的生物发光：发光蛋白系统。Symp Soc ExpBiol.1985；39：351-72.
Shimomura O，Teranishi K.，与coelenterazine的发光相关的发光。Luminescence.2000 Jan-Feb；15(1)：51-8.
Snowdowne KW，Borle AB.在哺乳动物细胞中用水母蛋白测定无细胞质的钙。Am J Physiol.1984 Nov；247(5 Pt 1)：C 396-408.
Thompson EM，Nagata S.Tsuji FI.，来自海洋贝类Vargulahilgendorfii的荧光素酶cDNA的克隆和表达。Proc Natl Acad Sci USA.1989 Sep；86(17)：6567-71.
Thompson EM，Nagata S.Tsuji FL，Vargula hilgendorfii荧光素酶：用于监测哺乳动物细胞中基因表达的分泌型报导酶。Gene.1990 Dec 15；96(2)：257-62.
Ungrin MD，Singh LM，Stocco R，Sas DE，Abramovitz M.，用于G-蛋白结合受体的基于水母蛋白的自动化钙功能测定。AnalBiochem.1999 Jul 15；272(1)：34-42.
Webster JJ，Chang JC，Manley ER，Spivey HO，Leach FR.，影响通过萤火虫荧光素酶进行ATP分析的缓冲液。Anal Biochem.1980Jul 15；106(1)：7-11.
Yang Te-Tuan，Sinai Parisa，Kitts Paul A.Kain Seven R.，用分泌型碱性磷酸酶报导系统进行的基因表达的定量。Biotechnique.199723(6)1110ff
JP 05064583，Tora，(TORAY IND Inc.)，用抗原、抗体、半抗原或激素等修饰过的荧光素酶-它是从Vargula hilgendorfii中分离的，可用于生物发光分析。
JP 08027200，Tora，(TORAY IND Inc.)，包括与IgG结合结构域融合的荧光素酶的蛋白-可以用作化学发光免疫测定的诊断试剂
JP 09187281，Kikk，(KIKKOMAN Corp.)，抗体-萤火虫荧光素酶融合蛋白-和相关的产物，即萤火虫荧光素酶融合基因，重组DNA及其制备
US 5196524，Gustafson G.；Ingolia T.；Kirchner G.；RobertsJ.，(Lilly&Co)，编码具有细菌荧光素酶活性的融合蛋白的重组DNA-包括从特殊的天然生物发光细菌中分离的lux A和B基因的编码区，以及特定限制酶识别位点的DNA接头
US 5418155，Milton J.，Cornier；William W.Lorenz，分离的Renilla荧光素酶及其使用方法
US 5422266，Cormier MJ.；Prasher D.，(UNIV GEORGIA RES FOUNDINC)，编码apo：水母蛋白的DNA-可用于重组生产apo：水母蛋白，在化学和生物化学测定中它是生物发光标记。
US 5670356，Sherf B.；Wood K.(Promega Corp)，修饰过的萤火虫荧光素酶基因-编码细胞质形式的荧光素酶
US 5798441 Cormier M.J.；Prasher D.，(UNIV GEORGIA RES FOUNDINC)，新分离的apo水母多肽-可以用作生物/化学测定的发光标记WO 0020619，Alan P.；Liu Jingxue，分泌型renilla荧光素酶WO 9520653，Renard JP；Thompson E.M.；Thompson E.，(INRAINST NAT RECH AGRONOMI QUE)，用Vargula荧光素酶基因作为标记检测转基因胚胎-可以在胚泡阶段鉴定这种胚胎，以及含有该基因的转基因动物，胚胎和细胞系
WO 9938999，Roelant C.(Packard Instr.Co.Inc.)，通过检测样品发光检测renilla荧光素酶的存在。
Figure ISA00000301305600051
Figure ISA00000301305600061
Figure ISA00000301305600071
Figure ISA00000301305600081

Claims (6)

1.一种编码荧光素酶的DNA分子或其对应的RNA分子，其中所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。
2.一种重组DNA或RNA载体，其包含权利要求1的DNA或RNA分子。
3.权利要求2的重组DNA或RNA载体，包括位于所述DNA或RNA分子5’方向的功能性启动子。
4.一种包含权利要求2所述载体的微生物。
5.一种肽，它是由权利要求1的DNA或RNA分子编码的。
6.权利要求1的DNA或RNA分子作为细胞系统报导基因的用途。
CN2010105056541A 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途 Expired - Lifetime CN101979586B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10058091A DE10058091A1 (de) 2000-11-23 2000-11-23 Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung
DE10058091.2 2000-11-23

