PT1339853E - Luciferases isoladas e sua aplicação - Google Patents

Description

1 ΡΕ1339853

DESCRIÇÃO "LUCIFERASES ISOLADAS E SUA APLICAÇÃO" A invenção relaciona-se com a sequência de nucleótidos e de aminoácidos, assim como com a actividade e aplicação das luciferases LuAL, Lul64, Lul6, Lu39, Lu45,

Lu52 e Lu22.

Luciferases

Designa-se como luminescência a radiação de fotões no domínio do espectro na região do visível, em que esta é realizada por moléculas emissoras excitadas. A diferença para a fluorescência é que neste caso a energia não é aplicada do exterior sob forma de radiação de comprimento de onda mais curto.

Diferencia-se a quimiluminiscência da bioluminis-cência. Designa-se como quimiluminiscência uma reacção química que leva a uma molécula excitada, que emite radiação luminosa por si só, quando os electrões excitados voltam ao estado fundamental. Se esta reacção for catalisada por uma enzima, trata-se de bioluminiscência. As 2 ΡΕ1339853 enzimas que fazem parte da reacção são, de uma forma geral, designadas por luciferases.

Um resumo sobre organismos luminiscentes encontra-se em Hastings et al. 1995.

Consideram-se luciferases como peroxidases ou mono e dioxigenases. Os substratos enzimáticos que formam as substâncias iniciais para obtenção dos produtos emissores de radiação luminosa designam-se por luciferinas. Diferenciam-se de espécies para espécies. 0 rendimento quântico dos sistemas situa-se entre 0,1-0,9 fotões por molécula de substrato (Idelgaufts, 1993).

As luciferases são classificadas segundo a sua origem ou pelas suas propriedades emzimáticas. No que se segue é apresentado um resumo sobre alguns tipos de luciferases:

Luciferases bacterianas

Produto genético Organismo Substrato λ Expressão Literat./patente Genes lux Vibrio fischerii FMN, dodecanal NADH 4 95 nm citossólico Apley et al., 1985 Gustafson G., US5196524

Tabela 1: Luciferases bacterianas 3 ΡΕ1339853

Luciferases eucarióticas dependentes de celenterazinas

Produto genético Organismo Substrato λ Expressão Literat./patente Luciferase Renilla Celente- 480 nm eitos- Mathews et al.,1977 Renilla reniformis razina sólico Lorenz et al., 1991 Lorenz et al., 1996 Alan, P; WO 0020619 Milton J., US 5418155 Roeland C., WO 9938999 Luciferase Vargula Luciferina 460 secreto- Thompson et al.,1989 Vargula/ Cypridia hilgendor- ferii Vargula nm rico Thomson et al. 1990 Tora, JP 05064583 Tora, JP 08027200 Renard et al., WO 9520653 Luciferase Watasemia Watasemia scintillans Luciferina Watasemia ·? citos- sólico Inoue et al., 1976 Luciferase Olophorus Olophorous graciliros- tris Celente razina 454 secreção Inouye et al., 2000 Aequorin Aequoria Celente- 470 eitos- Head et al., 2000 aequoria razina (Ca2+ activado) nm sólico Shimomura et al., 2000 Jones et al, 1999 Kendall et al.,1998 Inouye et al., 1985 Shimomura et ai., 1969 Cormier et al., US 5798441 Cormier et al., US 5422266 Obelin Obelia Celente razina 470 nm citos- sólico Matveev et al., 1999 Berestovskaya, 1999

Tabela 2: Luciferases eucarióticas dependentes de celenterazina 4 ΡΕ1339853

Luciferases eucarióticas independentes de celenterazina

Produto genético Organismo Substrato λ Expressão Literat./patente Lucife rase Firefly Photinus pyralis Luciferina Firefly, ATP 550 nm citos- sólico Webster et ai., 1980 Gould et al.,1988 Sala-Newby etal.,1992 Bonin et al.1994 Sherf B., US5670356 KIKK, JP 09187281

Tabela 3: Luciferases eucarióticas independentes de celenterazina

As luciferases podem ser igualmente diferenciadas entre si pela especificidade do seu substrato. A celenterazina e a luciferina (Jones et al., 1999) fazem parte dos substratos mais importantes, assim como os derivados de ambas as substâncias. No que se segue, os substratos e a sua reacção são representadas esquema-ticamente por luciferases:

Substratos de luciferases

No que se segue, são exemplificadamente representados alguns substratos de luciferase e a sua reacção. Todos os substratos aqui representados são transformados enzimaticamente com libertação de energia luminosa e dióxido de carbono (C02) e consumo de oxigénio (02) . A dependência da reacção de co-factores ou portadores de energia (por exemplo ATP para a luciferase Firefly) é especifica da enzima. ΡΕ1339853 5

Celenterazina

Celenterazina

+ hv47Siun Celenteramida equorina onda 470

Reacção de com emissão nm. celenterazina em de energia luminosa celenteramida por de comprimento de

Luciferina atp+o2 AMP 4 C02 ho

Luciferina

+ hv $60 nm Oxiluciferina

Reacção de luciferina em oxiluciferina por luci-ferase Firefly com emissão de energia luminosa de comprimento de onda 560 nm.

Luciferina vargula

Luciferina vargula Oxiluciferina vargula 6 ΡΕ1339853

Reacção de luciferina vargula em oxiluciferina vargula por luciferase vargula com emissão de energia luminosa de comprimento de onda 460 nm.

Sistemas "repórter"

De uma forma geral são designados por genes "repórter" ou genes indicadores os genes cujos produtos genéticos podem ser facilmente determinados por meio de métodos bioquimicos ou histoquimicos. Distinguem-se pelo menos 2 tipos de genes "repórter". 1. Genes resistentes. São designados por genes resistentes os genes cuja expressão confere a uma célula ou a outras substâncias uma resistência contra antibióticos, cuja presença conduza à morte de células no meio de crescimento caso o gene resistente não esteja presente. 2. Gene "repórter". Os produtos de genes "repórter" são aplicados na tecnologia genética como indicadores findidos ou não fundidos. Os genes "repórter" mais utilizados são a beta-galactosidase (Alam et al., 1990), a fosfatase alcalina (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), as luciferases e outras fotoproteinas (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984). 7 ΡΕ1339853

Classificação da espécie Metridia longa

Artrópodes->Crustáceos^Copepodas A espécie Metridia longa faz parte dos crustáceos, dos caranguejos, especialmente dos copepodas ou do zooplâncton.

Isolamento da cDNA

Para determinação da actividade bioluminescente da espécie Metridia longa foram capturados exemplares no mar branco (estação biológica de Kartesh, Rússia)e armazenados em azoto liquido. Para o estabelecimento de bibliotecas de cDNA de Metridia longa o RNA foi isolado pelo isotiocinanato pelo método de Krieg (Krieg et al., 1996).

