BRPI0115534B1 - Nucleic acid molecule coding luciferases, its employment, recombinant rna or dna vector, and transgenic microorganism - Google Patents

Abstract

"luciferases isoladas assim como seu emprego". a invenção refere-se a seqüências de nucleotídeo e aminoácido assim como à atividade e emprego das luciferases lual, lu164, e lu22.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO CODIFICANDO LUCIFERASES, SEU EMPREGO, VETOR DE RNA OU DNA RECOMBINANTE, E MICRORGANISMO TRANSGÊNICO". A presente invenção se refere à sequência de nucleotídeos e aminoácidos, assim como à atividade e emprego das luciferases LuAL, Lu 164, Lu16, Lu39, Lu45, Lu52, e Lu22.

Luciferases Denomina-se a radiação de fótons no âmbito espectral visível como luminescência, sendo que essa ocorre por meio de moléculas emissoras excitadas. Contrariamente à fluorescência, aqui a energia não é introduzida de fora na forma de radiação de ondas de comprimento mais curto.

Quimioluminescência distingue-se de bioluminescência. Denomina-se quimioluminescência uma reação química que leva a uma molécula excitada com luz própria, quando os elétrons excitados voltam ao estado básico. Caso essa reação seja catalisada por uma enzima, fala-se de bioluminescência. As enzimas que tomam parte na reação são em geral, denominadas de luciferases.

Uma visão geral sobre organismos luminescentes é encontrada em Hastings et al. 1995.

Luciferases trata-se de peroxidases ou monogenases e dioxi-genases. Os substratos de enzima, que formam as substâncias de partida para os produtos emissores de luz, chamam-se luciferinas. Eles são diferentes de espécie para espécie. O rendimento do quantum dos sistemas situa-se entre 0,1 - 0,9 fótons para cada molécula de substrato reagida (Idelgaufts, 1993).

Luciferases são classificadas segundo sua procedência ou a suas propriedades enzimáticas. A seguir é indicada uma visão geral sobre alguns tipos de luciferases: Tab. 3: Luciferases eucarióticas independentes de coelenterazina Luciferases diferenciam-se igualmente umas das outras por sua especificidade de substrato. Dentre os substratos mais importantes pertencem coelenterazina (Jones et ai., 1999) e Luciferina, assim como derivados de ambas as substâncias. A seguir, os substratos e sua conversão são es-quematicamente apresentados: Substratos de luciferase A seguir são apresentados, por exemplo, alguns substratos de luciferase e sua transformação. Todos os substratos aqui são transformados enzimaticamente com liberação de luz e dióxido de carbono (CO2) e consumo de oxigênio (O2). A dependência da reação de cofatores ou veículos de energia (por exemplo, ATP para Luciferase Firefly) é específica da enzima. Coelenterazina Coelenterazina Coelenteramida Conversão de coelenterazina em coelenteramidas por Aequorin sob emissão de luz de comprimento de onda 470 nm.

Luciferina Luciferina Oxi luciferina Conversão de luciferina em oxiluciferina através de luciferase Firefly sob emissão de luz de comprimento de onda 560 nm.

Luciferina Vargula Luciferina Vargula Oxiluciferina Vargula Conversão de Luciferina Vargula em Oxiluciferina Vargula passando por Luciferase Vargula sob emissão de luz de comprimento de onda 460 nm.

Sistemas Repórter Como gene repórter ou gene indicador denomina-se em geral genes, cujos produtos genéticos são facilmente comprovados com o auxílio de processos bioquímicos ou histoquímicos simples. Diferenciam-se pelo menos 2 tipos de genes repórteres. 1. Genes de resistência. Como genes de resistência são denominados genes, cuja expressão de uma célula confere resistência contra antibióticos ou outras substâncias, cuja presença no meio de crescimento leva à morte celular, quando falta o gene de resistência. 2. Gene repórter. Os produtos de genes repórteres são empregados na tecnologia genética como indicadores fusionados ou infusionados. Dentre os genes repórteres mais utilizados pertencem a beta-galactosidase (Alam et ai., 1990), fosfatase alcalina (Yang et ai., 1997; Cullen et ai., 1992), luciferase e outras fotoproteínas (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et ai., 1984).