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB018194338A Division CN1303214C (zh) 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101979586A CN101979586A (zh) 2011-02-23
CN101979586B true CN101979586B (zh) 2012-08-08

Family

ID=7664340

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200510118849XA Expired - Lifetime CN1847399B (zh) 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途
CN2010105056541A Expired - Lifetime CN101979586B (zh) 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途
CN2012102094057A Pending CN102732537A (zh) 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途
CNB018194338A Expired - Lifetime CN1303214C (zh) 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200510118849XA Expired - Lifetime CN1847399B (zh) 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012102094057A Pending CN102732537A (zh) 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途
CNB018194338A Expired - Lifetime CN1303214C (zh) 2000-11-23 2001-11-22 分离的荧光素酶及其用途

Country Status (19)

Country Link
US (4) US7297483B2 (zh)
EP (1) EP1339853B1 (zh)
JP (2) JP4179877B2 (zh)
KR (1) KR100841808B1 (zh)
CN (4) CN1847399B (zh)
AT (1) ATE335824T1 (zh)
AU (3) AU2002220697A1 (zh)
BR (2) BRPI0115534B1 (zh)
CA (1) CA2429451C (zh)
DE (2) DE10058091A1 (zh)
DK (1) DK1339853T3 (zh)
ES (1) ES2271111T3 (zh)
HK (3) HK1096423A1 (zh)
IL (2) IL155878A0 (zh)
MX (1) MXPA03004539A (zh)
PL (1) PL206385B1 (zh)
PT (1) PT1339853E (zh)
WO (2) WO2002042469A1 (zh)
ZA (1) ZA200303928B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10058091A1 (de) 2000-11-23 2002-06-06 Bayer Ag Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung
DE102007005804A1 (de) * 2007-02-06 2008-08-07 Bayer Healthcare Ag Sekretierte Luziferase Lu164M3 und deren Verwendung
DE102007005803A1 (de) 2007-02-06 2008-08-07 Bayer Healthcare Ag Sekretierte Luziferase MLuc7 und deren Verwendung
JP5605727B2 (ja) 2010-04-06 2014-10-15 Ｊｎｃ株式会社 セレンテラジン類縁体及びセレンテラミド類縁体
US10428317B2 (en) 2010-12-03 2019-10-01 Gene Stream Pty Ltd Light-emitting molecules
US8435777B1 (en) 2012-01-20 2013-05-07 Cayla CPG-free gene for a new secreted reporter protein
US10533231B2 (en) 2012-10-26 2020-01-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Artificial bioluminescent enzyme
JP6132350B2 (ja) * 2012-10-26 2017-05-24 国立研究開発法人産業技術総合研究所 人工生物発光酵素
EP2932267B1 (en) * 2012-12-12 2020-05-06 Promega Corporation Recognition of cellular target binding by a bioactive agent using intracellular bioluminescence resonance energy transfer
WO2015056762A1 (ja) * 2013-10-18 2015-04-23 独立行政法人産業技術総合研究所 人工生物発光酵素に用いるための発光基質

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5604123A (en) * 1988-08-09 1997-02-18 Toray Industries, Inc. Luciferase, gene encoding the same and production process of the same

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5838313A (en) * 1995-11-20 1998-11-17 Siemens Corporate Research, Inc. Multimedia-based reporting system with recording and playback of dynamic annotation
CA2324648C (en) * 1998-03-27 2013-02-26 Prolume, Ltd. Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
US6853375B2 (en) * 2000-05-10 2005-02-08 Cognos Incorporated Method for preemptive screen rendering
DE10058091A1 (de) * 2000-11-23 2002-06-06 Bayer Ag Isolierte Luziferasen Lu164, LuAL und Lu22, sowie deren Verwendung
US6643635B2 (en) * 2001-03-15 2003-11-04 Sagemetrics Corporation Methods for dynamically accessing, processing, and presenting data acquired from disparate data sources
US8036939B2 (en) * 2001-06-08 2011-10-11 Servigistics, Inc. Reporting in a supply chain
US7587755B2 (en) * 2004-07-02 2009-09-08 Citrix Systems, Inc. System and method for executing interactive applications with minimal privileges
US20060230234A1 (en) * 2005-03-30 2006-10-12 Sap Ag. Browser cache management
US7779347B2 (en) * 2005-09-02 2010-08-17 Fourteen40, Inc. Systems and methods for collaboratively annotating electronic documents
US7831464B1 (en) * 2006-04-06 2010-11-09 ClearPoint Metrics, Inc. Method and system for dynamically representing distributed information