Para a preparação dos cDNA foi realizado o PCR-RT. Foram para isso incubados 10 yg de RNA com trans-criptase reversa (Superscribt Gold II) segundo o esquema seguinte:

PCR 1. 30 segundos 95°C 2. 6 minutos co 0 O 3. 10 segundos O 0 LO CTi 4 . 6 minutos 68 °C 17 ciclos do passo 4 após o passo 3 ΡΕ1339853

Para a inactivação da polimerase, os produtos de reacção foram incubados com proteinase K durante 30 minutos a 37°C e o cDNA precipitado com etanol. O cDNA foi dissolvido com água e incubado com Sfil durante uma hora a 37°C. Os produtos de reacção foram filtrados por gel para separação de fragmentos pequenos. O cDNA fraccionado foi subsequentemente ligado ao vector XTriplEx2 seccionado e desfosforilado em Sfil. Para a preparação de um banco de expressão fagoX os fragmentos de cDNA clonados foram subsequentemente embalados em fagoX no sistema de embalagem in vitro SMART cDNA Library Construction Kits (Clontech). A identificação dos fagos recombinantes que continham uma inserção de cDNA com expressão potencial de luciferase dependente de colenterazina, foi realizada por um "library screening".

Para este fim, uma base de bactérias de E. coli XLl-Blue foi colocada em placas com cápsulas de cultura de 90 mm e incubadas durante 10 horas a 37°C. De seguida, foi realizada a infecção com 2500 fagos por cápsula de cultura e uma fase de incubação de 8 horas a 37°C para formação de placas. As cápsulas de cultura foram subsequentemente armazenadas durante uma hora a 4°C para o endurecimento do agar mole.

Para a realização de uma placa de replicação, as membranas de nitrocelulose foram imersas em suspensões de E. coli XLl-Blue e secas. As membranas secas foram colo- 9 ΡΕ1339853 cadas durante 60 segundos sobre as placas de fago e de seguida sobre placas de agar fresco. Subsequentemente as placas de agar foram incubadas durante 2 horas a 37°C e adicionou-se 4 mL de meio SOB (+ 10 mM MgS04, 0,2% maltose). A base de bactérias foi dissolvida, ressuspensa em meio LB (+ 20 mM IPTG) e incubada durante uma hora a 37°C. As bactérias foram separadas por centrifugação, desintegradas por ultrassons e a actividade de biolumi-niscência determinada no luminómetro após adição de celen-terazina.

As placas de cultura com um sinal positivo de bioluminiscência foram agregadas em sectores realizando-se uma nova replicação de placas. A replicação de placas foi continuada até à identificação de placas activas isoladas. Para a subclonação das inserções cDNA dos fagos de placas positivas foi realizado no vector pTriplEX2 em E. coli BM25.8 de acordo com o protocolo preparativo para o "kit" SMART cDNA Library construction. Os E. coli transferidos com pTriplEX2-cDNA foram incubados no meio LB com uma concentração de ampicilina de 100 pg/mL de um dia para o outro a 37°C. Para a sobre-expressão a cultura foi diluida de 1:150 com meio LB de um dia para o outro e incubada durante 1 hora a 37°C. De seguida realizou-se a indução por adição de IPTG (tiogalactosido de isopropilo) até a uma concentração final de 20 mM. A cultura induzida foi incubada durante 1 hora a 37°C e as bactérias separadas por centrifugação. A desintegração das células realizou-se por ultra-sons em 0,5 mL de tampão SM. A quimiluminiscência foi 10 ΡΕ1339853 determinada no luminómetro após adição de 10 μΐ de celenterazina (10“4 M em metanol) .

Foram identificadas três luciferases, que apresentavam uma actividade de luciferase dependente de celenterazina. As luciferases foram designadas por Lul64, LuAL e Lu22. No que se segue, as luciferases são apresentadas isoladamente. A invenção relaciona-se com moléculas de ácido nucleico, que codificam a sequência peptidica apresentada nas SEQ ID n°2, SEQ ID n°4 ou SEQ ID n°6 ou pelo menos apresentam 90% de identidade com estes ácidos nucleicos, e em que os ácidos nucleicos codificam péptidos, que são luciferases secretoras. Adicionalmente a invenção rela-ciona-se com moléculas de ácido nucleico que incluem uma molécula de ácido nucleico como apresentada nas SEQ ID n°l, SEQ ID n°3, SEQ ID n°5, SEQ ID n°7, SEQ ID n°8, SEQ ID n°9 ou SEQ ID n°10, em que os ácidos nucleicos codificam luciferases.

As luciferases são adequadas como genes "repórter" para sistemas celulares, especialmente para recepto-res, para canais iónicos, para transportadores, para factores de transcrição ou para sistemas induziveis.

As luciferases são aplicáveis em sistemas bacte-rianos, por exemplo para a determinação do titulo ou como substrato para sistemas bioquímicos especialmente para proteinases. 11 ΡΕ1339853

As luciferases podem igualmente ser aplicadas como enzimas "repórter" acopladas a anticorpos ou outras proteínas, por exemplo para ELISA, para imunohistoquímica ou para Western-Blot.

As luciferases são aplicáveis em sistemas BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer).

As luciferases são igualmente adequadas como proteína de fusão para microscopia confocal ou para a análise de interacção proteína-proteína.

As luciferases são aplicáveis como enzima "repórter" acopladas à biotina, NHS, CN-Br ou outros promotores de acoplamento, por exemplo para ELISA ou para imobilização.

Adicionalmemnte as luciferases são aplicáveis como enzima "repórter" acopladas a oligonucleótidos DNA ou RNA, por exemplo para "northern" e "Southern" "Blot" ou para PCR "realtime". A invenção relaciona-se também com a purificação das luciferases como tipo bruto ou proteína diária assim como a aplicação das luciferases em sistemas de translacção in vitro. 12 ΡΕ1339853

Sequências de nucleotidos e aminoácidos

LuAL A luciferase LuAL é uma proteína com um peso molecular de 23,7 kDa e um ponto isoeléctrico de 8,32. A sequência de nucleótido codificada é: ca»tega^pt^tc^*t«»^fe*tt»»fataet^i^a^e^íeaaefetfeett9caactfaaaea5ípfegfeta obtendo-se uma sequência de aminoácido de:

RCSDYGQDKTvT^QÃÍlJVGAIVDlPEISGFKBMAMEQFIAQVDI^.fCTTÍlCLKGIA.FíMCS e uma composição de aminoácido de:

Ala: 18 (8,3%) Cys: 10 (4,6%) Asp: 14 (6,4%) Glu: 12 (5,5%) Phe: 10 (4, 6%) Gly: 19 (8,7%) His: 2 (0,9%) Ile: 18 (8,3%) Lys: 21 (9,6%) Leu: 15 (6,9%) Met: 10 (4, 6%) Asn: 8 (3,7%) Pro: 7 (3,2%) Gin: 5 (2,3%) Arg: 7 (3,2%) Ser: 9 (4,1%) Thr: 15 (6, 9%) Vai: 14 (6,4%) Trp: 2 (0, 9%) Tyr: 2 (0,9%) 13 ΡΕ1339853

Lul 64 A luciferase Lul64 é uma proteína com um peso molecular de 23,8 kDa e um ponto isoeléctrico de 7,81. A sequência de nucleótido codificada é: obtendo-se uma sequência de aminoácido de: e uma composição de aminoácido de:

Ala: 21 (9,6%) Cys : 10 (4,6%) Asp: 15 (6,8%) Glu: 13 (5, 9% Phe: 10 (4,6%) Gly: 18 (8,2%) His : 2 (0,9%) Ile: 18 (8,2% Lys: 22 (10,0%) Leu: 14 (6,4%) Met: 10 (4,6%) Asn: 7 (3,2%: Pro: 7 (3,2%) Gin: 5 (2,3%) Arg: 7 (3,2%) Ser: 8 (3,7% Thr: 14 (6,4%) Vai: 14 (6,4%) Trp: 2 (0,9%) Tyr: 2 (0, 9% Lu22 A luciferase Lu22 é uma proteína com um peso 14 ΡΕ1339853 molecular de 20,2 kDa e um ponto isoeléctrico de 7,89. A sequência de nucleótido codificada é: obtendo-se uma sequência de aminoácido de:

mm e uma composição de aminoácido de:

Ala: 21 (11 1 s-, 1 0 ) Cys: : 11 (5,8%) Asp: 12 (6, 3%) Glu: 9 (4, 7%: Phe: 7 (3, 7%) Gly: 21 (11,1% ) His: 6 (3, 2%) Ile: 13 (6, 8%; Lys : 16 (8, 4%) Leu: 12 (6,3%) Met: 7 (3, , 7%) Asn: 4 (2, , 1% Pro: 6 (3, 2%) Gin: 9 (4,7%) Arg: 6 (3, , 2%) Ser: 9 (4, 7 2 r / 0 Thr: 6 (3, 2%) Vai: 13 (6,8%) Trp: 1 (0, , 5%) Tyr: 1 (0, R 2 F sj 0

Estas sequências encontram-se novamente na listagem de sequências. 15 ΡΕ1339853

Actividade enzimática e caracterização bioquímica das luciferases

As proteínas LuAL, Lul64 e Lu22 são enzimas, que por reacção de celenterazina libertam energia luminosa. Fazem parte por isso das luciferases. As luciferases podem ser expressas activamente tanto por células bacterianas como também por eucarióticas. As luciferases LuAL, Lul64 e Lu22 expressas por células eucarióticas são secretadas. Na expressão bacteriana não se realiza nenhuma secreção. A actividade das luciferases depende da temperatura. Para as luciferases LuAL e Lul64 podem ser determinadas temperaturas óptimas de 22°C (para a LuAL) ou 27°C (para a Lul64) . A actividade da luciferase Lu22 tem uma temperatura óptima de 4°C ou temperaturas inferiores.

Exemplos

Plasmídeos/Construções

Os vectores aplicados para a preparação das construções a seguir representadas foram os vectores pcDNA3.1(+) e pTriplEX2 da Clontech, assim como o vector pASMplr (construção própria com elementos promotores sensitivos cAMP; cre) . Os derivados dos vectores foram designados por pcDNA3-x, pTriplEX2-x e pASM-x. 16 ΡΕ1339853

LuAL A Fig.l apresenta os traçados de plasmídeos dos vectores pTriplEX2-LuAL, pcDNA3-LuAL e pASM-LuAL. A Fig.2 apresenta os traçados de plasmídeos dos vectores pTriplEX2-Lul64, pcDNA3-Lul64 e pASM-Lul64. A Fig.3 apresenta os traçados de plasmídeos dos vectores pTriplEX2-Lu22, pcDNA3-Lu22 e pASM-Lu22.

Derivados de colenterazina como substratos de Lul64

Para a identificação de substratos para Lul64 foram incubados 10 pL de soluções de diversos derivados de celenterazina (10~4 M) com 10 pL de sobrenadante de linhas celulares de CHO-pcDNA3-Lul64 e determinada a luminis-cência. A celenterazina foi referida a "molecular probes" (USA). Não se registaram diferenças entre as luciferases LuAL e Lu22 em comparação com a luciferase Lul64. Como substrato óptimo para a Lul64, LuAL e Lu22 pode ser identificada a celenterazina não modificada (fig.B, celenterazina a). A Fig.4 apresenta derivados de celenterazina como potenciais substratos para a Lul64 e uma representação gráfica da medição de luminiscência durante 30 segundos a 8,7 kV no luminómetro (RLU, "relative light units"); assim 17 ΡΕ1339853 como a representação esquemática da estrutura molecular dos derivados da celenterazina. Àctividade enzimática das luciferases Lul64, LuAL e Lu22 dependentes da celenterazina A expressão bacteriana realizou-se no E.coli estirpe BL21(DE3) por transformação das bactérias com os plasmideos de expressão pTriplEX2-Lul64, pTriplEX2-LuAL e pTriplEX2-Lu22. As bactérias transformadas foram incubadas em meio LB durante 3 horas a 37°C e a expressão foi induzida durante 4 horas por adição de IPTG até uma concentração final de 1 mM. As bactérias induzidas foram separadas por centrifugação, ressuspensas em PBS e desintegradas por ultrassons. Adicionou-se 5 pL do lisado (5 mg/mL) à celenterazina (IO-4 M em metanol) ou luciferina (lucife-rina Firefly) e medida a quimiluminiscência. A medição realizou-se a 9,5 kV durante 30 segundos em RLU ("relative light units") . Para a Lul64 foram medidos 230000, para a LuAL 320000 e para a Lu22 260000 RLU. A expressão realizou-se em E.coli BL21(DE3) com vectores pTriplEx2-Lul64, pTriplEx2-LuAL e pTriplEx-Lu22.

Expressão eucariótica A expressão eucariótica constitutiva realizou-se em células CHO por transfecção das células com os plasmideos de expressão pcDNA3-Lul64, pcDNA3-LuAL e pcDNA2-Lu22 em ensaios transientes. Para este fim foram colocadas 18 ΡΕ1339853 em placas 1000 células por poço em meio DMEM-F12 em placas de microtitulação de 96 poços e incubadas de um dia para o outro a 37°C. A transfecção realizou-se com 6 "kits" Fugene (Roche) de acordo com instruções do fornecedor. As células transfectadas foram incubadas de um dia para o outro em meio DMEM-F12 a 37°C. A medição da quimiluminiscência no meio (5 pL) e lisado celular (5 pL) realizou-se após adição de celenterazina (10“4 M em metanol) durante 30 segundos a 9,5 kV no luminómetro à temperatura ambiente.