Ordenação das espécies Metridia longa Artrópodes —^-Crustáceos—>Copepodes A espécie Metridia longa pertence aos crustáceos, aos camarões, especial mente aos copepodes ou zooplancton.

Isolamento do cDNA

Para verificação da atividade bioluminescente da espécie Metridia longa foram capturados exemplares no Mar Branco (Estação biológica Kartesh, Rússia) e armazenados em nitrogênio líquido. Para edificação da biblioteca de cDNA de Metridia longa, o RNA foi isolado segundo o processo de Krieg (Krieg et ai., 1996) por meio de isotiocianato.

Para preparação do cDNA foi realizada a PCR (reação de cadeia polimerase) à temperatura ambiente. Aqui incubaram 10pg de RNA com transcriptase reversa (Superscribt Gold II) segundo o seguinte esquema: PCR 1. 30 segundos 95°C

2. 6 minutos 68°C

3. 10 segundos 95°C

4. 6 minutos 68°C 17 ciclos da etapa 4 após a etapa 3.

Os produtos de reação foram incubados para desativação da polimerase por 30 minutos a 37°C com proteinase K e o cDNA precipitado com etanol. O cDNA foi dissolvido em água e incubado com Sfil por uma hora a 37°C. Os produtos de reação foram filtrados em gel para separação de fragmentos menores. O cDNA fracionado foi em seguida ligado no vetor cortado em Sfil e desfosforilado λΤπρΙΕχ2. Para preparação de um banco de expressão fagosÀ, os fragmentos de cDNA clonados foram em seguida em-pacotados pelo sistema de empacotamento in vitro SMART cDNA Library Construction Kits (Clontech) em λ-fagos.

Para a identificação dos fagos recombinantes, que continham uma inserção de cDNA com expressão potencial de luciferases dependentes de colenterazina, foi realizado um "library screening".

Para tanto foram laminados caldos de bactérias Bakterienrasen de E. coliXL1-azul em pratos de cultura de 90 mm e incubados por 10 horas a 37°C. Em seguida ocorreu a infecção com 2500 fagos por placas de cultura e uma fase de incubação de 8 horas a 37°C para formação da placa. Para endurecimento do ágar macio os pratos de cultura foram em seguida armazenados por uma hora a 4°C.

Para realização de um revestimento replicado, membranas de nitrocelulose foram embebidas e secadas com suspensões de E. co//'XL1-azul. As membranas secas foram colocadas por 60 segundos em placas de fagos e em seguida em pratos de ágar fresco. Em seguida, os pratos de á- gar foram incubados por 2 horas a 37° C e adicionaram-se 4 ml de meio SOB (+ 10 mM de MgS04, 0,2% de maltose). Dissolveu se o caldo de bactéria, em meio LB (+ 20 mM IPTG) ressuspenso e incubou-se por uma hora a 37°C. As bactérias foram cultivadas por centrifugação, desintegradas por ultra-som, e a atividade bioluminescente foi determinada após adição de coelenterazina no luminômetro.

Placas de cultura com sinal bioluminescente positivo foram divididas em setores e colocadas em novas placas de réplica ("replica plating"). As placas de réplica continuaram a ser usadas até a identificação de placas individuais ativas. A subclonagem das inserções de cDNA dos fagos de placas positivas ocorreu no vetor pTriplEX2 em E. coli BM25.8 segundo protocolo de preparação para o kit de construção da biblioteca SMART cDNA. As E. coli transferidas com pTriplEx2-cDNA foram incubadas em meio LB com uma concentração de ampicilina de 100 pg/ml durante a noite a 37°C. Para a sobreexpressão diluiu-se a cultura da noite 1 : 150 com meio LB e incubou-se por 1 hora a 37°C. Em seguida ocorreu a indução através da adição de IPTG (isopropiltiogalactosídeo) até uma concentração final de 20 mM. A cultura induzida foi incubada por 1 hora a 37°C e as bactérias foram cultivadas por centrifugação. A desintegração celular ocorreu por ultra-som em 0,5 ml de solução tampão SM. A quimioluminescência foi medida após adição de 10 ocl de coelenterazina (10 '4 M em metanol) medida no luminômetro. Identificaram três luciferases, que apresentaram uma atividade Luciferase dependente de coelenterazina. As luciferases foram denominadas Lu164, LuAL e Lu22. A seguir as luciferases são apresentadas em detalhes. A invenção refere-se também a equivalentes funcionais das três luciferases. Equivalentes funcionais são aquelas luciferases que têm um espectro de substrato comparável, são secretadas e são pelo menos 70% homólogas. É preferida uma homologia de 80 % até 90%. Particularmente preferida é uma homologia de 95%.