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5604123A (en) * 1988-08-09 1997-02-18 Toray Industries, Inc. Luciferase, gene encoding the same and production process of the same

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Thomson C M et al..he widespread occurrence and tissue distribution of theimidazolopyrazine luciferins..《JOURNAL OF BIOLUMINESCENCE AND CHEMILUMINESCENCE》.1997,87-91. *
王书锦
王今朝
蒋宇扬
蒋宇扬;金振华;王书锦;王今朝;马诚;蒋晓琳.萤火虫荧光素酶分离纯化及其特性的研究.《清华大学学报(自然科学版)》.1998,16-19. *
蒋晓琳.萤火虫荧光素酶分离纯化及其特性的研究.《清华大学学报(自然科学版)》.1998,16-19.
金振华
马诚

Also Published As

Publication number Publication date
CN1847399B (zh) 2010-12-15
US20040219527A1 (en) 2004-11-04
HK1154623A1 (en) 2012-04-27
KR100841808B1 (ko) 2008-06-26
CN102732537A (zh) 2012-10-17
CN1303214C (zh) 2007-03-07
AU2487602A (en) 2002-06-03
JP2004516828A (ja) 2004-06-10
ES2271111T3 (es) 2007-04-16
JP4519163B2 (ja) 2010-08-04
US7297483B2 (en) 2007-11-20
US8236540B2 (en) 2012-08-07
BR0115534A (pt) 2003-09-09
AU2002224876B2 (en) 2007-04-05
US20130115641A1 (en) 2013-05-09
DE10058091A1 (de) 2002-06-06
CN1476481A (zh) 2004-02-18
DE50110723D1 (de) 2006-09-21
HK1096423A1 (en) 2007-06-01
PT1339853E (pt) 2006-12-29
WO2002042470A1 (de) 2002-05-30
US20100184185A1 (en) 2010-07-22
EP1339853B1 (de) 2006-08-09
AU2002220697A1 (en) 2002-06-03
BRPI0115534B1 (pt) 2017-07-18
ATE335824T1 (de) 2006-09-15
JP4179877B2 (ja) 2008-11-12
US9745557B2 (en) 2017-08-29
HK1061044A1 (en) 2004-09-03
CN101979586A (zh) 2011-02-23
JP2008054689A (ja) 2008-03-13
IL155878A0 (en) 2003-12-23
PL206385B1 (pl) 2010-08-31
DK1339853T3 (da) 2006-11-13
CN1847399A (zh) 2006-10-18
EP1339853A1 (de) 2003-09-03
PL362774A1 (en) 2004-11-02
CA2429451C (en) 2010-10-19
US20150247131A1 (en) 2015-09-03
WO2002042469A1 (de) 2002-05-30
CA2429451A1 (en) 2002-05-30
IL155878A (en) 2011-03-31
KR20030051865A (ko) 2003-06-25
ZA200303928B (en) 2004-05-21
MXPA03004539A (es) 2004-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9745557B2 (en) Isolated luciferases and the use thereof
EP0973874B1 (en) Enzyme assay for mutant firefly luciferase
AU2006281994B2 (en) Arachnocampa luciferases
IL168158A (en) Photoprotein with improved bioluminescence
KR20070121689A (ko) 생발광이 강화된 포토프로테인 및 세포내 칼슘인디케이터로서의 이의 용도
KR20090116733A (ko) 분비형 루시페라아제 ＭＬｕｃ7 및 그의 용도
RU2345137C2 (ru) Флуоресцирующие белки из веслоногих ракообразных и способы их применения
KR20070029630A (ko) 단리된 광단백질 엠티클리틴 및 그의 용도
US7544484B2 (en) Nucleic acids encoding membrane-binding proteins and methods of using same
US20040023311A1 (en) Modulation of angiogenesis through targeting of cysteine oxygenase activity
Baldwin et al. Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University, and the Texas Agricultural Experiment Station, College Station, TX., USA, 77843

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1154623

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1154623

Country of ref document: HK

CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20120808