Para a Lul64 foram medidos 680000, para a LuAL 670000 e para a Lu22 510000 RLU ("relative light units"). A expressão realizou-se em células CHO com os vectores pcDNA3-Lul64, pcDNA3-LuAL e pcDNA3-Lu22.

Espectro de emissão das luciferases Lul64, LuAL e Lu22

Para a medição do espectro de emissão foram transformados E.coli BL21(DE3) com os plasmídeos pTriplEx2-Lul64, pTriplEx2-LuAL e pTriplEx-Lu22 e sobre-expressos, como descrito em 3.1. Adicionou-se 100 pL de lisado bacteriano a 50 pL de celenterazina (10~4 M) e medido o espectro de emissão. No que se segue, os espectros de emissão das luciferases são representados em gráficos. A emissão méxima da reacção do substrato é obtida para as luciferases LuAL, Lul64 e Lu22 para um comprimento de onda de cerca de 490 nm. A Fig.5 apresenta o espectro de emissão das luci- 19 ΡΕ1339853 ferases Lul64 (A), LuAL (B) e Lu22 (C) segundo expressão bacteriana. (RLU, "relative light units").

Secreção das luciferases Lul64, LuAL e Lu22 de células CHO no exemplo Lul64 e LuAL

Para a caracterização da expressão das luciferases LuAL, Lul64 e Lu22 em células eucariotas, células CHO foram transfectadas de uma forma estável com os plasmídeos pcDNA3-LuAL, pcDNA3-Lul64, pcDNA3-Fireluc e pcDNA3.1(+). Os clones obtidos foram cultivados em meio DMEM-F12. A luciferase Firefly foi aplicada como controlo positivo para uma luciferase não secretada. 0 plasmídeo pcDNA3.1(+) serviu como plasmídeo de controlo para determinação de uma actividade endógena potencial da célula parental CHO.

Para a determinação da secreção das luciferases foram colocadas 2000 células em placas de microtitulação com 384 poços. O meio foi removido após 24 horas, as células lavadas com solução de tirode e adicionado 30 pL de meio fresco. De seguida realizou-se a primeira medição (0 h) após a adição de 5 pL de celenterazina (10~4 M) ou luciferina para a luciferase Firefly no luminómetro a 9,5 kV durante 30 segundos. Após uma até cinco horas realizaram-se as medições 1 h até 5 h. A Fig.6 representa a actividade da luciferase no meio dependendo do tempo. Uma secreção da luciferase Firefly não se realizou. As luciferases LuAL, Lul64 e Lu22 são luciferases secretoras. 20 ΡΕ1339853 A Fig.6 representa a actividade da luciferase no meio (5 pL) de células CHO após transfecção com pcDNA3-LuAL, pcDNA3-Firefly, pcDNA3-Lul64 e pcDNA3 como vector de controlo sem inserção cDNA. (RLU, "relative light units"; h, horas; Firefly: luciferase Firefly).

Dependência da temperatura da actividade da luciferase

Para a determinação da dependência da temperatura das luciferases Lu22, Lul64 e LuAL, células CHO foram transfectadas de forma transiente com os vectores pcDNA3-Lu22, pcDNA3-Lul64, pcDNA3-LuAL e a actividade da luciferase nos sobrenadantes determinada a temperaturas entre 0 e 47°C. Para este fim o sobrenadante celular, assim como a solução de celenterazina foram adaptadas à temperatura de medição durante 5 minutos. A medição foi efectuada durante 30 segundos a 9,5 kV no luminómetro. A Fig.7 representa a luminiscência medida dependente da temperatura para as luciferases LuAL, Lul64 e Lu22. A actividade da luciferase da LuAL apresenta uma temperatura óptima de 27°C. Para a Lul64 foi determinada uma temperatura óptima de 22 °C e para a Lu22 uma temperatura óptima de 4°C ou temperaturas inferiores. A Fig.7 representa a actividade da luciferase dependente da temperatura no meio (5 pL) de células CHO após transfecção com pcDNA3-LuAL, pcDNA3-Firefly e pcDNA3-Lul64. (RLU, "relative light units"; meio: DMEM-F12+10% FCS). 21 ΡΕ1339853

Expressão induzida das luciferases Lul64, LuAL e Lu22 em células CHO no Exemplo LuAL A expressão eucariótica induzida realizou-se em células CHO por transfecção das células com o plasmideo de expressão pASM-LuAL em ensaios transientes. Para esse fim foram colocadas em placas 10000 células por poço em meio DMEM-F12 sobre placas de microtitulação de 96 poços e incubadas de um dia para o outro a 37°C. A transfecção realizou-se com 6 "kits" Fugene (Roche) segundo as instruções do fabricante. As células transfectadas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C em meio DMEM-F12. A indução realizou-se durante 5 horas por forkolina (10“5 M) . A medição da quimiluminiscência no meio e lisado celular realizou-se após adição de celenterazina (10~4 M em metanol) durante 30 segundos a 9,5 kV no luminómetro. A Fig.8 representa a expressão induzida de LuAL em células CHO. A indução realizou-se durante 5 horas por forkolina (10“5 M) a 37°C. A medição da actividade em 10 pL de sobrenadante celular (RLU, "relative light units"; factor de indução: quociente dos RLU induzido e RLU não induzido).

Aplicação das luciferases Lul64, LuAL e Lu22 como genes "repórter" em sistemas celulares no exemplo dos receptores NPY2 e A2A com LuAl como genes "repórter"

Realizou-se a clonagem da sequência cDNA da 22 ΡΕ1339853 luciferase LuAL ao vector de expressão pASMplr afim de poder analisar a activação de receptores acoplados pela proteina G por ligandos específicos de receptores em sistemas baseados em células. 0 vector de expressão pASMplr contém elementos promotores (CRE) sensitivos cAMP, que proporcionam uma medição indirecta da concentração cAMP intra-celular. Neste sistema a luciferase é aplicada como gene "repórter". A aplicação das luciferases Lu22, Lul64 e Lu22 como genes "repórter" em sistemas celulares foi evidenciada, por exemplo, para os receptores NPY2 (receptor neuropeptidico 2) acoplado à proteina G e A2A (receptor adenosina 2a) . Para este fim o clone CHO-pASM-LuAL estável foi transfectado de forma transiente com o vector pcDNA3-NPY2 ou pcDNA3-A2A. No caso do recptor NPY2 é considerado um Gi, no caso do receptor A2A um receptor acoplado Gs. A activação do receptor A2A realizou-se durante 4 h por adição de 1 μΜ NECA. A activação do receptor NPY2 realizou-se por adição de 10 μΜ de péptido NPY2 na presença de 10“5 M de forscolina. A medição da actividade da luciferase no meio (30 pL) realizou-se após adição de celenterazina (10“4 M) durante 30 segundos a 9,5 kV no luminómetro. A Fig.9 representa a aplicação das luciferases como genes "repórter" para sistemas celulares para receptores A2A e NPY2 acoplados à proteina G. (RLU: "relative light units"). 23 ΡΕ1339853

Literatura/patentes

Aptey ECf Wagner % lafdfereeàf S,, Eapid proçedure fer tlie prepaitótm oí teedoxIo“MÂI>F+ oxidoredtóas© m molsculariy pitre fem at 36 kDa>, Itmi Bmhem m$ 0^150(1):145-54.