As luciferases são apropriadas como genes repórteres para sistemas celulares especiais para receptores, para canais iônicos, para transportadores, para fatores de transcrição ou para sistemas induzíveis.

As luciferases são empregáveis em sistemas bacterianos, por exemplo, para determinação de título, ou como substratos para sistemas bioquímicos, especialmente para proteinases.

As luciferases também podem ser empregadas como enzimas repórteres ligadas a anticorpos ou outras proteínas, por exemplo, ELISA, para imuno-histoquímica ou Western Blot.

As luciferases são empregáveis nos sistemas BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer).

As luciferases servem também como proteínas de fusão para miroscopia corporal ou para análise de intenções proteína-proteína.

As luciferases como enzima repórter também são acopladas à biotina, NHS, CN-Br ou outro promotor de acoplamento por exemplo para ELISA ou para imobilização.

Além disso, as luciferases são empregáveis como enzima repórteres acopladas a oligonucleotídeos DNA ou RNA, por exemplo, para Northern-Blot e Southern - Blot ou PCR de tempo real. A invenção refere-se também à limpeza das luciferases como tipo selvagem ou proteína - etiqueta assim como ao emprego das luciferases em sistemas in vitro.

Sequências de nucleotídeo e de aminoácidos LuAL A luciferase LuAL é uma proteína com um peso molecular de 23,7 kDa e um ponto isoelétrico de 8,32. A sequência de nucleotídeo codifi-cadora (SEQ ID NO: 1) é: 5'atggatatgagggttatctttgctcttgttttctcatcattggttcaggccaaatcaactgaattcgatccta acattaacattgttggtttagaaggaaaatttggtataacaaaccttgagacggatttattcacaatatgggaga caatggatgtcatcaaatcágatattacagatactgatagagtcagcaactttgttgcaactgaaaccgatgcta accgtgggaaaatgcctggcaaaaaactgccactggcagttatcatggaaatggaagccaatgctttcaaagctg gctgcaccaggggatgccttatctgtctttcaaaaataaagtgtacagccaaaatgaaggtgtacattccaggaa gatgtcatgattatggtggtgacaagaaaactggacaggcaggaatagttggtgcaattgttgacattcccgaaa tctctggatttaaggagatggcacccatggaacagttcattgctcaagttgatctttgcgctacctgcactactg gatgtctcaaaggtcttgccaatgttaagtgctcfcgaactcctgaagaaatggctgcctggcagatgtgcaagtt ttgctgacaagattcaaaaagaagttcacaatatcaaaggcatggctggagatcgttga 3' disto origina-se uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO:2) de: MDMRVIFALVFSSLVQAKSTEFDPNINIVG1EGKFGITNLETDLFTIWETMDVIKSDITDTD RVSN FVATET DANRGKMPGKKL PLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLS KIKCTAKMKVYIPG RCHDYGGDKEÍTGQAGIVGAI VDI PEISGFKEMAPMEQFIAQVDLCATCTTGCLKGLANVKCS ELLKKWL PGRCAS FADKIQKEVHNIKGMAGDR e uma composição de aminoácido de: Ala: 18 (8,3%) Cys: 10 (4,6%) Asp: 14 (6,4%) Glu: 12 (5,5%) Phe: 10 (4,6%) Gly: 19 (8,7%) His: 2 (0,9%) lie: 18 (8,3%) Lys: 21 (9,6%) Leu: 15 (6,9%) Met: 10 (4,6%) Asn: 8 (3,7%) Pro: 7 (3,2%) Gin: 5 (2,3 %) Arg: 7 (3,2%) Ser: 9 (4,1%) Thr: 15 (6,9%) Vai: 14 (6,4%) Trp: 2 (0,9%) Tyr: 2 (0,9%) Lul164 A luciferase Lu164 é uma proteína com um peso molecular de 23,8 kDa e um ponto