Serestevskaya MG* IIMn M* Â¥* Bo&dâr ¥S* YyieteM !$»

MajtiM#? Ilj ¥0« PíHsàm H, AlaMsev YB, ÇoíEaiMMofid fomiatk® of aetive pkítopmtein obelia iíi a ceM-froe trmtsktíoB System: ábeet dfcrdágh sâMítive measure of^s&ls8iisWc«8 «osse, Âmâ Bkdteni 1999 Mar l#$5(l):?2-4.

Boiais et ai Pkotinas ppiis Mibiase. <km. 1994 I4E7S-77 Àístm J, Cook JOL Repórter genes: apptkkioii to dtie stedy of mammaiiaa gene &gasorij»tiea. Âmtl· Mtetdbm* 1990 Aug I;1SEP):245”54

CoJteia Biyâs R,, MMim Mkhael EL> Secrmed plieemal alkalme phospíiatase &§ a estoyoHa repórter geoe, Meihoâs in E?mm&íogy, 2!6J62ff

Hm§mm Oíífi Fhysí&lôf*y : Soutos book, Sperelaldâ N. («d)* Âmdemte presa, H&sd JF* íeoaye S» TeraafeM K, ft, The érysfcal s^far© of fie pkítopTOteiá aeqpork at 23 Á resolstiQm N&tur& 200® May !Η;405(67Ι%ΙΤ24,

Ck&ld &» Sanesh d, FireSy isdfess© m a too! is molecular as ded! hlolBgy, Anc&

BimMm, 198% 161:561-507

IdelgauBs R, Geate^iaokigie m A-2. FCfTVerlsg, Wekifeeím, 1993 ΡΕ1339853 - 24 -

Inonye S, MagacM M» Sakâki Y, Takâgi Y* Mbata % Iwaaaga $ Mlyata T, Tsnji FL CforÉsg and se<pence amtysís of cDNA for tbe lEiuineseení protek acqtudiL PmcWúíiÂmdm USA 1985 May;B2(lQ):3I54~g

Uawy* &, mm, ,H.-} €T., TettahfidKmL^, 34,2971-2974 (197#

Msap, &« W^nieH BL» Nskatij«.ra, E. aaâ Sltmomams O*, FIM iettes 481 (2900) 19-25

Jnnes Keitii^ líibMrt Frank, Keensm Martkfe Gkwhg jdlyMi, lumliíesmxea and tfflôtóh çalled eoskráeimine, Tibteck 1999» 17:47?ff

Einisl IíbsbÉiíii M* JfoàaiBteB Mkàad M« Aasp&m víektia môvss lato aa «dííisg iwm Tíkmk 1998 l&ZK»

Er.bg, $*, CMh, C*, Allred, lXf B*aedix» M.» Fafaa £L KHA fram âir-dríed frozen seeííons for RT-FCE and diíbreatíal dbpky Bwtmkmqms, 1996 Sqtí21 <3)i425-& har&Êz WW, MeCsiwt R0* Le^toii M, Mbr ME, fsolata and of a cDMA èpsódMg EoaMa remfomas lyciferass. Pras Naí! AcmÍ Sti USA 1991

May torenz WW, Cimier Ml» 0*Κ«» BI» Hm D, Esch» Àá» Statlay M*

Exp«R<m oíths Réiullâ mdibrmis beitRase gsme la mamiBMían eelis. J Bmimnm Cfatmihmm. 1996 Mãtfcsivs 4» €» aí aL Farffieaim s»á praj^bs of mnlla ranilbtmis· kelfemse,. Bwchmmtry. 1977, 16(1): 85-91 25 ΡΕ1339853 •Maívee? SVf Lmk JQ Baiisart S,t Gene&caSIy Qbeik as a

Ifo^umkesos»! lafcssí is m &â$ay for a peptide. átml Bwekmi 199$ May 1$;27ί!(1):Φ~74,

Pfeffip GN, Símcíore and dyoamlcs of grasn ffosreseent proàm Curr Opm ãtmci Bi&L 1997Dsc;7(6)-S2L~7

Sala-Mawby «t áL, BqpeRktn of recombmajii íãreSy liriferase, Biochm Soc, Tmmml 1992,20:1438

Sliiniasmra O, lohssss FEL, Froperíies ôf th® Mdssémseest protelo, agqsoris. Bioehemis&y* !9690ds8(l 0):3991-7, SMisòiimrá O», BMíiims^ceace is tbe saa: pfestopísMa spierns. Symp Sm £xp EM. 1985;39:351-72, ifataMim O, Tera&isM K» Ii^tó-«aáttes iavolved k foa ImkseKaiss of eodèafeaafie. Lumimscmce, 2000 JââhFeb;LS(l}:5l~$.

Saowdow&e KW, Bode AB* Measurametó of cytosdk fke calciom k mammatli® eslb wifo â^soiiiL ÃmJPhpsmL 1984 Narç247(5 B I):C39&40S.

Tlmpiw EM, Magata 8, TswJI FLS CScaikg and exp«.§ãIos ef cDN for tbe IwâieKase firam tbe matise ostracod V&rgak tfopaétóL JPme AM Amd S&i U SÁ 1989 Sep;86(17):õ5õ7-7L 26 ΡΕ1339853

Uagríis MD, Smgh LM, Stoeeo E» Sas DE, Áfcmmwite M», Aa aatoamied aeqttori:n Iiímínescence-èased fumÉsss! ctócitm assay for 0-protem^õiipled receptaís, Aml Biúchem. 1999 Μ 1 5:272(1)04^42,

Webster >M, Oiasg JC, Maaioy ER, -Spif«f HO,. Leacè flt, Boífer effèots os AT? asslysls hj ffrgfly hmhmc, Anal Bimhém 1980 M 1S;106(1}:?-11,