isoelétrico de 7,81. A sequência de nucleotídeo codifi-cadora (SEQ ID NO:3) é: 5'atggatataaaggttgtctttactcttgttttctcagcattggttcaggcaaaatcaactgaattcgatccta acattgacattgttggtttagaaggaaaatttggtataacaaaccttgagacggatttattcacaatatgggaga. caatggaggtcatgatcaaagcagatattgcagatactgatagagccagcaactttgttgcaactgaaaccgatg ctaaccgtggaaaaatgcctggcaaaaaactgccactggcagttatcatggaaatggaagccaatgctttcaaag ctggcígcaccaggggatgccttatctgtctttcaaaaataaagtgtacagccaaaatgaaggtgtacattccag gaagatgtcatgattatggtggtgacaagaaaactggacaggcaggaatagttggtgcaattgttgacattcccg aaatctctggatttaaggagatggcacccatggaacagttcattgctcaagttgaacgttgcgcttcctgcacta ctggatgtctcaaaggtcttgccaatgttaagtgctctgaactcctgaagaaatggctgcctgacagatgtgcaa gttttgctgacaagattcaaaaagaagttcacaatatcaaaggcatggctggagatcgttga 3' dela origina-se uma sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 4) de: MDIKWFTLVFSALVQAKSTEFDPNIDIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMEVMIKADIADT DRASN FVATET DANRGKMP GKKLPLAVIHEMEANAFKAGCT RGCLI CL SKIKCTAKMKVYIP GRCHDYGG DKKTGQAGIVGAIVDIPEIS GFKEMAPMEQ FIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKC S ELLKKWL P DRCAS FADKIQKEVHNIKGMAGDR . e uma composição de aminoácido de: Ala: 21 (9,6%) Cys: 10 (4,6%) Asp: 15 (6,8%) Glu: 13 (5,9%) Phe: 10 (4,6%) Gly: 18 (8,2%) His: 2 (0,9%) lie: 18 (8,2%) Lys: 22 (10,0%) Leu: 14 (6,4%) Met: 10 (4,6%) Asn: 7 (3,2%) Pro: 7 (3,2%) Gin: 5 (2,3%) Arg: 7 (3,2%) Ser: 8 (3,7%) Thr: 14 (6,4%) Vai: 14 (6,4%) Trp: 2 (0,9%) Tyr: 2 (0,9%) Lu22 A luciferase Lu22 é uma proteína com um peso molecular de 20,2 kDa e um ponto isoelétrico de 7,89. A sequência de nucleotídeo codifi- cadora (SEQ ID NO: 5) é: 5'»tfg§agtcaaacttat-ttttgctg ttgtttgtgtcgcagttgccce ggctgccacaattcaggaaaatt ttg aagacattgat cttgtagccataggt ggeagctttgcatcagatgttgatgctaacagaggtggacatggtggac a t cctggcaaaaagatgccaaaaga agtacttatggaaatg gaagccaat gctaaa cgagctggctgccaoaggg St tgtctggtttgtctgtca cacat caagtg cacagcacaa atgcagaagttfcatcccagga agatgccatagtt Ãtgcagga gacaaggattctgctcagggaggaat tgccggtgg tgcca tt gttgatat acctgaaattgccgga t C tsaa ga aatgaagcccatggaaeagttcattgctcaagttgatctctgtgaagattgcacaactggatgcctca aaggtc ttgccaatg ttcattgctctgatctcctgaaga agtggctgccatcaagatgtaagaeat ttgettcca àaattca.afc.ctcaagtggataecatcaaaggtttggctggagatcgttga 3' dela orígína-se uma sequência de aminoáddo {SEQ ID NO: 6) de: MGVKLX FAWCVAVAQAATIQENFEDIOLVAIG GS FAS DVDANRG6HGGH FGKKM PXEVLMG MEANAKRAGCHRGCLVCLSHIKCTAQMQKFIPGRCHSYAGDKDSAQGGIAGGAIVDIPEIAG FK EMKPMEQFIAQV DLCEDCTTGCLKGLANVHCS DLLKKW L P SRCKT FASKIQSQVDTIKGL AGDR e uma composição de aminoáddo de: Aia: 21 ¢11,1%) Cys: 11 {5,8%) Asp: 12(6,3%) Glu: 9 {4,7%) Phe: 7 (3,7%) Gly: 21 (11,1%) His: 6 (3,2%) lie: 13(6,8%) Lys: 16 (8,4%) Leu: 12 {6,3%) Met: 7 (3,7%) Asn: 4 (2,1%) Pro: 6 (3,2%) Gin: 9 {4,7%) Arg: 6 (3,2%) Ser: 9 (4,7%) Thr: 6 {3,2% Vai: 13 (6,8%) Trp: 1 (0,5%) Tyr: 1 (0,5%) Essas sequências podem ser reencontradas na listagem de sequência.

Atividade enzimática e caracterização bioquímica das luciferases As proteínas LuAL, Lu 164, e Lu22 são enzimas, que liberam luz sob conversão de coelenterazina. Elas pertencem, portanto às luciferases. As luciferases são tanto bacterianas como também expressas em células eucarioticamente ativas. As luciferases expressas nas células euca rí óticas LuAL, Lu 164, e Lu22 são secretadas. Na expressão bacteriana não ocorre nenhuma secreção, A atividade das luciferases ê dependente da temperatura, Para as luciferases LuAL e Lu 164 podem ser determinadas a temperatura ótima de 22°C (para LuAL) ou 27°C {para Lu 164). A atividade das ludferases Lu22 tem uma temperatura ótima de 4°C ou temperaturas mais baixas.

Exemplos Plasmídeo/construções Como vetores para preparação das construções a seguir apresentadas foram empregados vetores pcDNA3.1 (+) e pTriplEx2 da firma Clontech, assim como o vetor pASMpir (construção própria com cAMP elementos promotores sensíveis; cre). Os derivados dos vetores foram denominados pcDNA3-x, pTriplEx2-x e pASM -x.

LuAL A figura 1 indica os mapas de plasmídeo dos vetores pTriplEX2-LuAI, pcDNA3-LuAI e pASM-LuAI. A figura 2 indica os mapas de plasmídeo dos vetores pTriplEX2-Lu164, pcDNA3-Lu164 e pASM-Lu164. A figura 3 indica os mapas de plasmídeo dos vetores pTriplEx-22, pcDNA3-Lu22 e pASM-Lu22 Derivados de Coelenterazina como substratos de Lu164 Para identificação de substratos de Lu164 são incubadas soluções de 10 od de diversos derivados de coelenterazina (10'4 M) com respectivamente 10 pi de resíduo de linhas celulares CHO-pcDNA3-Lu164 e a lu-minescência é medida. As coelenterazinas foram referidas em Molecular Probes (USA).

Nas luciferases LuAL e Lu22 não houve nenhuma modificação em comparação com luciferases Lu164. Como substratos ótimos de Lu164, LuAI e Lu22 pode ser identificada colenterazina não modificada (figura B., coelenterazina a). A figura 4 indica derivados coelenterazina como substratos potenciais para Lu164 e uma representação gráfica da medição de lumines-cência por 30 segundos a 8,7 kV no luminômetro (RLU, relative light units); assim como a apresentação esquemática da estrutura molecular dos derivados coelenterazina.

Atividade enzimática das luciferases Lu164, LuAL, e Lu22 dependendo de coelenterazina Expressão bacteriana A expressão bacteriana ocorreu no filo E. coli BL21(DE3) por transformação das bactérias com os plasmídeos de expressão pTriplEX2- Lu164, pTriplEX2-LuAI e pTriplEX2-Lu22. As bactérias transformadas foram incubadas por 3 horas a 37°C em meio LB e a expressão por 4 horas por adição de IPTG até uma concentração final de 1mM. As bactérias induzidas foram cultivadas por centrifugação, ressuspensas em PBS e desintegradas por ultrassom. Reagiram-se 5 pi do lisado (5 mg/ml) com coelenterazina (10' 4M em metanol) ou luziferina (Luciferina Firefly) e a quimioluminescência foi medida. A medição ocorreu a 9,5 kV por 30 segundos em RLU (relative light units). Para Lu164 foram medidos 230 000, para LuAL 320 000 e para Lu22 260 000 RLU. A expressão ocorreu em E. coli BL21(DE3) com os vetores pTriplEx2-Lu164, pTripEx2-LuAL e p TriplEx2-Lu22.