Yaag IVTaan, SMmi Paris a} Mm Pastí A» Kaía Sew R,? Q&mffieaiiori of geae 23{δ)Η10Η JF E5M45I3, Fom, (TORAYIND Is©,), Iiicifemse modMsd wtft aatlg®^ itóiboáy,, teaptea or homose* etc, - Is Esokfed frosi Vargpfe MlgeiKteif useM is bio~ kmmesea&t analysis JP M)2?'2f>0, &s, fíOEÂY MD te,}, Brotem eomptiá&g lucifersse &sed to Ig® blsdmg áo&ms * meful m diagttosttc roageat in càeaMttmijfôscesí iisimm^oassays JP 09I872EÍ, 30¾ (ICÍKECJMAM €®rp,)s Aaíibody-ílreây iudfeme fesod: potok ~ asd rekíed pmáutcte Le, âreíly losifeg:® fsssd pae, recòmbmaat DMA má íts p^pifBíba ϋ$ 5I9ÍS24, Crusíqfson 0; hg&im T>; Kxnàmr <*; Miêerês J., {Lâiy & Co)s

Rseõórfemast DMA ostMdisg Émoa protela witib temisl faadjhase aetivily -c«aapte eodiag m$om «f te  and B geass isotai &m spedie saíurtily Mo Imskescent temia, asd DMA linfcer of speoffiefi tostóction assasse recopítion site US S41S1.SS, Míkm Ãf C&mier; WUtíam W. Lúrmmt IsoMed Rmsíla Luolfersso wà Metkoá ofsse tteeof 27 ΡΕ1339853 m 54222«, Corafer Μ. 1; Fraskê? D.t (UMIY 0EORGI IBS ΨΟΧΜΒ mC% DNA codkg for :apo;aeqií«ÍE - »M for recmiMíant proda, of íspoioeqaúiiíi wiiieíi Is a btodimmescent msifer m Chemical and bfoefeemical asap PS 5670356, Skerf E; Wmd K (Promsga Corp), ModMeá fecffy ludfemse gene - PS 5798441 Cermfer Μ l; Frmfwt x% (IJMV ΟΜΟΙΑ EES FOOMD MQ, New kôMod apmqàodn polypéptide * useM as a larniisesecnt mârkòr m blo/ehemieal assays WO W206I9, Àhn F.SesmMranlik indfemse WO 9526653, Remré J F; Th&mpson & M; Hmmpmn E, (ΚΕΑ IMS! MâT 1B0H AGRONOMIQOB), Bsíéctmg transgcme emfcryos mg V&rguk ludfferase gene as a íoaifer « allows itotificatioa of saci eixbryss aí the blasíoeyst stafe, afeô tramgeak :aamials? cmbryss and celí ime coníg. íMs gene WO 9f3S9ff* Rmlími C (Packasá Imtr, Go, lm ji} Betókg Êm prosmee «f raslla 28 ΡΕ1339853

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Bayer AG <120> LUCIFERASES ISOLADAS E SUA APLICAÇÃO <130> LeA34790 <150> 10058091.2 <160> 10 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 660 <212> DNA <213> Metridia longa <400> 1 atggateafcaa aggtfcgfcetl tacto ttgtfc tfcctoagoat tggttoeggo aaaataasôt €0 ga&ttcgafco ctaacafetga. cattgttgrgt ttôfíuaggaa mtttfffcat aacaaaccfct 120

gagacggatt tattsae&at afegggagaea atggaggfcea tgatçaaago agatattgea ISO gatsetgata gagceagcaa atttgrttgoa stsctaaocg tggaasaafeg 240 CCtggcaaaa aaetgeeaet ggcafttato atgga&atgg aafesaatge tttcaaafçst 300 gfotgoaooa ggggatgoec tatcfcgfeott te&aa&ataa agtgtacagc caasstgaag 3i0 gtgtacatte eaggaaçatçr fce&tg&fcfcafc ggt.ggt.ga.c3, agaââactggr acaggcafga 420 afcafttfgtg caatfcgtfcga aatfcoaegaa afcófccfcgfãt tta&ffagafc ggcaeceatg 4S0 gaacaffctca ttgetcáagt bgaaegttss gettcetgca etaetgg&fcf tctcaaaggt 540 etfcgeea&tg ttaagtgcfcc tgaactcctg aagaaatgrgc tfcefcgacag stgfcfcgaft #0Ó tttf ctgaca ag&ttc&aaa agaagttcac aatatcaaag gc&fcggefcgg agategttga §60 <210> 2 <211> 219

<212> PRT <213> Metridia longa <4 0 0> 2 Háfc &sp Xla %s Vai Vai Pfcé Vbat Usa Vai m® Ser Ala leu Vai Gin

Ma Lys Ser Vhr Olu mm Asp Peo Mn ilã Asp lie Vai Gly LetvGlu ΡΕ1339853 29 20 25 30

Gly Itys> Ph® Siy lis Tísr As» 1«®« Glu T$ir A$g» leu Phe Çhr 11« *$xp 35 , 40 45 SI» $hr Met Sl» Vai Mafc 11« Lya Ala &sp £1® Ala Asp Thr Asp Mg só 55 m

Ma Ser Ase Phe vai Ala Tbr Gltt Asp Ala Asn Aeg Gly Ays Mafc 65 70 75 50

Pre Sly iys Lys Lee Pro lueu Ma Vai Ile Mat Gl» Mst slu Ma As» 55 00 05

Ala Efcs Lyá Ma Gly Cys Vhr Mg Sly Cys 1«« XI® Cys leu ser Lys 100 105 110 lie lys Cys 7&r Ala Lya Mefc Ays Vai Vyx Ile Pro GXy Arg Çys ais 11S 120 125 ASp Tyr Gly Gly Asp Lys Ays $hr Sly Glft Ala Gly Xle Vai Gly Ma ISO 135 140

Xle Vai Aap lie Fsó Gla Xle Ser Gly Pfes Ays slu Sfsft Ala P»c Met M5 150 155 1«0

Gi» Gin. Phe íle Ala Gia Vai Asp Arg cys Ala Ser Cya Thr Thr Gly £65 170 175

Cyg leu &ys Gly Leu Ala As» Vai x,ys Cys Ser 01» leu leu Lys lya 180' £#§: too 7sp 1®» ®ro Asp Ãxg Cys Ala Ser phe Al» As» lys lie Gin lys Glu 155 205 205