Expressão eucariótica A expressão eucariótica constitutiva ocorreu em células CHO através da transfecção das células com os plasmídeos de expressão pcD-NA3-Lu164, pcDNA3-LuAL e pcDNA3-Lu22 em experimentos transientes. Elas foram revestidas com 10 000 células por orifício em meio DMEM-F12 em placas de microtitulação com 96 cavidades e incubadas a 37°C durante a noite. A transfecção ocorreu com o auxílio do kit fugene 6 (Roche) segundo dados do fabricante. As células transfixadas foram incubadas durante a noite a 37°C em meio DMEM-F12. A medição da quimioluminescência no meio (5 μΙ) e lisado celular (5 μΙ) ocorreu após adição de coelenterazina (10'4M em metanol) por 30 segundos a 9,5 kV no luminômetro à temperatura ambiente.

Para Lu 164 foram medidos 680 000, para LuAL 670 000 e para Lu22 510 000 RLU (relative light units). A expressão ocorreu em células CHO com os vetores pcDNA3-Lu164, pcDNA3-LuAL e pcDNA3-Lu22. Espectro de emissão das luciferases Lu 164, LuAL, e Lu 22 Para medição do espectro de emissão, E. coli BL21(DE 3) foi transformado com os plasmídeo pTriplEx2-Lu164, pTriplEx2-LuAL, e pTri-plEx2-Lu22 e sobre-expressos, como descrito abaixo sob 3.1. Reagram-se 100 μΙ do lisado de bactérias com 50 μΙ de coelenterazina (10'4 M) e o espectro de emissão foi medido. A seguir são graficamente apresentados os espectros de emissão das luciferases. A emissão máxima ocorreu por meio da reação do substrato nas luciferases LuAL, Lu164, e Lu22 a um comprimento de onda de cerca de 490 nm. A figura 5 indica os espectros de emissão das luciferases Lu164 (A), LuAL (B) e Lu22 (C) segundo a expressão bacteriana. (RLU, relative light units).

Secreção das luciferases Lu164, LuAL e Lu22 de células CHO nos exemplos Lu 164 e LuAL.

Para caracterização da expressão das luciferases LuAL, Lu164, e Lu22 em células eucarióticas foram estavelmente transfixadas células CHO com os plasmídeos pcDNA3-LuAL, pcDNA3-Lu164, pcDNA3-Fireluc e pcDNA3.1(+). Os clones obtidos foram cultivados em meio DMEM-F12. As luciferases Firefly foram empregadas como controle positivo para uma lucife-rase não-secretada. O plasmídeo pcDNA3.1(+) serviu para controle de plasmídeo para comprovação de uma atividade endógena das células de origem CHO.

Para comprovação da secreção das luciferases 2000 células foram revestidas em 384 orifícios das placas de microtitulação. Após 24 horas o meio foi removido, as células com solução de Tyrode foram lavadas e adicionaram-se 30 pi de meio fresco. Em seguida ocorreu a primeira medição (Oh) após a adição de 5 μΙ de coelenterazina (10'4 M) ou luciferina para a luciferase Firefly no luminômero a 9,5 kV por 30 segundos. Após uma até cinco horas ocorreram as medições 1 h até 5 h.

Na figura 6 é apresentado o acréscimo da atividade luciferase no meio dependendo do tempo apresentado. Uma secreção da luciferase firefly não ocorreu. As luciferases LuAL, Lu164, e Lu22 são luciferases secretórias. A figura 6 indica a atividade luciferase no meio (5 μΙ) de células CHO após a transfecção com pcDNA3-LuAL, pcDNA3-Firefly, pcDNA3-Lu164, e pcDNA3 como vetor de controle sem inserção de cDNA. (RLU, relative light units; h, horas; firefly: Firefly Luciferase) Dependência da atividade luciferase quanto à temperatura Para determinação da dependência quanto à temperatura das luciferases Lu22, Lu164, e LuAL células CHO transientes com os vetores pcDNA3-Lu22, pcDNA3-Lu164 e pcDNA3-LuAL foram transfixadas e determinou-se a atividade luciferase dos resíduos a temperaturas entre 0 e 47°C. Aqui o resíduo celular assim como a solução de coelenterazina foi adaptado por 5 minutos na temperatura de medição. A medição ocorreu por 30 segundos a 9,5 kV no luminômetro.

Na figura 7 a luminescência medida é apresentada dependendo da temperatura das luciferases LuAL, Lu164, e Lu22. A atividade da luciferase de LuAL apresenta uma temperatura ótima a 27°C. Para Lu164 determinou-se um ótimo de temperatura ótima a 22°C, e para Lu22 uma temperatura ótima a 4°C ou temperaturas menores. A figura 7 mostra atividade luciferase dependente de temperatura no meio (5 pl) de células CHO após transfecção com pcDNA3-LuAL, pcDNA3-firefly e pcDNA3-Lu164. (RLU: relative light units; meio: DMEM-F12 + 10% FCS) Expressão induzida das luciferases Lu164, LuAL e Lu22 em células CHO no Exemplo LuAL A expressão eucariótica induzida ocorreu em células CHO por transfecção das células com a plasmídeo de expressão pASM-LuAL em experimentos transientes. Aqui foram revestidas 10 000 células por orifício em meio DMEM-F12 em placas de microtitulação com 96 cavidades e incubou-se durante a noite a 37°C. A transfecção ocorreu com o auxílio dos kits Fu-gene 6 (Roche) segundo dados do fabricante. As células transfixadas foram incubadas no meio DMEM-F12 a 37°C durante a noite. A indução ocorreu por 5 horas através de Forskolin (10'5 Μ). A medição da quimioluminescên-cia no meio e no lisato celular ocorreu após adição de coelenterazina (10'4 M em metanol) por 30 segundos a 9,5 kV no luminômetro. A figura 8 mostra a expressão induzida de LuAL em células CHO. A indução ocorreu por 5 horas através de Forskolin (10'5M) a 37°C. A medição da atividade em 10 μΙ de resíduo celular (RLU: relative light units; fator de indução: quociente de RLU induzido e RLU não induzido).

Emprego das luciferases Lu164, LuAL e Lu22 como gene repórter em sistemas celulares no exemplo dos receptores NPY2 e A2A com LuAL como gene repórter Para poder analisar a ativação de receptores acoplados à proteína G, de sistemas à base de ligantes específicos de receptor na célula, clo-nou-se a sequência de cDNA da luciferase LuAL no vetor de expressão pASMpir. O vetor de expressão pASMpir contém elementos promotores sensíveis cAMP (CRE), que possibilitam uma medição indireta da concentração de cAMP intracelular. A luciferase serve no sistema como gene repórter. O emprego das luciferases Lu22, Lu164, e Lu22 como genes repórteres em sistemas celulares foi indicado, por exemplo, para os receptores acoplados à proteína G NPY2 (receptor neuropeptídeo 2) e A2A (receptor adenosina 2a). Aqui o clone estável CHO-pASM-LuAL foi transientemen-te transfectado com o vetor pcDNA3-NPY2 ou pcDNA3-A2A. O receptor NPY2 trata-se de um receptor Gi, o receptor A2A de um receptor acoplado Gs. A ativação do receptor A2A ocorreu por 4 horas por adição de 1μΜ NECA. A ativação s do receptor NPY2 ocorreu por adição de 10 μΜ PY2-peptídeo na presença de Forskolin 10'5M. A medição da atividade luciferase no meio (30 pl) ocorreu após adição de coelenterazina (10'4 M) por 30 segundos a 9,5 kV no luminômetro. A figura 9 indica o emprego das luciferases como gene repórter para sistemas celulares no exemplo dos receptores A2A e NPY2 acoplados à proteína G. (RLU: relative light units).

REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico conforme mostrada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 fusionada na ponta 5’ à sequência de um promotor funcional heterólogo, em que os ácidos nucleicos codificam luciferases.

2. Vetor de RNA ou DNA recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 1.

3. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que contêm um vetor, como definido na reivindicação 2.

4. Emprego da molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é como um gene repórter para sistemas celulares.