Vai Sis Asm lie t%& Gly Hat Ala Gly Asp Arg 210 215 <210> 3 <211> 573

<212> DNA <213> Metridia longa 30 ΡΕ1339853 <400> 3 atgggagtea aaettatttfe fcgetgtfcgfcfc tgtgtcgoag ttgesesgg© fcgccacaatt 60 c&gg&aaa-fct ttgaagacat tgafccttsgta gcscataggfcg gcagcfctfcgo ateagatgtt 120 gaigcfcaaca gaggtggaca feggfcggaeat eefcggeaaaa agafegccsaa agsagtactt 180 atggaaatgg aagceâatgc taaaogagct ggctgccaca ggggfctgfceft; ggfcttgtctg 240 teacacafcea agtgcacagc aeaaatgcag aagtttafcec caggaagatg «eatagttafc 300 goagga.gaua aggafctctge tecagggagga attogcciggfcg gtgccattgt tgatafcacet 360 gaaattgcrag gatttaaaga aafcgs&geac atggaacagt teattgstca agttgatctc 420 tgtga&gafefe geacaactgg afcgacfecaaa ggtefcfcgcca atgtfccafctg ctcfegatctc 480 ctgaagaagt ggçtgccatc aagatgfcaag açafcfcfcgcfcfc ocaaaatfeça ateteaagrtSf 540 gataceafcca aaggtfctgge tggagsstcgfc fega 373 <210> 4

<211> 218 <212> PRT <213> Metridia longa <4 0 0> 4

Hst Asp M&t Axg Vai lie Wbiet Ala te» Vai Wb» Ser ter te» Vai SI» 1 .5 10 15

Ma &ys ter Ttir <31« Phe tep Pr® &»» Ile Asn 11a vai. Sly teu 61» 20 25 30

Oly Lys Phe «ly 11® Tffctr Asa teia ®il« ter Asp teu th® fhr XI® ®rp 35 40 45 «Ia Thr M&t tep Vai XI« Xys te» Asp 11® Tht Asp ter Asp Axg Vai 50 55 60 S®» As& Phe Vai Ala fh* Gla Th» Asp Ma Asa A*g Sly £>ye Kat· Sxg 65 70 75 80

Gly l*ys l*ys teu Pr© teu Ala Vai Xla Ha-fc Gl« ífet Glu Ala As» Ala 85 00 t5

Ph® Xys Ala Gly Cy© ter &»g Gly Cy® teu li® Cys teu S©r &ys 11© 100 105 110: 31 ΡΕ1339853

Qjf» Tttx Ala Xys Mst tys Vai £yr lis ftw» Giy Arg Çya Bi?? &ap 115 120 22S

Vyr fílj A®p xgf» iya ISir Sly ©1» Ala SXy 11« Vai 61y Ma lia 230 1 m 140

Vai Asp II® Pro 01» ll* S-er Giy fha lys Olu Mst Ala to Hat 01a 145 ISO 255 160 θΐη Hm» lia Ala Gin Vai &©p Lea Cys Ma ftec Cys to ffeic Gly Cys 1SS 130 175 l*a« lys Oly leu Ala &s» Vai iy& Cy» Ser Gia I»sa iea 2*y® Lys frp ISO 185 100

li®» fxt) my Arg Cys Ma Ssr Pfe* Ma Ãsp iys II* Gin %s 41» Vai I&S 200 20S

Eia Asa II* I*ya Sly Mst Ma Giy As$? A»g 210 215 <210> 5 <211> 657

<212> DNA <213> Metridia longa <400> 5 atggatatga gggttafeeftt tgctcttgtt ttctrsatcat tggttcagge oaaatcaact 00 gaattagatc ctaacattaa cattgttggt ttagaaggaa aatttggtat aacaaacctt 220 gagaeggatt tattcacaat atgggagassa atggatSftea tcaaatcaga tattaaagat 100 i&çtgatagag fccagcasctt tgttgoaact gaaaccgafcg etaaecgtgg gaa&atgeet 240 ggcaaaaaae fegccactggc agttateafcg gasatggaag ecaatgcttt çaasgctggo 300 tgcsLccagga gafcgceifc&t ctgtettfeca aa&ata&agfc gtacageca® aatgaaggtg 360 tacatfeccag gaagatgfcoa tgattatggfc ggftgac&açfs aaactggae* ggeaggaafca 420 gttggtgeaa fcfcgrtetgaeat fceecgaaate tetggattta aggagratggc acccatggaa 460 cagfcfecattg etcaagttga tefcfctgcgofc acstgeaeta etggatgtet éaaaggtatt 540 gccsàtgtta. agtgetetgm a.st©®tgaag aastffetge cfeggcag&tg tgcaagt.ttt 800· gcfcgaoaaga ttcaaaaaga agttcacaat atea&agge* tggatggfaga t«gt%g& 65? 32 ΡΕ1339853 <210> 6 <211> 190 <212> PRT <213> Metridia longa <400> 6

Sfet Gis· Val x#m L&u lie P&e Ala Vai Vai Cys Vai Ala Vai Ala Gin 15 1® 15

Ala Ala *fe*? Ile SI» ©1» Asn PM ©1« Asp il® Asp Mu Val Ala 11« 20 SS 30 ©ly ©ly Ser P&e Ala Ser Asp Vai Asp Ma Asa Arg <31y Gly Eis <31y 35 40 45 ί31γ Ml Pro Sly Ays tya fjfefc Pré lya Ola Val M M&t ©lu Mét ©lu 50 55 50

Ala Asa Ala Lys &rg Ma Gly (¾¾ Sis Arg <31y Cys M Val Cys Leu 65 70 75 80

Ser sis lie %s Oys yhr Ma «In Hat ©ía l»y# Pha 11« Pro Qly Arg 85 »0 05

Cys His 8a* Tyx Ala Oly Asp Lys Asp Sã* Ma Sln Sly Gly Ils Ala 100 105 110 ©ly Oly Ala lia Val Asp lis Pro si» Ha Ala <51y SM X.ys Oiti Wtefc 215 120 125 lys Prc Mtefc· Sl» Sln. PM lia Ma sl» Val Asp Leu Cys eia Asp Cys 130 135 1-40

Ihr Ths eiy ©ys Mu Lys ©ly Mu Ala Asa Vai His Cys Sa* Asp Mu «5 150 1S5 1#0

Mv Ays Sy« Trp M» Pro s«r Arg Cys iys Sh* sfee Ma Ser Ay» Ila 155 170 17S eie Se* «1» Val Asp fís* lie Ay# Giy Mu ala ©ly Asp Arg 200 155 200 33 ΡΕ1339853 <210 > 7 <211> 657

<212> DNA <213> Metridia longa <400> 7 afcggataÉg» aggfcfcafcctt tgefccfcfeatt tfcotaagrast tggfctcaggç caastesasfc 60

gâ&ttcg&fcç ctaac&ttga cafctgttggfc ttagaaggaa aatttggteat aaeaaaectt ISO gag&egfafcfc feattcaosat atgggagaca &tgg&ggtea tcaaatcaga ta-ttgcagat 100 acfcga.t&g&g tcagc&actt fcgfctg&aact gaascog&tg ct.aaoc-gt.gg gaa.aatgcet 240 ggaaaaaaac fegsaasfcggíi agttatestg gaafctgga&g coaa-tgc-ttt ca&agctggc 300 tgt-accsggg gatgççttat cfegtcttfcea aaàátáaatjt gtácagcc&a mtgaaggtg 360 taeattccag gaagâfegtoa tgattstggfc ggtgacaaga aaactggaca ggcaggaata 420 gttggfcgcaa tfcgttgácat tcccgaaafcc tetggattta aggagatggc aetcatggaa 480 cafttcttfcg stcaagttga tegttgeact fesetgôaeta etggatffcet <5&aaggtstt $40 goçaatgtfta agtgetefcgss actcctgaag a&atggcsfcge etgacãgatg fcgcaagtttt 000 getgacaaga ttaaaaataga agfcfctaeaafc ats&&&ggea. tggctggaga tcgttga €31 <210> 8 <211> 630

<212> DNA <213> Metridia longa <400> 8 sfcfgatatea aagttatttt tgatisfcfcafcfc tgtsattgcat tggtccaggc c&ateca&ct 60

gWMHMMUttg »tcJM8»tta» tattgttggt atagaaggga s^fcttggtast aacsgatett ISO

gaaaeggatt fcafcfceateat atgggagaca aaecgtafega tcagi&caga taatgaacaa ISO gccaacacag attctaaccg tggtaaaatg eetgggaaaa aattaecact. ggcagtaet<2 240 afcagxsatgg aagccaatgt títtfcaaagct ggctgtacca ggggatgtct tatttgtcfct 300 tctaaaatca agtgtacsge e&ai&atgaag aagtaoatte qagg&agateg teatgatt&c 360 ggaggagaca agaààaçtgig ããaggcaggc afeagtfcggag etafctgttga cafctcctgat 420 atctctggat ttaaagagat gggaeecmtg gageagttca fctgcfccaagt tgatcgctgc 400 acegactgta ctactggstg eefcejaaaggfc ettgceaatg tsaagtgate tgaaefeeátc 540 aaaaaatggc tgecagacag atgtgcaagt tfetgctgaca aaattcaaag tga&gtgoac 600 34 ΡΕ1339853 aacattsi&gg gectegetgg a9ategt.fc.9a £30 <210> 9 <211> 657

<212> DNA <213> Metridia longa <4 0 0> 9 atggatataa àgfttftctt tgcfccttgtt ttctefcgcafc fcggfctcaggs. câsstcaaefc 60

gaattéfste tTt&acatfcçra catfcgrfctggt ttagaaggaa aafcfctggt&fc aaoaaaccfct ISO gagasfgatt tatfcsaeaat afcggga^aaa atggsggtea teasaasaga tafctgcagafc 180 actgatagâg ces&gàáçjcfcfc tgfcfcgcaacfc gaaaec.gatg çteaccg-fcg-g gaaaafcgoefc 240 çfgcaaaaaât tgesastggc agtfcateafcg gaaafcggaag «seaafcgettt caa&gcfcggo 300 tgoaoeâffsr gafcftettefc çtgffcet.ttça aaaateaagfc gteoagec&fc aafcga&ggtg 360 tecattecag gaa.g-atgeea tgatfcãtggt. ggtgscaaga aaaGfcgg&sa ggcagga&ta 420 gt&ggtgeaa, ttgttgacat tceegaaate tetggattta aggagatgga aeecafcgga» 480 cagttcstfcçf ct«aagtfcga. tcgfctgwgct tcofeg®a«fc« cteggatgtefc caaaggfccfcfc 640 gee&&fcgtte agteeigaag &ã&fcgg«tge efceaeagatg fc.geaâffcfc,fcfc 600 gcfcgacsaaga feteaaaaaga agfcfccataat afceaaagçps» tggtstggaga tegttga §W1 <210> 10 <211> 657

<212> DNA <213> Metridia longa <400> 10 &tegâtsa.fc&a aggttgtctfc tgetetfcsjte ttetetgcat fcggtfceaggc casateaacfc 60 gamttegate cfcaaeafcfcga cgfctgttggt ttegaaggaa aatttggtefc aacaaacctt 120 gagacggafct t&fcte»£â&t afcgggagaca atggaggtça tcaaaacaga tattgcagafc 280 acfcgafcag&g caagaaacfct; fcgfctgcaacfc ga&accgatg efcaaeegfcgg gaaaafcgecfc 240 ggcaâaàaat fcgçcaçfcgge agtfcattâtg g»Ãa.tggaag «eaafcgettt ôaaagstggc 300 fcgcaeeaggrg gatgeettafc otgtetttea amaatsasgfc gtaoagecaa aatgâ&ggrfcg 360 tacstteeagr gaagafcgcca tgatfcatggfc ggtgacaaga aaactggaça ggcaggaata 420 grtaggtge&a ttgttgacat teccgaaatc fccfcggattfca aggagatgga acesafcggaa 480 csgttsafctg cteaagttga tegtfegagct tectgcaáfca ctsggatgtet Gâaaggtcfcfc 540 #00 #00 35 ΡΕ1339853 ÊS7 geea&fcgtfcsi agtgsfcetsa aetecfeg&ag &â.&fcggctgc etgacagstg tgessgtttt gctegaca&ga. ttcaasaaga agttca.caat atcaaaggca tggctggaga tcgfctgra

Lisboa, 2 de Novembro de 2006

Claims (3)

1. ΡΕ1339853 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de ácido nucleico, seleccionada do grupo de moléculas de ácido nucleico incluindo: a) uma molécula de ácido nucleico, que codifica a se quência peptídica apresentada nas SEQ ID n°2, SEQ ID n°4 ou SEQ ID n°6. b) uma molécula de ácido nucleico, que codifica uma sequência peptidica, que apresenta pelo menos 90% de identidade com uma das sequências peptidicas nas SEQ ID n° 2, SEQ ID n°4 ou SEQ ID n°6, em que os péptidos considerados são luciferases secre- toras. c) uma molécula de ácido nucleico, incluindo uma molécula de ácido nucleico como representada na SEQ ID n° 1, SEQ ID n°3, SEQ ID n°5, SEQ ID n°7, SEQ ID n°8, SEQ ID n°9, ou SEQ ID n°10, em que os ácidos nucleicos codificam luciferases.
2. 2. Moléculas de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência contém um promotor 5' funcional para sequência .
3. 3. Vector RNA ou DNA recombinante, contendo uma molécula de acordo com a reivindicação 2. ΡΕ1339853 2 4 . de acordo 5. nucleótidos de 6. reivindicações celulares. Um organismo não humano, contendo um vector com a reivindicação 3. Péptidos, codificados por sequências de acordo com a reivindicação 1. Aplicação de luciferases de acordo com as 1-5 como genes "repórter" para sistemas Lisboa, 2 de Novembro de 2006